JPH066588B2

JPH066588B2 - 免疫系の刺激作用を有するアルカロイドの一種のオキシインド−ル及びそれを含有する製剤

Info

Publication number: JPH066588B2
Application number: JP59502728A
Authority: JP
Inventors: ケプリンガ−，クラウス; ヴアグネル，ヒルデベルト; クロイツカンプ，バーバラ
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1984-07-06
Filing date: 1984-07-06
Publication date: 1994-01-26
Anticipated expiration: 2009-01-26
Also published as: JPS61502604A

Description

【発明の詳細な説明】〔技術分野〕この発明は、式Ｃ_２１Ｈ_２４Ｏ_４Ｎ_２を有するイソプテ
ロポジン、プテロポジン、イソミトラフイリンおよびミ
トラフイリンからなる群から選んだオキシインドールア
ルカロイドに関する。

この発明は、更にそのようなアルカロイドのオキシイン
ドールを含有する製剤に関するが、実質上タンニン物質
を含まない、その新鮮な内皮が黄褐色又は暗褐色である
カギカズラＵ．トーメントサ(Uncaria tomentosa)Ｄ
Ｃの根部分の抽出物は除外される。

〔背景技術〕

抗生物質及び制細胞剤による伝染病及び腫瘍疾患の学説
上の大きな発展にもかかわらず、伝染病とその感染に対
抗する多数の療法が増加してきた。

少数の抗ウイルス剤は有効であるが、制細胞剤による療
法は、必然的に免疫抑制を伴う点が不利な条件となって
いる。

このような事情からこれに代わる補助剤による療法の研
究が集中的に行われてきた。この療法の概念は、以前は
刺激療法として、そして、今日では免疫刺激作用として
知られているが、再び興味を呼ぶに至った。

この関係で最も興味深い事は、特異的又は非特異的な内
生の防御機構を誘発する若しくは同時に投与された抗原
に対する免疫反応を増大する物質又は混合物質のような
いゆる免疫刺激剤による体液又は細胞の防御機構におけ
る非特異的な増加作用に関することである。

さまざまな実験により、ある化合物が、免疫刺激剤にな
り得ることが証明されている。

藻類や真菌類の多糖類のようないくつかの化合物が、腫
瘍疾患の補助剤による療法において既に製剤として使用
されている。この種の化合物はその大部分が混合物であ
り化学的に不明確のものであることが欠点である。この
点に関しては低分子化合物によって満たされるように思
われる。これらの化合物の大部分は、免疫刺激作用が認
められた原型のものと見なされているアリストロキン
（ＡＳ）とともに窒素含有化合物である。アリストロキ
アクレマテイティス(Aristolochia clematitis)（ア
マノスズクサ科）は、既に古代エジプト及びギリシャに
おいてあらゆる種類の負傷に使用されていた。デストモ
デルが開発されて(J.R.Mose and G. Lukas, Phamacolog
ic Research 11,33,1961)、それによって生体の内生防
御の可能性としての刺激作用が証明された。類似療法の
薬局方の指示に従って調製したアリストロキアクレマ
テイティスの抽出物が、テスト抽出物として使用され
た。ウサギの白血球の食細胞作用の活性の実験におい
て、食細胞作用の活性が最初の値の２倍に増加するのが
アリストロキアの抽出物の種々の希釈液を注射した後数
日して観察された。希釈液Ｄ３は最も有効なものであっ
た。希釈液Ｄ７については効果が観察されなかった。

免疫系刺激作用を有する他に知られている化合を以下に
示すが、Ｎ−含有化合物の種類の物質において活性物質
の存在する可能性が高くなっており、フェノール類、キ
ノン類及びテルペン類で顕著である。ほとんど全ての化
合物が細胞の防御に有効である。

１．アルカロイド類ａ）セファランチン（ビスベンジルイソキノリンアル
カロイド）ｂ）ベルバミン（ビスベンジルイソキノリンアルカロ
イド）ｃ）マトリン（ルピンアルカロイド）ｄ）ピロカルピン（イミダゾールアルカロイド）２．フェノール類／キノン類ａ）２，３−ジヒドロキシ安息香酸ｂ）フェルラ酸ｃ）フォルフェニシン（アミノ酸誘導体）ｄ）アネトールｅ）クレイスタンシン（リグナン）ｆ）カルクリゴサイド（フェノールグルコケイド）ｇ）ウルシオール（Ｃ_１５／Ｃ_１７側鎖を有するピロカ
テキン誘導体）ｈ）α−トコフェロール（ビタミンＥ）ｉ）ユビキノン（主にＱ７，Ｑ８）ｊ）マエサニン（Ｃ_１５側鎖を有するキノン）３．テルペン類ａ）ゼクスブレビンＡ／Ｂ（セルマクランタイプのア
スキテルペンラクトン）ｂ）１２−ｏ−テトラデオアノイル−フォルボール−１
３−アセテート、ＴＰＡ（テトラサイクリックジテル
ペン）ｃ）非配糖体オレオン酸を含むサポニン（ペンタサイク
リックトリテルペン）ｄ）シノンコサイド（ステロイドグリコサイド）〔発明の開示〕ここに、式Ｃ_２１Ｈ_２４Ｏ_４Ｎ_２を有する、イソプテロ
ポジン、プテロポジン、イソミトラフイリンおよびミト
ラフイリンからなる群から選んだ少なくとも１種のオキ
シインドールアルカロイドが、優れた免疫刺激作用を有
することが見い出された。

ＷＯ−Ａ−82/1130で分かるように、大部分はタンニン
物質を含有せずその新鮮な内皮が黄褐色又は暗赤色であ
るウンカリアトーメントサＤＣの根抽出物は、制癌
剤、避妊薬などとして使用することができる。植物アル
カロイドの分離方法に部分的に非常に似ており、そこに
記載された調製法及び南米のウンカリア種に含有される
ヘミングウェイらによって指摘されたアルカロイド類(C
hemical Abstract,Volvme 82,No.21,Ref.135680 K)によ
ると、アルカロイド類が、根抽出物の前記の用途に直接
的に関係しないが、その基礎となるであろう活性物質で
ある可能性はあり得た。根抽出物の種々の効果は免疫系
の非特異的刺激作用により生起するであろうとの考えか
ら、南米のウンカリア種の種々の部位に含有されている
アルカロイド類が分離されその免疫効果が分析された。
これに関して、ある種の効果が、個々に分離された精製
アルカロイドど同様に粗アルカロイド分画についても認
められた。免疫系刺激作用の特別の性質が、アルカロイ
ドのテトラー及びペンタサイクリックオキシインドー
ルに認められたので、種々の植物からの他のアルカロイ
ド類と同様に他のウンクレア種からの同様なアルカロイ
ド類の免疫特性に関して調査した結果、支持すべき結果
が得られ、そして、良好な免疫刺激効果を有する物質の
細胞毒素性が興味深いものとなった。

免疫刺激作用及び細胞毒素性に関し種々の物質を試験す
るために、以下の生体外及び生体内試験のモデルが作成
された。

１．BRANDT法を改良した顆粒球試験中性好性の顆粒球は、マクロファージと共に最も重要な
食作用の奏効細胞であり、それ故に、感染に抗して重要
な役割をはたしている。それらは、人間の血液中の全白
血球の約６０−７０％に相当する。これら全ての顆粒球
の食作用効果は、ブランドによって開発され（Scand.J.
Haematol.Suppl.2,1967）、ティンパーによって改良さ
れた（Munich Med.Weekly 8,251,1978）方法に従って生
体外で測定することができる。

顆粒球の分画は健康な発端者の血液から取得される（Ｐ
ＭＬ−多形核白血球の省略形を示す）このＰＭＬ−分画は、主として、中性好性顆粒球及びリ
ンパ球、単球、血水板と同様きわめてわずかの好酸性及
び好塩基類粒球から成るものである。一定量の酵母菌細
胞（Saccharomyces cerevisiae）及び試験される物質を
添加した後、１０分間、３７℃にて培養し、懸濁液を担
体上に塗って更に３５分間室温にて培養した。次いで、
これを染色して顕微鏡により評価した。１００個のＰＭ
Ｌ−細胞が担体あたり選択され、個々の細胞からなる酵
母菌粒子がどれ位食作用を受けたか測定した。食作用の
指標によると食作用を受けた酵母菌粒子は平均数を示し
ていた。

試験は免疫作用の本質部分を模擬しているので、試験さ
れた物質は、仮りにそれらが同じ条件下で作用するとす
れば、生体内においても活性を示すことが仮定される。
既に記述したように、これは低分子化合物であるアリス
トロキンについで既に確認されている。しかしながら、
この機構の過程は、ほとんど知られていない。

試験は、以下の通り実施された。

顆粒球懸濁液の調製臨床的に健康な成人のヘパリンを加えた静脈血１５mlを
１．５％のデキストランＴ500(Pharmacia社）で２：１
に希釈し、室温下に３０分間放置した。白血球を含有す
る上澄を殺菌したプラスチックチューブに注入し５００
r.p.m.で７分間遠心分離した。沈澱中の顆粒球は、各々
の場合５mlのRPMI−緩衝液で２回洗滌した。次いで、顆
粒球を、約５mlの緩衝液中に懸濁しノイバウエル(Neuba
uer)血球計算器中で５×10⁶細胞／mlの濃度に調整し
た。

酵母菌懸濁液の調製０．９％のNaCl中に懸濁した酵母菌を１００℃に加熱
し、ガーゼで３回過し、3-5×10⁷粒子／mlに調整し
た。

混注した血清の調製臨床的に健康な成人５人の血清を混合し、５ml単位で凍
結した。試験のために、０．９％NaClで１：１０に希釈
した。

試験は、以下のように実施した。

０．９％NaClに溶解した０．２mlの物質及びコントロー
ルとして０．９％NaCl０．２mlを各々０．２mlの混注し
た血清、顆粒球及び酵母菌懸濁液にピペツトで注入し先
ず１０分間培養した。次いで、５mlの各標品を担体に付
して、更に３０分間室温にて高湿度下で培養した。沈澱
した顆粒球、上澄を注意深く０．９％のNaClで洗滌し、
担体を乾燥器で乾燥した。

染色１）５滴のMay-Grundawald-溶液（Merck社）、過、非
希釈２）２滴の蒸留水３）１５滴のGiesma-溶液（Merck社）、水１８０ml中５
ml ４）４滴の蒸留水空気乾燥化。

評価１００個の顆粒球を担体あたり数え、個々の細胞から成
る酵母菌粒子がどの位食作用を受けたかを決定した。食
作用の指標（ＰＪ）は、顆粒球あたりの酵母菌粒子の平
均数を示す。対照値における食作用活性の増加（Ｓ）
は、次式に従って計算される。

２．化学ルミネッセンス試験（ＣＬ） BRANDT法に従った顆粒球試験は、物質及び抽出物の食作
用増強化の特性の決定方法として信頼性が高いが、それ
は、非常に時間及び手数のかかる方法である。そこで、
一つの方法として化学ルミネッセンスによる方法が食作
用を受けた細胞の新しい測定方法になる得る。

ALLENら(Biochem.Biophys.Res.Commun,47,129,1972)が
最初にラテックス粒子及び種々の細菌の食作用の間の中
性好性顆粒球による光放射を発見し、そして、NELSONら
（Infec.Immun.14,129,1975）及びWEIDEMANNら（FEBS L
etters,89,136,1978）が食作用を営む血液マクロファー
ジ（単核細胞）についてのＬ−現象を証明して以来、こ
の反応は、実験的及び臨床的免疫学に応用されている。
しかしながら、反応過程の実際の機構は充分に解明され
るに至っていない。要約すると、活性化された食作用に
生起するＣＬは、次のように説明される：これらの細胞
が、細菌、ウィルス又は他の外因性の物質、例えば化学
物質、と接触すると、先ず、酸素吸収の増加が起こる。
続いて、細胞中で過酸化物−アニオン−ラジカルＯ_２が
酸素分子から形成され、次いで自然又は酵素反応的に他
の活性酸素分子、例えば、過酸化水素(H₂O₂)、単分子酸
素(¹O₂)、ヒドロキシル基(OH)及び次亜塩素−アニオン
(OCL^-)のようなものに転換する。この過程は、“呼吸の
突発”と呼ばれている。

活性酸素分子を食作用を受けた細胞の直ぐ近隣に食作用
を営む液胞それ自体中と同様に遊離すること、及びリゾ
チーム酵素の活性化によって、浸入した微生物又は癌細
胞は破壊され又は死滅させられる。いわゆる陽イオン剤
の蛋白質及びラクトフェリンのような他の分子もまた関
係する。微生物の細胞壁は、酸化及び還元を受け、部分
的に破壊される。細胞壁物質が活性化酸素分子のための
化学ルミネッセンス物質として役立つので、ＣＬは副次
的効果として生ずる。

そのような食作用を受けた細胞のＣＬ−反応の低い光の
収量は、活性化酸素によって酸化された物質の添加によ
って生体外実験において増加され、そして物理的に測定
可能な一定の波長の光を生成する。好適な物質は、ルミ
ノール（５−アミノ−２，３−ジヒドロ−１，４−フタ
ールアジンジイオン）及びルシゲニン（１０，１０′−
ジメチル−９，９′−ビアグリジニウムジニトレート）
であり、これらはＣＬ−反応を１０^３倍増加させる。

光−倍率器によって光子が計算される鋭敏な測定倍率器
の使用によって、上記物質により増加したＣＬを測定す
ることができる。

この研究では、同時に６つの試験を可能にする６−チャ
ンネル−ＣＬ−装置を使用した。更に、使用された装置
は、ＣＬ−反応を時間に依存して自動記録することがで
きる。それ故に、時間−依存効果を第３要素として投与
量−効果−曲線に加えることができる。

物質の食作用−増強効果の生体外実験のために、顆粒球
の精製された細胞群又はマクロファージが使用されるか
あるいは測定が直接希釈血液中で実施される。食作用の
活性化は、固体粒子、例えばオプソニンを加えた細菌、
ザイモサン及びラテックス粒子又はある種の溶解された
物質によってはたされる。知られている活性剤は、例え
ば種々のイオン及びフッ素イオンである。

試験は以下のように実施した。

最初の測定では、ＣＬ−測定を実施するための文献の種
々の指示を再現することは困難であることが示された。

食作用−誘導された活性酸素の形成についての物質の影
響を試験する際、ＣＬ−反応は、使用された化合物の種
々の活性化能を別として、特定の範囲まで、使用された
ＣＬ−増強化物の作用と同じく、食作用の働き、測定時
間、温度、pH値、媒質の組成に依存する。

全ての試験は、ベルソルドのＣＬ−評価プログラムを持
ったアップル社コンピューターと連結して、ベルソルド
の６−チャンネル−バイオルマートLB9505により実施し
た。

約５１０nmのせまい波長分布で光子を発し、それが光−
倍率器の感度の最大域に分布するルシゲニンが光増幅の
ために選択された。

測定溶液のpH値は、７．１及び７．４の間にあるべきで
それはベロナール緩衝液の添加によって達成される。試
験物質は、リン酸塩緩衝液に溶解された（ＰＢＳ−緩衝
液）。“呼吸の突発”反応は、グルコース代謝の増加と
関連しているので、両者の緩衝液システムは、０．１％
のグルコースを含有している。

食作用の活性化のためにオプソニンを加えたザイモサン
を使用した。分離された顆粒球のＣＬの測定は、ＰＢＳ
−緩衝液で１０^６細胞／μに調整された、分離多形核
白血球(PMNL)から成る血液により実施した。

全血液によるＣＬ−測定は、赤血球により色彩が消失し
たので、１：１００の希釈をＰＢＳ緩衝液で行なった。
こうして、色彩の消失は、本質的に減じられた。

試験物質は、先ず分離された顆粒球又は全血液と共に室
温で１０分間そして３７℃で１０分間培養した。オプソ
ニンを加えたザイモサンを添加した後、測定が３７℃で
始められた。各試料のＣＬ−反応を６０分間観察し、そ
して、測定値をグラフ化してcpmで表示した。各物質に
特有の曲線が得られた。積分された表面は、直接、ＣＬ
−反応の強さと比例している。

顆粒球の生起した“呼吸の突発”の刺激作用を決定する
ために、顆粒球試験に関する同様の方式が使用された。

装置ＣＬ−測定：biolumat LB9505,ベルソネード，ワイルド
バッドコンピュータ及びディスケットドライブユニッ
ト：アップルIIe，アップルズプログラム：ベルソールドディスプレイ：DM5112CX,サンヨープリンター／プロッター：Ｉプソン RX-80 溶液の調製ａ）殺菌したCa²⁺／Mg²⁺を除いたＰＢＳ緩衝液（ベルリ
ンのバイオクロムの完成品として利用可能）ｂ）Ca²⁺，Mg²⁺，グルコース及びアルブミンを含むベル
ソナル緩衝液原溶液：８．３ｇのNaCl，１．０２ｇのベルソナル、１
０２mgのMgCl₂及び２２mgのCaCl₂を１５０mlの水に溶解
した。１Ｍ−HClを３．５ml添加後、水を加えて２００m
lとした。

試験溶液：４０mlの原溶液を１４０mlの試験溶液で希釈
し、１Ｍ−HClでpH７．０調整し、に水を加えて２００m
lとした。

２００mgの精製牛血アルブミン(Boehringer)及び２００
ｇのグルコースを添加した後、溶液を過して殺菌し
た。

ｃ）ルシゲニン溶液原溶液：２５．５mgのルシゲニンを１０mlの水に溶解し
た。

試験溶液：原溶液を１：５の割合に水で希釈した。

ｄ）オプソニンを加えたザイモサン貯蔵懸濁液：２５mgのザイモサンを１０mlの０．９％Na
Cl中に懸濁し水溶中で９０分間加熱した。冷却後、懸濁
液を２ml単位に分画して凍結した。

試験溶液：２mlの貯蔵懸濁液を２mlの臨床的に健康な成
人の血精と共に室温で３０分間培養し、遠心分離し、
０．９％NaClで洗滌した。オプソニンを加えたザイモサ
ンを２mlの０．９％NaCl中に懸濁した。各ケースにおい
て、水として蒸留水を使用した。

多形核白血球(PMNL)の調製２０mlの血液を３０mgのEDTAと混合した。１５mlのこの
血液を注射器で７mlのデキストランと混合し、室温に３
０分間放置した。白血球を含む上澄を殺菌した遠心分離
チューブに移し、1000r.p.m.で３０分間遠心分離した。
残渣は白血球及び赤血球の残りの部分から成り、これら
は色彩を消失させる点で測定に影響し得る。残りの赤血
球を低張アルカリ液で除去した。このために、残渣を
０．２５％のNaCl溶液中に懸濁し、混合器で２０分間混
合した。次いで、２０mlの１．６％NaCl溶液を混合し、
再度、混合した。2000r.p.m.で１０分間遠心分離後、上
澄を吸引除去し、これらの工程を２度繰り返した。次い
で、残渣を２mlのＰＢＳ緩衝液中に懸濁し、Turcks溶液
で１：１０に希釈した。ノイバウエル血球計算器中でＰ
ＢＳ緩衝液により１０^６細胞／mlに調製した。

試験は、以下の通り実施した。

ａ）血液：４６０μのベロナール緩衝液２００μの希釈血液１００μのルシゲニン溶液２００μののＰＢＳに溶解した物質及びコ
ントロールとしてのＰＢＳｂ）PMNL：６３０μのベロナール緩衝液１５μのPMNL １００μのルシゲニン溶液２００μのＰＢＳに溶解した物質
及びコントロールとしてのＰＢＳ室温で１０分間予備培養し、次いで６−チャンネル−bi
olumat中で３７℃にて１０分間培養した後、４０μの
オプソニンを添加したザイモサンを攪拌下で混合し、測
定を開始した。６０分後に測定を停止した。

試験結果の評価試料のＣＬ−反応を測定期間中コンピューターに蓄積
し、測定後、曲線で表示された。表面の積分によって、
各々の試料のＣＬ−反応の強さをcpmで得た。

試験物質によるＣＬ−反応のＳの増加は、次式に従って
計算した。

文献によるとBRANDT法に従った顆粒球試験で正の反応を
示す全ての抽出物及び物質は、ＣＬ−試験においてもま
た正の結果を与えることが仮定される。二つの測定結果
が相互にどのように関連するのかそしてＣＬ−方法が顆
粒球試験と実際にどのように比較されるのか知られてい
ない。更に、分離された顆粒球によるＣＬ−測定を全血
液による方法と比較することが必要である。

精製物質のＣＬ−試験のために、我々は、食作用−増強
効果が確実であるアリストロキンのＮａ塩を選び、そし
て、既に顆粒球試験から濃度−効果のデータを得てい
る。

顆粒球及び全血液法の精度、再現性及び感度期待していたように、分離された顆粒球の７−８％の相
対的な変化率での測定は正確な方法であることが確認さ
れたが、全血液では、約１６％の平均値が得られた。

PMNL法では、ＣＬ−反応の顕著な増加が１０^−９％希釈
においても記録された。

対照的に、全血液法は、はるかに感度が低い。１０^−３
％の濃度で測定し得る増加を示した。低濃度では非常に
低い値であった。このことは、本質的には、全血液を希
釈したにもかかわらず依然として存在する赤血球の消失
効果に依ると考えられる。コントロールのcpmは、この
試験ではPMML試験の場合より大体低くなっている。

これらの結果により、二つのＣＬ−方法が適用される範
囲が限定される。短期間で実施される全血液法は、免疫
刺激効果による物質の予備選択にのみ適用し得る。しか
しながら、分離された顆粒球によるＣＬ−測定によって
のみ投与量−効果曲線を作成し得る。

全血液及びPMNL法によるＣＬ−反応の増加％、試験物質
はアリストロキンＣＬ−法と顆粒球試験の比較顆粒球試験の場合と同様に、“呼吸の突発”反応の形で
食作用活性の投与量−依存性の増加が、分離された顆粒
球によるＣＬ−試験においても見い出された。種々のア
リストロキン濃度のＣＬ−反応を以下に示す。これらの
測定結果は、顆粒球試験の場合ときわめて良く相関し
た。ただ、最大値は１０^−５％の濃度によるＣＬ−試験
では顆粒球試験の場合より１０倍低かった。

顆粒球及びＣＬ−試験で同じ式で計算した％数は、二つ
の測定原理が異なるので直接比較することはできない。
顆粒球及びＣＬ−試験によるアリストロキンの投与量−
効果−曲線の比較は、二つの試験法の曲線経路と良く一
致した。

我々の試験によると、分離した顆粒球によるＣＬ−法
は、精度、感度の点で充分にBRANDT法に従った手数のか
かる顆粒球試験に代え得るものであり、更に、時間−依
存性の刺激作用の記録により、仮定される食作用過程を
詳細に記述し得る。

３．BIOZZI法に従ったカーボン−クリアランス−テスト
（ＣＣＴ） BIOZZIらによって開発されたこの生体外試験(C.R.Soc.B
iol.148,431,1954)(Progr.Liver Dis.2,166,1965)によ
って、細網内皮系(RES)の組織マクロファージの食作用
活性を決定した。ゲラチンで安定化したカーボン粒子を
試験動物に静脈内注射し、一定の期間後、血液を後眼窩
静脈集網から採取し、そしてカーボンの放出を、測光法
により測定した。肝臓部分のクップフェル細胞は、外因
性粒子の放出が９０％であり、脾臓部分のマクロファー
ジは１０％であった。

カーボン放出の指数関数は、負の傾斜が回帰係数Ｋであ
る直線（ｔに対するlogＥ）によって示される。仮りに
潜在的に刺激された物質が、試験開始前の一定の時期、
例えば２４又は４８時間前に、一定の濃度で一回又は数
回与えられたとすると、食作用の増加は、ブランク値に
よる回帰係数と比較することによって決定される。も
し、関係がＫ物質／^Ｋコントロール＜１であれば、試験
物質は、食作用活性に抑制効果を持つ。もし、関係が、
＞１であれば、刺激が起こる。

カーボン放出の回帰係数Ｋは、各々肝臓及び脾臓の重量
に依存して異なるので、真の放出定数（α−値）は、こ
れらの計算合体した後にのみ見い出される。我々の種々
の物質による試験では、α−値の指数は、Ｋ−値の指数
と著しい差を示した。

試験動物：メスのNMRI−マウス、２５−３０ｇ収集数：スクリーニング試験に３匹、又は、物質に５
匹、コントロールに２匹管理及び飼養：２０°−２２℃のケージ、ＳＦＩ−標準
飼養、水処理方法：０．９％NaClに溶解した物質を一回又は数回
投与した。溶液は、精製した懸濁液として細胞−刺激作
用を避けるために過すべきである。粗製の懸濁液の腹
腔内投与は、動物を致死に至らす。個々の投与量は、通
常、体重あたり０．１及び１０mg／kgであった。最終の
投与は、試験開始の２４時間前に実施した。

試験は以下の通り実施した。

１０％のガスブラック（粒子サイズ200-250A）を含むイ
ンキ懸濁液を、１％ゲラチンを含む０．９％NaClによっ
てmlあたり１６mgのカーボンを含むように調整し、３７
℃に予備加熱した。各マウスには、尾の静脈中に０．１
ml／１０ｇ注射した。ｔ＝３，６，９，12，15分の後、
25μの血液が後眼窩静脈集網から採取した（ヘパリン
を加えた−方法−シクロピペット法）。血液を２mlの蒸
留水中で溶血させ、カーボン濃度を測光法でλ＝６５０
nmで測定した（日立−スペクトロメータ 181，細胞の
厚さ１cm）。

評価：指数関数で示されるカーボンの放出のために、回
帰係数Ｋが数学的に決定された（ｔに対するlogＥ）。
指数^Ｄ物質／^Ｋコントロールを作成して、ＲＥＳの刺激
作用又は抑制作用を決定し得た。

４．リンパ球の転換試験リンパ球の転換試験において、通常のリンパ球の胚−転
換の誘発及びそれに続く有系分裂を測定した。このため
に、試験される物質を分離されたリンパ球又は希釈した
全血液と培養し、標品を^１４Ｃ−及び^３Ｈ−チミジンで
マークして再び培養した。細胞−ＤＮＡに結合したマー
クしたチミジンを液体シンチレーションスペクトロメー
タで測定した。

５．腹水症細胞についての^３Ｈ−チミジン−結合試験に
よる細胞毒素性顆粒球試験においてある物質が高濃度において顆粒球を
溶解するので、我々は、腹水症細胞における^３Ｈ−チミ
ジン−結合試験のモデルで細胞−損傷効果を試験して、
活性化物質における食作用の増加及び細胞毒素性の間の
関係を見い出すことができた。

WEITZELらに従ったこの生体外試験系（Hoppe-Seyher′s
Z.physiolg.Chem.348,433,1967）において、腫瘍細胞の
ＤＮＡ−合成の阻害による物質の細胞毒素性が、ラット
のWalter−250−癌肉腫の腹水症細胞における^３Ｈ−チ
ミジンの結合割合の変化によって数値的に測定された。

試験は以下の通り実施された。

３mlのWalker−250−癌肉腫細胞懸濁液を５０mlの遠心
分離グラス中でMEDIUM L-15(Boehrringer)１０mlと混
合し、１０分間遠心分離した。上澄を傾捨し、遠心分離
グラスを媒質でへりから１cmまで満たした。攪拌した細
胞懸濁液より試料あたり１ml（２×１０^６細胞／mlに相
当）を遠心分離グラスに入れ、500μの試験溶液を加
え、コントロール試験は500μの媒質を加えて実施し
た。各試験は４〜６回実施した。３７℃で２時間予備培
養後、100μの^３Ｈ−チミジン（５０Ci/nM）を試料あ
たり加え、更に攪拌下で培養した。次いで、１．５mlの
１Ｎ−過塩素酸を試料あたり添加して結合を停止し、調
製物を冷凍室に一夜保存した。結合しない前駆物質を含
む残渣を過塩素酸で湿した紙により吸収除去し、５％
トリクロロ酢酸で洗滌し、再度エタノールで洗滌した。
フィルターをポリエチレンフラスコ中に入れ活性をトル
エンシンチレーターで測定した。結果をコントロールと
比較して、阻害効果を％で示した。

試験結果の比較各試験ごとに同一物質による結合阻害作用の割合が３０
％に至るまで種々の変化を示したので、葉酸の拮抗物質
としてDNA−合成を阻害するMethotrexatを各試験シリ
ーズにおいて参考物質として試験した。Methotrexat
−阻害作用の平均値（２mg／mlで４３％）を物質の相対
的阻害作用Ｈを決定するために使用した。

得られた結果を顆粒球試験の結果と比較することによ
り、他の低分子化合物で構成された考え方が追認され、
これによると、高濃度で細胞毒素活性を示す物質は、再
に10^-2又は10^-3％に希釈しても分離された顆粒球の食作
用効果を刺激する影響を有していた。このことは一般的
に云えるとしても、高分子化合物にも適用するには更に
試験して解明する必要がある。

６．急性毒性試験動物：メス又はオスのNMRI−マウス、３０−３５ｇ
管理及び飼養：２０°−２２℃のケージＳＦＩ−標準飼養、水収集数：マウス５匹試験は以下の通り実施した：水又は０．９％NaCl溶液に
溶解した試験物質を咽喉等を介してマウスに投与した。
コントロール群に関して行動を１４日間観察した。

全ての試験における前提条件は、試験材料の完全な溶解
性である。好脂性抽出物又は物質の試験においては、可
溶化剤として添加されるカルボキシメチルセルロース又
はジメチルスルフォキシドのような化合物が、可溶化剤
は一部自己刺激作用を有するので、試験濃度における対
照値として使用される。ＣＣＴにおいては、DMSOの使用
は高い毒素のために勧められない。

更に、試験溶液は可能な限り細菌を除去して調製すべき
である。グラム陽性細菌は、顆粒球の食作用効果を刺激
する影響を一部有する細胞壁多糖類を含有している。グ
ラム陰性細菌の細胞壁リポ多糖類は、いわゆるエンドト
キシンといわれ、試験結果に影響を及ぼす。生きている
細菌及び細菌抽出物は、高いＲＥＳ−刺激作用を示す。
更に、ある種のエンドトキシンは、発熱性、抗原性及び
細菌毒素の代謝変化のような副次的効果を有しており、
これらは、ＣＣＴにおいても影響され得る。

試験溶液を過して滅菌すること及びそれを冷凍室に保
存することの更に勧めるべきことである。

この発明に従って、アルカロイドのオキシインドールの
有効性について原理を特徴化するために、ウンカリア
トーメンノーサの未処理の水及びエタノール抽出物をNH
₃処理した粉末、更に、粗製アルカロイド混合物、他の
アルカロイドのオキシインドールと同様に分離された精
製アルカロイド類を試験した。尚、NH₃単独による刺激
作用は前もって除外されていた。

抽出物の調製のために、１０％NH₃でアルカリ処理した
粉末、乾燥化した剤を１：１０の割合で溶出剤と混合
し、マグネチックスターラーで２日間室温にて抽出し、
過し、物を濃縮乾燥した。

粗製のアルカロイド混合物は、以下の方法に従って調製
した。乾燥薬草を１０％NH₃に湿し、１時間室温に放置
し、注意深くＩＲで乾燥した。次いで、薬剤をマグネチ
ックスターラーで４日間エチル酢酸に湿して軟化させ
た。こうして得た粗抽出物を濃縮し、水層部が正のVals
er−反応を示さなくなるまで２％H₂SO₄で抽出した。水
層部をpH８−９のアルカリとなるまでNaCO₃を混合し
た。エチル酢酸による水層部の抽出を重ねることによっ
て、７５０ｇの薬剤は明褐色の粗製アルカロイド混合物
６．７５ｇとなり、収率は０．９％に相当した。次いで
塩酸の附加塩の形に転換した。

個々のオキシインドール、アルカロイド類を粗製のアル
カロイド混合物から分離し、同定した。

それらは以下の通りである。

１．アローイソプテロポジン、式Ｃ_２１Ｈ_２４Ｏ_４Ｎ_２
を有する異性体Ａ，MG：368 ｍ．ｐ．：２０４°−２０９° 薄層クロマトグラフィー：Ｒ_ｆ0.73(LM I)；0.48(LM I
I)；0.83(LM III) HPLC：Rt 8.8min(TS I) 〔α〕^２０ _Ｄ：−85.1（ｃ＝0.554／CHCl₃） UV(MeOH)＝λ_ｍａｘ＝208,243,283(sh) マススペクトル：m/e(rel.int.)：368(M⁺,100),223(7
0),208(35),180(14),146(11),145(9),144(5),130(25),6
9(45) アロープテロポジン，式Ｃ_２１Ｈ_２４Ｏ_４Ｎ_２を有する
異性体Ｂ、MG：368 ｍ．ｐ．：２１４°−２１９℃ Tlc：Ｒ_ｆ0.72(LM I),0.47(LM II),0.81(LM III) HPLC：Rt 0.8min(TS I) UV(MeOH)＝λ_ｍａｘ＝208,243,283(sh) マススペクトル：m/e(rel.int.)：368(M⁺,100),223(8
4),208(25),180(20),146(8),145(11),144(11),130(14),
69(35) ３．ノルマル−イソミトラフィリン，式Ｃ_２１Ｈ_２４Ｏ
_４Ｎ_２を有する異性体Ａ；ＭＧ３６８ｍ．ｐ．：９６°−１０６℃(Z) Tlc：Ｒ_ｆ0.71(LM I)；0.47(LM II),0.80(LM III) HPLC：Rt 9.2min(TS I) 〔α〕^２０ _Ｄ：＋145゜（ｃ＝0.758／CHCl₃） UV(MeOH)＝λ_ｍａｘ＝208,243,283(sh) ＭＳ：Ｍ／ｅ(rel.int.)：368(M⁺,70),223(100),208(1
0),180(4),146(6),145(5),144(7),130(11),69(29) ４．ノルマル−ミトラフィリン，式Ｃ_２１Ｈ_２４Ｏ_４Ｎ
_２を有する異性体Ｂ；ＭＧ３６８ｍ．ｐ．：２６４°−２６８℃ Tlc：Ｒ_ｆ0.55(LM I),0.39(LM II),0.50(LM III) HPLC：Rt 10.4min(TS I) 〔α〕^２０ _Ｄ：−4.3℃（ｃ＝0.587／CHCl₃） UV(MeOH)＝λ_ｍａｘ＝208,243,283(sh) マススペクトル：ｍ／ｅ(rel.int.)：368(M⁺,60),223(1
00),208(10),180(4),146(6),145(7),144(10),130(10),6
9(27) 使用した溶媒混合物(LM)for Tlc ＬＭ (I) クロロフォルム−アセトン（５：４）ＬＭ (II) クロロフォルム−エタノール（９５：５）ＬＭ (III) エチルアセテート−イソプロパノール−N
H₃ conc.（１００：２：１）ウンカリアトーメントサから分離されたこれらのオキ
シインドールアルカロイドの他に、ウンカリア種に含
有されているオキシインドールアルカロイドのスペシ
オフィリンがあり、その構造式は、であり、そしてゲルセミウムセメルビレンス(Gelsemi
um semervirens)（フジウツギ科）の根の主要成分の一
つとして知られているオキシインドールアルカロイド
のゲルセミンを少なくとも免疫学試験の一部に使用し
た。

水溶解性の塩酸の附加塩を調製するために、アルカロイ
ド塩基をエーテルに溶解し、HCl−ガスをガスボンベか
ら導入した。エーテルを除去し、塩酸の附加塩を無水エ
ーテルで再度洗滌し、次いで真空デシケーター中で五酸
化リンにより乾燥した。

種々の抽出物及び物質の食作用の増加割合が、各々種々
の濃度で顆粒球試験において確立された。

細胞毒素性は、ほとんどの場合１０^−１％の濃度で観察
された。

比較のために、顆粒球試験が、非オキシインドールア
ルカロイドについて実施された。

ウィルス性の目の炎症に利用されているイソキノリン
アルカロイドのベルベリンは、１０^−４％の濃度に至る
まで非活性であった。

ビンクリスチン（アスピドスペルミン型のインドール
アルカロイド）及びカモトテシン（キノリンアルカロ
イド）については、１０^−６％まで希釈しても効果は見
られなかった。これらの化合物は、有系分裂−阻害剤及
び制癌剤として使用される。ピンクリスチンの場合、マ
クロファージー食作用の生体外−阻害作用は、１０^−４
％及び１０^−５％の濃度において見られた。

バプティシアティンクトリア(Baptisia tinctoria)
（蝴蝶花科）の全植物の主要アルカロイドで、キニリジ
ンディンアルカロイドのシチシンは、敗血症性の疾患
及び潰瘍に使用されるが、これは、１０^−４％の濃度に
至っても効果を示さない。

タリクトラムファベリ(Thalictrum faberi)（毛莨
科）から分離されたビスベンジルイソキノリンアルカ
ロイドのタリファベリン、タリファビン及びファングサ
ニン（１０^−４％まで試験した）についての試験では、
これらが中国において抗炎症剤及び胃癌の処置に民間療
法として使用されているにもかかわらず、効果を示さな
かった。

アルカロイド混合物から分離された精製アルカロイド類
の中には、効果上の差異が、最大効果が一様に１０^−２
％−１０^−５％の濃度範囲にあるにもかかわらず、見ら
れた。BRANDT法に従った顆粒球試験で見い出された結果
は、化学ルミネッセンス試験によって確認された。この
二つの試験の結果（例えば、イソリンコフィリンによる
もの）の差異の理由は、まだ見い出されていない。次の
表は、粗製アルカロイド混合物及びウンカリアトーメ
ントサから分離したオキシインドールアルカロイドの
ＣＬ−反応の増加割合を示す。

アルカロイドを少量含有する、ウンカリア種の茎抽出物
は、通常の１０％及び２０％の増加率に関して、高い食
作用活性を示さなかった。

対照的に、イソプテロポディンを含有する根は、平均し
て３０％及び４０％の値を示した。

根のように高いアルカロイド濃度を示す葉は、違った状
況を示した。１９８３年収穫の試料は、イソプテロポデ
ィンを含有せず、茎に比べてわずかに高い刺激作用値を
示し、そして、１９８１年に収穫した葉は、３０％及び
４０％の増加率を示した。この葉は、根の濃度と同じ程
度のイソプテロポディンを含有していた。

薬剤のアルカロイド含有量はさておき、効果は、個々の
アルカロイドの種々の食作用増強率を総合して確認され
るアルカロイドのパターンに依存している。

水溶解性の塩酸附加塩の形での粗製アルカロイド混合物
の試験は、平均２０％の食作用増化を示した。後者はエ
タノールによる全抽出物の場合よりも高くなかったの
で、水及びエタノール抽出物中に付随して存在する物質
が、効果の増加上補助剤的役割を有していると思われ
る。このことは、水溶解性のカテキン抽出物（pH６．
０）の１％水溶液１０mlを全アルカロイド混合物の０．
１％水溶液１０mlと混合し、マグネチックスターラーで
室温に２４時間攪拌し、凍結乾燥し、最終的にカーボン
−クリアランス試験を実施して確認された。

BIOZZI法に従ってカーボン−クリアランス−試験を実施
した全材料の結果を要約して以下の表に示した。

顆粒球試験の場合と同様に、この試験においても、アル
カロイドの有効性が見い出された。アルカロイドを含有
する水浸軟物は、アルカロイド含有量の低い水浸軟物よ
りも高い範囲でＲＥＳを刺激する。アルカロイド混合物
を、それ自体刺激作用のないカテキンと一緒に適用する
と、水浸軟物の場合と同様の高さの活性の増加が得られ
た。

リンパ細胞転換試験ウンカリアトーメントサからの全水抽出物を試験し、
ウンカリアトーメントサからの阻製アルカロイド混合
物及び二つの混合物Ｐ_１及びＰ_２を試験した。Ｐ_１は、
アルカロイドのイソプテロポディン、プテロポディン、
及びイソミトラフィリンを含有し、これらは、顆粒球試
験では活性を示し、Ｐ_２は、非活性のアルカロイドのミ
トラフィリン及びリンコフィリンを含有する。

全血液法においてもまた分離したリンパ球による測定に
おいても、試験したどの物質も自然転換を上回る程の^３
Ｈ−チミジン−結合の増加は示さなかった。

急性毒性、細胞毒素性及び抗腫瘍効果急性毒性試験をウンカリアトーメントサ及び阻製アル
カロイド混合物からの全水抽出物によってマウスについ
て実施した。抽出物は、体重あたり最大濃度５ｇ／kgで
経口的に、また、２ｇ／kgで腹腔内に投与した。アルカ
ロイド混合物は、経口的に２ｇ／kgまでまた腹腔内に１
ｇ／kgまで投与した。マウスは、１４日間以上観察した
ところ、通常の行動に変化は見られなかった。

細胞毒素性の試験を^３Ｈ−チミジン−結合試験により腹
水症細胞について実施した。種々の抽出物及びアルカロ
イド濃度を試験した。^３Ｈ−チミジン結合試験におけるウンカリアトーメ
ントサからの抽出物およびアルカロイド濃縮物の結合阻
害作用の割合ａ）０．２％の投与量による細胞毒素性の比較ｂ）種々の濃度における結合阻害作用の割合明らかなように、１０^−１％の濃度のアルカロイド濃縮
物は、細胞毒素性効果を有している、希釈する程毒素性
は減少する。これらの結果は、アルカロイド濃縮物Ｐ_１
及びＰ_２の細胞毒素性試験と相関する。５μ／mlに至
る濃度においては、二つの細胞タイプの成長は影響を受
けない。５０μ／ml（５×１０^−３％）の投与量にお
いてのみ、二つのサンプルはわずかに細胞毒素効果を示
した。

二つの細胞毒素性試験により、細胞毒素性と免疫刺激作
用の間に相関のあることが判明した。例えば、全アルカ
ロイド混合物は、１０^−１％の濃度において顆粒球を溶
解する。更に希釈して、細胞毒素効果を全く又はほとん
ど有しなくしても、免疫刺激作用は観察された。^３Ｈ−
チミジン−結合試験において、Ｐ_２の顆粒球試験では不
活性であるアルカロイドのミトラフィリンとの混合物
は、Ｐ_２を活性アルカロイドと混合したものより低毒素
であることは興味深い。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】免疫系刺激剤の成分としての式Ｃ_２１Ｈ
_２４Ｏ_４Ｎ_２を有するイソプテロポジン、プテロポジ
ン、イソミトラフイリンおよびミトラフイリンからなる
群から選んだオキシインドールアルカロイド。
【請求項２】少なくとも１つがアロー異性体であること
を特徴とする請求項１に記載のオキシインドールアルカ
ロイド。
【請求項３】免疫系刺激剤が塩酸の附加塩の形のオキシ
インドールアルカロイドの１０^−３％〜１０^−６％の濃
度の水溶液であることを特徴とする請求項１に記載のオ
キシインドールアルカロイド。
【請求項４】免疫系刺激剤が少なくとも１種以下のオキ
シインドールアルカロイドを含有することを特徴とする
請求項１に記載のオキシインドールアルカロイド。アローイソプテロポジン、以下の式を有する異性体Ａアロープテロポジン、以下の式を有する異性体Ｂノルマル−イソミトラフイリン、以下の式を有する異性
体Ａノルマル−ミトラフイリン、以下の式を有する異性体Ｂ
【請求項５】免疫系刺激剤が、少なくとも１つのアルカ
ロイド−カテキン複合体を含有することを特徴とする請
求項１に記載のオキシインドールアルカロイド。
【請求項６】免疫系刺激剤が、水溶性カテキン抽出物１
０容量部と水溶性オキシインドールアルカロイド溶液１
０容量部との混合物であることを特徴とする請求項１に
記載のオキシインドールアルカロイド。