JPH067129B2 - 光信号の比率による試料中の分析対象物の濃度測定法 - Google Patents
光信号の比率による試料中の分析対象物の濃度測定法Info
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- JPH067129B2 JPH067129B2 JP62210024A JP21002487A JPH067129B2 JP H067129 B2 JPH067129 B2 JP H067129B2 JP 62210024 A JP62210024 A JP 62210024A JP 21002487 A JP21002487 A JP 21002487A JP H067129 B2 JPH067129 B2 JP H067129B2
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Description
【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は試料中の分析対象物を検出する方法に関し、更
に特定すると間接的比色検出によって分析対象物の濃度
を測定するために酵素免疫検定を用いる方法に関する。
に特定すると間接的比色検出によって分析対象物の濃度
を測定するために酵素免疫検定を用いる方法に関する。
［従来技術］ 分析対象物の比色的検出のための検定はよく知られてい
る。特に酵素免疫法（ＥＩＡ）および酵素結合免疫吸着
法（ＥＬＩＳＡ）が試験試料中に存在する抗原（分析対
象物）の比色検出に用いられる。これらの酵素免疫検定
方法では、試験抗原または分析対象物に特異的な抗体を
通常透明なプラスチック試験管である固体相に結合す
る。これらの酵素免疫法の多く（全てではない）では、
固体相抗体、抗原および固体相に結合した酵素標識抗体
の量が試料中の抗原濃度に直接比例するような酵素標識
抗体との間にサンドイッチ形成が起こる。過剰の未反応
試薬を通常試験管から洗浄し、気質を添加して酵素反応
を起こさせる。
る。特に酵素免疫法（ＥＩＡ）および酵素結合免疫吸着
法（ＥＬＩＳＡ）が試験試料中に存在する抗原（分析対
象物）の比色検出に用いられる。これらの酵素免疫検定
方法では、試験抗原または分析対象物に特異的な抗体を
通常透明なプラスチック試験管である固体相に結合す
る。これらの酵素免疫法の多く（全てではない）では、
固体相抗体、抗原および固体相に結合した酵素標識抗体
の量が試料中の抗原濃度に直接比例するような酵素標識
抗体との間にサンドイッチ形成が起こる。過剰の未反応
試薬を通常試験管から洗浄し、気質を添加して酵素反応
を起こさせる。
タンパク質抗原で典型的に起こるサンドイッチ形成に加
えて、競合法を実施することが可能である。限定量の抗
体を固体相上に乗せ、試料および酵素標識ハプテンを同
時にインキュベートする。分析対象物が試料中に存在し
ない時は酵素標識ハプテンの固体相への結合が最大にな
る。試料中の分析対象物の量が増加すると、固体相との
結合が酵素標識ハプテンと競合して、酵素標識ハプテン
結合量は分析対象物濃度と反比例する。競合法はハプテ
ンおよびタンパク質分析対象物の両方に実施され得る
が、サンドイッチ型検定ではタンパク質タイプの分析対
象物のみが可能である。
えて、競合法を実施することが可能である。限定量の抗
体を固体相上に乗せ、試料および酵素標識ハプテンを同
時にインキュベートする。分析対象物が試料中に存在し
ない時は酵素標識ハプテンの固体相への結合が最大にな
る。試料中の分析対象物の量が増加すると、固体相との
結合が酵素標識ハプテンと競合して、酵素標識ハプテン
結合量は分析対象物濃度と反比例する。競合法はハプテ
ンおよびタンパク質分析対象物の両方に実施され得る
が、サンドイッチ型検定ではタンパク質タイプの分析対
象物のみが可能である。
比色検定技法では、基質として酵素に反応して活性化さ
れる発色物質を含み得る。その結果検出される試験管内
の液性溶液中で十分な色が生成する。この性質の測定は
分光光度計の使用により試験管内の色の生成を測定する
ことによって完了することがしばしばある。検出される
物質として蛍光発色団を用いる場合には、蛍光光度計と
ともに蛍光顕微鏡が以前には測定方法として用いられ
た。抗体の比色検定に色原体としてテトラメチルベンジ
ジン（ＴＭＢ）を用いる酵素標識法は米国特許第4,503,
143号に記述されている。
れる発色物質を含み得る。その結果検出される試験管内
の液性溶液中で十分な色が生成する。この性質の測定は
分光光度計の使用により試験管内の色の生成を測定する
ことによって完了することがしばしばある。検出される
物質として蛍光発色団を用いる場合には、蛍光光度計と
ともに蛍光顕微鏡が以前には測定方法として用いられ
た。抗体の比色検定に色原体としてテトラメチルベンジ
ジン（ＴＭＢ）を用いる酵素標識法は米国特許第4,503,
143号に記述されている。
［発明が解決しようとする問題点］ 試料中の分析対象物の比色検定に分光光度計を用いる場
合、発色反応に伴なう光の検出に影響し得る要素が多数
ある。例えば、調べる試料を含む試験管に入射光ビーム
を与えるための光源は、しばしば例えば米国特許第4,51
6,856号に記述されているようなタングステンランプの
ようなランプである。分光光度計に検出される光または
蛍光発光の検出のために光電増倍管に集められた光に影
響し得るランプ出力に変動が生じるのはまれではない。
調べる試料を含む試験管の位置取りは試験の度ごとに違
うことがあり、試験結果に影響し得る。試験管の光通過
距離および光学的性質のような他の要素も各試験試料に
差を生じて測定結果に影響し得る。比色検定方法におけ
る前述の変動を校正したり除去する技術としてはこれら
の試験方法の精度、再現性および信頼性の改良が最も望
ましい。
合、発色反応に伴なう光の検出に影響し得る要素が多数
ある。例えば、調べる試料を含む試験管に入射光ビーム
を与えるための光源は、しばしば例えば米国特許第4,51
6,856号に記述されているようなタングステンランプの
ようなランプである。分光光度計に検出される光または
蛍光発光の検出のために光電増倍管に集められた光に影
響し得るランプ出力に変動が生じるのはまれではない。
調べる試料を含む試験管の位置取りは試験の度ごとに違
うことがあり、試験結果に影響し得る。試験管の光通過
距離および光学的性質のような他の要素も各試験試料に
差を生じて測定結果に影響し得る。比色検定方法におけ
る前述の変動を校正したり除去する技術としてはこれら
の試験方法の精度、再現性および信頼性の改良が最も望
ましい。
蛍光測定における改良は米国特許第4,495,293号に記述
されている。しかし、その特許の目的はリガンドの濃度
に関連して発光する光の蛍光強度における改良を提供す
ることである。免疫比濁法による巨大分子の測定のため
の他の技法がデグリラ（De Grella）らによりクリニカ
ルケミストリー(Clin.Chem.)31/9,1474-1477(1985)の
「アネフェロメトリーシステムフォーザアボットTD
X TM(A Nephelometry System for the AbbottTDX TM)」に
記載されている。発色反応を測定するための比濁法はこ
の論文に記述されており、その方法は血清タンパク質を
測定するために散乱エネルギーの減衰を頼みにしてい
る。しかしデグリラらの論文には前述のように測定に影
響する変動の校正に役立つであろう教示も示唆もない。
されている。しかし、その特許の目的はリガンドの濃度
に関連して発光する光の蛍光強度における改良を提供す
ることである。免疫比濁法による巨大分子の測定のため
の他の技法がデグリラ（De Grella）らによりクリニカ
ルケミストリー(Clin.Chem.)31/9,1474-1477(1985)の
「アネフェロメトリーシステムフォーザアボットTD
X TM(A Nephelometry System for the AbbottTDX TM)」に
記載されている。発色反応を測定するための比濁法はこ
の論文に記述されており、その方法は血清タンパク質を
測定するために散乱エネルギーの減衰を頼みにしてい
る。しかしデグリラらの論文には前述のように測定に影
響する変動の校正に役立つであろう教示も示唆もない。
従って、注目している分析対象物の比色検定を頼りにし
ている測定では、いまだに改良が求められている。本発
明はこのような改良を目差すものである。
ている測定では、いまだに改良が求められている。本発
明はこのような改良を目差すものである。
［問題点を解決するための手段］ 試料中の分析対象物の検出のための本発明の方法は、注
目の分析対象物を含む液性懸濁液または溶液に多波長の
入射光ビームをあてることを特徴とする。この液体は試
料中に存在する分析対象物の濃度の増加に比例して、第
１波長での光量を減衰させることができる。更に本方法
は第１波長、および分析対象物濃度の増加で実質的に光
の減衰が起こらない第２波長、に関連した液体からの光
信号を検出することを特徴とする。その２つのそれぞれ
の波長の比率を求める。次にこの比率が既知量の分析対
象物の比率と比較して試料中の分析対象物の量を決定す
る。
目の分析対象物を含む液性懸濁液または溶液に多波長の
入射光ビームをあてることを特徴とする。この液体は試
料中に存在する分析対象物の濃度の増加に比例して、第
１波長での光量を減衰させることができる。更に本方法
は第１波長、および分析対象物濃度の増加で実質的に光
の減衰が起こらない第２波長、に関連した液体からの光
信号を検出することを特徴とする。その２つのそれぞれ
の波長の比率を求める。次にこの比率が既知量の分析対
象物の比率と比較して試料中の分析対象物の量を決定す
る。
本発明の一つの実施態様は、間接比色検定により試料中
の分析対象物の濃度の測定に酵素免疫法を用いる方法で
あり、光散乱減衰を利用する。本方法は酵素標識結合
体、分析対象物を調べる試料、および固体支持体に結合
した抗体を混合し、その分析対象物を結合抗体および酵
素標識結合体に結合させて、固体相中に免疫学的複合体
を形成することを特徴とする。更に本方法は酵素に反応
する発色物質を含む液性溶液を免疫学的複合体と混合し
て、発色物質を活性化する反応を起こさせることを含
む。発色物質の吸収極大またはその付近で光散乱減衰を
起こし得る粒子をその混合物に添加して安定な懸濁液を
作製する。本方法は更にその懸濁液に多波長の入射光を
あてることを含む。入射光の第１波長は発色物質によっ
て最大に吸収される波長と実質的に同一である。発色物
質はその濃度が増加した時に極大波長における光の増加
量を吸収することができる。入射光ビームの第２波長は
発色物質によって最大に吸収される波長とはスペクトル
的に離れている。第１および第２波長において懸濁液に
よって散乱される光を検出し、その２つのそれぞれの波
長の比率を求める。本方法の次の工程はその比率の数量
と、それ以前の工程を既知濃度の分析対象物を含む試料
で実施した時の光散乱検出による比率の数量と比較し
て、試料中の分析対象物の濃度を測定することである。
の分析対象物の濃度の測定に酵素免疫法を用いる方法で
あり、光散乱減衰を利用する。本方法は酵素標識結合
体、分析対象物を調べる試料、および固体支持体に結合
した抗体を混合し、その分析対象物を結合抗体および酵
素標識結合体に結合させて、固体相中に免疫学的複合体
を形成することを特徴とする。更に本方法は酵素に反応
する発色物質を含む液性溶液を免疫学的複合体と混合し
て、発色物質を活性化する反応を起こさせることを含
む。発色物質の吸収極大またはその付近で光散乱減衰を
起こし得る粒子をその混合物に添加して安定な懸濁液を
作製する。本方法は更にその懸濁液に多波長の入射光を
あてることを含む。入射光の第１波長は発色物質によっ
て最大に吸収される波長と実質的に同一である。発色物
質はその濃度が増加した時に極大波長における光の増加
量を吸収することができる。入射光ビームの第２波長は
発色物質によって最大に吸収される波長とはスペクトル
的に離れている。第１および第２波長において懸濁液に
よって散乱される光を検出し、その２つのそれぞれの波
長の比率を求める。本方法の次の工程はその比率の数量
と、それ以前の工程を既知濃度の分析対象物を含む試料
で実施した時の光散乱検出による比率の数量と比較し
て、試料中の分析対象物の濃度を測定することである。
本発明のもう一つの実施態様は間接的比色検定（蛍光減
衰を利用する）によって試料中の分析対象物の濃度の測
定に酵素免疫法を用いる方法である。本方法では、酵素
標識抗体結合体を分析対象物を調べる試料および固体相
に結合した抗体と混合して、その分析対象物を結合した
抗体および結合体に結合させて固体相中で免疫学的複合
体を形成する。本方法は酵素に反応する発色物質を含む
液性溶液を免疫学的複合体と混合して発色物質を活性化
する反応を起こすことを含む。試料中に存在する分析対
象物の濃度の増加に機能するような活性化発色物質の吸
収極大またはその付近で蛍光の減衰を起こすための第１
蛍光団をこの混合物に添加する。この混合物に更に分析
対象物の濃度が増加してもその蛍光の減衰を実質的に起
こさない第２蛍光団を添加する。入射光を試験管を通し
て、その溶液に多波長であてる。これらの波長の光は活
性化発色物質の吸収極大またはその付近の波長を含み、
第１および第２蛍光団の励起を起こす波長を含む。溶液
中の蛍光団によって発光される蛍光を検出する。本方法
は２つの蛍光波長の比率を求めることを含む。求めた比
率の数量を以前の工程を既知濃度の分析対象物を含む試
料で実施した時の蛍光検出による比率の数量と比較し
て、試料の分析対象物の濃度を測定する。
衰を利用する）によって試料中の分析対象物の濃度の測
定に酵素免疫法を用いる方法である。本方法では、酵素
標識抗体結合体を分析対象物を調べる試料および固体相
に結合した抗体と混合して、その分析対象物を結合した
抗体および結合体に結合させて固体相中で免疫学的複合
体を形成する。本方法は酵素に反応する発色物質を含む
液性溶液を免疫学的複合体と混合して発色物質を活性化
する反応を起こすことを含む。試料中に存在する分析対
象物の濃度の増加に機能するような活性化発色物質の吸
収極大またはその付近で蛍光の減衰を起こすための第１
蛍光団をこの混合物に添加する。この混合物に更に分析
対象物の濃度が増加してもその蛍光の減衰を実質的に起
こさない第２蛍光団を添加する。入射光を試験管を通し
て、その溶液に多波長であてる。これらの波長の光は活
性化発色物質の吸収極大またはその付近の波長を含み、
第１および第２蛍光団の励起を起こす波長を含む。溶液
中の蛍光団によって発光される蛍光を検出する。本方法
は２つの蛍光波長の比率を求めることを含む。求めた比
率の数量を以前の工程を既知濃度の分析対象物を含む試
料で実施した時の蛍光検出による比率の数量と比較し
て、試料の分析対象物の濃度を測定する。
本発明の原理によれば、比色検定は光散乱または蛍光信
号の収集のような間接的技法を用いて達成される。光の
比率の検討は酵素免疫法のような検定中に生成する色の
量を間接的に測定する方式で行なう。更に光信号の比率
（その比率の一方の信号は記録信号であり、他方は対照
信号である）を用いて、ランプ出力の変動、試験管位置
直径、または光学的性質の変化のような変数を除去する
ための補正機構を行なう。更に、光散乱減衰を利用する
場合、上述の比率は光の検出目的のために混合物に添加
される粒子状物質の濃度による差異をも克服する。上述
の混合物に粒子状物質を添加するもう一つの利点は粒子
が光散乱または他の光信号能力が温度に敏感でない安定
な懸濁液の形成に選択され得ることである。
号の収集のような間接的技法を用いて達成される。光の
比率の検討は酵素免疫法のような検定中に生成する色の
量を間接的に測定する方式で行なう。更に光信号の比率
（その比率の一方の信号は記録信号であり、他方は対照
信号である）を用いて、ランプ出力の変動、試験管位置
直径、または光学的性質の変化のような変数を除去する
ための補正機構を行なう。更に、光散乱減衰を利用する
場合、上述の比率は光の検出目的のために混合物に添加
される粒子状物質の濃度による差異をも克服する。上述
の混合物に粒子状物質を添加するもう一つの利点は粒子
が光散乱または他の光信号能力が温度に敏感でない安定
な懸濁液の形成に選択され得ることである。
従って本発明は光信号（好適なのは光散乱または蛍光）
の減衰の程度を測定することによって分析対象物の濃度
を間接的に比色定量することを可能にする。上述のよう
な問題となる変動を抑制することに加えて、本発明に使
用される好適な発色物質が低濃度で光散乱や蛍光の具合
に影響を及ぼすので、本発明の好適な方法は分析対象物
の感度の良い検出を可能にする。本発明の他の利点や特
色は以下の詳細な説明から、より明らかになるであろ
う。
の減衰の程度を測定することによって分析対象物の濃度
を間接的に比色定量することを可能にする。上述のよう
な問題となる変動を抑制することに加えて、本発明に使
用される好適な発色物質が低濃度で光散乱や蛍光の具合
に影響を及ぼすので、本発明の好適な方法は分析対象物
の感度の良い検出を可能にする。本発明の他の利点や特
色は以下の詳細な説明から、より明らかになるであろ
う。
第１図は酸化テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）の濃度
に対する３波長における光散乱の測定を表わしたグラフ
であり； 第２図は本発明原理に従って、酸化テトラメチルベンジ
ジン（ＴＭＢ）の濃度に対して、測定された異なる波長
の光散乱の２種類の比率を表わしたグラフであり； 第３図は酵素免疫法に本発明原理を用いて、ヒト絨毛性
ゴナドトロピン（ｈＣＧ）の濃度に対して、測定された
光散乱の比率を表わしたグラフであり； 第４図は酵素免疫法に本発明原理を用いて、ヒト黄体形
成ホルモン（ｈＬＨ）の濃度に対して、測定された光散
乱の比率を表わしたグラフであり； 第５図は酵素免疫法に本発明原理を用いて、ヒト絨毛性
ゴナドトロピン（ｈＣＧ）の濃度に対して、測定された
蛍光信号の比率を表わしたグラフであり； 第６図は酵素免疫法に本発明原理を用いて、ヒト甲状腺
刺戟ホルモン（ｈＴＳＨ）の濃度に対して、測定された
蛍光信号の比率を表わしたグラフであり；そして 第７図は競合型の酵素免疫法に本発明原理を用いて、チ
ロキシン（Ｔ４）の濃度に対して、測定された蛍光信号
の比率である。
に対する３波長における光散乱の測定を表わしたグラフ
であり； 第２図は本発明原理に従って、酸化テトラメチルベンジ
ジン（ＴＭＢ）の濃度に対して、測定された異なる波長
の光散乱の２種類の比率を表わしたグラフであり； 第３図は酵素免疫法に本発明原理を用いて、ヒト絨毛性
ゴナドトロピン（ｈＣＧ）の濃度に対して、測定された
光散乱の比率を表わしたグラフであり； 第４図は酵素免疫法に本発明原理を用いて、ヒト黄体形
成ホルモン（ｈＬＨ）の濃度に対して、測定された光散
乱の比率を表わしたグラフであり； 第５図は酵素免疫法に本発明原理を用いて、ヒト絨毛性
ゴナドトロピン（ｈＣＧ）の濃度に対して、測定された
蛍光信号の比率を表わしたグラフであり； 第６図は酵素免疫法に本発明原理を用いて、ヒト甲状腺
刺戟ホルモン（ｈＴＳＨ）の濃度に対して、測定された
蛍光信号の比率を表わしたグラフであり；そして 第７図は競合型の酵素免疫法に本発明原理を用いて、チ
ロキシン（Ｔ４）の濃度に対して、測定された蛍光信号
の比率である。
本発明は多種類の実施態様（図面に示す）で達成され、
本明細書中に発明の好適な実施態様を記述するが、本開
示は発明の原理の典型として考えるべきであり、例示さ
れた実施態様に発明を限定するつもりではない。発明の
範囲は添付された請求の範囲およびその相当語句によっ
て判断されるであろう。
本明細書中に発明の好適な実施態様を記述するが、本開
示は発明の原理の典型として考えるべきであり、例示さ
れた実施態様に発明を限定するつもりではない。発明の
範囲は添付された請求の範囲およびその相当語句によっ
て判断されるであろう。
本発明の本質は抗原および抗体を含む分析対象物の比色
検定に発色物質を用いる好適な酵素免疫法の改良を供給
するものである。しかしながら本発明によって提供され
る改良は前述のように試料中の分析対象物の濃度を決定
するために測定によって生ずる色を間接的に判定する技
法に関する。
検定に発色物質を用いる好適な酵素免疫法の改良を供給
するものである。しかしながら本発明によって提供され
る改良は前述のように試料中の分析対象物の濃度を決定
するために測定によって生ずる色を間接的に判定する技
法に関する。
分光光度計などの使用による色の形成の直接測定にたよ
るよりもむしろ、本方法は試料中に存在する分析対象物
の量の決定に蛍光や光散乱を用い、吸収のような他の光
信号も本発明の間接的比色定量技法で検出され得ると理
解される。測定される液体試料によって散乱される光や
発光される蛍光の程度が酵素免疫法に用いられる発色物
質の濃度の作用として減衰され得ることが確認されてい
る。このような減衰は入射光の波長が発色物質によって
最大に吸収される波長と同じかまたは実質的に同じかそ
の付近である時に起こる。従って発色物質の濃度が増加
すると、入射光吸収量は増加するが光散乱や蛍光の程度
は減少する。
るよりもむしろ、本方法は試料中に存在する分析対象物
の量の決定に蛍光や光散乱を用い、吸収のような他の光
信号も本発明の間接的比色定量技法で検出され得ると理
解される。測定される液体試料によって散乱される光や
発光される蛍光の程度が酵素免疫法に用いられる発色物
質の濃度の作用として減衰され得ることが確認されてい
る。このような減衰は入射光の波長が発色物質によって
最大に吸収される波長と同じかまたは実質的に同じかそ
の付近である時に起こる。従って発色物質の濃度が増加
すると、入射光吸収量は増加するが光散乱や蛍光の程度
は減少する。
本発明に有効な典型的発色物質の１つの過酸化水素中の
テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）である。酵素免疫法
（酵素はペルオキシダーゼが好適である）にＴＭＢを基
質として用いる時には、酵素は補助基質（過酸化水素）
の存在下、ＴＭＢを酸化型に変える。中性のpHでは、酸
化ＴＭＢはスペクトルの可視部に２つの主要な吸収極大
を示す。一方の吸収極大は約450nmに中心があり、他方
の極大は大体655nmである。強い悲酸化酸で酸性にする
と655nmの吸収は消失するが450nmのバンドは高い吸光係
数で残留する〔E.S.ボス(Bos)らによりジャーナルオブ
イムノアッセイ（Journalof Immunoassay）２，187(198
1)に記載されたテトラメチルベンジジン アズ アン
エイムステストネガティブ クロモゲン フォー ホー
ス‐ラディッシュ ペルオキシダーゼ インエンザイム
イムノアッセイ(3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine
as an Ames Test Negative Chromogen for Horse-Radis
hPeroxidase in Enzyme Immunoassay)を参照せよ〕。
テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）である。酵素免疫法
（酵素はペルオキシダーゼが好適である）にＴＭＢを基
質として用いる時には、酵素は補助基質（過酸化水素）
の存在下、ＴＭＢを酸化型に変える。中性のpHでは、酸
化ＴＭＢはスペクトルの可視部に２つの主要な吸収極大
を示す。一方の吸収極大は約450nmに中心があり、他方
の極大は大体655nmである。強い悲酸化酸で酸性にする
と655nmの吸収は消失するが450nmのバンドは高い吸光係
数で残留する〔E.S.ボス(Bos)らによりジャーナルオブ
イムノアッセイ（Journalof Immunoassay）２，187(198
1)に記載されたテトラメチルベンジジン アズ アン
エイムステストネガティブ クロモゲン フォー ホー
ス‐ラディッシュ ペルオキシダーゼ インエンザイム
イムノアッセイ(3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine
as an Ames Test Negative Chromogen for Horse-Radis
hPeroxidase in Enzyme Immunoassay)を参照せよ〕。
本発明の観点によると、ＴＭＢのような発色物質によっ
て生ずる色を測定する代りに光散乱のような光信号を検
出する。熱分解法シリカ（fumedsilica）粒子やポリス
チレン微粒子のような光散乱源を酸化ＴＭＢに添加する
と、450nmで測定すると存在する酸化ＴＭＢの量に対し
て光散乱の減衰、すなわち測定試料中の分析対象物濃度
の間接的測定が行なえる。酸化ＴＭＢの濃度に関して45
0nmで測定した光散乱の減衰を図１に示す。450nmでの光
散乱の減衰は発光物質の吸収特性に関連する。特に酸化
ＴＭＢ濃度が増加すると、光吸収量は増加し、入射光波
長が酸化ＴＭＢの極大吸収波長と同じすなわち450nmの
時には光散乱量は減少する。他方ＴＭＢの極大吸収波長
からはスペクトル的に離れた２波長で測定した光散乱は
示された濃度範囲では減衰しないことを第１図は示して
いる。実際、560nmおよび660nmでの光散乱検出がその濃
度範囲では実質的に一定のままである時は、（その大き
さが光吸収物質の濃度に依らないので）その２波長での
光散乱を内部対照波長として使用し得る。従って発色物
質の極大吸収波長で測定した光散乱とその極大吸収波長
からスペクトル的に離れた他の波長で発色物質の濃度に
依存しないものとから比率を求めることができる。
て生ずる色を測定する代りに光散乱のような光信号を検
出する。熱分解法シリカ（fumedsilica）粒子やポリス
チレン微粒子のような光散乱源を酸化ＴＭＢに添加する
と、450nmで測定すると存在する酸化ＴＭＢの量に対し
て光散乱の減衰、すなわち測定試料中の分析対象物濃度
の間接的測定が行なえる。酸化ＴＭＢの濃度に関して45
0nmで測定した光散乱の減衰を図１に示す。450nmでの光
散乱の減衰は発光物質の吸収特性に関連する。特に酸化
ＴＭＢ濃度が増加すると、光吸収量は増加し、入射光波
長が酸化ＴＭＢの極大吸収波長と同じすなわち450nmの
時には光散乱量は減少する。他方ＴＭＢの極大吸収波長
からはスペクトル的に離れた２波長で測定した光散乱は
示された濃度範囲では減衰しないことを第１図は示して
いる。実際、560nmおよび660nmでの光散乱検出がその濃
度範囲では実質的に一定のままである時は、（その大き
さが光吸収物質の濃度に依らないので）その２波長での
光散乱を内部対照波長として使用し得る。従って発色物
質の極大吸収波長で測定した光散乱とその極大吸収波長
からスペクトル的に離れた他の波長で発色物質の濃度に
依存しないものとから比率を求めることができる。
酸化ＴＭＢの濃度に関して決定したこれらの光散乱比率
を第２図に示す。
を第２図に示す。
第２図には２つの比率（一方は450nm/560nmで他方は450
nm/660nm）の測定を示している。これらの比率は両方と
も第１図に示された酸化ＴＭＢの減衰曲線を追ってい
る。しかし第２図は450nm/560nm比率の方が450nm/660nm
比率よりもいくらか正確であることを示している。一方
の波長が発色物質の濃度に依存しないもので比率を求め
るために560nmおよび660nm以外の波長で光散乱を測定で
きることが理解される。第２図に示すようにこのような
波長で光散乱の比率を求めることによって、光路の長
さ、試験管の光学的性質、管の位置取り、ランプ出力の
変化の差異や試料に添加された光散乱源の濃度の差異さ
えも取り消す内部補正が検出システムに供給される。
nm/660nm）の測定を示している。これらの比率は両方と
も第１図に示された酸化ＴＭＢの減衰曲線を追ってい
る。しかし第２図は450nm/560nm比率の方が450nm/660nm
比率よりもいくらか正確であることを示している。一方
の波長が発色物質の濃度に依存しないもので比率を求め
るために560nmおよび660nm以外の波長で光散乱を測定で
きることが理解される。第２図に示すようにこのような
波長で光散乱の比率を求めることによって、光路の長
さ、試験管の光学的性質、管の位置取り、ランプ出力の
変化の差異や試料に添加された光散乱源の濃度の差異さ
えも取り消す内部補正が検出システムに供給される。
試料中の分析対象物の検出のためのもう一つの間接的比
色定量法は２種類の発色団の使用を伴なう。ＴＭＢのよ
うな発色物質を含む液性溶液の光散乱特性を測定する代
りに蛍光を測定する。蛍光団の一方は記録信号として、
他方は対照信号として働く。
色定量法は２種類の発色団の使用を伴なう。ＴＭＢのよ
うな発色物質を含む液性溶液の光散乱特性を測定する代
りに蛍光を測定する。蛍光団の一方は記録信号として、
他方は対照信号として働く。
この方法に使用される蛍光団はその励起および発光のそ
れぞれの波長が互いに実質上スペクトル的に離れるよう
に選択される。この特徴に留意して、記録用として働く
蛍光団はその励起または発光の波長が発色物質の吸収極
大であるかまたは大体その付近であるように選択され
る。例えば、上で指摘したように、酸化ＴＭＢの吸収極
大は450nmである。もし蛍光団の励起または発光のいず
れかの波長が酸化ＴＭＢによって極大吸収される波長と
同じかまたは大体その付近の波長であるならば、蛍光の
程度は酸化ＴＭＢのような発色物質の濃度に伴なって減
衰すると決定されている。発色物質の濃度が増加すると
入射吸収量は増加するが、蛍光の程度は減少する。
れぞれの波長が互いに実質上スペクトル的に離れるよう
に選択される。この特徴に留意して、記録用として働く
蛍光団はその励起または発光の波長が発色物質の吸収極
大であるかまたは大体その付近であるように選択され
る。例えば、上で指摘したように、酸化ＴＭＢの吸収極
大は450nmである。もし蛍光団の励起または発光のいず
れかの波長が酸化ＴＭＢによって極大吸収される波長と
同じかまたは大体その付近の波長であるならば、蛍光の
程度は酸化ＴＭＢのような発色物質の濃度に伴なって減
衰すると決定されている。発色物質の濃度が増加すると
入射吸収量は増加するが、蛍光の程度は減少する。
他方、第２蛍光団は励起または発光の波長が発色物質の
吸収極大で代表される波長からスペクトル的に離れるよ
うに選択される。発色物質の吸収スペクトルと重ならな
いスペクトル範囲内で、第２または対照蛍光によって発
光される蛍光の測定は吸収種の濃度に依存しない。発色
物質の極大吸収波長または大体その付近で記録蛍光団の
蛍光と発色物質の吸収スペクトルからスペクトル的に離
れた範囲における対照蛍光団の蛍光との比率を調べるこ
とによって、酵素免疫法で生成する色の量を間接的に測
定する測定技術が供給される。
吸収極大で代表される波長からスペクトル的に離れるよ
うに選択される。発色物質の吸収スペクトルと重ならな
いスペクトル範囲内で、第２または対照蛍光によって発
光される蛍光の測定は吸収種の濃度に依存しない。発色
物質の極大吸収波長または大体その付近で記録蛍光団の
蛍光と発色物質の吸収スペクトルからスペクトル的に離
れた範囲における対照蛍光団の蛍光との比率を調べるこ
とによって、酵素免疫法で生成する色の量を間接的に測
定する測定技術が供給される。
蛍光信号の比率（一方の蛍光は記録であり、他方の蛍光
は対照である）での信頼性が試料中の分析対象物の間接
的比色定量検定のための上述の光散乱比率と同様の有利
な特徴を与える。
は対照である）での信頼性が試料中の分析対象物の間接
的比色定量検定のための上述の光散乱比率と同様の有利
な特徴を与える。
蛍光比率技法を実施する時、好適な発色物質はＴＭＢで
あり、これは酸化されると大体450nmに吸収極大を持
つ。酸化ＴＭＢの吸収極大と同じかまたはその付近に励
起または発光波長を持つ蛍光団は多数利用できる。例え
ばクマリン343、９−アミノアクリジン塩酸塩および８
−メトキシピレン−1,3,6−トリスルホン酸（ＭＰＴ）
は記録蛍光団として良い候補であり、そのうちＭＰＴが
好適である。ＭＰＴは約395nmで励起して、約430nmに発
光ピークがある。これらの波長は酸化ＴＭＢの450nmの
吸収極大に比較的近い。
あり、これは酸化されると大体450nmに吸収極大を持
つ。酸化ＴＭＢの吸収極大と同じかまたはその付近に励
起または発光波長を持つ蛍光団は多数利用できる。例え
ばクマリン343、９−アミノアクリジン塩酸塩および８
−メトキシピレン−1,3,6−トリスルホン酸（ＭＰＴ）
は記録蛍光団として良い候補であり、そのうちＭＰＴが
好適である。ＭＰＴは約395nmで励起して、約430nmに発
光ピークがある。これらの波長は酸化ＴＭＢの450nmの
吸収極大に比較的近い。
対照蛍光団としてオキサジン170過塩素酸塩およびより
好適なスルホロ‐ダミン101（ＳＲ101）を含む異なった
蛍光団を選択することもできる。ＳＲ101は589nmで励起
し、約605nmに発光ピークを示す。従ってＳＲ101の励起
および発光波長はＭＰＴのような記録蛍光団の励起およ
び発光波長とともに酸化ＴＭＢの吸収極大波長からも実
質上スペクトル的に分離または遠いことがわかる。この
スペクトルの分離により吸収種の濃度に依存しない蛍光
信号の検出が可能となる。
好適なスルホロ‐ダミン101（ＳＲ101）を含む異なった
蛍光団を選択することもできる。ＳＲ101は589nmで励起
し、約605nmに発光ピークを示す。従ってＳＲ101の励起
および発光波長はＭＰＴのような記録蛍光団の励起およ
び発光波長とともに酸化ＴＭＢの吸収極大波長からも実
質上スペクトル的に分離または遠いことがわかる。この
スペクトルの分離により吸収種の濃度に依存しない蛍光
信号の検出が可能となる。
更に、対照蛍光団に関しては、ＴＭＢのような発色物質
の種々の濃度に相対して信号が減衰しないまたは実質的
に減衰しないように選択すべきである。これに関して、
対照蛍光団は試験管の位置、直径または光学的性質を含
めた多数の要素を補正する内部対照システムとして働
く。それ故それぞれの記録および対照蛍光団の選択で
は、記録蛍光団はその吸収極大またはその付近で発色物
質の濃度にともなって蛍光の程度が減衰し、一方対照蛍
光団の蛍光の程度は発色物質に対して比較的一定のまま
であるべきである。ＳＲ101のような蛍光団は発色物質
に対して蛍光の程度が停止剤の添加後２分以内のような
短時間の間、全く一定のままである限り、対照蛍光団と
して働き得ることに注目すべきである。
の種々の濃度に相対して信号が減衰しないまたは実質的
に減衰しないように選択すべきである。これに関して、
対照蛍光団は試験管の位置、直径または光学的性質を含
めた多数の要素を補正する内部対照システムとして働
く。それ故それぞれの記録および対照蛍光団の選択で
は、記録蛍光団はその吸収極大またはその付近で発色物
質の濃度にともなって蛍光の程度が減衰し、一方対照蛍
光団の蛍光の程度は発色物質に対して比較的一定のまま
であるべきである。ＳＲ101のような蛍光団は発色物質
に対して蛍光の程度が停止剤の添加後２分以内のような
短時間の間、全く一定のままである限り、対照蛍光団と
して働き得ることに注目すべきである。
多数の分析対象物のための酵素免疫法が本発明間接的比
色定量検定法に選択された方法である。例えば、ヒト絨
毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）は女性の妊娠検査で測定
され；黄体形成ホルモン（ｈＬＨ）は女性の受精能検査
で測定され；甲状腺刺激ホルモン；チロキシン；および
ある種の細菌や微生物の検査の測定も酵素免疫法および
比色検出法を用いて実施される。しかし本発明は上述の
分析対象物の検出に限定される訳ではない、というのは
これらの分析対象物は本発明の間接的光検出法を用いて
測定できる多種類の分析対象物の単なる類例である。
色定量検定法に選択された方法である。例えば、ヒト絨
毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）は女性の妊娠検査で測定
され；黄体形成ホルモン（ｈＬＨ）は女性の受精能検査
で測定され；甲状腺刺激ホルモン；チロキシン；および
ある種の細菌や微生物の検査の測定も酵素免疫法および
比色検出法を用いて実施される。しかし本発明は上述の
分析対象物の検出に限定される訳ではない、というのは
これらの分析対象物は本発明の間接的光検出法を用いて
測定できる多種類の分析対象物の単なる類例である。
発色物質として過酸化水素中のＴＭＢの使用に加えて、
他の発色物質も本発明で使用できることは知られてい
る。上述のように本発明の技法は発色物質の極大吸収波
長またはその付近で光散乱または蛍光を測定し、その吸
収スペクトルからは離れた波長（注目の分析対象物の濃
度に依存しない）で対照をとることによって種々の酵素
または基質系に適用できる。従ってＴＭＢの他に、他の
代表的な発色物質としてはベンジジン、ｏ−フェニレン
ジアミン、ｏ−トルイジンおよびＡＢＴＳが挙げられ
る。米国特許第4,503,143号に記述されているような過
酸化水素中ＴＭＢの使用は本発明における使用に好適な
発色物質である。
他の発色物質も本発明で使用できることは知られてい
る。上述のように本発明の技法は発色物質の極大吸収波
長またはその付近で光散乱または蛍光を測定し、その吸
収スペクトルからは離れた波長（注目の分析対象物の濃
度に依存しない）で対照をとることによって種々の酵素
または基質系に適用できる。従ってＴＭＢの他に、他の
代表的な発色物質としてはベンジジン、ｏ−フェニレン
ジアミン、ｏ−トルイジンおよびＡＢＴＳが挙げられ
る。米国特許第4,503,143号に記述されているような過
酸化水素中ＴＭＢの使用は本発明における使用に好適な
発色物質である。
本明細書によって意図されたＥＩＡ法では、酵素は抗体
や抗原のような分析対象物を標識したり、発色反応を触
媒するのに用いられる。望ましい酵素は酸化還元酸素
で、特にカタラーゼやペルオキシダーゼほ含むヘム酵素
である。これらの酵素はそのヘム補欠分子族のため独自
の吸収スペクトルを持ち、その基質である過酸化水素と
混合するとそのスペクトルに一時的な変化を示す。ＴＭ
Ｂを触媒する特に望ましい酵素の一つは西洋ワサビペル
オキシダーゼである。
や抗原のような分析対象物を標識したり、発色反応を触
媒するのに用いられる。望ましい酵素は酸化還元酸素
で、特にカタラーゼやペルオキシダーゼほ含むヘム酵素
である。これらの酵素はそのヘム補欠分子族のため独自
の吸収スペクトルを持ち、その基質である過酸化水素と
混合するとそのスペクトルに一時的な変化を示す。ＴＭ
Ｂを触媒する特に望ましい酵素の一つは西洋ワサビペル
オキシダーゼである。
光散乱源として測定試料に添加される粒子に関しては、
多数の代替物が有効である。平均直径が0.010と0.014ミ
クロンの範囲内の微粒子は光がこれらの粒子にあたると
散乱効果が生ずるように光をあてた液性溶液中に含まれ
るのが好ましい。ポリスチレンまたは水の比重とほぼ同
じ比重を持つ他の物質からできた微粒子は、光散乱効果
を与えるための源として好適である。この微粒子は測定
をゆがめるような副発光性を実質上持たないことが望ま
しい。しかし最も好ましいのは、上述の大きさの範囲
で、熱分解法シリカでできた微粒子が本発明で最も満足
に実施することが知られている。熱分解法シリカをクエ
ン酸で希釈するとシリカ濃度が0.3％(W/V)までは直線的
な光散乱応答を生ずることは知られている。実際、異な
った試験管に添加される熱分解法、シリカの量は、比率
としての光散乱の測定がこのような差異を補正するの
で、光散乱の測定に影響することなく変更することがで
きる。
多数の代替物が有効である。平均直径が0.010と0.014ミ
クロンの範囲内の微粒子は光がこれらの粒子にあたると
散乱効果が生ずるように光をあてた液性溶液中に含まれ
るのが好ましい。ポリスチレンまたは水の比重とほぼ同
じ比重を持つ他の物質からできた微粒子は、光散乱効果
を与えるための源として好適である。この微粒子は測定
をゆがめるような副発光性を実質上持たないことが望ま
しい。しかし最も好ましいのは、上述の大きさの範囲
で、熱分解法シリカでできた微粒子が本発明で最も満足
に実施することが知られている。熱分解法シリカをクエ
ン酸で希釈するとシリカ濃度が0.3％(W/V)までは直線的
な光散乱応答を生ずることは知られている。実際、異な
った試験管に添加される熱分解法、シリカの量は、比率
としての光散乱の測定がこのような差異を補正するの
で、光散乱の測定に影響することなく変更することがで
きる。
よく知られた酵素免疫法の技法は以下のように実施され
る。例えば、典型的には澄んだまたは透明なプラスチッ
クで製造された試験管などの内側表面に注目の抗原や分
析対象物のための抗体を結合させる。１回以上の工程
で、酵素標識結合体および分析対象物を調べる液体試料
を試験管内で混合して、分析対象物を結合した抗体およ
び結合体と結合し固体相に免疫学的複合体を形成する。
この免疫学的複合体は固体相抗体、分析対象物、および
酵素標識抗体との間で生ずるサンドイッチ形成を表わ
し、固体相に結合した酵素標識抗体の量は試料中の分析
対象物濃度と直接比例する。通常の様式では未反応の試
薬を試験管から洗浄し、次に基質を添加して酵素反応を
開始させる。
る。例えば、典型的には澄んだまたは透明なプラスチッ
クで製造された試験管などの内側表面に注目の抗原や分
析対象物のための抗体を結合させる。１回以上の工程
で、酵素標識結合体および分析対象物を調べる液体試料
を試験管内で混合して、分析対象物を結合した抗体およ
び結合体と結合し固体相に免疫学的複合体を形成する。
この免疫学的複合体は固体相抗体、分析対象物、および
酵素標識抗体との間で生ずるサンドイッチ形成を表わ
し、固体相に結合した酵素標識抗体の量は試料中の分析
対象物濃度と直接比例する。通常の様式では未反応の試
薬を試験管から洗浄し、次に基質を添加して酵素反応を
開始させる。
以下の好適な実施態様では、酵素反応は過酸化水素およ
びＴＭＢの両方を試験管に添加し、それによってＴＭＢ
が活性化（酸化）されて所定の時間の後試験管内で色が
生成する。試験管内の酸化ＴＭＢの濃度は試料中の分析
対象物濃度に直接比例する。次に酸溶液を試験管に添加
して、酵素反応を終了させる。この型式の測定は分光光
度計または蛍光光度計を用いて光信号を測定して記録さ
れ得る。これらの色を検出する器械はよく知られてお
り、典型的には光源としてのランプ、試験管を保持する
ための足場または装置、光電増倍管および光を検出する
光学機器を含む。散乱光はいずれの方向でも検出できる
のであるから、器械内の光検出装置の位置は変更するこ
とができる。例えば蛍光光度計を用いるならば、蛍光は
入射光ビームに対して90°で検出される。本発明のもう
一つの観点に従って、蛍光光度計の光学は蛍光の代りに
光散乱を入射光ビームに対して90°で検出されるように
変更できる。分光光度計では、色は入射光ビームに対し
て前方向で測定される；これらの器械は前方向で色より
もむしろ散乱を検出するように変更し得る。光散乱も同
様に他の方向で検出できる。
びＴＭＢの両方を試験管に添加し、それによってＴＭＢ
が活性化（酸化）されて所定の時間の後試験管内で色が
生成する。試験管内の酸化ＴＭＢの濃度は試料中の分析
対象物濃度に直接比例する。次に酸溶液を試験管に添加
して、酵素反応を終了させる。この型式の測定は分光光
度計または蛍光光度計を用いて光信号を測定して記録さ
れ得る。これらの色を検出する器械はよく知られてお
り、典型的には光源としてのランプ、試験管を保持する
ための足場または装置、光電増倍管および光を検出する
光学機器を含む。散乱光はいずれの方向でも検出できる
のであるから、器械内の光検出装置の位置は変更するこ
とができる。例えば蛍光光度計を用いるならば、蛍光は
入射光ビームに対して90°で検出される。本発明のもう
一つの観点に従って、蛍光光度計の光学は蛍光の代りに
光散乱を入射光ビームに対して90°で検出されるように
変更できる。分光光度計では、色は入射光ビームに対し
て前方向で測定される；これらの器械は前方向で色より
もむしろ散乱を検出するように変更し得る。光散乱も同
様に他の方向で検出できる。
光源としてタングステンランプのようなランプを用いる
時には、スペクトル的に豊富な光ビームは350nmと800nm
の間の波長を持つものを供給するのが典型的である。こ
のようなスペクトル的に豊富な光では、試験管の入射側
または散乱側または両側で光ビームをフィルターに通す
必要がある。適当なフィルターを用いることによって発
色物質による極大吸収波長で光散乱かまたは蛍光のいず
れかの最高の信号を得ることが可能である。減衰の波長
および対照波長は物質によって変わり得るので適当なフ
ィルターの選択および位置は選択される発色物質に依存
する。フィルター選択および位置は光学分野に通常の技
術を持つ者には容易に実行され得る。
時には、スペクトル的に豊富な光ビームは350nmと800nm
の間の波長を持つものを供給するのが典型的である。こ
のようなスペクトル的に豊富な光では、試験管の入射側
または散乱側または両側で光ビームをフィルターに通す
必要がある。適当なフィルターを用いることによって発
色物質による極大吸収波長で光散乱かまたは蛍光のいず
れかの最高の信号を得ることが可能である。減衰の波長
および対照波長は物質によって変わり得るので適当なフ
ィルターの選択および位置は選択される発色物質に依存
する。フィルター選択および位置は光学分野に通常の技
術を持つ者には容易に実行され得る。
以下の実施例は本発明の技法の典型として提供されるも
のであるが、発明がそれに限定されるように解釈される
べきではないと理解される。
のであるが、発明がそれに限定されるように解釈される
べきではないと理解される。
実施例Ｉ 光透過性ポリスチレン試験管の内側表面を抗ｈＣＧでコ
ートした。試験管に抗ｈＣＧペルオキシダーゼ標識結合
体の１：50希釈物100μおよびｈＣＧを調べる、およ
び含むと考えられる液体試料100μを添加した。37℃
で30分間反応を行ない、次にその反応物を吸出した。0.
05％ツイーン（Tween）水溶液を各２mlずつで３回その
試験管を洗浄した後、テトラメチルベンジジン（ＴＭ
Ｂ）および過酸化水素の両方を含む基質200μを添加
し、その混合物を室温で30分間培養した。次にその試験
管に約0.014ミクロンの平均直径を持つ熱分解法シリカ
粒子を０．３％(W/V)で含有するクエン酸１mlを添加し
た。その試験管を光学的に修正した蛍光光度計に入れ
て、試験管の壁を通してその懸濁液に光をあてた。入射
光ビームに対して90゜に散乱する光を450nmと560nmの両
方で検出しその結果はその２波長の比率で表わした。上
で概説したのと同様の工程を用いて、既知濃度のｈＣＧ
を含有する試料によって標準曲線を作り、それに関する
データを第３図の曲線に示した。第３図の標準曲線の比
率とその器械で表わされた未知試料の比率を比較するこ
とにより、未知試料中のｈＣＧ濃度を決定した。
ートした。試験管に抗ｈＣＧペルオキシダーゼ標識結合
体の１：50希釈物100μおよびｈＣＧを調べる、およ
び含むと考えられる液体試料100μを添加した。37℃
で30分間反応を行ない、次にその反応物を吸出した。0.
05％ツイーン（Tween）水溶液を各２mlずつで３回その
試験管を洗浄した後、テトラメチルベンジジン（ＴＭ
Ｂ）および過酸化水素の両方を含む基質200μを添加
し、その混合物を室温で30分間培養した。次にその試験
管に約0.014ミクロンの平均直径を持つ熱分解法シリカ
粒子を０．３％(W/V)で含有するクエン酸１mlを添加し
た。その試験管を光学的に修正した蛍光光度計に入れ
て、試験管の壁を通してその懸濁液に光をあてた。入射
光ビームに対して90゜に散乱する光を450nmと560nmの両
方で検出しその結果はその２波長の比率で表わした。上
で概説したのと同様の工程を用いて、既知濃度のｈＣＧ
を含有する試料によって標準曲線を作り、それに関する
データを第３図の曲線に示した。第３図の標準曲線の比
率とその器械で表わされた未知試料の比率を比較するこ
とにより、未知試料中のｈＣＧ濃度を決定した。
実施例II 光透過性ポリスチレン試験管の内側表面を抗ｈＬＨでコ
ートした。その試験管に抗ｈＬＨペルオキシダーゼ標識
結合体の１：50希釈液100μおよびｈＬＨを調べるま
たは含有すると考えられる試料100μを添加した。37
℃で１時間反応を行ない、次に反応液を吸出した。その
試験管を0.05％ツイーン水溶液各２mlで３回洗浄した。
洗浄した試験管にテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）お
よび過酸化水素の両方を含有する基質200μを添加
し、室温で30分間反応させた。約0.014ミクロンの平均
直径を持つ熱分解法シリカ粒子を0.3％(W/V)含有する１
Ｍクエン酸１mlを添加して反応を停止した。その試験管
を光学的に修正された蛍光光度計中に置き、入射光ビー
ムに対して90°で集めた光散乱を測定した。光散乱は45
0nmおよび560nmの両方で検出し、その結果はその２波長
での光散乱の比率として表わした。既知濃度のｈＬＨに
関して測定した比率で標準曲線を作った。この標準曲線
を第４図に示す。試験試料ではその装置によって表わさ
れた光散乱の比率を第４図の標準曲線と比べて未知試料
中のｈＬＨ濃度を確認することができた。
ートした。その試験管に抗ｈＬＨペルオキシダーゼ標識
結合体の１：50希釈液100μおよびｈＬＨを調べるま
たは含有すると考えられる試料100μを添加した。37
℃で１時間反応を行ない、次に反応液を吸出した。その
試験管を0.05％ツイーン水溶液各２mlで３回洗浄した。
洗浄した試験管にテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）お
よび過酸化水素の両方を含有する基質200μを添加
し、室温で30分間反応させた。約0.014ミクロンの平均
直径を持つ熱分解法シリカ粒子を0.3％(W/V)含有する１
Ｍクエン酸１mlを添加して反応を停止した。その試験管
を光学的に修正された蛍光光度計中に置き、入射光ビー
ムに対して90°で集めた光散乱を測定した。光散乱は45
0nmおよび560nmの両方で検出し、その結果はその２波長
での光散乱の比率として表わした。既知濃度のｈＬＨに
関して測定した比率で標準曲線を作った。この標準曲線
を第４図に示す。試験試料ではその装置によって表わさ
れた光散乱の比率を第４図の標準曲線と比べて未知試料
中のｈＬＨ濃度を確認することができた。
実施例 III 光透過性ポリスチレン試験管の内側表面を抗ｈＣＧでコ
ートした。この試験管に抗ｈＣＧペルオキシダーゼ標識
結合体の１：200希釈液100μおよびｈＣＧを調べるお
よび含むと考えられる液体試料100μを添加した。37
℃で15分間反応させ、反応液を吸出した。0.05％ツイー
ン水溶液各２mlで３回試験管を洗浄した後、ＴＭＢと過
酸化水素の両方を含有する基質200μを各試験管に添
加した。ＴＭＢは1.7μＭ ＭＰＴおよび8.6μＭ ＳＲ
101を含有した。この混合物を37℃で15分間反応させ
た。次に１Ｍクエン酸の0.8mlを試験管に添加した。そ
の試験管をＭＰＴ蛍光団用に励起側に395nmフィルタ
ー、発光側に430nmフィルターを含む蛍光光度計に置い
た。その蛍光光度計はＳＲ101蛍光団用に励起側に589nm
フィルター、発光側に605nmフィルターを含有した。ラ
ンプからの光を試験管の壁を通してその溶液をあてた。
蛍光を430nmと605nmで検出して、結果をその２波長の比
率で表わした。上で概説したのと同様の工程を用いて既
知濃度のｈＣＧを含有する試料により標準曲線を作り、
それに関するデータを第５図の曲線に示す。その装置に
よって表わされる未知試料の蛍光比率を第５図の標準曲
線の比率と比較することによって、未知試料中のｈＣＧ
濃度を決定した。
ートした。この試験管に抗ｈＣＧペルオキシダーゼ標識
結合体の１：200希釈液100μおよびｈＣＧを調べるお
よび含むと考えられる液体試料100μを添加した。37
℃で15分間反応させ、反応液を吸出した。0.05％ツイー
ン水溶液各２mlで３回試験管を洗浄した後、ＴＭＢと過
酸化水素の両方を含有する基質200μを各試験管に添
加した。ＴＭＢは1.7μＭ ＭＰＴおよび8.6μＭ ＳＲ
101を含有した。この混合物を37℃で15分間反応させ
た。次に１Ｍクエン酸の0.8mlを試験管に添加した。そ
の試験管をＭＰＴ蛍光団用に励起側に395nmフィルタ
ー、発光側に430nmフィルターを含む蛍光光度計に置い
た。その蛍光光度計はＳＲ101蛍光団用に励起側に589nm
フィルター、発光側に605nmフィルターを含有した。ラ
ンプからの光を試験管の壁を通してその溶液をあてた。
蛍光を430nmと605nmで検出して、結果をその２波長の比
率で表わした。上で概説したのと同様の工程を用いて既
知濃度のｈＣＧを含有する試料により標準曲線を作り、
それに関するデータを第５図の曲線に示す。その装置に
よって表わされる未知試料の蛍光比率を第５図の標準曲
線の比率と比較することによって、未知試料中のｈＣＧ
濃度を決定した。
実施例 IV 上記実施例と同様の手順で、試験管を抗ｈＴＳＨでコー
トした。この試験管に抗ｈＴＳＨペルオキシダーゼ標準
結合体の１：200希釈液100μおよびｈＴＳＨを調べる
および含むと考えられる試料200μを添加した。37℃
で30分間反応させ、次いで反応液を吸出した。試験管を
0.05％ツイーン水溶液各２mlで３回洗浄した。その洗浄
した試験管にＴＭＢと過酸化水素を含有する基質および
上述の２種類の蛍光団、ＭＰＴおよびＳＲ 101、300μ
を添加した。37℃で７分間反応させて、１Ｍクエン酸
0.8mlを添加した反応を停止させた。実施例IIIで記述し
たような蛍光光度計で試験管を測定し、その結果はＭＰ
Ｔ／ＳＲ101の試料中に初めから含まれていたｈＴＳＨ
濃度との比率で表わした。代表的な結果を第６図に示
す。
トした。この試験管に抗ｈＴＳＨペルオキシダーゼ標準
結合体の１：200希釈液100μおよびｈＴＳＨを調べる
および含むと考えられる試料200μを添加した。37℃
で30分間反応させ、次いで反応液を吸出した。試験管を
0.05％ツイーン水溶液各２mlで３回洗浄した。その洗浄
した試験管にＴＭＢと過酸化水素を含有する基質および
上述の２種類の蛍光団、ＭＰＴおよびＳＲ 101、300μ
を添加した。37℃で７分間反応させて、１Ｍクエン酸
0.8mlを添加した反応を停止させた。実施例IIIで記述し
たような蛍光光度計で試験管を測定し、その結果はＭＰ
Ｔ／ＳＲ101の試料中に初めから含まれていたｈＴＳＨ
濃度との比率で表わした。代表的な結果を第６図に示
す。
実施例 Ｖ 光透過性ポリスチレン試験管の内側表面を抗Ｔ４でコー
トした。そのコートした試験管にペルオキシダーゼ標識
Ｔ４結合体の１：15,000希釈液300μおよびＴ４を調
べるおよび含むと考えられる試料25μを添加した。37
℃で15分間反応させ、次に反応液を吸出した。その試験
管を０．５％ツイーン‐水溶液各０．５mlで６回洗浄し
た。その洗浄した試験管にＴＭＢと過酸化水素を含む基
質およびＭＰＴとＳＲ 101の２種類の蛍光団からなる3
00μを添加した。37℃で15分間反応させ、１Ｍクエン
酸０．８mlを添加して反応を停止させた。次に試験管を
実施例IIIに記述したような蛍光光度計で測定し、ＭＰ
Ｔ／ＳＲ101の比率を試験管に最初に添加したＴ４の量
に対してプロットした。典型的なデータを第７図に示
す。
トした。そのコートした試験管にペルオキシダーゼ標識
Ｔ４結合体の１：15,000希釈液300μおよびＴ４を調
べるおよび含むと考えられる試料25μを添加した。37
℃で15分間反応させ、次に反応液を吸出した。その試験
管を０．５％ツイーン‐水溶液各０．５mlで６回洗浄し
た。その洗浄した試験管にＴＭＢと過酸化水素を含む基
質およびＭＰＴとＳＲ 101の２種類の蛍光団からなる3
00μを添加した。37℃で15分間反応させ、１Ｍクエン
酸０．８mlを添加して反応を停止させた。次に試験管を
実施例IIIに記述したような蛍光光度計で測定し、ＭＰ
Ｔ／ＳＲ101の比率を試験管に最初に添加したＴ４の量
に対してプロットした。典型的なデータを第７図に示
す。
［発明の効果］ 以上のように本発明は注目の分析対象物の間接的比色検
出用に光信号の比率によっている。本明細書に記述され
たような技法を用いることによって光路の長さ、試験管
の光学的性質、試験管の位置、ランプ出力の変化および
システムの光学に影響を及ぼす同様の要素による差異を
否定する内部補正機構を供給する。従来の比色定量法で
は、ランプ出力や光路の長さにおける変動のような差異
は二重ビーム分光光度計および全ての測定に組合せたキ
ュベットを用いて補正するのが典型である。本発明に用
いる検出器は二重ビームを用いず、各測定に異なったキ
ュベットを用いるので、本明細書に記述された比率法は
これらの影響を最小にするのに効果的な方法として有用
である。
出用に光信号の比率によっている。本明細書に記述され
たような技法を用いることによって光路の長さ、試験管
の光学的性質、試験管の位置、ランプ出力の変化および
システムの光学に影響を及ぼす同様の要素による差異を
否定する内部補正機構を供給する。従来の比色定量法で
は、ランプ出力や光路の長さにおける変動のような差異
は二重ビーム分光光度計および全ての測定に組合せたキ
ュベットを用いて補正するのが典型である。本発明に用
いる検出器は二重ビームを用いず、各測定に異なったキ
ュベットを用いるので、本明細書に記述された比率法は
これらの影響を最小にするのに効果的な方法として有用
である。
第１図は酸化テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）の濃度
に対する３波長における光散乱の測定を表わしたグラフ
であり； 第２図は本発明原理に従って、酸化テトラメチルベンジ
ジン（ＴＭＢ）の濃度に対して測定された異なる波長の
光散乱の３種類の比率を表わしたグラフであり； 第３図は酵素免疫法に本発明原理を用いて、ヒト絨毛性
ゴナドトロピン（ｈＣＧ）の濃度に対して測定された光
散乱の比率を表わしたグラフであり、 第４図は酵素免疫法に本発明原理を用いて、ヒト黄体形
成ホルモン（ｈＬＨ）の濃度に対して測定された光散乱
の比率を表わしたグラフであり、 第５図は酵素免疫法に本発明原理を用いて、ヒト絨毛性
ゴナドトロピン（ｈＣＧ）の濃度に対して測定された蛍
光信号の比率を表わしたグラフであり； 第６図は酵素免疫法に本発明原理を用いて、ヒト甲状腺
刺激ホルモン（ｈＴＳＨ）の濃度に対して測定された蛍
光信号の比率を表わしたグラフであり、そして 第７図は競合型の酵素免疫法に本発明原理を用いて、チ
ロキシン（Ｔ４）の濃度に対して、測定された蛍光信号
の比率である。
に対する３波長における光散乱の測定を表わしたグラフ
であり； 第２図は本発明原理に従って、酸化テトラメチルベンジ
ジン（ＴＭＢ）の濃度に対して測定された異なる波長の
光散乱の３種類の比率を表わしたグラフであり； 第３図は酵素免疫法に本発明原理を用いて、ヒト絨毛性
ゴナドトロピン（ｈＣＧ）の濃度に対して測定された光
散乱の比率を表わしたグラフであり、 第４図は酵素免疫法に本発明原理を用いて、ヒト黄体形
成ホルモン（ｈＬＨ）の濃度に対して測定された光散乱
の比率を表わしたグラフであり、 第５図は酵素免疫法に本発明原理を用いて、ヒト絨毛性
ゴナドトロピン（ｈＣＧ）の濃度に対して測定された蛍
光信号の比率を表わしたグラフであり； 第６図は酵素免疫法に本発明原理を用いて、ヒト甲状腺
刺激ホルモン（ｈＴＳＨ）の濃度に対して測定された蛍
光信号の比率を表わしたグラフであり、そして 第７図は競合型の酵素免疫法に本発明原理を用いて、チ
ロキシン（Ｔ４）の濃度に対して、測定された蛍光信号
の比率である。
Claims (4)
- 【請求項１】a)内側表面に抗体を結合した透明容器中
で、ペルオキシダーゼ標識抗体および分析対象物を調べ
るべき試料を混合し、その分析対象物を上記容器内側表
面の結合抗体および上記標識抗体に結合させて容器内表
面に免疫学的複合体を形成し； b)上記容器中にテトラメチルベンジジンおよび過酸化水
素を含む溶液を添加して上記免疫学的複合体との反応に
よりテトラメチルベンジジンを活性化して発色させ； c)上記混合物に上記反応を停止させるための溶液および
粒子を添加して、安定な微粒子懸濁液を生成させ； d)上記容器を通して上記懸濁液に少なくとも二つの波長
の入射光をあてるが、その際、上記入射光の第１波長は
存在する分析対象物の濃度の関数として活性化されたテ
トラメチルベンジジンが上記入射光からの散乱光の量を
減衰させる波長である約450nmであり、第２波長は上記
第１波長とは離れていて分析対象物の濃度が増加しても
光散乱の減衰は実質上起こらない波長であり； e)上記第１波長および第２波長において懸濁液による散
乱光を検出して上記のそれぞれ二波長での散乱光の比率
を求め； f)工程(a)から(e)を既知の濃度の上記分析対象物を含ん
だ試料で実施した時の光散乱検出による比率と比較する
ことにより試料中の分析対象物の濃度を測定する ことを特徴とする、試料中の分析対象物の濃度を測定す
るための酵素免疫検定法。 - 【請求項２】分析対象物がヒト絨毛性ゴナドトロピンお
よび黄体形成ホルモンからなる群から選択される、特許
請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項３】特許請求の範囲第１項記載の工程(a)に代
えて、内側表面に抗体を結合した透明容器中で、ペルオ
キシダーゼ標識分析物および分析対象物を調べるべき試
料を混合し、透明容器中の内側表面に結合した抗体との
結合に関して、上記分析対象物を上記ペルオキシダーゼ
標識分析物と競合させて固相上に免疫学的複合体を形成
する工程を含み；そして 工程(b)の「免疫学的複合体」が「ペルオキシダーゼ」
である ことを特徴とする、特許請求の範囲第１項記載の酵素免
疫検定法。 - 【請求項４】a)内側表面に抗体を結合した透明容器中
で、ペルオキシダーゼ標識抗体および分析対象物を調べ
るべき試料を混合し、その分析対象物を上記容器内側表
面の結合抗体および上記標識抗体に結合させて容器内表
面に免疫学的複合体を形成し； b)上記容器中にテトラメチルベンジジンおよび過酸化水
素を含む溶液を添加して上記免疫学的複合体との反応に
よりテトラメチルベンジジンを活性化して発色させ； c)上記混合物に第１蛍光団を添加して、試料中に存在す
る分析対象物の濃度の関数として活性化されたテトラメ
チルベンジジンの吸収極大またはその付近で蛍光を生じ
させ； d)上記混合物に分析対象物の濃度が増加してもその蛍光
を実質上減衰しない第２蛍光団を添加し； e)上記容器を通して工程(d)で生じた混合物に複数の波
長の入射光をあてるが、該複数の波長は、活性化された
テトラメチルベンジジンの吸収極大またはその付近の波
長、および該第１蛍光団を活性化させる波長および該第
２蛍光団を活性化させる波長であり； f)上記蛍光団により放射された蛍光を検出して上記二つ
の蛍光波長の比率を求め； g)工程(a)から(f)を既知の濃度の上記分析対象物を含ん
だ試料で実施した時の蛍光検出による比率と比較するこ
とにより試料中の分析対象物の濃度を測定する ことを特徴とする、試料中の分析対象物の濃度を測定す
るための酵素免疫検定法。
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|---|---|---|---|
| US2334 | 1987-01-12 | ||
| US07/002,334 US4954435A (en) | 1987-01-12 | 1987-01-12 | Indirect colorimetric detection of an analyte in a sample using ratio of light signals |
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|---|---|
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| JP (1) | JPH067129B2 (ja) |
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