JPH0671435B2 - モノクロ−ン抗体 - Google Patents
モノクロ−ン抗体Info
- Publication number
- JPH0671435B2 JPH0671435B2 JP61201923A JP20192386A JPH0671435B2 JP H0671435 B2 JPH0671435 B2 JP H0671435B2 JP 61201923 A JP61201923 A JP 61201923A JP 20192386 A JP20192386 A JP 20192386A JP H0671435 B2 JPH0671435 B2 JP H0671435B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- monoclonal antibody
- prosomal
- protein
- proteins
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2474/00—Immunochemical assays or immunoassays characterised by detection mode or means of detection
- G01N2474/20—Immunohistochemistry assay
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/81—Packaged device or kit
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/807—Apparatus included in process claim, e.g. physical support structures
- Y10S436/808—Automated or kit
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/811—Test for named disease, body condition or organ function
- Y10S436/813—Cancer
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/808—Materials and products related to genetic engineering or hybrid or fused cell technology, e.g. hybridoma, monoclonal products
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 この発明はプロソマル蛋白［prosomal proteins］に対
するモノクローン抗体，これらの抗体を生産する細胞
系，免疫化学診断法，及びこの方法で使用する診断剤に
関する． プロソム［prosomes］はリボ核蛋白［RNP］複合体［cop
lexes］又はRNP粒子であり，特にダック及びマウスの赤
芽球及びヒト ヘラ ［Hela］細胞において，近年生化
学的方法により示され，電子顕微鏡によって可視化され
た［SPOHR et alによって定義されたEur.J.Biochem,17,
296−318,（1970）］．この目的で文献を引用しておく
［Schmid et al,EMBM Journal ３（１）,29−34,（19
84）］． プロソムの分子量は約600,000ドルトンと評価されてい
る．プロソムは極めて安定した複合体である．実際，こ
れは，リボニュークレアーゼ，プロテアーゼK,1Mを超え
るセシウム イオン，及び［上記の細胞中における］抑
制mRNPsの他の構成分を溶解することが示されている界
面活性剤“Sarkosyl"［ナトリウム Ｎ−ラウロイルサ
ルコシネイト］に対して抵抗性がある． これらの複合体は，約19sの沈降 ［sedimentation］係数を有し、細胞の型及び種によっ
て,1−12の小RNA及び種に特定の員子と全ての種に共通
の員子との両者を含む蛋白の特性集団の１又はそれ以上
の員子［member］を含む．これらの員子蛋白の分子量は
19,000及び50,000の間で変り，プロソムあたりの蛋白の
分子数は20のオーダーである． プロソマル蛋白の集団［population］は少なくとも25の
識別員子を包含し，従って約25の異なる型のプロソムが
存在し得る． 現在まで，プロソムの生理学的及び診断的意義は明らか
ではなかった．然しながら，発明者等は，プロソムが細
胞の分化及び全生体についてさえも細胞間の連絡及び自
己免疫疾患に関連する多くの重要な生理学的過程に関与
することがあることの徴候を有している．例えば，発明
者等は，細胞，及び胚の発達及び細胞分化の間の生物の
官能状態と関連する生理学的特異性を示すプロソムの分
化分布［differential distribution］を見出だした． 特に，胚の上皮細胞において，一定の型のプロソマル坑
原が，分化の異なる段階に従って，核内に，次いで細胞
質内に，かつ次いで細胞質のセクター内に証明されるこ
とができる． 他の著しい発見は，一定の場合にプロソムが存在し，プ
ロソマルRNAに結合した単一蛋白成分の多重コピーから
のみ多分なるものである．更に，プロソムの定量分布が
赤芽球の分化の段階に応じて変るばかりでなく，更に各
種のプロソマル蛋白がその後の分化段階を通じてその分
布が異なることが発見されたが，核内の蛋白は細胞質内
のものと同一の分子量を有することが発見された． プロソムは，細胞が染色体からプラスマ膜へ及びそれを
超えて広がるネットワークの部分を構成することを示す
ことができる．このことは細胞動的構造と形質発現及び
制御のカスケイドの一連の段階［プロソムに与えられる
主な役割］との間の関係を示唆するものである．プロソ
ム及びプロソマル蛋白の決定及び特に分化検出は，例え
ば癌の場合におけるように，遺伝子制御の障害に関連す
る異常の診断の有力な手段と考えられる． 従って，プロソムは，その構造及び存在により，所定の
細胞の生理学的状態を反映する細胞成分の新しいクラス
を代表する． このように，プロソムを同定する手段を利用できること
は必要であることが分った．これは例えば次のような目
的のためである． Ａ） 実験目的で： １） 生存するヒト及び動物の細胞の詳細な構造の分
析； ２） 転写後の形質発現の制御の研究； 及び Ｂ） 診断目的で： １） 病的状態又は病原体との関連で所定の細胞のプロ
ソマル免疫表現型の障害の定義； ２） 分化及び発展の状態に関連する細胞の同定，例え
ば成人細胞の間の胚型の細胞の同定． 従って，この発明は，例えばプロソム関連現象の検出に
有用であり，一定のプロソム関連障害に治療的に適用で
きるプロソマル蛋白に対して指向したモノクローン抗体
に関する． この発明は，従って，プロソム関連現象の検出法，及び
特に試料中のプロソム関連障害を診断する方法であっ
て，該試料を少なくとも１種のプロソマル蛋白に対して
特に指向したモノクローン抗体と共に培養することを包
含し，モノクローン抗体が直接的又は間接的に標識を付
与され，次いで該標識とプロソマル蛋白及び／又は該モ
ノクローン抗体との結合が測定される方法にも関する． 従って，この発明は，標識にカップルしたプロソマル蛋
白に対して特に指向したモノクローン抗体を包含する診
断剤にも関する． この発明の方法において，試料は，組織物質［好ましく
は顕微鏡検査に適したその切片］又は診断すべき生体に
由来する液体媒体［血液又はその分画，尿又はリンパ
液］，又はある場合には完全生体自体［例えばin imagi
ng］であることができる． この発明の方法に用いる標識は，免疫測定において一般
に用いられる任意の標識であることができる．その例に
は，放射性原子又は化合物，酵素，赤芽球のような粒
子，ラテックス粒子，染料の分散ゾル粒子，金属又は金
属化合物，染色体，発蛍光団，等がある．標識は直接的
又は間接的にモノクローン抗体に結合することができ
る．直接結合は好ましくは共有結合によって，場合によ
り連結分子を用いて形成することができる．標識とモノ
クローン抗体との間の間接的結合は，例えばモノクロー
ン抗体と標識特定坑原，又は第２の抗体又はそのフラグ
メント又は蛋白Ａ又は類似化合物と，例えばアビジン又
はビオチンと結合するモノクローン抗体を用い，これと
標識ビオチン又はアビジンとをそれぞれ反応させること
によって，形成することができる． 液体試料に適用されるこの発明の方法によれば，任意の
型の通常の免疫測定が適用できる．その二三をあげる
と，サンドイッチ測定，固相競合測定，凝集測定，又は
凝集抑制測定である．サンドイッチ測定においては，一
般に検出される坑原は，一方では固定化した又は固体表
面に固定化される抗体と，他方では標識され又は標識さ
れるべき抗体との間にサンドイッチされる．固相競合に
おいては，測定される坑原は例えば固相結合抗体及び標
識坑原と共に培養される．凝集測定においては，測定す
る坑原は粒子結合抗体と共に培養し，これは凝集し坑原
結合で沈澱を形成する．他方，凝集抑制測定では粒子結
合坑原と共に遊離の抗体が測定する坑原と培養され得
る． この発明による方法で組織物質が試料として用いられる
場合には，この組織物質は場合により先ず固定されるこ
とができ，次いで場合により物質を先ず化学的又は物理
的手段で固定した後に標識されているか又は標識される
べきモノクローン抗体と共に培養され得る． この発明に用いる標識は培養後に標識の型あるいは用い
る方法の型に応じて可視的又は器具法によってその結合
について観察される． プロソマル蛋白に対して特に指向したモノクローン抗体
は，不滅化した［immortalized］抗体生産細胞の生物学
的純粋の細胞系によって生産される． この不滅化した抗体生産細胞は，当業界で既知の各種の
方法の任意のものによって得ることができ，一般には次
の工程を経る.1 リンパ球のような特定の細胞の生産に
適した細胞の誘導;2 該細胞の不滅化;3 所望の特性及
び親和性を有するこれらの不滅化細胞からクローンの選
択．しばしば用いられる方法には，コーラ等が1975年に
最初に記載したもので［Koehler and Millstein,Nature
256,495−497（1975）］，求められている抗体に対する
坑原でマウスを免疫化し，ヒ細胞を単離し，これとマウ
ス ミエローマ細胞と融合しいわゆるハイブリドーマを
得る．然しながら，マウスとは異なる動物も同様に免疫
化することができ，他の体部分からの抗体生産細胞も同
様に適している．更にこれらの抗体生産細胞はエプテイ
ン−バー［Eptein−Bar］ビールス又はオンコジェン［o
ncogenic］DNAのような不滅化形質転換遺伝物質による
細胞の形質転換のような他の方法によって不滅化するこ
とができる． 上に述べたように，この発明によるプロソマル蛋白に対
するモノクローン抗体は，免疫蛍光検査，及び免疫酵素
又は放射免疫技術のような免疫測定の従来の技術によっ
てプロソムの検出又は同定に適している． この発明による方法の適用は，生物学の実験研究の分野
及び医学研究の分野において，特に癌研究，及び較差免
疫表現型による疾病の診断のための臨床医学において極
めて重要である． 例えば，生物学の実験研究の分野において，この発明に
よる方法は汎存生理学複合体の役割においてプロソムの
構造の特性化，機能及び合成に用いることができる．特
に，プロソムの個別の型の較差細胞学的局在は，細胞分
画及び生化学の方法により，又は完全細胞又は組織切片
の免疫蛍光検査によって，この発明による方法を用いて
非常に容易となる． 発達生物学において，プロソムの存在又は不在及び特定
の型の細胞における特定のプロソムの特徴的細胞学的局
在を与えることによって，プロソマルモノクローン抗体
は胚の発達における特定細胞の特性化，同定及び追跡に
有用であり，従来そうであったように，発達に関して確
立される動的組織学を可能にする．プロソムが遺伝子表
出の較差制御に関与する限り，この発明による方法は細
胞制御の基礎となる機構を解明するのに用いることがで
きる． 医学研究の分野において，この発明による方法は、較差
免疫表現型により，特定組織の細胞の型及び細胞の分化
の段階に応じ確立されるプロソマル坑原の分布の実際の
地図を可能にする．細胞の制御に影響する病理学的条件
の場合におけるこの分布の変更，従って生理学的状態
は，この発明の方法を用いて同定することができる． 異なる起源の病理学的条件の臨床診断にあたって，この
発明による方法は必須の手段を提供する．実際，この方
法は，健常からそれて，例えばバイオプシーによって除
かれた組織の切片及び生理液体中に迅速に認識すべき細
胞の存在及び分布を可能にする．この方法で，現在は細
胞学及び組織学の高度の経験を必要とする病理学的条件
の診断が較差フルオロメトリーによって自動化され得
る． 癌に関しては，この発明による方法は発達の初期の段階
において末梢血液中の細胞の存在を検出するのに極めて
有用である．実際，健常末梢血液は未熟細胞を極めて少
数し含有しない．対照的に，白血病患者の末梢血液には
かなりの数の未熟細胞が存在することが認められてい
る． この発明は，次にあげる例によって詳細に説明する． 例 １ プロソマル蛋白の単離 蛋白は電気泳動によってプロソムから抽出する．プロソ
ムは予めショ糖勾配［gradient］に基づき分割法によっ
て他の細胞複合体から分離したものである． プロソマル蛋白の生産は次の工程からなる． １） 遠心分離により及びショ糖勾配に基づく分割法に
よって他の細胞複合体からのプロソムの分離し，及び約
198の沈降係数を有する粒子の回収， ２） ゲル電気泳動による求める蛋白の抽出． ダック及びマウスのプロソムの生産は文献に詳細に記載
されている［SCHMID et al,EMBO Journal ３（１）,29
−34,（1984）］． ヘラ細胞プロソムは次の手順に従って得られた． １） ポスト−ミスコンドリア上澄みをヘラ細胞の培養
から文献［GANDER et al.Eur.J.Biochem.38,443−452,1
973］に記載の方法で調製した； ２） ポリリボゾーム及びポストーリボゾーム粒子の調
製は文献［VINCENT et al.Eur.J.Biochem.112,617−63
3,1980］に記載の方法で調製した； ３） 遊離の細胞質リボ核蛋白複合体は低塩含量のバッ
ファ中15−28％強度（重量／重量）イソカイネチック
ショ糖勾配に再懸濁したポストーリボゾーム粒子のペレ
ットの沈降によって分画した．この組成は次の通りであ
る:10mMトリエタノールアミン.HCl（pH7.4）.50mM KC
l.及び5mM ２−メルカプトエタノール．この分画はTi1
4型のベックマン ゾーナル ロータ中で15h,41,000rpm
及び４℃で行なった． ４） 15−30Sの範囲内で沈降した粒子は次いで再び合
せ，ベックマン型Ti60ロータ中で18h,48,000rpm及び４
℃で高速遠心分離によって濃縮した． ５） 遠心分離ペレットをショ糖勾配［５−21％重量／
重量］にKClの存在下で0.5M［ロータSW41 37,000rpm,1
7h.,4℃］の濃度で入れ，約19Sで沈降した分画を回収し
た． 全ての場合において，プロソマル蛋白はこれらの分画か
ら抽出し，ゲル電気泳動の既知の方法を用いて同定し
た．例えば，レムリ ［LAEMMLI,Nature 227,680−685,1970］による一次元ナ
トリウム ドデシル サルフェイト［SDS］−ポリアク
リルアミドゲル上の電気泳動，又はオファレル［Ｏ′FA
RRELL et al.Cell.12,1133−1142,1977］の記載した二
次元ゲル上の電気泳動である．これらの電気泳動法に用
いた分子量マーカーは次の化合物である：フォスフォリ
ラゼ−ｂ［94K］，ボビン血清アルブミン［64K］，オバ
ルブミン［43K］，カルボニック アンヒドラーゼ［31
K］，大豆トリプシン インヒビター［21K］及びラクト
アルブミン［14K］． 例２ プロソマル蛋白に対するモノクローン抗体 一般的にいって，この発明によるプロソムの蛋白に対す
る抗体を生産するハイブリドマ細胞系を得る方法は次の
工程を包含する． １） 例１によって調製した所望の蛋白の所定の量での
マウスの免疫； ２） 免疫マウスのヒ臓の除去及びヒ臓細胞の分離； ３） こうして得たヒ臓細胞とマウスミエローマ細胞と
の融合促進剤の存在下における融合； ４） 未融合ミエローマ細胞が成長しない選択性媒体中
で，かつ適当な栄養成分の存在下での得られたハイブリ
ッド細胞の培養； ５） 所望の抗体を生産する細胞の選択及びこれらの細
胞のクローニング． この方法の第一工程，即ちマウスの免疫は抗体合成の細
胞の記憶を刺激するように行なう． 免疫プロトコルは，皮下又は腹腔内に，約２−３週間の
間隔で連続３回，所定量のプロソム蛋白を，融合の前４
日及び２月の休養期間後，注射して，同量のプロソム蛋
白で皮下又は腹腔内に投与を与えることから成る． 各注射に用いるプロソム蛋白の量はマウスあたり約20−
50μｇである． この方法で免疫したマウスは次いで殺し，そのヒ臓を除
き，文献［例えば,MOORE et al.“Culture of Normal H
uman Leucocytes"J.A.M.A.199 519−524,1967］に定め
られたようにRPMI1640媒体中でヒ臓細胞回収処理をす
る． 細胞融合は，この発明の第３工程となるもので，プロソ
ム蛋白に対し免疫のマウスのヒ臓細胞とマウス ミエソ
ーマとを，融合促進剤ポリエチレン グリコールの存在
下で，コーラ，ミルスタインの技術［KOHLER and MILST
EIN,Nature 256 495−497 （1975）］に従って混合す
ることからなる．ミエローマ細胞はヒ臓細胞に対して1:
10の割合で使用する． ポリエチレン グリコールの存在下,1分間37℃で撹拌し
ながら培養後，細胞はRPMI1640媒体中で洗浄し，同一媒
体中に再懸濁し，次いでハイブリッド細胞の成長に適し
た選択的媒体で培養する． ミエローマ細胞は，酵素ヒポキサンチン：グアニン フ
ォスフォリボシルトランスフェラーゼが欠けているの
で，ヒポキサンチン，アミノプテリン及びチミジンを含
む媒体を再現しない．従ってハイブリドーマ細胞の成長
のための選択的媒体はヒポキサンチン，アミノプテリン
及びチミジンを含む． 所望のフロソーム蛋白に対する抗体を生産する細胞は次
いで選択されクーロンされる．実質的量のモノクローン
抗体の生産は，この方法で選択されたハイブリッド細胞
の管中培養によるか，又はマウスに注射し，約15日後に
求める抗体を含む酸性液体を収穫することによって行な
うことができる． こうして得られたモノクローン抗体は−20℃で冷凍して
貯蔵する． 例３ ダック プロソムの蛋白P27K及びp31Kに対する抗体の調
製 ビンセントの記載する方法［VINCENT et al.Eur.J.Bioc
hm,112,617−633,（1980）］によって得られたダック20
SグロビンmRNPsを,0.5M KClの処理で沈降係数4S,13S,1
6S及び19S（プロソム）の４の主要サブ複合体に解離さ
れる．特定のプロソム蛋白に対する抗体を得るため,Bal
b cマウスに上記例２に定めた免疫プロトコルに従いフ
ロインド［Freund］助剤の存在下20μｇのプロソム［上
で得られた19S沈降の粒子］を腹腔内及び皮下に注射し
た．第２の注射の１週間後，マウス血清をサンプリング
し，抗体の存在をELISA及び免疫電気泳動技術により検
出した． 第３の注射の２月後，同量のプロソムの投与を静脈内大
び腹腔内に行ない,4日後マウスを殺し，そのヒ臓を除
き，ヒ臓細胞［106］を融合促進剤としてポリエチレン
グリコールを用い,KOHLER,MILSTEINの方法に従い［ス
イスのバーゼルのHOFFMANN−LA−ROCHEのT.STAEHELIN研
究所から提供された］PAIマウスのミエローマ細胞［1
07］と融合させた． プロソム蛋白に対する抗体を生産する細胞は次いで選択
的媒体で選択され，制限希釈法によってクローンした． 抗体を生産するハイブリッド細胞の検出はELISA法及び
免疫電気移転法によって行なった． この２の試験で,20SグロビンmRNP粒子を坑原として用
い，ボジチブ クローン，即ちプロソム蛋白p27K及びp3
1Kに対する抗体を生産するクローンをこの坑原で選択し
た． p27K及びp31Kプロソム蛋白に対するモノクローン抗体を
生産する細胞系を，パスツール研究所の国立微生物寄託
機関［Collection National de Culture de Microorgan
isms of the Pasteur Institute］に，それぞれno.I−5
88及びＩ−589としてブダペスト条約に基づく国際寄託
をした． 抗−p27K抗体を生産する細胞系［内部記号IB5として指
示する］は，約5.9の等電pHを有するクラスIgGlの抗体
を生産する． 抗−p31K抗体を生産する細胞系［内部記号AA4として指
示する］は，約5.2の等電pHを有するクラスIgGlの抗体
をも生産する． 添附の第１図は次のものを示す． 254nmで観察した0.5mKClの存在下ショ糖勾配中のダック
20SグロビンmRNP粒子の沈降プロフィール［第1A図］． 蛋白をクウマシイ［Coomasie］ブルーで染色し,Aに示す
勾配の分画の蛋白の一次元SDSポリアクリルアミド ゲ
ルの写真．この図でＭは分子量マーカーを示し，ゾーン
３−６はダック プロソム蛋白に対応する． 次の例４と同一の方法によってニトロセルロース紙に移
し蛋白p27K［第1C1図］及び蛋白p31K［第1C2図］に対す
るモノクローン抗体で後続反応［ELISA］をしたＢで示
したゲルと同種ゲル中の蛋白の写真． 例４ 例３で得られたモノクローン蛋白を用いる蛋白27K及び3
1Kの全般的性質の説明 この例における蛋白27K及び31Kの語はそれぞれ分子量27
000及び31000を有するプロソマル蛋白を指すものであ
る． プロソマル蛋白に対するモノクローン抗体の特異性及び
全般性を示すため,0.5M塩化カリウム中でショ糖勾配で
解離後得られたダック，マウス及びヘラ細胞プロソム蛋
白を一次元ゲル電気泳動に付しクウマシイ ブルーで染
色した．同種ゲルの蛋白を，トウビンの技術によって ［TOWBIN et al. Proc.Natl.Acad.Sci. USA 76,4350−4
354］ゲルからニトロセルロース紙に移した．移した
後，ニトロセルロース紙を４℃で３％のボビン血清アル
ブミンを含有するPBSフォスフェイト バッファ中に一
夜浸漬し非−特定反応生成物を除いた．次いで，この紙
を腹水液体に由来する例３で得られたプロソム蛋白に対
する抗体と18℃で一夜培養しPBSに希釈した［1:600］．
次いで，この紙を４回PBSで洗浄した後,3時間PBSで希釈
し［1:1000］10％ゴート血清を含むパーオキシダーゼ標
識抗体［マウスIgGに対するゴート抗体］で培養した．
反応後，この紙を再びPBSで洗浄し５−10分間４−クロ
ロ−１−ナフトールで酵素反応が可視化した． この実験で，ダック プロソム蛋白p27K及びp31Kにたい
する例３で得た抗体は，ダック，マウス及びヘラ細胞プ
ロソム蛋白にポジチブに反応した． 添附の第２図は次のものを示す． Ａでは，マウマシイ ブルー染色後のダック赤血球
（ａ），マウス赤血球（ｂ），及びヘラ細胞（ｃ）の蛋
白の電気泳動からのゲルの写真で,Mは分子量マーカーを
示す． Ｂでは，ニトロセルロース紙に移し蛋白p31Kに対するモ
ノクローン抗体との反応後の同種ゲルにおける蛋白の写
真． Ｃでは，ニトロセルロース紙に移し蛋白p27Kに対するモ
ノクローン抗体との反応後の該蛋白の写真． 例５ プロソムの同定のためのプロソマル蛋白に対するモノク
ローン抗体の利用 シト免疫蛍光研究をプロソマル坑原の同定のため各種の
型の細胞で行なった． 第１段階では，室温で15分間PBS中３％パラフォルムア
ルデヒドを用いて固定した細胞からスミアをつくった．
この固定段階後，細胞を５分間0.1％「トリトンx100」
で浸透させ，次いでPBS中１％ラビット血清及び0.1％ボ
ビン血清アルブミンで予培養して非特定反応を抑制し
た． PBSで４回連続洗浄後，細胞を１時間湿潤室内で蛋白p27
に対するモノクローン抗体又は蛋白p31Kに対するモノク
ローン抗体で培養した．細胞は次いで３回30分間洗浄
し，第２蛍光標識抗体［マウスIgG/FITCに対するラビッ
ト抗体」で30分間暗所で培養した．細胞は次いで光顕微
鏡で観察し，細胞は測定したプロソマル蛋白を含有し，
これらの細胞は蛍光細胞であった． この実験はダック末梢血液細胞及びヘラ細胞について行
なった．第３図及び第４図は顕微鏡で観察した細胞の写
真である． これらの図において； 写真3A1は，蛋白p27Kに対する抗体と反応したダック末
梢血液細胞のものである．写真3A2は，蛋白p31Kに対す
る抗体と反応したダック末梢血液細胞のものである．こ
れらの２写真において成体細胞は実質的に蛍光を欠いて
いるが，若い細胞は多いか少ないかはあるが蛍光であ
り，分化の程度及び使用したモノクローン抗体の型に応
じた強度及び分布のプロソマル蛋白の存在を示す． 第4B1図は，蛋白p27Kに対するモノクローン抗体で培養
したヘラ細胞を示す． 第4B2図は，蛋白p31Kに対するモノクローン抗体で培養
したヘラ細胞を示す．この場合，細胞はすべて蛍光であ
り，従ってすべてプロソマル蛋白を含む．染色は使用し
たプロソマル抗体の型に応じてことなることを注意すべ
きである． この実験は，この発明によるモノクローン抗体が生存ヒ
ト及び動物細胞の分化 ［differentiation］の研究に用いられることを示すも
のである．
するモノクローン抗体，これらの抗体を生産する細胞
系，免疫化学診断法，及びこの方法で使用する診断剤に
関する． プロソム［prosomes］はリボ核蛋白［RNP］複合体［cop
lexes］又はRNP粒子であり，特にダック及びマウスの赤
芽球及びヒト ヘラ ［Hela］細胞において，近年生化
学的方法により示され，電子顕微鏡によって可視化され
た［SPOHR et alによって定義されたEur.J.Biochem,17,
296−318,（1970）］．この目的で文献を引用しておく
［Schmid et al,EMBM Journal ３（１）,29−34,（19
84）］． プロソムの分子量は約600,000ドルトンと評価されてい
る．プロソムは極めて安定した複合体である．実際，こ
れは，リボニュークレアーゼ，プロテアーゼK,1Mを超え
るセシウム イオン，及び［上記の細胞中における］抑
制mRNPsの他の構成分を溶解することが示されている界
面活性剤“Sarkosyl"［ナトリウム Ｎ−ラウロイルサ
ルコシネイト］に対して抵抗性がある． これらの複合体は，約19sの沈降 ［sedimentation］係数を有し、細胞の型及び種によっ
て,1−12の小RNA及び種に特定の員子と全ての種に共通
の員子との両者を含む蛋白の特性集団の１又はそれ以上
の員子［member］を含む．これらの員子蛋白の分子量は
19,000及び50,000の間で変り，プロソムあたりの蛋白の
分子数は20のオーダーである． プロソマル蛋白の集団［population］は少なくとも25の
識別員子を包含し，従って約25の異なる型のプロソムが
存在し得る． 現在まで，プロソムの生理学的及び診断的意義は明らか
ではなかった．然しながら，発明者等は，プロソムが細
胞の分化及び全生体についてさえも細胞間の連絡及び自
己免疫疾患に関連する多くの重要な生理学的過程に関与
することがあることの徴候を有している．例えば，発明
者等は，細胞，及び胚の発達及び細胞分化の間の生物の
官能状態と関連する生理学的特異性を示すプロソムの分
化分布［differential distribution］を見出だした． 特に，胚の上皮細胞において，一定の型のプロソマル坑
原が，分化の異なる段階に従って，核内に，次いで細胞
質内に，かつ次いで細胞質のセクター内に証明されるこ
とができる． 他の著しい発見は，一定の場合にプロソムが存在し，プ
ロソマルRNAに結合した単一蛋白成分の多重コピーから
のみ多分なるものである．更に，プロソムの定量分布が
赤芽球の分化の段階に応じて変るばかりでなく，更に各
種のプロソマル蛋白がその後の分化段階を通じてその分
布が異なることが発見されたが，核内の蛋白は細胞質内
のものと同一の分子量を有することが発見された． プロソムは，細胞が染色体からプラスマ膜へ及びそれを
超えて広がるネットワークの部分を構成することを示す
ことができる．このことは細胞動的構造と形質発現及び
制御のカスケイドの一連の段階［プロソムに与えられる
主な役割］との間の関係を示唆するものである．プロソ
ム及びプロソマル蛋白の決定及び特に分化検出は，例え
ば癌の場合におけるように，遺伝子制御の障害に関連す
る異常の診断の有力な手段と考えられる． 従って，プロソムは，その構造及び存在により，所定の
細胞の生理学的状態を反映する細胞成分の新しいクラス
を代表する． このように，プロソムを同定する手段を利用できること
は必要であることが分った．これは例えば次のような目
的のためである． Ａ） 実験目的で： １） 生存するヒト及び動物の細胞の詳細な構造の分
析； ２） 転写後の形質発現の制御の研究； 及び Ｂ） 診断目的で： １） 病的状態又は病原体との関連で所定の細胞のプロ
ソマル免疫表現型の障害の定義； ２） 分化及び発展の状態に関連する細胞の同定，例え
ば成人細胞の間の胚型の細胞の同定． 従って，この発明は，例えばプロソム関連現象の検出に
有用であり，一定のプロソム関連障害に治療的に適用で
きるプロソマル蛋白に対して指向したモノクローン抗体
に関する． この発明は，従って，プロソム関連現象の検出法，及び
特に試料中のプロソム関連障害を診断する方法であっ
て，該試料を少なくとも１種のプロソマル蛋白に対して
特に指向したモノクローン抗体と共に培養することを包
含し，モノクローン抗体が直接的又は間接的に標識を付
与され，次いで該標識とプロソマル蛋白及び／又は該モ
ノクローン抗体との結合が測定される方法にも関する． 従って，この発明は，標識にカップルしたプロソマル蛋
白に対して特に指向したモノクローン抗体を包含する診
断剤にも関する． この発明の方法において，試料は，組織物質［好ましく
は顕微鏡検査に適したその切片］又は診断すべき生体に
由来する液体媒体［血液又はその分画，尿又はリンパ
液］，又はある場合には完全生体自体［例えばin imagi
ng］であることができる． この発明の方法に用いる標識は，免疫測定において一般
に用いられる任意の標識であることができる．その例に
は，放射性原子又は化合物，酵素，赤芽球のような粒
子，ラテックス粒子，染料の分散ゾル粒子，金属又は金
属化合物，染色体，発蛍光団，等がある．標識は直接的
又は間接的にモノクローン抗体に結合することができ
る．直接結合は好ましくは共有結合によって，場合によ
り連結分子を用いて形成することができる．標識とモノ
クローン抗体との間の間接的結合は，例えばモノクロー
ン抗体と標識特定坑原，又は第２の抗体又はそのフラグ
メント又は蛋白Ａ又は類似化合物と，例えばアビジン又
はビオチンと結合するモノクローン抗体を用い，これと
標識ビオチン又はアビジンとをそれぞれ反応させること
によって，形成することができる． 液体試料に適用されるこの発明の方法によれば，任意の
型の通常の免疫測定が適用できる．その二三をあげる
と，サンドイッチ測定，固相競合測定，凝集測定，又は
凝集抑制測定である．サンドイッチ測定においては，一
般に検出される坑原は，一方では固定化した又は固体表
面に固定化される抗体と，他方では標識され又は標識さ
れるべき抗体との間にサンドイッチされる．固相競合に
おいては，測定される坑原は例えば固相結合抗体及び標
識坑原と共に培養される．凝集測定においては，測定す
る坑原は粒子結合抗体と共に培養し，これは凝集し坑原
結合で沈澱を形成する．他方，凝集抑制測定では粒子結
合坑原と共に遊離の抗体が測定する坑原と培養され得
る． この発明による方法で組織物質が試料として用いられる
場合には，この組織物質は場合により先ず固定されるこ
とができ，次いで場合により物質を先ず化学的又は物理
的手段で固定した後に標識されているか又は標識される
べきモノクローン抗体と共に培養され得る． この発明に用いる標識は培養後に標識の型あるいは用い
る方法の型に応じて可視的又は器具法によってその結合
について観察される． プロソマル蛋白に対して特に指向したモノクローン抗体
は，不滅化した［immortalized］抗体生産細胞の生物学
的純粋の細胞系によって生産される． この不滅化した抗体生産細胞は，当業界で既知の各種の
方法の任意のものによって得ることができ，一般には次
の工程を経る.1 リンパ球のような特定の細胞の生産に
適した細胞の誘導;2 該細胞の不滅化;3 所望の特性及
び親和性を有するこれらの不滅化細胞からクローンの選
択．しばしば用いられる方法には，コーラ等が1975年に
最初に記載したもので［Koehler and Millstein,Nature
256,495−497（1975）］，求められている抗体に対する
坑原でマウスを免疫化し，ヒ細胞を単離し，これとマウ
ス ミエローマ細胞と融合しいわゆるハイブリドーマを
得る．然しながら，マウスとは異なる動物も同様に免疫
化することができ，他の体部分からの抗体生産細胞も同
様に適している．更にこれらの抗体生産細胞はエプテイ
ン−バー［Eptein−Bar］ビールス又はオンコジェン［o
ncogenic］DNAのような不滅化形質転換遺伝物質による
細胞の形質転換のような他の方法によって不滅化するこ
とができる． 上に述べたように，この発明によるプロソマル蛋白に対
するモノクローン抗体は，免疫蛍光検査，及び免疫酵素
又は放射免疫技術のような免疫測定の従来の技術によっ
てプロソムの検出又は同定に適している． この発明による方法の適用は，生物学の実験研究の分野
及び医学研究の分野において，特に癌研究，及び較差免
疫表現型による疾病の診断のための臨床医学において極
めて重要である． 例えば，生物学の実験研究の分野において，この発明に
よる方法は汎存生理学複合体の役割においてプロソムの
構造の特性化，機能及び合成に用いることができる．特
に，プロソムの個別の型の較差細胞学的局在は，細胞分
画及び生化学の方法により，又は完全細胞又は組織切片
の免疫蛍光検査によって，この発明による方法を用いて
非常に容易となる． 発達生物学において，プロソムの存在又は不在及び特定
の型の細胞における特定のプロソムの特徴的細胞学的局
在を与えることによって，プロソマルモノクローン抗体
は胚の発達における特定細胞の特性化，同定及び追跡に
有用であり，従来そうであったように，発達に関して確
立される動的組織学を可能にする．プロソムが遺伝子表
出の較差制御に関与する限り，この発明による方法は細
胞制御の基礎となる機構を解明するのに用いることがで
きる． 医学研究の分野において，この発明による方法は、較差
免疫表現型により，特定組織の細胞の型及び細胞の分化
の段階に応じ確立されるプロソマル坑原の分布の実際の
地図を可能にする．細胞の制御に影響する病理学的条件
の場合におけるこの分布の変更，従って生理学的状態
は，この発明の方法を用いて同定することができる． 異なる起源の病理学的条件の臨床診断にあたって，この
発明による方法は必須の手段を提供する．実際，この方
法は，健常からそれて，例えばバイオプシーによって除
かれた組織の切片及び生理液体中に迅速に認識すべき細
胞の存在及び分布を可能にする．この方法で，現在は細
胞学及び組織学の高度の経験を必要とする病理学的条件
の診断が較差フルオロメトリーによって自動化され得
る． 癌に関しては，この発明による方法は発達の初期の段階
において末梢血液中の細胞の存在を検出するのに極めて
有用である．実際，健常末梢血液は未熟細胞を極めて少
数し含有しない．対照的に，白血病患者の末梢血液には
かなりの数の未熟細胞が存在することが認められてい
る． この発明は，次にあげる例によって詳細に説明する． 例 １ プロソマル蛋白の単離 蛋白は電気泳動によってプロソムから抽出する．プロソ
ムは予めショ糖勾配［gradient］に基づき分割法によっ
て他の細胞複合体から分離したものである． プロソマル蛋白の生産は次の工程からなる． １） 遠心分離により及びショ糖勾配に基づく分割法に
よって他の細胞複合体からのプロソムの分離し，及び約
198の沈降係数を有する粒子の回収， ２） ゲル電気泳動による求める蛋白の抽出． ダック及びマウスのプロソムの生産は文献に詳細に記載
されている［SCHMID et al,EMBO Journal ３（１）,29
−34,（1984）］． ヘラ細胞プロソムは次の手順に従って得られた． １） ポスト−ミスコンドリア上澄みをヘラ細胞の培養
から文献［GANDER et al.Eur.J.Biochem.38,443−452,1
973］に記載の方法で調製した； ２） ポリリボゾーム及びポストーリボゾーム粒子の調
製は文献［VINCENT et al.Eur.J.Biochem.112,617−63
3,1980］に記載の方法で調製した； ３） 遊離の細胞質リボ核蛋白複合体は低塩含量のバッ
ファ中15−28％強度（重量／重量）イソカイネチック
ショ糖勾配に再懸濁したポストーリボゾーム粒子のペレ
ットの沈降によって分画した．この組成は次の通りであ
る:10mMトリエタノールアミン.HCl（pH7.4）.50mM KC
l.及び5mM ２−メルカプトエタノール．この分画はTi1
4型のベックマン ゾーナル ロータ中で15h,41,000rpm
及び４℃で行なった． ４） 15−30Sの範囲内で沈降した粒子は次いで再び合
せ，ベックマン型Ti60ロータ中で18h,48,000rpm及び４
℃で高速遠心分離によって濃縮した． ５） 遠心分離ペレットをショ糖勾配［５−21％重量／
重量］にKClの存在下で0.5M［ロータSW41 37,000rpm,1
7h.,4℃］の濃度で入れ，約19Sで沈降した分画を回収し
た． 全ての場合において，プロソマル蛋白はこれらの分画か
ら抽出し，ゲル電気泳動の既知の方法を用いて同定し
た．例えば，レムリ ［LAEMMLI,Nature 227,680−685,1970］による一次元ナ
トリウム ドデシル サルフェイト［SDS］−ポリアク
リルアミドゲル上の電気泳動，又はオファレル［Ｏ′FA
RRELL et al.Cell.12,1133−1142,1977］の記載した二
次元ゲル上の電気泳動である．これらの電気泳動法に用
いた分子量マーカーは次の化合物である：フォスフォリ
ラゼ−ｂ［94K］，ボビン血清アルブミン［64K］，オバ
ルブミン［43K］，カルボニック アンヒドラーゼ［31
K］，大豆トリプシン インヒビター［21K］及びラクト
アルブミン［14K］． 例２ プロソマル蛋白に対するモノクローン抗体 一般的にいって，この発明によるプロソムの蛋白に対す
る抗体を生産するハイブリドマ細胞系を得る方法は次の
工程を包含する． １） 例１によって調製した所望の蛋白の所定の量での
マウスの免疫； ２） 免疫マウスのヒ臓の除去及びヒ臓細胞の分離； ３） こうして得たヒ臓細胞とマウスミエローマ細胞と
の融合促進剤の存在下における融合； ４） 未融合ミエローマ細胞が成長しない選択性媒体中
で，かつ適当な栄養成分の存在下での得られたハイブリ
ッド細胞の培養； ５） 所望の抗体を生産する細胞の選択及びこれらの細
胞のクローニング． この方法の第一工程，即ちマウスの免疫は抗体合成の細
胞の記憶を刺激するように行なう． 免疫プロトコルは，皮下又は腹腔内に，約２−３週間の
間隔で連続３回，所定量のプロソム蛋白を，融合の前４
日及び２月の休養期間後，注射して，同量のプロソム蛋
白で皮下又は腹腔内に投与を与えることから成る． 各注射に用いるプロソム蛋白の量はマウスあたり約20−
50μｇである． この方法で免疫したマウスは次いで殺し，そのヒ臓を除
き，文献［例えば,MOORE et al.“Culture of Normal H
uman Leucocytes"J.A.M.A.199 519−524,1967］に定め
られたようにRPMI1640媒体中でヒ臓細胞回収処理をす
る． 細胞融合は，この発明の第３工程となるもので，プロソ
ム蛋白に対し免疫のマウスのヒ臓細胞とマウス ミエソ
ーマとを，融合促進剤ポリエチレン グリコールの存在
下で，コーラ，ミルスタインの技術［KOHLER and MILST
EIN,Nature 256 495−497 （1975）］に従って混合す
ることからなる．ミエローマ細胞はヒ臓細胞に対して1:
10の割合で使用する． ポリエチレン グリコールの存在下,1分間37℃で撹拌し
ながら培養後，細胞はRPMI1640媒体中で洗浄し，同一媒
体中に再懸濁し，次いでハイブリッド細胞の成長に適し
た選択的媒体で培養する． ミエローマ細胞は，酵素ヒポキサンチン：グアニン フ
ォスフォリボシルトランスフェラーゼが欠けているの
で，ヒポキサンチン，アミノプテリン及びチミジンを含
む媒体を再現しない．従ってハイブリドーマ細胞の成長
のための選択的媒体はヒポキサンチン，アミノプテリン
及びチミジンを含む． 所望のフロソーム蛋白に対する抗体を生産する細胞は次
いで選択されクーロンされる．実質的量のモノクローン
抗体の生産は，この方法で選択されたハイブリッド細胞
の管中培養によるか，又はマウスに注射し，約15日後に
求める抗体を含む酸性液体を収穫することによって行な
うことができる． こうして得られたモノクローン抗体は−20℃で冷凍して
貯蔵する． 例３ ダック プロソムの蛋白P27K及びp31Kに対する抗体の調
製 ビンセントの記載する方法［VINCENT et al.Eur.J.Bioc
hm,112,617−633,（1980）］によって得られたダック20
SグロビンmRNPsを,0.5M KClの処理で沈降係数4S,13S,1
6S及び19S（プロソム）の４の主要サブ複合体に解離さ
れる．特定のプロソム蛋白に対する抗体を得るため,Bal
b cマウスに上記例２に定めた免疫プロトコルに従いフ
ロインド［Freund］助剤の存在下20μｇのプロソム［上
で得られた19S沈降の粒子］を腹腔内及び皮下に注射し
た．第２の注射の１週間後，マウス血清をサンプリング
し，抗体の存在をELISA及び免疫電気泳動技術により検
出した． 第３の注射の２月後，同量のプロソムの投与を静脈内大
び腹腔内に行ない,4日後マウスを殺し，そのヒ臓を除
き，ヒ臓細胞［106］を融合促進剤としてポリエチレン
グリコールを用い,KOHLER,MILSTEINの方法に従い［ス
イスのバーゼルのHOFFMANN−LA−ROCHEのT.STAEHELIN研
究所から提供された］PAIマウスのミエローマ細胞［1
07］と融合させた． プロソム蛋白に対する抗体を生産する細胞は次いで選択
的媒体で選択され，制限希釈法によってクローンした． 抗体を生産するハイブリッド細胞の検出はELISA法及び
免疫電気移転法によって行なった． この２の試験で,20SグロビンmRNP粒子を坑原として用
い，ボジチブ クローン，即ちプロソム蛋白p27K及びp3
1Kに対する抗体を生産するクローンをこの坑原で選択し
た． p27K及びp31Kプロソム蛋白に対するモノクローン抗体を
生産する細胞系を，パスツール研究所の国立微生物寄託
機関［Collection National de Culture de Microorgan
isms of the Pasteur Institute］に，それぞれno.I−5
88及びＩ−589としてブダペスト条約に基づく国際寄託
をした． 抗−p27K抗体を生産する細胞系［内部記号IB5として指
示する］は，約5.9の等電pHを有するクラスIgGlの抗体
を生産する． 抗−p31K抗体を生産する細胞系［内部記号AA4として指
示する］は，約5.2の等電pHを有するクラスIgGlの抗体
をも生産する． 添附の第１図は次のものを示す． 254nmで観察した0.5mKClの存在下ショ糖勾配中のダック
20SグロビンmRNP粒子の沈降プロフィール［第1A図］． 蛋白をクウマシイ［Coomasie］ブルーで染色し,Aに示す
勾配の分画の蛋白の一次元SDSポリアクリルアミド ゲ
ルの写真．この図でＭは分子量マーカーを示し，ゾーン
３−６はダック プロソム蛋白に対応する． 次の例４と同一の方法によってニトロセルロース紙に移
し蛋白p27K［第1C1図］及び蛋白p31K［第1C2図］に対す
るモノクローン抗体で後続反応［ELISA］をしたＢで示
したゲルと同種ゲル中の蛋白の写真． 例４ 例３で得られたモノクローン蛋白を用いる蛋白27K及び3
1Kの全般的性質の説明 この例における蛋白27K及び31Kの語はそれぞれ分子量27
000及び31000を有するプロソマル蛋白を指すものであ
る． プロソマル蛋白に対するモノクローン抗体の特異性及び
全般性を示すため,0.5M塩化カリウム中でショ糖勾配で
解離後得られたダック，マウス及びヘラ細胞プロソム蛋
白を一次元ゲル電気泳動に付しクウマシイ ブルーで染
色した．同種ゲルの蛋白を，トウビンの技術によって ［TOWBIN et al. Proc.Natl.Acad.Sci. USA 76,4350−4
354］ゲルからニトロセルロース紙に移した．移した
後，ニトロセルロース紙を４℃で３％のボビン血清アル
ブミンを含有するPBSフォスフェイト バッファ中に一
夜浸漬し非−特定反応生成物を除いた．次いで，この紙
を腹水液体に由来する例３で得られたプロソム蛋白に対
する抗体と18℃で一夜培養しPBSに希釈した［1:600］．
次いで，この紙を４回PBSで洗浄した後,3時間PBSで希釈
し［1:1000］10％ゴート血清を含むパーオキシダーゼ標
識抗体［マウスIgGに対するゴート抗体］で培養した．
反応後，この紙を再びPBSで洗浄し５−10分間４−クロ
ロ−１−ナフトールで酵素反応が可視化した． この実験で，ダック プロソム蛋白p27K及びp31Kにたい
する例３で得た抗体は，ダック，マウス及びヘラ細胞プ
ロソム蛋白にポジチブに反応した． 添附の第２図は次のものを示す． Ａでは，マウマシイ ブルー染色後のダック赤血球
（ａ），マウス赤血球（ｂ），及びヘラ細胞（ｃ）の蛋
白の電気泳動からのゲルの写真で,Mは分子量マーカーを
示す． Ｂでは，ニトロセルロース紙に移し蛋白p31Kに対するモ
ノクローン抗体との反応後の同種ゲルにおける蛋白の写
真． Ｃでは，ニトロセルロース紙に移し蛋白p27Kに対するモ
ノクローン抗体との反応後の該蛋白の写真． 例５ プロソムの同定のためのプロソマル蛋白に対するモノク
ローン抗体の利用 シト免疫蛍光研究をプロソマル坑原の同定のため各種の
型の細胞で行なった． 第１段階では，室温で15分間PBS中３％パラフォルムア
ルデヒドを用いて固定した細胞からスミアをつくった．
この固定段階後，細胞を５分間0.1％「トリトンx100」
で浸透させ，次いでPBS中１％ラビット血清及び0.1％ボ
ビン血清アルブミンで予培養して非特定反応を抑制し
た． PBSで４回連続洗浄後，細胞を１時間湿潤室内で蛋白p27
に対するモノクローン抗体又は蛋白p31Kに対するモノク
ローン抗体で培養した．細胞は次いで３回30分間洗浄
し，第２蛍光標識抗体［マウスIgG/FITCに対するラビッ
ト抗体」で30分間暗所で培養した．細胞は次いで光顕微
鏡で観察し，細胞は測定したプロソマル蛋白を含有し，
これらの細胞は蛍光細胞であった． この実験はダック末梢血液細胞及びヘラ細胞について行
なった．第３図及び第４図は顕微鏡で観察した細胞の写
真である． これらの図において； 写真3A1は，蛋白p27Kに対する抗体と反応したダック末
梢血液細胞のものである．写真3A2は，蛋白p31Kに対す
る抗体と反応したダック末梢血液細胞のものである．こ
れらの２写真において成体細胞は実質的に蛍光を欠いて
いるが，若い細胞は多いか少ないかはあるが蛍光であ
り，分化の程度及び使用したモノクローン抗体の型に応
じた強度及び分布のプロソマル蛋白の存在を示す． 第4B1図は，蛋白p27Kに対するモノクローン抗体で培養
したヘラ細胞を示す． 第4B2図は，蛋白p31Kに対するモノクローン抗体で培養
したヘラ細胞を示す．この場合，細胞はすべて蛍光であ
り，従ってすべてプロソマル蛋白を含む．染色は使用し
たプロソマル抗体の型に応じてことなることを注意すべ
きである． この実験は，この発明によるモノクローン抗体が生存ヒ
ト及び動物細胞の分化 ［differentiation］の研究に用いられることを示すも
のである．
第１図ないし第４図は、本発明に関する生物の形態を示
す写真である。
す写真である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/574 Ａ 9015−2Ｊ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (9)
- 【請求項１】少なくとも１種のプロソマル蛋白に対して
特に指向し、他の細胞蛋白とは交差反応性ではないモノ
クローン抗体。 - 【請求項２】p27K及びp31Kとして指示されたプロソマル
蛋白の１種に対して特に指向し、他の細胞蛋白とは交差
反応性ではない特許請求の範囲第１項に記載のモノクロ
ーン抗体。 - 【請求項３】細胞系IB5及びAA4の一によって生産された
特許請求の範囲第１項に記載のモノクローン抗体。 - 【請求項４】試料を少なくとも１種のプロソマル蛋白に
対して特に指向し他の細胞蛋白とは交差反応性ではない
モノクローン抗体と共に培養することを包含し、モノク
ローン抗体が直接的又は間接的に標識を付与され、次い
で該標識とプロソマル蛋白及び／又は該モノクローン抗
体との結合を測定する試料中のプロソム関連現象を検出
する方法。 - 【請求項５】該モノクローン抗体がp27K及びp31Kとして
指示されたプロソマル蛋白の１種に対して指向するもの
である特許請求の範囲第４項に記載の方法。 - 【請求項６】該試料がパリのパスツール研究所微生物寄
託機関に寄託番号Ｉ−588及びＩ−589として寄託された
細胞系によって生産されたモノクローン抗体の１種で培
養される特許請求の範囲第４項に記載の方法。 - 【請求項７】プロソマルに対して特に指向し、他の細胞
蛋白とは交差反応性ではなく、標識に結合したモノクロ
ーン抗体を含む診断剤。 - 【請求項８】該モノクローン抗体がp27K及びp31Kとして
指示されたプロソマル蛋白の１種に対して特に指向し、
他の細胞蛋白とは交差反応性ではないものである特許請
求の範囲第７項に記載の診断剤。 - 【請求項９】該モノクローン抗体が細胞系IB5及びAA4の
一によって生産されたものである特許請求の範囲第７項
に記載の診断剤。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8512946 | 1985-08-30 | ||
| FR8512946A FR2586814A1 (fr) | 1985-08-30 | 1985-08-30 | Anticorps monoclonaux anti-proteines p 27 k et p 31 k de prosomes et leur application a titre de reactifs de diagnostic et/ou d'identification de cellules |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6066670A Division JPH0822226B2 (ja) | 1985-08-30 | 1994-03-10 | モノクローン抗体を生産する細胞系 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62130699A JPS62130699A (ja) | 1987-06-12 |
| JPH0671435B2 true JPH0671435B2 (ja) | 1994-09-14 |
Family
ID=9322505
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61201923A Expired - Lifetime JPH0671435B2 (ja) | 1985-08-30 | 1986-08-29 | モノクロ−ン抗体 |
| JP6066670A Expired - Lifetime JPH0822226B2 (ja) | 1985-08-30 | 1994-03-10 | モノクローン抗体を生産する細胞系 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6066670A Expired - Lifetime JPH0822226B2 (ja) | 1985-08-30 | 1994-03-10 | モノクローン抗体を生産する細胞系 |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5059521A (ja) |
| EP (2) | EP0219368B1 (ja) |
| JP (2) | JPH0671435B2 (ja) |
| KR (1) | KR0138534B1 (ja) |
| AT (2) | ATE154395T1 (ja) |
| AU (1) | AU596605B2 (ja) |
| CA (1) | CA1294570C (ja) |
| DE (2) | DE3684223D1 (ja) |
| DK (1) | DK172758B1 (ja) |
| ES (1) | ES2001626A6 (ja) |
| FR (1) | FR2586814A1 (ja) |
| IE (1) | IE59258B1 (ja) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5459035A (en) * | 1988-12-15 | 1995-10-17 | Amdl, Inc. | Method of detecting the tumors using ring shaped particles as a tumor marker |
| CA2023030A1 (en) * | 1990-07-13 | 1992-01-14 | Robert R. Guerrero | In vitro method and probe for detecting the presence of the ring shaped particle and malignancy in humans and animals |
| WO1992007269A1 (en) * | 1990-10-11 | 1992-04-30 | Pro-Soma S.A.R.L. | Diagnostic method |
| FI922667A0 (fi) * | 1990-10-12 | 1992-06-09 | Pro Soma Sarl | Diagnostiskt foerfarande. |
| ZA923679B (en) * | 1991-06-21 | 1993-01-27 | Pro Soma Sarl | Diagnostic method |
| US6308055B1 (en) | 1998-05-29 | 2001-10-23 | Silicon Laboratories, Inc. | Method and apparatus for operating a PLL for synthesizing high-frequency signals for wireless communications |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4444744A (en) * | 1980-03-03 | 1984-04-24 | Goldenberg Milton David | Tumor localization and therapy with labeled antibodies to cell surface antigens |
| US4448890A (en) * | 1980-09-29 | 1984-05-15 | Baylor College Of Medicine | Detection of human cancer cells with antibodies to human cancer nucleolar antigens |
-
1985
- 1985-08-30 FR FR8512946A patent/FR2586814A1/fr not_active Withdrawn
-
1986
- 1986-08-27 AU AU61894/86A patent/AU596605B2/en not_active Expired
- 1986-08-29 DE DE8686401898T patent/DE3684223D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-08-29 EP EP86401898A patent/EP0219368B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-08-29 DK DK198604143A patent/DK172758B1/da not_active IP Right Cessation
- 1986-08-29 DE DE3650635T patent/DE3650635T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-08-29 AT AT91200192T patent/ATE154395T1/de not_active IP Right Cessation
- 1986-08-29 KR KR1019860007219A patent/KR0138534B1/ko not_active Expired - Lifetime
- 1986-08-29 IE IE232586A patent/IE59258B1/en not_active IP Right Cessation
- 1986-08-29 ES ES8601511A patent/ES2001626A6/es not_active Expired
- 1986-08-29 CA CA000517227A patent/CA1294570C/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-08-29 AT AT86401898T patent/ATE73463T1/de not_active IP Right Cessation
- 1986-08-29 JP JP61201923A patent/JPH0671435B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1986-08-29 EP EP91200192A patent/EP0434670B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1989
- 1989-01-17 US US07/298,791 patent/US5059521A/en not_active Expired - Lifetime
-
1994
- 1994-03-10 JP JP6066670A patent/JPH0822226B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IE59258B1 (en) | 1994-01-26 |
| DK414386D0 (da) | 1986-08-29 |
| FR2586814A1 (fr) | 1987-03-06 |
| KR870002453A (ko) | 1987-03-31 |
| JPS62130699A (ja) | 1987-06-12 |
| ATE154395T1 (de) | 1997-06-15 |
| IE862325L (en) | 1987-02-28 |
| AU596605B2 (en) | 1990-05-10 |
| EP0434670B1 (en) | 1997-06-11 |
| ES2001626A6 (es) | 1988-06-01 |
| AU6189486A (en) | 1987-03-05 |
| KR0138534B1 (ko) | 1998-05-15 |
| CA1294570C (en) | 1992-01-21 |
| EP0219368B1 (en) | 1992-03-11 |
| DE3650635T2 (de) | 1997-12-04 |
| DE3650635D1 (de) | 1997-07-17 |
| EP0434670A1 (en) | 1991-06-26 |
| US5059521A (en) | 1991-10-22 |
| EP0219368A1 (en) | 1987-04-22 |
| ATE73463T1 (de) | 1992-03-15 |
| DK172758B1 (da) | 1999-06-28 |
| JPH0787967A (ja) | 1995-04-04 |
| DE3684223D1 (de) | 1992-04-16 |
| JPH0822226B2 (ja) | 1996-03-06 |
| DK414386A (da) | 1987-03-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4833084A (en) | Monoclonal antibody specific for DNA.RNA hybrids | |
| JPH06113832A (ja) | ジゴキシンに対し高い親和性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリッドセルライン及びその製造法 | |
| Chan et al. | Indirect immunofluorescence studies of proliferating cell nuclear antigen in nucleoli of human tumor and normal tissues | |
| Dreyer et al. | Tissue specific nuclear antigens in the germinal vesicle of Xenopus laevis oocytes | |
| Kochersperger et al. | Immunological uniqueness of human monoamine oxidases A and B: new evidence from studies with monoclonal antibodies to human monoamine oxidase A | |
| US5407804A (en) | Assays for O6 -methylguanine-DNA methyltransferase | |
| JPS60501075A (ja) | ヒトガン疾患診断法及びテストキツト | |
| JP2003096099A (ja) | ヒトｈｍｇ−１に特異的に結合する抗体並びにこの抗体を用いるヒトｈｍｇ−１の免疫学的測定方法及び免疫学的測定試薬 | |
| US5413910A (en) | Measuring non-dystrophin proteins and diagnosing muscular dystrophy | |
| JPH0671435B2 (ja) | モノクロ−ン抗体 | |
| KR910008637B1 (ko) | 심근 미오신 중사슬에 대한 단일클론항체 | |
| JP2020148557A (ja) | 試料中のｈｍｇｂ１の測定方法及び測定試薬 | |
| JPS60155134A (ja) | 体液中のだ液α―アミラーゼの存在下にすいぞうα―アミラーゼを特異的に測定するための試薬 | |
| JP5058403B2 (ja) | Ｃｋ−ｍｂ活性測定法およびｃｋ−ｍｂ活性測定試薬 | |
| Pettijohn et al. | Nuclear proteins that become part of the mitotic apparatus: a role in nuclear assembly? | |
| KR100233208B1 (ko) | 림프계암 또는 상피 세포암의 예후 판정에 사용되는 핵의 인단백질 | |
| CN116836273B (zh) | 抗血清淀粉样蛋白a抗体、检测血清淀粉样蛋白a的试剂和试剂盒 | |
| JPH05176790A (ja) | 脳ミオシンに対するモノクローナル抗体 | |
| WO1985000503A1 (en) | Monoclonal antibodies to the h-y antigen, methods of production, applications, and products of manufacture | |
| CN116813764A (zh) | 一种白色念珠菌人源化抗体的制备方法 | |
| JP2004161657A (ja) | ラット精子細胞の部分分画を標識するモノクローナル抗体 | |
| JPS60253872A (ja) | 抗ｓ−１００蛋白抗体 | |
| Mishra et al. | Monoclonal Antibodies | |
| JPH0987298A (ja) | ダニ抗原に対するモノクローナル抗体及びその用途 | |
| EP0232255A1 (en) | Immunochemical assays for human amylase isoenzymes and related monoclonal antibodies, hybridoma cell lines and production thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |