JPH0665302B2 - リンカ−ｄｎａによる二本鎖ｄｎａフラグメントの一定の結合方法、およびリンカ−ｄｎａとして好適なオリゴヌクレオチド - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、粘着末端を介して二本鎖ＤＮＡフラグメント
の一定の結合を行なう、請求の範囲第１項に示す特徴を
有する方法に関する。さらに本発明は、請求の範囲第１
項に示す式(I)〔式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｘおよびｎは後記
と同意義：〕で示される二本鎖リンカーＤＮＡに関す
る。本発明に係る方法およびリンカーＤＮＡは、遺伝物
質の特定の修飾に使用することができる。

制限リンカーは既知（シエラー(Scheller)等、サイエン
ス(Science)196,177(1977)）であつて、分子生物学およ
び遺伝工学においてかなりの間使用されてきた。制限エ
ンドヌクレアーゼの認識領域がオリゴヌクレオチド配列
の中央部にあり、かつ、通例、ＧおよびＣに富む配列が
5′および3′末端領域に位置することは、彼等すべてに
とつて周知のことである。既知のリンカー配列のうち２
例を下記に示す： EcoRIリンカー：ｄ（ＧＧＡＡＴＴＣＣ） BamHIリンカー：ｄ（ＣＧＧＡＴＣＣＧ） これらのリンカーの不都合な点は、以下の例によつて説
明することができる。これらのリンカーをＴ４−ポリヌ
クレオチドリガーゼを用いてＤＮＡにライゲーシヨンす
ると、その遺伝物質（ＤＮＡ）は、これらのリンカーに
より必ず、且つ非可逆的に変化する。なぜなら、適当な
制限エンドヌクレアーゼを用いた「切断」の後（そして
適当ならばクローン化等を行なつた後）には、たとえ１
本鎖の特異的エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレア
ーゼの使用後であつても、カツプリング（対合）したリ
ンカーヌクレオチドのうち幾らかがＤＮＡ上に残存して
しまうからである。

文献の述べるところによるこの例において、元のＤＮＡ
が２ＧＣ塩基対だけ長くなることは明白である。

既知の方法の欠点は、本発明に係る方法およびリンカー
ＤＮＡを使用して回避できる。なぜなら本発明によれ
ば、元の遺伝情報を変化させることなく回復させられる
からである。本発明方法の特徴は、請求の範囲第１項の
特徴を記述した部分から明らかである。

本明細書中で使用する「相補的」という語は、ワトソン
およびクリツクの意味での相補性を意味する。「逆相補
的」とは、２個の配列が、一方を左から右へ、他方を右
から左へ読んだ時に相補的であることを意味する。

通常、オリゴヌクレオチドＩならびに第１および第２の
ＤＮＡフラグメントは、5′末端にリン酸基を有する。
オリゴヌクレオチドＩにこれが無い場合は、第１または
第２のＤＮＡフラグメントがリンカーＤＮＡとの結合点
に5′−リン酸基を確実に有することが必要となるだけ
である。もし第１または第２のＤＮＡフラグメントがリ
ン酸基を欠くならば、オリゴヌクレオチドＩが5′−リ
ン酸基を持つていなければならない。

Ｒ^１が、４種のヌクレオチドＡ、Ｔ、ＣおよびＧが結合
してできる可能なテトラヌクレオチド配列の１個であつ
て、自己相補的でない場合は表１に示す配列のような結
果となる。Ｒ^１が、４種のヌクレオチドＡ、Ｔ、Ｃおよ
びＧが結合してできる可能なペンタヌクレオチドの１個
であつて、自己相補的でない場合（ヌクレオチドが奇数
であることを考慮すれば、ペンタヌクレオチド配列は自
己相補的にはなり得ない）、同様の順列化によつて得ら
れる可能な配列は、ここでは１個１個表示しないが、例
えば以下の通りである。

対応する順列化により、同様にして自己相補的であるか
又は自己相補的でないヘキサヌクレオチドの可能な組み
合わせもまた、ヌクレオチドＡ、Ｔ、ＣおよびＧから得
ることができ、これは例えば以下の通りである。

Ｒ^１が自己相補的でないテトラヌクレオチドもしくはペ
ンタヌクレオチド配列、または自己相補的もしくは非自
相補的なヘキサヌクレオチド配列であるここに記載の事
例においては、以下の事があてはまる。即ち、Ｒ^２はＲ
^１に対して逆相補的な配列を有していなければならず、
かつ同じ鎖長である。例えば、 (5′)ＡＣＴＡ(X)_ｎＴＡＧＴ(3′) (5′)ＣＡＣＡＣＡ(X)_ｎＴＧＴＧＴＧ(3′) (5′)ＡＡＡＴＴＴ(X)_ｎＡＡＡＴＴＴ(3′) のごとくである。

さらにこの場合、以下の事があてはまる：Ｒ^１またはＲ
^２のいずれか一方は、単一のリボヌクレオチドを、3′
または5′末端位に含まれなければならず、または、適
当ならば、Ｘもまた3′もしくは5′末端のリボヌクレオ
チドを含む。例えば、 (5′)Ｃ＊ＡＣＡＧＣ＊ＴＧＴＧ(3′) 〔ここではＲ^１がＣ＊ＡＣＡであり、Ｒ^２がＴＧＴＧで
あり、ＸがＧＣ＊であり、リボヌクレオチドは＊によつ
て表わされている〕 のごとくである。

適用される規則は、スペーサーＸ中に粘着末端を作るた
めに、Ｒ^１またはＲ^２のいずれかがリボヌクレオチドを
有する場合には、リボヌクレオチドの存在が必要であ
り、他方、Ｒ^１およびＲ^２の各々がリボヌクレオチドを
含む場合には、スペーサーＸ中のリボヌクレオチドは不
必要である、ということである。

しかしながら、Ｒ^１およびＲ^２が5′−または3′−リボ
ヌクレオチドを含み、そのリボヌクレオチドの位置が、
移された粘着末端の鎮長を決定するということもあり得
る。

さらに、以下の事があてはまる：Ｔ＊（リボチミジン）
は、同じ働きをするＵ＊（リボウリジン）に置き換える
ことができる。

ベーリンガー・マンハイム・ゲー・エム・ベー・ハー(B
oehringer Mannheim GmbH),1981の小冊子「制限エンド
ヌクレアーゼ」には、第II類および第III類の制限エン
ドヌクレアーゼのリストおよび説明がある。この刊行物
には、本発明方法に使用することのできる第II類および
第III類の制限エンドヌクレアーゼも記載されている
が、以下の記載においてこれらの名称を具体的に挙げる
ことはしない。

本発明方法を使用すれば、１、２、３、４、５または
６、好ましくは４個のヌクレオチドを有する粘着末端
を、第１のＤＮＡに移すことができ、一方、スペーサー
Ｘ由来のヌクレオチドは転移しない。しかし、実施例に
よつて以下に示すように、グループＸ中のリボヌクレオ
チドの位置が適当である場合には、スペーサーＸ由来の
１またはそれ以上のヌクレオチドを、第１のＤＮＡに移
すことも可能である。

第１のＤＮＡ上の粘着末端は、第１のＤＮＡおよびリン
カーＤＮＡから得られた反応生成物を開裂することによ
って形成され、これは図表１（明細書の末尾）に記載の
一般的手法を使用して説明できる。

図表１において、Ｎは、ヌクレオチドＡ、Ｔ、Ｇおよび
／またはＣ、ならびにＡ＊、Ｔ＊、Ｇ＊、Ｃ＊および／
またはＵ＊を示し、これらは残基Ｒ^１を形成しており、
そしてＸは、上に定義した２〜３０のヌクレオチド単位
を有するオリゴヌクレオチド基を示す。さらに、４種の
開裂方法ａ、ｂ、ｃおよびｄによる開裂位置を矢印で表
わし、これらの方法を以下に記載する。

方法ａおよびｂ 第II類または第III類の制限エンドヌクレアーゼを用い
て開裂を行なうと、この外来ＤＮＡ上に、リンカーＤＮ
Ａ中の基Ｒ^１またはＲ^２と同数のヌクレオチドを有する
粘着末端が形成される。エンドヌクレアーゼの特異性に
よつて、粘着末端は外来ＤＮＡの5′または3′末端に生
成する。

方法ｃおよびｄ 塩基またはＲＮaseを用いて開裂を行なう。したがつて
リボヌクレオチドＡ＊、Ｔ＊、Ｃ＊、Ｇ＊またはＵ＊が
開裂位置に存在することが前提条件となり、また、開裂
は常にリボヌクレオチドの3′末端で起こるということ
に留意すべきである。リボヌクレオチオの位置によつ
て、粘着末端は外来ＤＮＡの5′または3′末端に生成
し、さらに、リボヌクレオチドの位置は、転移した粘着
末端の鎮長（１〜６）を決定する。基Ｒ^１およびＲ^２の
ヌクレオチドから粘着末端をそつくり誘導することがで
きるが、スペーサー領域からヌクレオチドを転移させる
ことも可能である。

本発明に係る別の有利な態様によれば、粘着末端を有す
る第１のＤＮＡフラグメントを、第２のＤＮＡフラグメ
ントと結合させる前に、自体既知の、相異なる制限特異
性を有する粘着末端を持つたアダプターＤＮＡと反応さ
せることができる。この方法の実施例もまた後に掲げ
る。

本発明方法を、下記の好ましい実施例により詳細に説明
する。

一般式(I)のオリゴヌクレオチドにおいて、Ｒ^１および
Ｒ^２が一般式(II)で示される配列、即ち例えば第II類お
よび第III類の制限エンドヌクレアーゼに対する中心的
認識領域を示し、(X)_ｎが短いスペーサー領域を表わす
時、リガーゼ、とりわけＴ_４−ポリヌクレオチドリガー
ゼを用いて、これらのオリゴヌクレオチドにより遺伝物
質（ＤＮＡ）中に制限エンドヌクレアーゼに対する認識
領域を組み入れることが可能である。この方法では、式
(I)のオリゴヌクレオチドは、カツプリングおよびクロ
ーニングの行なわれた後も、元の遺伝情報を無修飾の形
で回復させることができる。これは、オリゴヌクレオチ
ドの両端にある粘着部分を含む制限エンドヌクレアーゼ
に対する信号配列によつて達成できる。

以下の実施例１は、本発明に係る式ｄ−（ＡＡＴＴＣＧ
ＡＡＴＴ）で示されるオリゴヌクレオチドを使用して達
せられる利点を説明するものである。

本発明に係る方法およびオリゴヌクレオチドを使用すれ
ば、本発明のオリゴヌクレオチド即ちリンカーＤＮＡと
カツプリングさせ、開裂させて粘着末端を作り、相補的
粘着末端を有する第２のＤＮＡ（ベクターＤＮＡ）とカ
ツプリングさせ、クローンし、再び開裂させて粘着末端
を除いた後に、遺伝情報（第１のＤＮＡ）が無修飾の形
で回復することは明らかである。

本発明による、エンドヌクレアーゼに特異的な粘着末端
の導入は、第１のＤＮＡの末端塩基対に依存している。
４種の起り得る塩基配置についての幾つかの実施例によ
り、さらに本発明方法を説明する。

実施例２ オリゴヌクレオチドＩ：ＡＡＴＴＣＧＡＡＴＴ（EcoRI
に対する信号配列） ＧＡＴＣＣＧＧＡＴＣ（BamHI
に対する信号配列） ＧＴＡＣＣＧＧＴＡＣ（KpnIに
対する信号配列） ＴＣＧＡＣＧＴＣＧＡ（SalIに
対する信号配列） ＡＧＣＴＣＧＡＧＣＴ（SaCI／
SaCIに対す る信号配列） 実施例３ オリゴヌクレオチドＩ：ＧＡＴＣＴＡＧＡＴＣ（BglII
に対する信号配列） ＴＣＧＡＴＡＴＣＧＡ（ClaIに
対する信号配列） ＡＧＣＴＴＡＡＧＣＴ（HindII
Iに対する信号配 列） ＡＡＴＴＴＡＡＡＴＴ（AhaIII
に対する信号配 列） 実施例４ オリゴヌクレオチドＩ：ＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡ（PstIに
対する信号配列） ＧＡＴＣＧＣＧＡＴＣ（PvnIに
対する信号配列） ＴＣＧＡＧＣＴＣＧＡ（XhoIに
対する信号配列） 実施例５ オリゴヌクレオチドＩ：ＧＡＴＣＡＴＧＡＴＣ（BclIに
対する信号配列） ＧＴＡＧＡＴＣＴＡＧ（XbaIに
対する信号配列） 実施例１〜５については、第１のＤＮＡ（外来ＤＮＡ）
の末端塩基対がわかつていることが必要である。これに
対し、幾つかの制限エンドヌクレアーゼについては、自
己相補的テトラヌクレオチド配列が存在するだけで十分
であるので、本発明方法に係るこれらのリンカーは、そ
こに存在する末端塩基対に関わりなく、あらゆる外来Ｄ
ＮＡに使用することができる。換言すれば、本発明のオ
リゴヌクレオチドのある種のものにカツプリングさせる
と、適当な制限エンドヌクレアーゼの粘着末端が常に生
成するのである。幾つかのこの実施例を以下に掲げる。

実施例６ オリゴヌクレオチドＩ：ＧＡＴＣＣＧＧＡＴＣ（MboI/S
au3Aに対する 信号配列） ＴＣＧＡＧＣＴＣＧＡ（TaqIに
対する信号配列） ＡＡＴＴＣＧＡＡＴＴ（EcoRI
＊に対する信号配列 ） ＡＧＣＴＣＧＡＧＣＴ（AluIに
対する信号配列） ＮはヌクレオチドＡ、Ｃ、ＧおよびＴのうちの１個であ
り、Ｎ′はこれらと互いに相補的なヌクレオチドＡ、
Ｃ、ＧおよびＴを示す。

１つのオリゴヌクレオチドの使用の実施例を以下に示す
が、ここでは、Ｒ^１は式(III)の配列を示し、Ｒ^２は式
(IV)の配列を示す〔ただし、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴ、なら
びにＡ＊、Ｃ＊、Ｇ＊およびＴ＊、ならびにＮおよび
Ｎ′についての定義は先に定義したものと同じであり、
かつＲ^１およびＲ^２は、左から右に読んだ場合、互いに
相補的なヌクレオチドＮおよびＮ′を除いて同一であ
る〕。

実施例７ オリゴヌクレオチドＩ：ＧＴＣＡＣＣＧＧＴＧＡＣ（Bs
tEIIに対する信号 配列） もし外来ＤＮＡに存在する末端塩基対のために所望の粘
着末端を直接生成させることができない場合は、開裂工
程と結合工程の間に、さらに別の工程を差しはさむこと
でこれを実施することができる。下記の実施例８におい
ては、第１のＤＮＡ（外来ＤＮＡ）が末端のＧＣ塩基対
を持つているので、HindIIIに特異的な粘着末端を直接
導入することができない。したがつて、まずBamHIリン
カーを、そして次にBamHI／HindIIIアダプターＤＮＡを
使用して所期の目的を達成する（アダプターＤＡＮは、
種々の制限特異性の粘着末端群を有する短いＤＮＡとし
て定義できる）。

実施例８ 実施例８に従つてこの方法を実施すると、最終的な分析
によれば、第１のＤＮＡが持つている末端塩基対に関わ
りなく、各々の粘着末端を導入することが可能となり、
また本発明思想に従つて、第１のＤＮＡは無修飾で回収
できる。

本発明に係る方法およびオリゴヌクレオチドのさらに別
形によれば、オリゴヌクレオチドの規定の位置にリボヌ
クレオチドを組み入れることができる。本発明によれ
ば、たとえその制限エンドヌクレアーゼを使用しなくて
も、ある制限エンドヌクレアーゼに特異的な粘着末端を
導入することが可能である。これを下記の実施例９およ
び１０により説明する。

実施例９ EcoRIに対する粘着末端： PstIに対する粘着末端： 実施例９および１０、ならびに以下の記載において、リ
ボヌクレオチドは＊によつて表わす。

以下に示した反応式から明らかな通り、リボヌクレオチ
ドの組み入れによつてＤＮＡの内部に一定のアルカリ不
安定位置ができる。

この間、ヌクレオチド間結合のリン酸基は、リボヌクレ
オチド上に残る。ホスフアターゼによる処理により、
２′，３′−シスージオール基が生成し、これを過ヨウ
素酸塩処理による既知の手法で開裂し、そして同じく既
知の手法により、緩和なアルカリ条件下にリボヌクレオ
チドの除去へと導く。最後に３′末端のデオキシリボヌ
クレオチドを、再度ホスフアターゼで処理することによ
り遊離させる。この粘着末端を３′−リン酸基により
「保護された」状態に保つため、この工程を、反応手順
の後の方まで行なわないことが有利であると言える。

この別法のもう１つの利点は、２本のＤＮＡ鎖のうち１
本のみに、決められたアルカリ不安定な切断部位を入れ
るようにリボヌクレオチドの位置を選択することがで
き、他方の鎖は適当な制限エンドヌクレアーゼにより切
断できるという点である。これを以下の２つの実施例に
より説明する。

実施例１１ 実施例１２ 本発明方法によれば、自己相補的でない粘着末端を導入
することも可能となる。この場合、Ｒ^１は、主たる請求
の範囲に記載の式(V)、(VI)または(VII)〔詳細な定義は
請求の範囲に記載した〕で示される、非自己相補的テト
ラヌクレオチドもしくはペンタヌクレオチド配列、また
は自己相補的もしくは非自己相補的ヘキサヌクレオチド
配列であり、Ｒ^２は常に、Ｒ^１に対し逆相補的で且つ等
しい長さの４、５または６個のヌクレオチド配列であ
る。前に詳説した通り、Ｒ^１および／またはＲ^２は５′
または３′末端リボヌクレオチドを有し、該当する場合
は、スペーサー(X)_ｎ中にさらにリボヌクレオチドを配
していなければならない。

リボヌクレオチドの位置により、同じヌクレオチド配列
により、粘着末端の長さに影響を及ぼしかつ、その粘着
末端を第１のＤＮＡ（外来ＤＮＡ）の３′または５′末
端のいずれかに方向づけることができる。

以下の実施例は、この別法を説明するものである。

実施例１３ 実施例１５ リボヌクレオチドを適当な位置に配することにより、ア
ルカリに不安定な切断部位を、２本のＤＮＡ鎖のうち一
方だけに導入することが、この方法にとつて可能とな
る。これにより、例えば環状の二本鎖ＤＮＡを用いて、
マイナスまたはプラスのうちいずれかの鎖を単離するこ
とができる。

以下の実施例は、オリゴヌクレオチドＩ〔ここでＲ^１お
よびＲ^２は自己相補的または非自己相補的なヘキサヌク
レオチド配列である〕を使用して、残基Ｒ^１、Ｒ^２およ
びＸ中でのリボヌクレオチドの位置に依存した、ヌクレ
オチド１〜６個の鎖長を有する粘着末端の生成をいかに
して可能とするかを説明するものである。

実施例１７ 上記実施例は、本発明方法がいかに融通性に富むもので
あるかを明らかにし、またこの事は、ＤＮＡフラグメン
ト非可逆的に結合させたい場合、または、内部に信号配
列が存在する可能性が高いために制限エンドヌクレアー
ゼの使用が制限される場合には、常に有利な点となる。

この事は、高分子量のＤＮＡフラグメントの場合、例え
ば遺伝子バンクを確立する場合には殆んど常にあてはま
る。

式(I)のオリゴヌクレオチドに含まれるスペーサー(X)_ｎ
は、制限エンドヌクレアーゼに対する認識領域のために
必要なヌクレオチド、および自己相補性によつて形成さ
れつつある二本鎖ＤＮＡに必要な安定性とを考慮した時
に必要となるスペーサーとして選ばれる、短いオリゴヌ
クレオチド配列である。例えばEcoRIリンカー： ｄ（ＡＡＴＴＣＧＡＡＴＴ） のように、中央のテトラヌクレオチド配列がＡＴ塩基対
によつてのみ形成されていると安定性は低いが、この場
合、例えば、 ｄ（ＡＡＴＴＣＧＣＧＡＡＴＴ） のごとく、例えばスペーサーを延長することによつて安
定性を増大させることができる。

この方法によつて、制限エンドヌクレアーゼに対するも
う１つの認識領域を導入することが可能である。例えば
Ｘ＝ＣＣＣＧＧＧとすると、EcoRIリンカーは式： を有することとなる。この例では、末端塩基対としてＧ
Ｃを有する外来ＤＮＡ中に、このリンカーによつてEcoR
I信号配列が導入されるだけでなく、SmaI／XmaIに対す
る極めて珍しい認識配列もまた導入される。

以下の例示態様は、式ｄ（ＧＡＴＣＣＧＧＡＴＣ）で示
される本発明のオリゴヌクレオチドの製造および本発明
における使用に関するものである。

実施例１８ ｄ（ＧＡＴＣＣＧＧＡＴＣ）の製造（テトラヘドロン・
レターズ（Tetrahedron Let.)1983,747を対照）。

Ｃ−担体１００mg（調節された有孔ガラス（ＣＰＧ）に
共有結合させたＮ−ベンゾイル化Ｃ１０μmol）を、Ｍ
ＳＮＴ（1.5当量／ＰＯ⁻）にて活性化した各１００μm
olのＮ−保護した５′−ジメトキシトリチウム化デオキ
シヌクレオシド３′−（２−クロロフエニル）−ホスホ
ジエステルＴ、Ａ、Ｇ、Ｇ、Ｃ、Ｃ、Ｔ、ＡおよびＧと
順次反応させる。反応の１サイクルは、ピリジン中での
縮合（45′）、ピリジンによる洗浄、無水酢酸／ピリジ
ンによるキヤツピング（10′）、ピリジンおよびCH₂Cl₂
/MeOH（７：３）による洗浄ならびにCH₂Cl₂／メタノー
ル（７：３）中の飽和ZnBr₂を１０分間使用することに
よるジメトキシトリチル基の離脱、ならびにCH₂Cl₂/MeO
H（７：３）およびピリジンによる洗浄からなる。

縮合の平均収率は９０〜９５％である。

最後の縮合の後、オキメート試薬（テトラヘドロン・レ
ターズ1978,2727参照）３mlで２４時間処理することに
より２−クロロフエニル基を離脱させ、生成物を担体か
ら分離し、そして濃アンモニア水により５０℃で１２時
間処理することによりＮ−アリール基を除去する。蒸発
させ、CHCl₃5mlずつで５回抽出した後、水性溶液を常法
によりＤＥＡＥセルロース上の陰イオン交換クロマトグ
ラフイーを用いて精製する（リービツヒ・アナーレン
（Liebigs Ann.)1978,839およびテトラヘドロン・レタ
ーズ1983,747を参照）。精製した物質を常法によりポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（２０％、７Ｍの尿素）お
よびホモオリゴｄＴ鎖長標準品との比較、ならびにマク
サムおよびギルバートの方法または移動性シフト法のい
ずれかによる配列決定によつて特性決定する。

ライゲーシヨン： ライゲーシヨン用の基質を得るために、常法によりpBR3
22をBal I（ＴＧＧＣＣＡ）にて線状にすると、ＤＮＡ
はこの方法によつて▲^G _C▼平滑末端を得ることになる。
６６ｍＭトリスHCl(pH7.6)、6.6mM MgCl₂、１０ｍＭジ
チオトレイトール、0.4mMＡＴＰおよび反応容量２０μ
ｌにつき４単位のＴ４リガーゼ中でライゲーシヨンを実
施する。リンカーは目的量の５０倍過剰量を使用する。
ライゲーシヨン時間は１０℃で２４時間である。

次にBamHIとのインキユベーシヨンを常法にて行ない、
得られたBamHI粘着末端を、２０μｌにつき0.０２単位
のＴ４リガーゼを使用する以外は上記の手法によつてラ
イゲーシヨンする。反応時間は２２℃で１時間である。

アガロースゲル電気泳動により、平滑末端ではなく粘着
末端のみがライゲーシヨンされるライゲーシヨン状態の
下に、線状のpBR322ＤＮＡが環状ＤＮＡに変換している
ことが確認された。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】以下の工程： 1.第１のＤＮＡフラグメントの平滑末端を、リガーゼの
   存在下に、両端が平滑末端である短い二本鎖リンカーＤ
   ＮＡと反応させること、 2.こうして得られたＤＮＡをリンカー配列の領域で開裂
   させ、１〜６個のヌクレオチド配列を有する粘着末端を
   形成させること、そして、 3.こうして得られた粘着末端を有するＤＮＡを、リガー
   ゼの存在下に、粘着末端を有する第２のＤＮＡフラグメ
   ントと結合させること、 からなる、粘着末端を会する二本鎖ＤＮＡフラグメント
   の一定の結合方法であつて、第１および第２のＤＮＡフ
   ラグメントの粘着末端は互いに相補的であり、使用され
   るリンカーＤＮＡは、ライゲーション条件下で二本鎖の
   形態をとる自己相補的オリゴヌクレオチドであつて、一
   般式(I)： (5′)Ｒ^１−(X)_n−Ｒ^２(3′) (I) 〔式中、Ｒ^１およびＲ^２は、左から右に読んだ場合、式
   (II)： (5′)Ａ＊ＡＴＴ＊(3′) Ｔ＊ＴＡＡ＊ Ａ＊ＴＡＴ＊ Ｔ＊ＡＴＡ＊ Ｇ＊ＧＣＣ＊ Ｃ＊ＣＧＧ＊ Ｇ＊ＣＧＣ＊ Ｃ＊ＧＣＧ＊ (II) Ｇ＊ＡＴＣ＊ Ｇ＊ＴＡＣ＊ Ｃ＊ＡＴＧ＊ Ｃ＊ＴＡＧ＊ Ａ＊ＣＧＴ＊ Ａ＊ＧＣＴ＊ Ｔ＊ＣＧＡ＊ Ｔ＊ＧＣＡ＊ （式中、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴ、ならびにＡ＊、Ｃ＊、Ｇ
   ＊およびＴ＊は、各々アデニン、シトシン、グアニンお
   よびチミジンヌクレオチドであり、Ａ＊、Ｃ＊、Ｇ＊お
   よびＴ＊は5′もしくは3′末端デオキシヌクレオチドま
   たは5′もしくは3′末端リボヌクレオチドのいずれかを
   示し、かつリボチミジンヌクレオチドＴ＊は、リボウリ
   ジンヌクレオチドに置き換わつていてもよい）で示され
   る配列群から選ばれる、同一の自己相補的テトラデオキ
   シヌクレオチドまたはモノリボトリデオキシヌクレオチ
   ド配列であるか、または、Ｒ^１は、式(III)： (5′)Ａ＊ＡＮＴＴ＊(3′) Ｔ＊ＴＮＡＡ＊ Ａ＊ＴＮＡＴ＊ Ｔ＊ＡＮＴＡ＊ Ｇ＊ＧＮＣＣ＊ Ｃ＊ＣＮＧＧ＊ Ｇ＊ＣＮＧＣ＊ Ｃ＊ＧＮＣＧ＊ (III) Ｇ＊ＡＮＴＣ＊ Ｇ＊ＴＮＡＣ＊ Ｃ＊ＡＮＴＧ＊ Ｃ＊ＴＮＡＧ＊ Ａ＊ＣＮＧＴ＊ Ａ＊ＧＮＣＴ＊ Ｔ＊ＣＮＧＡ＊ Ｔ＊ＧＮＣＡ＊ （式中、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴ、ならびにＡ＊、Ｃ＊、Ｇ
   ＊およびＴ＊は前記と同意義であり、Ｎはヌクレオチド
   Ａ、Ｔ、ＣまたはＧのうちの１個を示す） で示される配列群から選ばれるペンタデオキシヌクレオ
   チドまたはモノリボテトラデオキシヌクレオチド配列を
   示し、Ｒ^２は、式(IV)： (5′)Ａ＊ＡＮ′ＴＴ＊(3′) Ｔ＊ＴＮ′ＡＡ＊ Ａ＊ＴＮ′ＡＴ＊ Ｔ＊ＡＮ′ＴＡ＊ Ｇ＊ＧＮ′ＣＣ＊ Ｃ＊ＣＮ′ＧＧ＊ Ｇ＊ＣＮ′ＧＣ＊ Ｃ＊ＧＮ′ＣＧ＊ (IV) Ｇ＊ＡＮ′ＴＣ＊ Ｇ＊ＴＮ′ＡＣ＊ Ｃ＊ＡＮ′ＴＧ＊ Ｃ＊ＴＮ′ＡＧ＊ Ａ＊ＣＮ′ＧＴ＊ Ａ＊ＧＮ′ＣＴ＊ Ｔ＊ＣＮ′ＧＡ＊ Ｔ＊ＧＮ′ＣＡ＊ （式中、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴ、ならびにＡ＊、Ｃ＊、Ｇ
   ＊およびＴ＊は前記と同意義であり、Ｎ′はＮに対し相
   補的なヌクレオチドＡ、Ｔ、ＣまたはＧである） で示される配列の群から選ばれるペンタデオキシヌクレ
   オチドまたはモノリボテトラデオキシヌクレオチド配列
   を示し、かつ、Ｒ^１およびＲ^２の群の配列は、左から右
   に読んだ場合、互いに相補的なヌクレオチドＮおよび
   Ｎ′は別にして互いに同一であるか、または、Ｒ^１は、
   ４種のヌクレオチドＡ、Ｃ、ＧおよびＴの組み合わせに
   より可能な下記式(V)または(VI)で示される非自己相補
   的テトラヌクレオチドまたはペンタヌクレオチド配列の
   うちの１個であるか、または自己相補的もしくは非自己
   相補的な下記式(VII)で示されるヘキサヌクレオチド配
   列であり： (5′)Ｎ^１−Ｎ^２−Ｎ^３−Ｎ^４(3′) (V) (5′)Ｎ^１−Ｎ^２−Ｎ^３−Ｎ^４-N⁵(3′) (VI) (5′)Ｎ^１−Ｎ^２−Ｎ^３−Ｎ^４-N⁵-N⁶(3′) (VII) （式中、Ｎ^１、Ｎ^２、Ｎ^３、Ｎ^４、Ｎ^５およびＮ^６は、
   ヌクレオチドＡ、Ｔ、ＣまたはＧのうちの１個であ
   る）、Ｒ^２は、式(V)、(VI)または(VII)（式中、Ｎ^１、
   Ｎ^２、Ｎ^３、Ｎ^４、Ｎ^５およびＮ^６は前記と同意義） で示される、Ｒ^１に対し逆相補的なテトラヌクレオチ
   ド、ペンタヌクレオチドまたはヘキサヌクレオチド配列
   であり、そしてＲ^１がモノボトリデオキシヌクレオチ
   ド、モノリボテトラデオキシヌクレオチドもしくはモノ
   リボペンタデオキシヌクレオチド配列であつてＲ^２がテ
   トラデオキシヌクレオチド、ペンタデオキシヌクレオチ
   ドまたはヘキサデオキシヌクレオチド配列であるか、ま
   たはＲ^１がテトラデオキシヌクレオチド、ペンタデオキ
   シヌクレオチドもしくはヘキサデオキシヌクレオチド配
   列であつてＲ^２がモノリボトリデオキシヌクレオチド、
   モノリボテトラデオキシヌクレオチドもしくはモノリボ
   ペンタデオキシヌクレオチド配列であるか、またはＲ^１
   がＲ^２に対し逆相補的なモノリボトリデオキシヌクレオ
   チド、モノリボテトラデオキシヌクレオチドもしくはモ
   ノリボペンタデオキシヌクレオチド配列であるかのいず
   れかであり、リボヌクレオチドはＲ^１の5′もしくは3′
   末端またはＲ^２の5′もしくは3′末端に位置し、また、
   5′−または3′−リボチミジンはリボウリジンに置き換
   わつていてもよい。Ｘは、式(VIII)： (5′)Ｃ＊Ｇ＊(3′) Ｇ＊Ｃ＊ Ｔ＊Ａ＊ Ａ＊Ｔ＊ Ｇ＊ＣＧＧ＊ Ｇ＊ＧＣＣ＊ Ａ＊ＡＴＴ＊(VIII) Ｔ＊ＴＡＡ＊ Ｃ＊ＣＣＧＧＧ＊ Ｇ＊ＧＧＣＣＣ＊ Ａ＊ＡＡＴＴＴ＊ Ｔ＊ＴＴＡＡＡ＊ （式中、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴ、ならびにＡ＊、Ｃ＊、Ｇ
   ＊およびＴ＊は前記と同意義） で示される配列群から選ばれるオリゴヌクレオチドを示
   す。ｎは、１〜５の整数を示す。〕 で示されるものであり、こうして得られた二本鎖ＤＮＡ
   のリンカー領域における開裂を、リボヌクレオチドを含
   まないヌクレオチド配列については、自体既知の方法
   で、作成しようとする粘着末端に特異的な第II類または
   第III類の制限エンドヌクレアーゼを用いて行ない、リ
   ボヌクレオチドを含むヌクレオチド配列については、塩
   基またはリボヌクレアーゼを用いて行なうことを特徴と
   する方法。
2. 【請求項２】粘着末端を有する第１のＤＮＡフラグメン
   トを、第２のＤＮＡフラグメントに結合させる前に、自
   体既知の、相異なる制限特異性の粘着末端を有するアダ
   プターＤＮＡと反応させることを特徴とする、第１項記
   載の方法。
3. 【請求項３】ライゲーシヨン条件下で二本鎖であり、式
   (I)： (5′)Ｒ^１−(X)_ｎ−Ｒ^２(3′) (I) （式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｘおよびｎは前記と同意義） で示されるリンカーＤＮＡ。