JPH0672885B2

JPH0672885B2 - Analytical element

Info

Publication number: JPH0672885B2
Application number: JP60229800A
Authority: JP
Inventors: 司伊藤; 哲川勝; 明大西; 匡代石川
Original assignee: Konica Minolta Inc
Current assignee: Konica Minolta Inc
Priority date: 1985-10-17
Filing date: 1985-10-17
Publication date: 1994-09-14
Anticipated expiration: 2009-09-14
Also published as: JPS6290539A

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、流体試料中の微量成分測定用分析素子に係
り、特に生物学的流体試料中の特定微量成分を分析する
ための分析素子に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to an analytical element for measuring a trace component in a fluid sample, and more particularly to an analytical element for analyzing a specific trace component in a biological fluid sample. .

[Conventional technology]

生物学的流体試料中に含まれる極微量含有される物質を
検出する方法として、各種分析法の開発がなされてき
た。その分析方法は、主として免疫反応をその原理とす
るものである。上記原理を用いる測定法として、種々の
ものが開発されてきたが、最も精度の高いものとして、
免疫測定法が知られている。Various analytical methods have been developed as a method for detecting a substance contained in a trace amount contained in a biological fluid sample. The analysis method is based on the principle of immune reaction. Although various methods have been developed as the measurement method using the above principle, the most accurate method is as follows.
Immunoassays are known.

免疫測定法は、1958年、ベルソン（Berson）とイアロウ
（Yallow）が、放射性ヨードで標識した、ウシインシユ
リンと糖尿病患者血清中の抗インシユリン抗体を用い
て、血清中のインシユリンを測定することに成功して以
来、放射免疫測定法が広く用いられている。The immunoassay was successfully performed in 1958 by Berson and Yallow using serum iodine-labeled bovine insulin and anti-insulin antibodies in sera from patients with diabetes. Since then, radioimmunoassay has been widely used.

これ以後標識化合物として、放射性同位元素以外のもの
が種々開発がなされてきた。他の標識化合物としては例
えば、酵素、酵素基質、補酵素、酵素阻害物質、バクテ
リオフアージ、循環反応体、金属及び有機金属の錯体、
有機補欠分子族、化学発光性反応体、及び蛍光性分子等
が挙げられる。Since then, various labeling compounds other than radioisotopes have been developed. Other labeling compounds include, for example, enzymes, enzyme substrates, coenzymes, enzyme inhibitors, bacteriophages, circulating reactants, metal and organometallic complexes,
Examples include organic prosthetic groups, chemiluminescent reactants, and fluorescent molecules.

上記免疫測定法に関する技術上の重要な問題の１つとし
て、結合を起した物質（以下、Ｂと略記する）と起さな
かつた物質（以下、Ｆと略記する）の分離（以下B/F分
離と略記する）がある。As one of the important technical problems relating to the above-mentioned immunoassay, separation of a substance that causes binding (hereinafter abbreviated as B) and a substance that does not cause binding (hereinafter abbreviated as F) (hereinafter B / F) Abbreviated as separation).

従来、免疫測定法における問題点を解決するために各種
の方法が開発されてきた（例えば、特開昭53−38619
号、同53−79024号、同55−90859号、同57−67860号、
同57−200862号、同58−18167号、同59−77356号及び同
59−170768号各公報参照〕。Conventionally, various methods have been developed in order to solve the problems in the immunoassay method (for example, JP-A-53-38619).
No. 53-79024, No. 55-90859, No. 57-67860,
57-200862, 58-18167, 59-77356 and
59-170768).

しかし、これらの方法は、B/F分離が不完全である、ノ
イズが多く信号の信頼度に問題がある、測定可能な物質
が低分子物質に限られる等の欠点があつた。However, these methods have drawbacks such as incomplete B / F separation, noisy signal reliability, and low molecular weight measurable substances.

[Problems to be solved by the invention]

一方、ウエツト・ケミストリーにおいて、固定相を用い
た競合法による免疫測定法が開発されている（例えば特
開昭58−209994号及び同59−202064号各公報参照）。し
かし、それらの測定法では、両固定相を区別することな
く全体の酵素活性を測定しているため、バツクグラウン
ドやノイズの問題から、感度、精度及び再現性について
満足な結果が得られない。On the other hand, in Wet Chemistry, an immunoassay method by a competitive method using a stationary phase has been developed (see, for example, JP-A Nos. 58-209994 and 59-202064). However, in these measuring methods, the whole enzyme activity is measured without distinguishing both stationary phases, and therefore satisfactory results regarding sensitivity, accuracy and reproducibility cannot be obtained due to problems of background and noise.

他方、ドライ・ケミストリーにおいて、第２抗体を用い
る免疫測定法が開発されている（特開昭57−82766号及
び同57−82767号各公報参照）。しかし、これらは、操
作が煩雑であること、再現性の良い展開を行う技術が必
要であること等、改良の余地がある。更に、特開昭59−
34155号公報記載の発明では、未結合物収納シートを用
いる方法が開示されている。しかし、この方法でも、反
応用シートと未結合物収納シートとを密着させたままで
測定を行おうとすると前述した問題が生じ、また測定時
に両シートを分離するのは煩雑であり、特に測定を自動
化する際、障害となる。On the other hand, in dry chemistry, an immunoassay method using a second antibody has been developed (see JP-A Nos. 57-82766 and 57-82767). However, there is room for improvement in these because of complicated operations and the need for a technique for developing with good reproducibility. Furthermore, JP-A-59-
The invention described in Japanese Patent No. 34155 discloses a method of using an unbound object storage sheet. However, even in this method, the above-mentioned problem occurs when the measurement is performed while the reaction sheet and the unbound material storage sheet are in close contact with each other, and it is complicated to separate both sheets at the time of measurement, and particularly the measurement is automated. It becomes an obstacle when doing.

本発明は、前述の従来技術の欠点を改良するためになさ
れたものであり、その目的は、単一層の中でB/F分離を
行うことにより、測定対象として比較的高い分子量（２
万〜500万）の物質が適用可能であり、簡便な操作で感
度、精度及び再現性に優れた、流体試料中の特定成分を
定量することができる分析素子を提供することにある。The present invention has been made in order to improve the above-mentioned drawbacks of the prior art, and the purpose thereof is to carry out B / F separation in a single layer to obtain a relatively high molecular weight (2
The present invention is to provide an analytical element capable of quantifying a specific component in a fluid sample, which can be applied to 1 to 5 million substances) and is excellent in sensitivity, accuracy and reproducibility by a simple operation.

[Means for solving problems]

本発明を概説すれば、本発明は分析素子に関する発明で
あつて、流体試料中の特定成分Ａを、該特定成分Ａと特
異的に結合し得る物質Ｂと、該物質Ｂとは異なる特定成
分Ａと特異的に結合し得る物質Ｃと標識とが結合した標
識物Ｄとを用いて測定するための分析素子において、
（ａ）該物質Ｂを固定化した担体と、（ｂ）該物質Ｂに
結合した特定成分Ａに結合していない該標識物Ｄの標識
部位に特異的に結合して、該標識に起因する信号を変調
させる物質Ｅ（以下吸収物質Ｅと略記する）を固定化し
た担体とを含有する混合物を用いて形成した多孔質反応
層を有することを特徴とする。Briefly describing the present invention, the present invention relates to an analytical element, which is a substance B capable of specifically binding the specific component A in a fluid sample to the specific component A, and a specific component different from the substance B. In an analytical element for measurement using a substance C capable of specifically binding to A and a labeled substance D to which a label is bound,
(A) a carrier on which the substance B is immobilized, and (b) specifically binding to a labeling site of the labeled substance D which is not bound to the specific component A bound to the substance B, resulting from the labeling. It is characterized by having a porous reaction layer formed by using a mixture containing a carrier on which a substance E which modulates a signal (hereinafter abbreviated as absorbing substance E) is immobilized.

本発明に使用しうる流体試料としてはあらゆる形態の溶
液、コロイド溶液を挙げることができるが、好ましくは
生物由来の流体試料すなわち血液、血漿、血清、脳背髄
液、唾液、羊水、乳、尿、汗、肉汁等が挙げられ、特に
好ましいのは血液及び血清である。The fluid sample that can be used in the present invention can be any form of solution or colloidal solution, but preferably a biological fluid sample, that is, blood, plasma, serum, cerebrospinal fluid, saliva, amniotic fluid, milk, urine. , Sweat, gravy, etc., and particularly preferred are blood and serum.

本発明が測定しうる流体試料中の特定成分Ａとはその存
在又はその流体試料中での量が測定され、その成分の分
子の異なる部位に特異的に結合する物質が２種類以上得
うる物質又は物質の群であり、下記表１に挙げる物質又
は物質の群を例に挙げることができる。The specific component A in the fluid sample which can be measured by the present invention is a substance whose presence or amount thereof in the fluid sample is measured, and which can obtain two or more kinds of substances that specifically bind to different sites of the molecule of the component. Or, it is a group of substances, and the substance or the group of substances listed in Table 1 below can be mentioned as an example.

本発明に使用しうる流体試料中の特定成分Ａと特異的に
結合し得る物質Ｂとしては、測定対象により抗体、抗
原、レクチン、プロテインＡ、特定酵素の阻害物質など
が挙げられるが、該特定成分と該結合物質の結合反応が
抗原−抗体反応である場合が特に好ましい。本発明で使
用する抗体は、その由来を特に限定されるものではな
く、哺乳動物等に抗原を投与、免疫して得られる抗血
清、腹水液をそのままか、あるいは従来公知の方法であ
る（右田俊介編「免疫化学」中山書店第74〜88頁参
照）、硫酸ナトリウム沈殿法、硫酸アンモニウム沈殿
法、セフアデツクスゲルによるゲル過法、イオン交換
セルロールクロマトグラフイー法、電気泳動法等で精製
して用いることができる。 Examples of the substance B that can be specifically bound to the specific component A in the fluid sample that can be used in the present invention include an antibody, an antigen, a lectin, a protein A, and an inhibitor of a specific enzyme depending on the measurement target. It is particularly preferable that the binding reaction between the component and the binding substance is an antigen-antibody reaction. The antibody used in the present invention is not particularly limited in its origin, and an antiserum obtained by immunizing a mammal with an antigen, immunization, ascites fluid, or a conventionally known method (Right field) Shunsuke ed. “Immunochemistry”, Nakayama Shoten, pp. 74-88), sodium sulfate precipitation method, ammonium sulfate precipitation method, gel filtration method using Sephadex gel, ion-exchange cellulose chromatography method, electrophoresis method, etc. Can be used.

あるいは抗原で原作した哺乳動物等（例えばマウス）脾
蔵細胞と骨髄腫細胞（ミエローマ）とから雑種細胞（ハ
イブリドーマ）を得てモノクローナル抗体を用いるのが
特に好ましい。Alternatively, it is particularly preferred to obtain hybrid cells (hybridomas) from spleen cells (eg, mouse) spleen cells and myeloma cells (myeloma) that were originally produced with the antigen, and use the monoclonal antibody.

また、これらの抗体はIgG、IgM、IgA、IgD、IgE各分画
を用いることができ、あるいはこれらの抗体を酵素処理
してFab又はFab′といつた活性抗体フラグメントにして
使用してもよい。更にこれらの抗体は単一で使用して
も、複数の抗体を組合せ使用してもかまわない。Further, these antibodies may be IgG, IgM, IgA, IgD, IgE fractions, or may be used as active antibody fragments with Fab or Fab 'by enzymatically treating these antibodies. . Furthermore, these antibodies may be used alone or in combination of a plurality of antibodies.

流体試料中の特定成分Ａと特異的に結合し得る物質Ｂと
して抗体又は抗原を用いた場合、本発明分析素子の測定
原理は免疫測定法に属する。本発明の分析素子は免疫測
定法において特に好ましく使用できるが、本発明は免疫
測定法に限定されるものではなく、種々の応用が可能で
あることは以上に述べてきた内容からも明らかである。When an antibody or an antigen is used as the substance B capable of specifically binding to the specific component A in the fluid sample, the measurement principle of the analysis element of the present invention belongs to the immunoassay method. The analytical element of the present invention can be particularly preferably used in an immunoassay, but the present invention is not limited to the immunoassay, and it is apparent from the contents described above that various applications are possible. .

本発明に適用しうる標識としては、例えば、酵素、酵素
基質、酵素及び酵素前駆体の活性を変化させる物質（酵
素阻害物質、補酵素、補欠分子族、酵素前駆体を活性化
する物質など）、酵素前駆体、アポ酵素、蛍光物質など
が挙げられ、その代表的な例としては下記表２に示した
物質を挙げることができる。更に好ましくは表２に開示
された酵素及び蛍光物質が用いられる。（これらの標識
に起因する信号については後述する。） 2. 基質 p-ニトロフエニル‐β‐D-ガラクトシド o-ニトロフエニル‐βD-ガラクトシド 4-メチルウンベリフエロン‐β‐D-ガラクトシド p-ニトロフエニルホスフエートコルチゾール‐21-ヘミスクシネートウンベリフエロ
ンコンジユゲートルミノールイソルミノール N-（4-アミノブチル）‐N-エチルイソルミノールヘ
ミスクシンアミド N-（6-アミノヘキシル）‐N-エチルイソルミノール N-（4-アミノブチル）‐N-エチルイソルミノールルシゲニンアクリジニウムフエニルカルボキシレートロフインピロガロール没食子酸シロキシンビス（2,4,6-トリクロロフエニル）オキサレート及びそ
の誘導体 3. 酵素阻害物質フイソスチグミンメチオニンスルホキシミンワイルドフアイア（wildfire）毒素ブルーデキストラン o-ジアニシジン‐セルロース o-ジアニシジン‐デキストラン 2-プロピニルアミン 2-クロロアリルアミンフエニルグリシン p-ニトロフエニルグリシンアミノアセトニトリル 2-アミノ‐3-ヒドロキシプロピル‐1,3′‐カルボキシ
‐３′‐アミノ‐１′‐プロペニル‐１エーテル L-2-アミノ‐4-メトキシ‐トランス‐3-ブテン酸エタノールアミン o-サルフエートアルビジインアザセリンジアゾオキソノルロイシンジアゾオキソノアノルバリン △³-7-アミノセフアロスポリン酸ミモシン 2-アミノ‐4-ペンチン酸 2-アミノ‐4-クロロ‐4-ペンテン酸 3,3-ジクロロアラニン 3,3,3-トリクロロアラニン D-シクロセリン 2-ヒドロキシル‐3-ブチン酸 N,N-トリメチル‐2-プロピニルアミン β‐アミノプロピオニトリル 2-プロモエチルアミン 3-デシノイル‐N-アセチルシステアミン 2,3-デカジエノイル‐N-アセチルシステアミン β‐クロロ‐L-アラニン L-セリン‐o-サルフエート β‐フルオロアラニン L-ビニルグリシン D-ビニルグリシンプロパルギルグリシンガバクリン 5-ニトロ‐L-ノルバリン N-ベンジル‐N-メチル‐2-プロピニルアミン 3-ジメチルアミノ‐1-プロピングリセロールジイソプロピルホスホロフルオロライドフエニルメタンスルホニルフルオライドクラブラン酸アロプリノール 4. 補酵素・補欠分子族 FAD（フラビン・アデニン・ジヌクレオチド） FMN（フラビン・モノヌクレオチド）ヘム S-アデノシルメチオニン THF（テトラヒドロ葉酸） TPP（チアミン二リン酸） CoA（補酵素Ａ） UDP-Glc（ウリジン二リン酸グルコース） PLP（ピリドキサールリン酸） ATP（アデノシン三リン酸）ビオチン CoI（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド） CoII（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）アデノシルコバラミンメチルコバラミン CoM（2,2′‐ジチオジエタンスルホン酸） CoQ（ユビキノン） 5. アポ酵素アポグルタチオン還元酵素アポチトクローム還元酵素アポNADFHデヒドロゲナーゼアポグルコース・オキシダーゼアポリポアミド・デハイドロゲナーゼアポピリドキシン・ホスフエート・オキシダーゼアポペルオキシダーゼアポチトクロームＣアポキサンチンオキシダーゼアポ酵母乳酸デヒドロゲナーゼアポサルコシンオキシダーゼアポp-ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼアポアシル‐CoAデヒドロゲナーゼアポジヒドロリポ酸デヒドロゲナーゼアポコハク酸デヒドロゲナーゼアポホモシステインメチルトランスフエラーゼアポグルタミン酸ホルミルトランスフエラーゼアポトランスケトラーゼアポコリンアセチルトランスフエラーゼアポグリコーゲンシンターゼアポアラニンアミノトランスフエラーゼアポヘキソキナーゼ 6. 酵素前駆体を活性化させる物質エンテロペプチダーゼストレプトキナーゼプロテインキナーゼ酵素前駆体の各種プロテアーゼ 7. 酵素前駆体トリブシノーゲンキモトリプシノーゲンプロコリパーゼプロホスホリパーゼプロレニンプロカルボキシペプチダーゼＡプロカルボキシペプチダーゼＢキニノーゲンプロエラスターゼアンギオテンシノーゲンプロインシユリンプロパラチロイドホルモンプログルカゴンプロコラーゲン（可溶性）凝集因子 XI、XII、XIII プロコラゲナーゼプロココーナーゼプレカリクレインペプシノーゲンプラスミノーゲンフイプリノーゲンプロトロンピンプラスミノーゲンプロアクチベータプロアクロジン 8. 蛍光物質フルオレセインイソチオシアナート（FITC）テトラメチルローダミンイソチオシアナート（TRIT
C）ローダミンＢイソチオシアナート（RBITC）リサミンローダミン‐B200スルホリルクロライド（RB
200SC）ウンペリフエロン 4-メチルウンペリフエロン（4MU）フルオレセインチオフルバミル（FTC）フルオレセインチオカルバミル‐ジフエニルグリシン
（FTC-DPG）テトラメチルローダミン（TMR） 5-〔（4,6-ジクロロトリアジン‐2-イル）‐アミノ〕フ
ルオレセインジメチルアミノナフタレン‐5-スルホニルクロライド
（DNS-Cl）フルオラム 2-メトキシ‐2,4-ジフエニル‐３（2H）‐フラノン（MD
PF） 7-クロロ‐4-ニトロベンゾ‐2-オキサ‐1,3-ジアゾール
（MBD-Cl） 1-アニリノ‐8-ナフタレンスルホン酸（ANS） N-（3-ピレン）‐マレイミド（NPM） N-（7-ジメチルアミノ‐4-メチル‐2-オキシ‐3-クロロ
メチル）‐マレイミド（DACM） N-（p-2-ペンズイミダゾイル‐フエニル）‐マレイミド
（BIPM）アントラセンイソチオシアナートフルオロアンチルマレイミド（FAM）希土類元素を含む各種キレート及びこれらの誘導体本発明において標識物Ｄとは、前述の特定成分Ａと特異
的に結合し得る物質Ｃに前述の標識をその信号を発する
能力を保持したまま化学的手段等で直接又は間接的に結
合した物質の総称である。種々の公知の方法で前述の標
識を化学結合させることができ、更にくわしく言えば石
川栄治、河合忠、宮井潔編「酵素免疫測定法（第２
版）」（医学書院、1978年刊）や日本臨床病理学会編
「臨床病理」臨時増刊特集第53号「臨床検査のためのイ
ムノアツセイ−技術と応用−」（臨床病理刊行会、1983
年刊）に記載された方法を参考にすることができる。こ
れらの方法のうちでもグルタルアルデヒド法、過ヨーソ
酸法（ナカネ法）、マレイミド法は特に好ましく用いる
ことができる。Labels applicable to the present invention include, for example, substances that change the activity of enzymes, enzyme substrates, enzymes and enzyme precursors (enzyme inhibitors, coenzymes, prosthetic groups, substances that activate enzyme precursors, etc.) , Enzyme precursors, apoenzymes, fluorescent substances and the like, and typical examples thereof include the substances shown in Table 2 below. More preferably, the enzymes and fluorescent substances disclosed in Table 2 are used. (The signals due to these signs will be described later.) 2. Substrate p-nitrophenyl-β-D-galactoside o-nitrophenyl-βD-galactoside 4-methylumbellifererone-β-D-galactoside p-nitrophenylphosphate cortisol-21-hemisuccinate umbelliferone conjugate luminol isorminol N- (4-aminobutyl) -N-ethyl isorminol hemisuccinamide N- (6-aminohexyl) -N-ethyl isorminol N- (4-aminobutyl) -N-ethyl isorminol lucigenin acridinium phenyl carboxylate loffin pyrogallol Siloxin gallate Bis (2,4,6-trichlorophenyl) oxalate and its derivatives 3. Enzyme inhibitors Physostigmine Methionine Sulfoximine Wildfire toxin Blue dextran o-dianisidine-cellulose o- Anisidine-dextran 2-propynylamine 2-chloroallylamine phenylglycine p-nitrophenylglycine aminoacetonitrile 2-amino-3-hydroxypropyl-1,3'-carboxy-3'-amino-1'-propenyl-1 ether L-2-Amino-4-methoxy-trans-3-butenoic acid Ethanolamine o-Sulfate alvidiin Azaserine Diazooxonorleucine Diazooxonoanorvaline △ ³ -7-Aminocephalosporinic acid Mimosine 2-Amino-4-pentyne Acid 2-Amino-4-chloro-4-pentenoic acid 3,3-Dichloroalanine 3,3,3-Trichloroalanine D-Cycloserine 2-hydroxyl-3-butyric acid N, N-Trimethyl-2-propynylamine β- Aminopropionitrile 2-Promoethylamine 3-decinoyl-N-acetylcysteamine 2,3-decadienoyl -N-acetylcysteamine β-chloro-L-alanine L-serine-o-sulfate β-fluoroalanine L-vinylglycine D-vinylglycine propargylglycine gabacrine 5-nitro-L-norvaline N-benzyl-N-methyl-2 -Propynylamine 3-Dimethylamino-1-propyne Glycerol Diisopropylphosphorofluoride Phenylmethanesulfonyl fluoride Clavulanic acid Allopurinol 4. Coenzyme / Prosthetic group FAD (flavin / adenine dinucleotide) FMN (flavin / mononucleotide) ) Heme S-adenosylmethionine THF (tetrahydrofolate) TPP (thiamine diphosphate) CoA (coenzyme A) UDP-Glc (uridine diphosphate glucose) PLP (pyridoxal phosphate) ATP (adenosine triphosphate) biotin CoI (Nicotinamide adenine dinucleoti De) CoII (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate) adenosyl cobalamin methyl cobalamin CoM (2,2'-dithiodiethane sulfonic acid) CoQ (ubiquinone) 5. apoenzyme apoglutathione reductase apocytochrome reductase apo NADFH dehydrogenase apo Glucose oxidase Apolipoamide dehydrogenase Apopyridoxine phosphate oxidase Apoperoxidase Apocytochrome C Apoxanthine oxidase Apo yeast lactate dehydrogenase Apo sarcosine oxidase Apo p-hydroxybenzoate hydroxylase Apoacyl-CoA dehydrogenase Apogehydrolipoic acid dehydrogenase Apo succinic acid Dehydrogenase Apohomocysteine Methyl transfruase Apoglutamate formyltrans Fuerase apotransketolase Apocholine acetyl transphrutherase Apoglycogen synthase Apoalanine amino transfuberase apohexokinase 6. Substances that activate zymogens enteropeptidase streptokinase protein kinases zymogen precursors 7. zymogen precursors Businogen Chymotrypsinogen Procolipase Prophospholipase Prorenin Procarboxypeptidase A Procarboxypeptidase B Kininogen Proelastase Angiotensinogen Proincyurin Proparathyroid hormone Proglucagon Procollagen (soluble) aggregation factors XI, XII, XIII Procollagenase Prococornase precourase Kallikrein pepsinogen plasminogen fiuprineau Down Pro Tron pin plasminogen pro activator Puroakurojin 8. phosphor fluorescein isothiocyanate (FITC) tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRIT
C) Rhodamine B Isothiocyanate (RBITC) Lissamine Rhodamine-B200 Sulphonyl chloride (RB
200SC) Umperipherone 4-Methylumperipherone (4MU) Fluorescein Ophthalvamil (FTC) Fluorescein Thiocarbamyl-diphenylglycine (FTC-DPG) Tetramethylrhodamine (TMR) 5-[(4,6-Dichlorotriazine- 2-yl) -Amino] fluorescein Dimethylaminonaphthalene-5-sulfonyl chloride (DNS-Cl) Fluoram 2-methoxy-2,4-diphenyl-3 (2H) -furanone (MD
PF) 7-Chloro-4-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazole (MBD-Cl) 1-anilino-8-naphthalenesulfonic acid (ANS) N- (3-pyrene) -maleimide (NPM) N- (7-Dimethylamino-4-methyl-2-oxy-3-chloromethyl) -maleimide (DACM) N- (p-2-pentimidazoyl-phenyl) -maleimide (BIPM) anthracene isothiocyanate fluoroantirumaleimide ( FAM) Various chelates containing rare earth elements and their derivatives In the present invention, the labeled substance D is a chemical substance while retaining the ability to emit the above-mentioned label to the substance C capable of specifically binding to the above-mentioned specific component A. It is a generic term for substances that are directly or indirectly bound by means such as physical means. The above-mentioned label can be chemically bound by various known methods, and more specifically, “Ezyme Immunoassay (2nd Edition)” edited by Eiji Ishikawa, Tadashi Kawai, Kiyoshi Miyai.
Edition) "(Medical Shoin, published in 1978) and the Japanese Society for Clinical Pathology" Clinical Pathology "Extra Number Special Issue No. 53" ImmunoAssay for Clinical Examination -Technology and Application- "(Clinical Pathology Press, 1983)
You can refer to the method described in the annual publication. Among these methods, the glutaraldehyde method, the periodate acid method (Nakane method), and the maleimide method can be particularly preferably used.

また、「標識物Ｄ」に用いる「特定成分Ａと特異的に結
合し得る物質Ｃ」は、担体に固定化した「特定成分Ａと
特異的に結合し得る物質Ｂ」とは異なる種類のもので、
両者は該特定成分の一分子の異なる部位に同時に結合し
得る必要がある。The “substance C capable of specifically binding to the specific component A” used in the “labeled substance D” is of a different type from the “substance B capable of specifically binding to the specific component A” immobilized on the carrier. so,
Both must be able to bind simultaneously to different sites of one molecule of the specific component.

本発明に使用する吸収物質Ｅ、すなわち、前述の標識物
Ｄの標識部位に特異的に結合して、該標識に起因する信
号を消滅するか減じる物質Ｅは、使用する標識に対応し
て選ばれるべきものであり、下記のような物質を例に挙
げることができる。The absorbing substance E used in the present invention, that is, the substance E that specifically binds to the labeling site of the above-mentioned labeled substance D to eliminate or reduce the signal caused by the label is selected according to the label used. It should be done, and the following substances can be mentioned as examples.

1. 標識が「酵素」である場合標識に起因する信号該酵素活性による基質の減少・生成物の増加、エネルギ
ーの放射及びそれらに起因する変化好ましい吸収物質Ｅ該酵素に対する阻害剤（表２に挙げた阻害物質から該酵
素に対応するものを選んで使用できる。）該酵素に対する抗体で、酵素に結合してその活性に影響
を与えるもの 2. 標識が「酵素基質」である場合標識に起因する信号該基質が分析素子中に添加された酵素と反応することに
より生ずる生成物の増加、エネルギーの放射及びそれら
に起因する変化好ましい吸収物質Ｅ該基質に対する抗体で、基質に結合することにより該酵
素反応を阻害するもの。1. When the label is an enzyme Signal caused by the label Reduction of substrate due to the enzyme activity / increase of product, emission of energy and changes resulting from them Preferable absorption substance E Inhibitor for the enzyme (see Table 2) Those that correspond to the enzyme can be selected from the listed inhibitors and used.) Antibodies to the enzyme that bind to the enzyme and affect its activity 2. When the label is "enzyme substrate" Caused by the label The increase in product produced by the reaction of the substrate with the enzyme added to the analytical element, the emission of energy, and the changes caused thereby. Preferred absorbing substance E An antibody against the substrate, which is bound to the substrate by binding to the substrate. Those that inhibit the enzymatic reaction.

該基質を不可逆的阻害剤として取り込む酵素該基質を基質とする酵素で、その反応により本来検出し
ようとしている信号を発しないもの 3. 標識が「補酵素」又は「補欠分子族」である場合標識に起因する信号分析素子中に添加された該標識を必要とする酵素の反応
による基質の減少、生成物の増加、及びそれらに起因す
る変化好ましい吸収物質Ｅ該標識に対する抗体で、該標識に結合してその活性に影
響を与えるもの該標識を吸収又は消費するが、その活性により本来検出
しようとしている信号を発しないもの。Enzymes that take in the substrate as an irreversible inhibitor Enzymes that use the substrate as a substrate and do not give the signal originally intended to be detected by the reaction 3. When the label is "coenzyme" or "prosthetic group" Label Signal due to: decrease in substrate due to reaction of enzyme added to the analysis element, which requires the label, increase in product, and change caused by them preferable absorbing substance E antibody to the label, binding to the label Those that absorb or consume the label, but do not give the signal originally intended to be detected due to its activity.

4. 標識が「アポ酵素」である場合標識に起因する信号該標識はそのままでは信号を発しない。4. When the label is "apoenzyme" Signal originating from the label The label does not give a signal as it is.

後述の吸収物質と結合して酵素活性を再現し、その活性
による基質の減少・生成物の増加及びそれらに起因する
変化を測定できる。The enzyme activity can be reproduced by binding with an absorbing substance described later, and the decrease in the substrate, the increase in the product, and the change due to them due to the activity can be measured.

好ましい吸収物質Ｅ該標識の酵素活性を発現させる補欠分子族。（表２に例
示した補欠分子族から該標識に対応するものを選んで使
用できる） 5. 標識が「酵素前駆体を活性化させる物質」である場
合標識に起因する信号該標識が、分析素子中に添加された酵素前駆体を活性化
し、その活性による基質の減少、生成物の増加、及びそ
れらに起因する変化好ましい吸収物質Ｅ該物質に対する抗体で、該物質に結合してその活性に影
響を与えるもの該物質が酵素である場合、その阻害剤 6. 標識が「酵素前駆体」である場合標識に起因する信号該標識はそのままでは信号を発しない。Preferred Absorbent E A prosthetic group that expresses the enzyme activity of the label. (A corresponding one of the prosthetic groups shown in Table 2 can be selected and used.) 5. When the label is a “substance that activates a zymogen” A signal originating from the label Activates the zymogen added therein and decreases the substrate due to its activity, increases the product, and changes caused by them. Preferred absorption substance E An antibody against the substance, which binds to the substance and affects its activity When the substance is an enzyme, its inhibitor 6. When the label is a “enzyme precursor” Signal originating from the label The label does not give a signal as it is.

後術の吸収物質にいつたん結合後分子の一部が切断され
た酵素活性を発現し、その活性による基質の減少・生成
物の増加及びそれらに起因する変化を測定できる。It is possible to measure the enzyme activity in which a part of the molecule is cleaved after binding to the absorbent substance in the postoperative procedure, and the decrease in the substrate, the increase in the product, and the resulting change due to the activity can be measured.

好ましい吸収物質Ｅ該標識の酵素活性を発現させる物質 7. 標識が「蛍光物質」である場合標識に起因する信号該蛍光物質に励起光をあてた際に発する蛍光好ましい吸収物質Ｅ該標識に対する抗体及びその誘導体で、該標識の蛍光波
長・強度を変化させるもの。Preferred Absorbing Substance E A substance that expresses the enzyme activity of the label 7. When the label is a "fluorescent substance" Signal originating from the label Fluorescence emitted when the fluorescent substance is irradiated with excitation light Preferred absorbing substance E Antibody to the label And derivatives thereof that change the fluorescence wavelength and intensity of the label.

上記の各種吸収物質の具体例はいずれも当業者によく知
られており、あらためて開示するまでもないが本発明の
理解を助けるために、代表的な例を以下に示す。Although specific examples of the above-mentioned various absorbing materials are well known to those skilled in the art, and needless to disclose them again, representative examples will be shown below in order to facilitate understanding of the present invention.

本発明に使用しうる酵素と阻害剤の組合せとしては、ビ
チオン酵素（ピルビン酸カルボキシラーゼ、アセチルCo
-Aカルボキシラーゼ、プロピオニル‐CoAカルボキシラ
ーゼ、メチルマロニル‐CaAカルボキシラーゼなど）と
アビジン、ペルオキシダーゼとo-ジアニジン‐デキスト
ラン、乳酸オキシダーゼと2-ヒドロキシル‐3-ブチン
酸、モノアミンオキシダーゼとN,N-トリメチル‐2-プロ
ピニルアミン又はβ‐アミノプロピオニトリルなどが挙
げられ、更にジヤーナルオブジアメリカンケミ
カルソサイアテイ（J.Am.Chem.Soc）第80巻、第456頁
（1958年）；同第82巻、第596頁（1960年）；アカウン
ツオブケミカルリサーチ（Acc.Chem.Res）第９巻
313頁（1976年）；サイエンス（Science）第185巻320頁
（1974年）；化学工業1985第21頁（1985年）などに記載
された、若しくは引用された酵素阻害剤の組合せも好ま
しく用いることができる。The combination of the enzyme and the inhibitor that can be used in the present invention includes a biotin enzyme (pyruvate carboxylase, acetyl Co).
-A carboxylase, propionyl-CoA carboxylase, methylmalonyl-CaA carboxylase, etc.) and avidin, peroxidase and o-dianidin-dextran, lactate oxidase and 2-hydroxyl-3-butyric acid, monoamine oxidase and N, N-trimethyl-2- Examples include propynylamine and β-aminopropionitrile. Further, Journal of the American Chemical Society (J.Am.Chem.Soc) Volume 80, 456 (1958); Volume 82, 596. (1960); Volume 9 of Accounts of Chemical Research (Acc.Chem.Res)
313 (1976); Science, Volume 185, 320 (1974); Chemical Industry 1985, page 21 (1985) and the like, or combinations of enzyme inhibitors described preferably are also preferably used. You can

本発明の主要部分をなす多孔質反応層は前記（ａ）及び
（ｂ）で表される担体を含有する混合物を用いて形成
（例えば塗布及び／又は製膜することによる）したもの
であり、担体としては例えば粒子、繊維が挙げられる。The porous reaction layer forming the main part of the present invention is formed (for example, by coating and / or film forming) using a mixture containing the carrier represented by the above (a) and (b), Examples of the carrier include particles and fibers.

ここで用いられる粒子は粒径１〜1000μｍが好ましく材
質としては、デキストラン、アガロース、ポリアミド、
ポリスチレン、ポリカーボネート、あるいは特開昭55−
90859号公報に開示された材質などの有機ポリマー粒
子、あるいはガラス、二酸化ケイ素、ケイ砂などの無機
粒子を好ましく用いることができるが、特開昭57−1017
60号及び同57−101761号公報に開示された自己結合性粒
子を用いることが特に好ましい。代表的な材質としては
次の表３のようなものが例示できる。The particles used here preferably have a particle size of 1 to 1000 μm, and examples of the material include dextran, agarose, polyamide,
Polystyrene, polycarbonate, or JP-A-55-
Organic polymer particles such as those disclosed in Japanese Patent No. 90859, or inorganic particles such as glass, silicon dioxide and silica sand can be preferably used.
It is particularly preferable to use the self-bonding particles disclosed in JP-A-60 and JP-A-57-101761. Examples of typical materials include those shown in Table 3 below.

表３例示化合物（１）ポリ（スチレン‐コ‐グリシジルメタクリレート）〔90
/10〕（２）ポリ（スチレン‐コ‐メチルアクリレート‐コ‐グリシ
ジルメタクリレート）〔80/15/5〕（３）ポリ（スチレン‐コ‐n-ブチルメタクリレート‐コ‐グ
リシジルメタクリレート）〔75/15/10〕。Table 3 Exemplified compounds (1) Poly (styrene-co-glycidyl methacrylate) [90
/ 10] (2) Poly (styrene-co-methyl acrylate-co-glycidyl methacrylate) [80/15/5] (3) Poly (styrene-co-n-butyl methacrylate-co-glycidyl methacrylate) [75/15 /Ten〕.

（４）ポリ（スチレン‐コ‐ビニルベンジルクロライド‐コ‐
グリシジルメタクリレート）〔80/10/10〕。(4) Poly (styrene-co-vinylbenzyl chloride-co-
Glycidyl methacrylate) [80/10/10].

（５）ポリ（スチレン‐コ‐ジビニルベンゼン‐コ‐グリシジ
ルアクリレート）〔90/2/8〕。(5) Poly (styrene-co-divinylbenzene-co-glycidyl acrylate) [90/2/8].

（６）ポリ（p-ビニルトルエン‐コ‐グリシジルメタクリレー
ト）〔90/10〕。(6) Poly (p-vinyltoluene-co-glycidyl methacrylate) [90/10].

（７）ポリ（メタクリレート‐コ‐グリシジルメタクリレート
〔80/20〕。(7) Poly (methacrylate-co-glycidyl methacrylate [80/20].

（８）ポリ（スチレン‐コ‐N,N-ジメチルアミノエチルメタク
リレート）〔95/5〕。(8) Poly (styrene-co-N, N-dimethylaminoethyl methacrylate) [95/5].

（９）ポリ（スチレン‐コ‐アジリジルエチルメタクリレー
ト）〔95/5〕。(9) Poly (styrene-co-aziridylethylmethacrylate) [95/5].

（10）ポリ（スチレン‐コ‐メチルアクリレート‐コ‐アクロ
レイン）〔90/5/5〕。(10) Poly (styrene-co-methyl acrylate-co-acrolein) [90/5/5].

（11）ポリ（スチレン‐コ‐アクリルアミド）〔95/5〕（12）ポリ（スチレン‐コ‐ビニルチオール）〔95/5〕。(11) Poly (styrene-co-acrylamide) [95/5] (12) Poly (styrene-co-vinylthiol) [95/5].

（13）ポリ（スチレン‐コ‐メチロール化アクリルアミド）
〔95/5〕。(13) Poly (styrene-co-methylolated acrylamide)
[95/5].

（14）ポリ（スチレン‐コ‐t-ブチルアクリレート‐グリシジ
ルメタクリレート）〔95/5/5〕。(14) Poly (styrene-co-t-butyl acrylate-glycidyl methacrylate) [95/5/5].

（15）ポリ（スチレン‐コ‐ビニルイソシアネート）〔95/
5〕。(15) Poly (styrene-co-vinyl isocyanate) [95 /
Five〕.

（16）ポリ（メチルアクリレート‐コ‐スチレン‐コ‐N-メチ
ロールアクリルアミド）〔50/35/15〕。(16) Poly (methyl acrylate-co-styrene-co-N-methylol acrylamide) [50/35/15].

（17）ポリ（スチレン‐コ‐グリシジルメタクリレート‐コ‐
N,N-ジメチルアミノエチルメタクリレート）〔90/5/
5〕。(17) Poly (styrene-co-glycidyl methacrylate-co-
N, N-dimethylaminoethyl methacrylate) [90/5 /
Five〕.

（18）ポリ（スチレン‐コ‐メタクリル酸‐コ‐アクリルアミ
ド）〔95/2/3〕。(18) Poly (styrene-co-methacrylic acid-co-acrylamide) [95/2/3].

（19）ポリ（スチレン‐コ‐N-メチロールアクリルアミド‐コ
‐アクリル酸メトキシエチル）〔95/5/5〕。(19) Poly (styrene-co-N-methylolacrylamide-co-methoxyethyl acrylate) [95/5/5].

（20）ポリ（p-ビニルトルエン‐コ‐N-メチロールアクリルア
ミド‐コ‐アクリル酸）〔90/8/2〕。(20) Poly (p-vinyltoluene-co-N-methylolacrylamide-co-acrylic acid) [90/8/2].

（21）ポリ（メチルメタクリレート‐コ‐グリシジルメタクリ
レート‐コ‐t-ブチルアクリレート）〔80/10/10〕。(21) Poly (methyl methacrylate-co-glycidyl methacrylate-co-t-butyl acrylate) [80/10/10].

（22）ポリ（スチレン‐コ‐p-ビニルペンジルクロライド‐コ
‐アクリル酸‐コ‐アクリル酸ウレイドエチル）〔75/1
0/5/10〕。(22) Poly (styrene-co-p-vinylpentyl chloride-co-acrylic acid-co-ureidoethyl acrylate) [75/1
0/5/10].

（23）ポリ（スチレン‐コ‐メタクロレイン‐コ‐α‐ヒドロ
キシエチルメタクリレート）〔90/5/5〕。(23) Poly (styrene-co-methacrolein-co-α-hydroxyethyl methacrylate) [90/5/5].

（24）ポリ（スチレン‐コ‐アクロレイン‐コ‐アセトアセト
キシエチルメタクリレート）〔85/5/10〕。(24) Poly (styrene-co-acrolein-co-acetoacetoxyethyl methacrylate) [85/5/10].

（25）ポリ（スチレン‐コ‐N,N-ジメチルアミノエチルアクリ
レート‐コ‐ビニルスルホニルエチルメタクリレート）
〔90/5/5〕。(25) Poly (styrene-co-N, N-dimethylaminoethyl acrylate-co-vinylsulfonylethyl methacrylate)
[90/5/5].

（26）ポリ（p-ビニルトルエン‐コ‐アミノスチレン‐コ‐ビ
ニルスルホニルエチルメタクリレート）〔85/10/5〕。(26) Poly (p-vinyltoluene-co-aminostyrene-co-vinylsulfonylethylmethacrylate) [85/10/5].

（27）ポリ（スチレン‐コ‐N,N-ジメチルアミノエチルメタク
リレート）〔90/10〕。(27) Poly (styrene-co-N, N-dimethylaminoethyl methacrylate) [90/10].

（28）ポリ（スチレン‐コ‐アクリル酸）〔97/3〕。(28) Poly (styrene-co-acrylic acid) [97/3].

（29）ポリ（スチレン‐コ‐アクリルアミド）〔97/3〕（30）ポリ（p-ビニルトルエン‐コ‐t-ブチルアクリレート）
〔95/5〕（31）ポリ（メチルアクリレート‐コ‐メタクリルアミド）
〔95/5〕（32）ポリ（スチレン‐コ‐N-メチロールアクリルアミド）
〔95/5〕（33）ポリ（p-ビニルベンジルクロライド‐コ‐N-メチロール
アクリルアミド）〔96/4〕（34）ポリ（スチレン‐コ‐イタコン酸）〔98/2〕（35）ポリ（スチレン‐コ‐t-ブチルアクリレート）〔92/8〕（36）ポリ（メチルアクリレート‐コ‐スチレン‐コ‐アクロ
レイン）〔30/65/5〕（37）ポリ（メチルメタクリレート‐コ‐スチレン‐コ‐2-ヒ
ドロキシエチルメタクリレート）〔25/70/5〕（38）ポリ（スチレン‐コ‐ビニルスルホニルエチルアクリレ
ート）〔80/20〕（39）ポリ（スチレン‐コ‐N,N-ジメチルアミノエチルアクリ
レート）〔90/10〕（40）ポリ（スチレン‐メチルアクリレート‐コ‐アセトアセ
トキシエチルアクリレート）〔90/5/5〕（41）ポリ（スチレン‐コ‐メタクリル酸）〔95/5〕各例示化合物の後の括弧内は重合反応に用いた単量体の
重量％を示す。(29) Poly (styrene-co-acrylamide) [97/3] (30) Poly (p-vinyltoluene-co-t-butyl acrylate)
[95/5] (31) Poly (methyl acrylate-co-methacrylamide)
[95/5] (32) Poly (styrene-co-N-methylolacrylamide)
[95/5] (33) Poly (p-vinylbenzyl chloride-co-N-methylolacrylamide) [96/4] (34) Poly (styrene-co-itaconic acid) [98/2] (35) Poly ( Styrene-co-t-butyl acrylate) [92/8] (36) Poly (methyl acrylate-co-styrene-co-acrolein) [30/65/5] (37) Poly (methyl methacrylate-co-styrene-co -2-Hydroxyethyl methacrylate) [25/70/5] (38) Poly (styrene-co-vinylsulfonylethyl acrylate) [80/20] (39) Poly (styrene-co-N, N-dimethylaminoethyl acrylate) ) [90/10] (40) Poly (styrene-methyl acrylate-co-acetoacetoxyethyl acrylate) [90/5/5] (41) Poly (styrene-co-methacrylic acid) [95/5] Each exemplified compound Polymerization reaction is shown in parentheses after It indicates the weight percent of the monomers used.

あるいは、これらの粒子数種を混合して用いることもで
きる。Alternatively, several kinds of these particles may be mixed and used.

また、本発明の多孔質反応層に用いる繊維としては、バ
ルブ、綿、麻、絹、羊毛、セルロースエステル、ビスコ
ースレーヨン、銅アンモニアレーヨン、ポリアミド（6-
ナイロン、6,6-ナイロン、6,10-ナイロンなど）、ポリ
エステル（ポリエチレンテレフタレートなど）、ポリオ
レフイン（ポリプロピレン、ビニロンなど）、ガラス繊
維、石綿など。植物性・動物性・鉱物性・合成・半合成
・再生繊維を用いることができ、あるいはこれらを混合
して用いても良い。The fibers used in the porous reaction layer of the present invention include valves, cotton, hemp, silk, wool, cellulose ester, viscose rayon, copper ammonia rayon, polyamide (6-
Nylon, 6,6-nylon, 6,10-nylon, etc.), polyester (polyethylene terephthalate, etc.), polyolefin (polypropylene, vinylon, etc.), glass fiber, asbestos, etc. Plant-based / animal-based / mineral-based / synthetic / semi-synthetic / regenerated fibers may be used, or a mixture of these may be used.

該特定成分と特異的に結合する物質の固定化は、種々の
公知の方法により、該物質を前述の粒子又は繊維の表面
に物理的に吸着させるか、化学反応により直接あるいは
間接的に結合させることにより達成される。この際該物
質の該特定成分に対する特異的結合性が失われないよう
に留意する必要があり、例えば石川栄治、河合忠、宮井
潔編「酵素免疫測定法（第２版）」（医学書院、1978
年刊）、千畑一郎、土佐哲也、松尾雄志著「実験と応用
アフイニテイクロマトグラフイー」（講談社 1976年
刊）に記載されている方法を、好ましい方法の例として
挙げることができる。Immobilization of a substance that specifically binds to the specific component can be achieved by physically adsorbing the substance onto the surface of the particles or fibers described above by various known methods, or by directly or indirectly binding by a chemical reaction. It is achieved by At this time, it is necessary to pay attention so that the specific binding property of the substance to the specific component is not lost, and for example, “Enzyme-linked immunosorbent assay (second edition)” edited by Eiji Ishikawa, Tadashi Kawai, Kiyoshi Miyai (Medical Shoin, 1978
The method described in "Experiment and Application Affinity Chromatographie" (Kodansha, 1976) by Ichiro Chibata, Tetsuya Tosa, Yushi Matsuo (published in 1976) can be mentioned as an example of a preferable method.

また、該特定成分Ａと特異的に結合する物質Ｅを固定化
した後必要に応じて免疫反応における非特異的反応を排
除する目的で、測定すべき免疫反応に関与しないタンパ
ク質を担持することが可能である。Further, after immobilizing the substance E that specifically binds to the specific component A, a protein that is not involved in the immune reaction to be measured may be carried for the purpose of eliminating a nonspecific reaction in the immune reaction, if necessary. It is possible.

これらの代表的な例としては哺乳動物の正常血清タン白
質、アルブミン、ゼラチン及びその分解物等が挙げられ
る。Typical examples thereof include normal mammalian serum proteins, albumin, gelatin, and degradation products thereof.

以上述べてきた方法で前記（ａ）及び（ｂ）を作成す
る。この際（ａ）と（ｂ）は必ずしも同じ材質である必
要はなく、異なる材質の粒子、異なる材質の繊維、ある
いは粒子と繊維を組合せて使用しても良い。ただし、
（ａ）と（ｂ）を均一に混合するためには、平均粒径が
著しく異なる粒子を組合せるのは好ましくない。The above (a) and (b) are prepared by the method described above. At this time, (a) and (b) do not necessarily have to be the same material, and particles of different materials, fibers of different materials, or particles and fibers may be used in combination. However,
In order to uniformly mix (a) and (b), it is not preferable to combine particles having significantly different average particle sizes.

粒子又は繊維（ａ）、（ｂ）の混合比は各々に固定化さ
れた各特異的結合物質の量と結合定数に応じ定められ、
必要に応じては更に、特異的結合物質を固定化していな
い粒子又は繊維を調整のために加えても良い。The mixing ratio of particles or fibers (a) and (b) is determined according to the amount of each specific binding substance immobilized on each and the binding constant,
If necessary, particles or fibers to which a specific binding substance is not immobilized may be added for preparation.

これらの混合物を塗布及び／又は製膜することにより、
流体試料と自由に接触し得る相互連絡空隙孔を有する多
孔性構造が存在する多孔質反応層を形成する。自己結合
性を有しない粒子は適当な接着剤を用いて粒子同志が点
接着する形で製膜することができ、例えば特開昭55−90
859号の方法を適用することができる。自己結合性を有
する有機ポリマー粒子は特開昭57−101760号又は同57−
101761号各公報に記載の方法により同様に製膜できる。
繊維又は繊維及び粒子混合物については特開昭57−1258
47号、同57−197466号公報に記載された繊維分散液を塗
布することにより多孔質反応層を形成でき、また特願昭
59−28571号明細書で行われている方法のようにゼラチ
ンやポリビニルピロリドンのような水溶性バインダーを
使用した繊維分散液を塗布することも可能である。By applying and / or forming a film of these mixtures,
Form a porous reaction layer in which there is a porous structure with interconnecting pores that can freely contact the fluid sample. Particles having no self-bonding property can be formed into a film in which the particles are spot-bonded to each other by using an appropriate adhesive, for example, JP-A-55-90.
The method of No. 859 can be applied. Organic polymer particles having self-bonding property are disclosed in JP-A-57-101760 or 57-
A film can be similarly formed by the method described in each of the 101761 publications.
Japanese Patent Application Laid-Open No. 57-1258 discloses fibers or a mixture of fibers and particles.
A porous reaction layer can be formed by applying the fiber dispersion described in JP-A Nos. 47 and 57-197466.
It is also possible to apply a fiber dispersion using a water-soluble binder such as gelatin or polyvinylpyrrolidone, as in the method carried out in 59-28571.

本発明の分析素子の形態は分析を行いうるものであれば
よく、特に制限されるものではないが、製造上及び操作
・測定上、フイルム状あるいはシート状であることが好
ましい。The form of the analysis element of the present invention is not particularly limited as long as it can perform analysis, but it is preferably a film shape or a sheet shape in terms of production and operation / measurement.

本発明の分析素子の理解を助けるために、一例を挙げて
原理を説明する。In order to help understanding of the analytical element of the present invention, the principle will be described with an example.

第１図は本発明による分析素子の最も単純な態様の断面
図の一例である。この場合は多孔質反応層１のみで分析
素子が構成されている。FIG. 1 is an example of a cross-sectional view of the simplest mode of an analysis element according to the present invention. In this case, the analysis element is composed of only the porous reaction layer 1.

第２図は第１図の拡大図である。第２図において符号２
は前記（ａ）の粒子、３は前記（ｂ）の粒子そして４は
調整のため添加された粒子である。FIG. 2 is an enlarged view of FIG. Reference numeral 2 in FIG.
Are particles of (a), 3 are particles of (b), and 4 are particles added for adjustment.

第２図は粒子２、３及び４が均一に混合され、点接着す
ることにより多孔質反応層が構成されていることを示し
ている。FIG. 2 shows that the particles 2, 3 and 4 are uniformly mixed and point-bonded to form a porous reaction layer.

第３図は標識物Ｄの模式図であり、符号８は流体試料中
の特定成分Ａと特異的に結合し得る物質Ｃ、９は標識、
10は標識物Ｄを意味する。FIG. 3 is a schematic diagram of the labeled substance D, where reference numeral 8 is a substance C capable of specifically binding to the specific component A in the fluid sample, 9 is a label,
10 means the marker D.

第４図は本発明を説明する模式図であり、符号５は流体
試料中の特定成分Ａと特異的に結合し得る物質Ｂ（物質
Ｃとは異なる）、６は吸収物質Ｅ、７は流体試料中の特
定成分Ａを意味する。FIG. 4 is a schematic diagram for explaining the present invention. Reference numeral 5 is a substance B (different from the substance C) capable of specifically binding to the specific component A in the fluid sample, 6 is an absorbing substance E, and 7 is a fluid. It means the specific component A in the sample.

第１図〜第４図により本発明の機構を説明する。The mechanism of the present invention will be described with reference to FIGS.

流体試料の一定量をはかりとり、第１図の分析素子に滴
下する。すると流体試料中の特定成分Ａは粒子又は繊維
の表面に固定化された「流体試料中の特定成分Ａに特異
的に結合する物質Ｂ」に吸着される。A certain amount of a fluid sample is weighed and dropped on the analytical element shown in FIG. Then, the specific component A in the fluid sample is adsorbed by the “substance B that specifically binds to the specific component A in the fluid sample” immobilized on the surface of the particles or fibers.

次に標識物Ｄを含む溶液を滴下すると、該標識物Ｄは、
（ａ）の粒子表面に吸着された特定成分Ａ及び（ｂ）の
粒子表面に固定化された吸収物質Ｅの間で分配される
（第４図）。Next, when a solution containing the labeled substance D is dropped, the labeled substance D becomes
It is distributed between the specific component A adsorbed on the particle surface of (a) and the absorbing substance E immobilized on the particle surface of (b) (FIG. 4).

一定の反応時間の後の標識物はイ「流体試料中の特定成分Ａに特異的に結合する物質
Ｂ」を固定化した粒子表面に該物質Ｂを介して吸着され
る。After a certain reaction time, the labeled substance is adsorbed via the substance B to the particle surface on which the “substance B specifically binding to the specific component A in the fluid sample” is immobilized.

ロ吸収物質Ｅを固定化した固定表面に該物質Ｅを介し
て吸着される。(B) The substance E is adsorbed on the fixed surface on which the substance E is immobilized.

ハ流体試料中に残存するの３通りの状態にある。このうちハの割合はなるべく少
なくなるように反応条件と多孔質反応層の構成を設定す
るのが好ましい。流体試料中の特定成分Ａの濃度にイの
割合は支配され、該特定成分Ａの濃度が高いほどイの割
合は高くなり、ロの割合が低くなる。ロの状態の標識物
Ｄはその標識部位と吸収物質Ｅとの結合により該標識に
起因する信号が変調されるので、流体試料中の特定成分
Ａの濃度と、標識物Ｄ全体の信号強度の間には関数関係
が成立する。そこであらかじめ特定成分Ａの濃度がわか
つている流体試料（標準試料）を数種類用いて検量線を
作成しておけば、道の流体試料中の特定成分Ａの濃度を
知ることができるようになる。C. There are three states: remaining in the fluid sample. Of these, it is preferable to set the reaction conditions and the constitution of the porous reaction layer so that the proportion of C is as small as possible. The ratio of A to the concentration of the specific component A in the fluid sample is controlled, and the higher the concentration of the specific component A, the higher the ratio of A and the lower the ratio of B. The signal due to the label of the labeled substance D in the state of (2) is modulated by the binding between the labeled site and the absorbing substance E, so that the concentration of the specific component A in the fluid sample and the signal intensity of the entire labeled substance D are A functional relationship is established between them. Therefore, if a calibration curve is prepared in advance by using several kinds of fluid samples (standard samples) in which the concentration of the specific component A is known, the concentration of the specific component A in the fluid sample of the road can be known.

信号の測定方法は標識の種類により異なる。The method of measuring the signal depends on the type of sign.

例えば、標識が蛍光物質であれば、分析素子に励起光を
当て、蛍光強度を測定すれば良い。標識が酵素であれば
適当な基質、必要ならば酵素や発色系を含む溶液を添加
し一定時間インキユベートした後に、該発色系に適合し
た波長の光の反射濃度（基質の種類によつては蛍光強
度、発光強度）を測定することにより信号強度を測定で
きる。このような目的で用いられる基質・発色系は標識
酵素の種類に従つて公知の方法から適当なものを選択で
きる。For example, when the label is a fluorescent substance, excitation light may be applied to the analysis element to measure the fluorescence intensity. If the label is an enzyme, a suitable substrate, if necessary, a solution containing the enzyme or color-developing system is added, and after incubation for a certain period of time, the reflection density of light of a wavelength suitable for the color-developing system (fluorescence depending on the type of substrate is used. The signal intensity can be measured by measuring the intensity and the emission intensity. As the substrate / color-developing system used for such a purpose, an appropriate one can be selected from known methods according to the kind of the labeling enzyme.

一例を挙げれば、標識がペルオキシダーゼである場合
は、過酸化水素を0.001〜10.0％含む緩衝液（pH4.0〜9.
0）に表４に例示した化合物のうちの１種若しくは数種
を選んで溶解したものを用いることができる。As an example, when the label is peroxidase, a buffer solution containing 0.001 to 10.0% hydrogen peroxide (pH 4.0 to 9.
It is possible to use one obtained by dissolving one or several of the compounds exemplified in Table 4 in (0).

表４（１） o-ジアニン（２） o-トリジン又はその酸塩（３） o-フエニレンジアミン又はその酸塩（４）グアヤク（５）アドレナリン（６）フエノールフタレイン（７）フエロシアン化物（８） 4-アミノアンチピリン、及びその誘導体又はそ
れらの酸塩とフエノール又はナフトール又はそれらの誘
導体との組合わせ（９）アニリン及びその誘導体（10） o-トルイジン、p-トルイジン等のモノアミン類（11） o-フエニレンジアミン、N,N′‐ジメチル‐p-
フエニレンジアミン、N,N′‐ジエチルフエニレンジア
ミン、ベンジジン、ジアニシジン等のジアミン類（12）フエノール、チモール、o-,m-及びp-クレゾー
ル、α‐ナフトール、β‐ナフトール等のフエノール類（13）カテコール、グアヤコール、オルシノール、ピ
ロガロール、p,p-ジヒドロキシジフエニル、フロログル
シノールのようなポリフエノール類（14）サリチル酸、ピロカテキン酸、没食子酸のよう
な芳香族の酸（15）ロイコマラカイトグリーン、ロイコフエノール
フタレインのようなロイコ染料（16） 2,6-ジクロロフエノールインドフエノールのよ
うな着色染料（17）エピネフリン、フラボン類、チロシン、ジヒド
ロキシフエニルアラニン、トリブトフアンのような種々
の生化学物質（18） 2,2′‐アジノジ（3-エチル‐6-スルホベンゾ
チアゾリン）又はその塩、及び3,3′‐ジアミノベンジ
ジンのような特殊染料（19）その他、グアヤゴム、グアヤコン酸、ヨウ化カ
リウム、ヨウ化ナトリウム及び他の水溶性ヨウ化物、並
びにビリルビンのような物質標識が酵素基質、補酵素、アポ酵素、酵素前駆体を活性
化させる物質、酵素前駆体の場合も同様であり、要は信
号測定に必要とされる物質の溶液を添加、インキユベー
トし、反射濃度、蛍光強度、発光強度などを測定すれば
良い。Table 4 (1) o-dianine (2) o-tolidine or its acid salt (3) o-phenylenediamine or its acid salt (4) guaiac (5) adrenaline (6) phenolphthalein (7) ferocyanide ( 8) Combination of 4-aminoantipyrine and its derivatives or their acid salts with phenol or naphthol or their derivatives (9) Aniline and its derivatives (10) Monoamines such as o-toluidine and p-toluidine (11) ) O-Phenylenediamine, N, N′-dimethyl-p-
Diamines such as phenylenediamine, N, N'-diethylphenylenediamine, benzidine, and dianisidine (12) Phenols such as phenol, thymol, o-, m- and p-cresol, α-naphthol, β-naphthol ( 13) Polyphenols such as catechol, guaiacol, orcinol, pyrogallol, p, p-dihydroxydiphenyl, phloroglucinol (14) Aromatic acids such as salicylic acid, pyrocatechinic acid and gallic acid (15) Leucomalachite Leuco dyes such as green and leucophenolphthalein (16) Colored dyes such as 2,6-dichlorophenol indophenol (17) Various biochemicals such as epinephrine, flavones, tyrosine, dihydroxyphenylalanine and tributophane Substance (18) 2,2'-azinodi (3-ethyl-6-sulfoben Thiazoline) or its salt, and special dyes such as 3,3'-diaminobenzidine (19) Other substances such as guaia gum, guaiaconic acid, potassium iodide, sodium iodide and other water-soluble iodides, and bilirubin The same applies to the case where the label is an enzyme substrate, coenzyme, apoenzyme, a substance that activates a enzyme precursor, or an enzyme precursor.The point is to add a solution of the substance required for signal measurement, incubate, and reflect concentration. , Fluorescence intensity, emission intensity, etc. may be measured.

本発明で用いられる前記（ａ）と（ｂ）で示される担体
の粒子又は繊維はミクロ的に見るとわずかな接着部分を
除いて、その表面は離れた状態で反応層を構成してお
り、このことが流体試料を収容する空間を確保すると同
時に、（ａ）の粒子又は繊維の表面に固定化された物質
Ｂに吸着された標識物Ｄの標識部位が（ｂ）の粒子又は
繊維の表面に固定化された物質の影響を受けてその信号
が変調されることを防止しているのである。この結果、
本発明の特徴である単一層内のB/F分離が可能となつ
た。The particles or fibers of the carrier shown in the above (a) and (b) used in the present invention form a reaction layer in a state where their surfaces are apart from each other, except for a slight adhesive portion when viewed microscopically, This secures a space for accommodating the fluid sample, and at the same time, the labeling site of the labeling substance D adsorbed to the substance B immobilized on the surface of the particle or fiber of (a) has the surface of the particle or fiber of (b). The signal is prevented from being modulated by the influence of the substance immobilized on the. As a result,
B / F separation within a single layer, which is a feature of the present invention, has become possible.

更に、本発明の別な効果として、（ａ）、（ｂ）の粒子
又は繊維及び、必要に応じて調整のために添加する粒子
又は繊維を混合する際、その比率は自由に設定できるの
で、（ａ）及び（ｂ）に固定化した物質の量や標識物Ｄ
への結合能力が製造ロツトごとに多少変動しても、その
混合比を調整することにより常に一定の性能を持つ分析
素子を供給することが可能である。従来の粒子又は繊維
集合体による多孔層を利用した分析素子及びその類似品
は粒子又は繊維の集合体を流体試料を収納する容器とし
て扱つており、このような集合体を構成する粒子、繊維
に異なる機能を持たせたものを混合し製膜することで単
一層内でのB/F分離を行う試みは全く新しい試みであ
り、実際に上述した効果が得られたことは発明者にとつ
ても全く予想がつかない驚くべき結果であつた。Furthermore, as another effect of the present invention, when mixing the particles or fibers of (a) and (b) and particles or fibers added for adjustment as necessary, the ratio can be freely set, Amount of substance immobilized on (a) and (b) and labeled substance D
Even if the binding ability to γ varies slightly depending on the manufacturing lot, it is possible to supply an analytical element having a constant performance by adjusting the mixing ratio. Conventional analytical elements and similar products utilizing a porous layer of particles or fiber aggregates treat the aggregates of particles or fibers as a container for containing a fluid sample. Attempting to perform B / F separation in a single layer by mixing and film-forming those having different functions is a completely new attempt, and it was to the inventor that the above-mentioned effects were actually obtained. It was a surprising result that was completely unexpected.

本発明の実施に当つてはさまざまな態様が可能である。
例えば、第１図の態様の分析素子を使用する場合、前述
の方法の他に、標識物の一定量と流体試料を事前に混合
してから滴したり、あるいは流体試料と標識物を含む溶
液を同時に滴下することも可能である。この方法は感度
において多少不利となるが、反面分析に当つての操作を
非常に簡略化できる。Various aspects are possible in practicing the present invention.
For example, when the analytical element of the embodiment shown in FIG. 1 is used, in addition to the method described above, a predetermined amount of the labeled substance and the fluid sample are mixed in advance and then dropped, or a solution containing the fluid sample and the labeled substance. It is also possible to add at the same time. This method has some disadvantages in sensitivity, but on the other hand, the operation for analysis can be greatly simplified.

本発明の分析素子は前述の多孔質反応層が最低必要構成
要素であるが、発明の効果をより一層発揮するために種
々の補助層を設けることができる。第５図〜第10図に本
発明の分析素子の１実施の態様を表す断面概略図を示
す。In the analytical element of the present invention, the above-mentioned porous reaction layer is the minimum necessary constituent element, but various auxiliary layers can be provided to further exert the effects of the present invention. 5 to 10 are schematic sectional views showing one embodiment of the analytical element of the present invention.

第５図に示した本発明の分析素子は光透過性支持体11の
上に多孔質反応層が積層されており、支持体の存在によ
り素子の取扱い性が向上している。In the analytical element of the present invention shown in FIG. 5, a porous reaction layer is laminated on the light transmissive support 11, and the presence of the support improves the handling of the element.

このような目的で使用し得る支持体は、例えば酢酸セル
ロース、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネー
ト及びポリビニル化合物（例えばポリスチレン）のよう
な高分子化合物、あるいはガラスのような透明無機化合
物が挙げられる。該多孔性反応層はこのような支持体の
上で直接塗布及び／又は製膜するか、あるいはいつたん
多孔質反応層を別に形成した後に前述の支持体に貼りつ
けても良い。第５図に示した態様の場合、流体試料は反
応層側から滴下する必要があるが、信号の測定は両側か
ら行うことが可能である。Examples of the support that can be used for such a purpose include polymer compounds such as cellulose acetate, polyethylene terephthalate, polycarbonate and polyvinyl compounds (eg polystyrene), or transparent inorganic compounds such as glass. The porous reaction layer may be directly applied and / or formed into a film on such a support, or may be formed on the support after forming a separate porous reaction layer. In the case of the embodiment shown in FIG. 5, the fluid sample needs to be dropped from the reaction layer side, but the signal can be measured from both sides.

第６図に示した本発明の別の態様では、光反射性支持体
12の上に反応層が設けられている。この態様では、試料
滴下、信号測定とも多孔性反応層側から行い、信号を反
射濃度で測定する際に光反射性支持体がそれを容易にし
ている（信号を蛍光強度で測定する際は黒色の吸光性支
持体を同じように用いることで同様な効果を得ることが
できる）。In another embodiment of the invention shown in FIG. 6, a light reflective support is provided.
A reaction layer is provided on the surface 12. In this embodiment, both sample dropping and signal measurement are performed from the porous reaction layer side, and the light-reflecting support facilitates it when measuring the signal by the reflection density (black is used when measuring the signal by fluorescence intensity). The same effect can be obtained by using the absorptive support of 1) in the same manner).

このような目的で使用し得る支持体の材質としては前述
の支持体の材質に加えてセラミツクス、金属、あるいは
樹脂被覆等で防水処理を施した紙等が挙げられ、これら
の材質に必要ならばTiO₂、BaSO₄、マイカなどの白色顔
料等を塗布するか含有させることにより目的を果すこと
ができる。As the material of the support that can be used for such a purpose, in addition to the above-mentioned material of the support, ceramics, metal, or paper waterproofed with a resin coating or the like can be used. The purpose can be achieved by applying or containing a white pigment such as TiO ₂ , BaSO ₄ , or mica.

第７図の態様も同様な目的によるもので、光透過性支持
体11の上に多孔質反応層１、光反射層13が順に積層され
ている。この態様では試料は光反射層側から滴下され、
信号測定は光透過性支持体側から行われる。光反射層は
公知の分析素子及びその類似品に用いられていたものを
いずれも使用できるが、好ましくは多孔質反応層に用い
られるのと同様な粒子及び繊維に前述の白色顔料等を含
有させたものを塗布又は製膜するか貼りつけることがで
きる。更に好ましくは内部に白色顔料を含有する粒子の
表面に多孔質反応層に用いる時と同様に流体試料中の特
定成分に特異的に結合する物質Ｂや吸収物質Ｅを固定化
し、下層の多孔質反応層と同様の機能を持たせた光反射
層を設けることができる。このような特殊な光反射層を
用いると、光反射層内に多くの未反応標識物が残ること
を防止できる。The embodiment shown in FIG. 7 has the same purpose, and the porous reaction layer 1 and the light reflecting layer 13 are sequentially laminated on the light transmitting support 11. In this mode, the sample is dropped from the light reflection layer side,
The signal measurement is performed from the side of the light transmissive support. The light-reflecting layer may be any of those used in known analytical elements and similar products, but preferably the same particles and fibers as those used in the porous reaction layer are allowed to contain the aforementioned white pigment and the like. It can be applied, formed into a film, or attached. More preferably, the substance B or the absorbing substance E that specifically binds to a specific component in the fluid sample is immobilized on the surface of the particles containing the white pigment in the same manner as in the case of using the porous reaction layer, and the porous layer of the lower layer is fixed. A light reflection layer having the same function as the reaction layer can be provided. By using such a special light reflecting layer, it is possible to prevent a large amount of unreacted label from remaining in the light reflecting layer.

第８図の態様では多孔質反応層１の上に標識物含有層14
が設けられている。標識物含有層は多孔性媒体に面積濃
度が一定となるように標識物を含有させた層であり、流
体試料の一定量を滴下すると一定量の標識物が溶出さ
れ、多孔質反応層に試料と共に拡散するものである。素
材としては多孔質反応層と同様のものを塗布、製膜、貼
付しても良く、あるいは吸水性の洋紙、和紙、紙、ブ
ラツシユポリマー、あるいはガラス繊維、鉱物性繊維
（石綿など）、植物性繊維（木綿、麻、バルブなど）、
動物性繊維（羊毛、絹など）、合成繊維（各種ナイロ
ン、ビニロン、ポリエチレンテレフタレート、ポリプロ
ピレンなど）、再成繊維（レーヨン、セルロースエステ
ルなど）などを単独あるいは混合して製造した織物、不
織布、合成紙などで作成した標識物含有層を貼付しても
良い。また必要に応じてこの標識物含有層に前述の光反
射層の効果を合せ持たせることができる。第８図の態様
の場合標識が蛍光物質であれば、流体試料のみを滴下
し、インキユベートすれば直ちに測定が可能である。標
識が他の物質の時は、流体試料を滴下後一定時間インキ
ユベートした後、必要な基質・発色試薬等を含む溶液を
滴下することにより測定できる。In the embodiment shown in FIG. 8, the labeling substance-containing layer 14 is formed on the porous reaction layer 1.
Is provided. The labeled substance-containing layer is a layer in which the labeled substance is contained in the porous medium so that the area concentration becomes constant, and when a fixed amount of the fluid sample is dropped, a fixed amount of the labeled substance is eluted and the sample is placed in the porous reaction layer. It diffuses with. As the material, the same material as the porous reaction layer may be applied, formed into a film or attached, or water-absorbent paper, Japanese paper, paper, brush polymer, or glass fiber, mineral fiber (asbestos, etc.), plant Fiber (cotton, hemp, bulb, etc.),
Woven fabrics, non-woven fabrics, synthetic papers made of animal fibers (wool, silk, etc.), synthetic fibers (various types of nylon, vinylon, polyethylene terephthalate, polypropylene, etc.), regenerated fibers (rayon, cellulose ester, etc.) alone or mixed. You may stick the label containing layer created by the above. If necessary, the marker-containing layer can also have the effect of the light reflecting layer described above. In the case of the embodiment shown in FIG. 8, if the label is a fluorescent substance, it is possible to measure immediately by dropping only the fluid sample and incubating. When the label is another substance, it can be measured by dropping the fluid sample, incubating for a certain period of time, and then dropping a solution containing the necessary substrate, coloring reagent and the like.

第９図も標識物含有層を有する別な態様である。この場
合は下から順に光透過性支持体11、標識物含有層14、タ
イミング層15、多孔質反応層１が積層されている。タイ
ミング層は写真化学の分野で広く知られている技術であ
り、例えば硬膜度を適当に調節したゼラチン層などが用
いられる。本態様においては流体試料滴下後、試料中の
特定成分が多孔質反応層中の対応する粒子の表面にある
程度吸着された後に標識物が多孔質反応層に放出され
る。このような方法はデイレードアデイシヨンとして広
く知られ、本発明においては特に有効である。FIG. 9 also shows another embodiment having a marker-containing layer. In this case, the light transmissive support 11, the marker-containing layer 14, the timing layer 15, and the porous reaction layer 1 are laminated in this order from the bottom. The timing layer is a technique widely known in the field of photographic chemistry, and for example, a gelatin layer having an appropriately controlled degree of hardening is used. In this embodiment, after the fluid sample is dropped, the specific component in the sample is adsorbed to the surface of the corresponding particles in the porous reaction layer to some extent, and then the labeling substance is released to the porous reaction layer. Such a method is widely known as a delayed decision and is particularly effective in the present invention.

本態様のように標識物含有層が最上層以外の部分にある
場合、標識物含有層に用いる素材としては前述のものの
他にゼラチン、ゼラチン誘導体、多糖類（アガロースな
ど）、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチル
セルロースなどの親水性高分子物質、あるいはビニルピ
ロリドン、アクリル酸誘導体、メタクリル酸誘導体、ビ
ニルアルコール、スルホニルスチレンなどをモノマーと
したホモポリマーあるいはコポリマーといつた連続バイ
ンダーを塗布して用いる方法がある。更に別な態様とし
てはこうした親水性高分子物質やポリマーの膜厚及び組
成を調節することにより標識物含有層からの標識物溶出
速度を制御し、タイミング層の機能をも兼ねさせること
が可能である。When the labeled substance-containing layer is in a portion other than the uppermost layer as in the present embodiment, the materials used for the labeled substance-containing layer include gelatin, gelatin derivatives, polysaccharides (such as agarose), carboxymethyl cellulose, and hydroxyethyl cellulose, in addition to the materials described above. There is a method in which a hydrophilic polymer substance such as, or a homopolymer or copolymer having vinylpyrrolidone, an acrylic acid derivative, a methacrylic acid derivative, vinyl alcohol, sulfonylstyrene, etc. as a monomer and a continuous binder are applied and used. In still another embodiment, the elution rate of the labeled substance from the labeled substance-containing layer can be controlled by adjusting the film thickness and composition of the hydrophilic high molecular weight substance or polymer, and it can also function as the timing layer. is there.

第10図に示した態様は標識が蛍光物質以外の際（信号測
定に当り何らかの形で酵素反応を利用する標識の場合）
特に有用なものである。試薬層16は標識物含有層14と同
様の素材で、標識信号測定の際に必要な物質を面積濃度
一定に含有させたものである。この試薬層と標識物含有
層を設けることにより、蛍光物質以外の標識を用いる場
合でも、流体試料のみを滴下し、インキユペートするだ
けで測定が可能となる。The embodiment shown in FIG. 10 is for the case where the label is other than a fluorescent substance (in the case where the label uses an enzyme reaction in some form for signal measurement).
It is especially useful. The reagent layer 16 is made of the same material as the labeled substance containing layer 14, and contains a substance necessary for measuring the labeled signal in a constant area concentration. By providing the reagent layer and the label-containing layer, even when a label other than a fluorescent substance is used, measurement can be performed by dropping only a fluid sample and inking.

この場合、多孔質反応層における反応が充分に進行した
後に試薬層の内容物が溶出されるのが好ましく、そのた
めには前述のタイミング層を試薬層の上に設けるか、あ
るいは試薬層の組成を調整してタイミング層の効果を持
たせることが必要である。また、同様の理由から試薬層
は分析素子の最下層（支持体がある場合はその上）に設
けることが好ましい。In this case, it is preferable that the contents of the reagent layer be eluted after the reaction in the porous reaction layer has sufficiently progressed. For that purpose, the above-mentioned timing layer is provided on the reagent layer or the composition of the reagent layer is changed. It is necessary to adjust it to have the effect of the timing layer. For the same reason, the reagent layer is preferably provided on the lowermost layer of the analytical element (on the support, if any).

なお、酵素反応系にペルオキシダーゼを用いる場合は、
基質として過酸化水素と適当な還元物質が必要である。
このうち前者は揮発性であり、そのまま素子の中に含有
させるのは困難であるので、クメン・H₂O₂などの形で含
有させるが、流体試料が滴下された時点で過酸化水素を
発生させるのが好ましい。後者は、例えばグルコースオ
キシダーゼ、尿酸オキシダーゼ、アミンオキシダーゼに
代表される酸化酵素（反応生成物として過酸化水素を生
じるタイプのもの）と、その酵素の基質を乾燥状態で試
薬層に含有させるか、あるいは該過酸化酵素及び基質の
うち片方を試薬層に片方をそれと異なる層に含有させる
ことにより達成できる。When using peroxidase in the enzyme reaction system,
Hydrogen peroxide and a suitable reducing substance are required as substrates.
Of these, the former is volatile and it is difficult to incorporate it into the device as it is.Therefore, it is contained in the form of cumene / H ₂ O ₂ , but hydrogen peroxide is generated when the fluid sample is dropped. Preferably. In the latter, for example, an oxidase represented by glucose oxidase, urate oxidase, amine oxidase (a type that produces hydrogen peroxide as a reaction product) and a substrate for the enzyme are contained in a reagent layer in a dry state, or This can be achieved by including one of the peroxidase and the substrate in a reagent layer and the other in a different layer.

第11図及び第12図は、本発明の好ましい態様の一例につ
いて断面図、斜視図を示したものである。分析素子の取
扱いが容易になるよう、全体がプラスチツク製のマウン
ト17で覆われており、マウント上部に試料注入孔、下部
に信号測定孔が開いている。11 and 12 are a sectional view and a perspective view showing an example of a preferred embodiment of the present invention. To facilitate the handling of the analytical element, the whole is covered with a plastic mount 17, a sample injection hole is formed in the upper part of the mount, and a signal measurement hole is formed in the lower part.

本発明の分析素子は更に、流体試料を素子に適用した際
にその展開を補助する展開層、流体試料が血液（全血）
の際に必要となることがある血球分離層、必要に応じて
設ける接着層、保護層といつた補助層を設けることがで
きる。これらの補助層及び前述の発色試薬層、標識物含
有層、タイミング層は独立して設けても良く、あるいは
複数の機能を併わせもつた層として設けても良い。これ
らの層はその機能に応じて設けられるべき位置が容易に
決定できる。The analysis element of the present invention further comprises a spreading layer that assists the development of the fluid sample when it is applied to the element, and the fluid sample is blood (whole blood).
In this case, a blood cell separation layer, which may be necessary, an adhesive layer provided if necessary, a protective layer and an auxiliary layer can be provided. The auxiliary layer, the color-developing reagent layer, the label-containing layer, and the timing layer described above may be provided independently, or may be provided as a layer having a plurality of functions. The positions of these layers to be provided can be easily determined according to their functions.

〔Example〕

以下、本発明を実施例によつて更に具体的に説明する
が、本発明はこれら実施例に限定されない。Hereinafter, the present invention will be described more specifically by way of examples, but the present invention is not limited to these examples.

実施例１（１）ウサギ抗FITC抗体の作製牛血清アルブミン（BSA）50mgを5mlの0.1モル炭酸ナト
リウム溶液（pH 9.0）に溶解し、2mgのフルオレセイン
ソチオシアナート（米国リサーチオルガニツクス社製）
を500μｌのジメチルホルムアミドに溶解して加え、遮
光室温下３時間かくはんし、セフアデックスG-25（フア
ルマシア社製）カラムで精製、凍結乾燥した。Example 1 (1) Preparation of Rabbit Anti-FITC Antibody 50 mg of bovine serum albumin (BSA) was dissolved in 5 ml of 0.1 molar sodium carbonate solution (pH 9.0), and 2 mg of fluorescein soothiocyanate (manufactured by Research Organics, Inc., USA).
Was dissolved in 500 μl of dimethylformamide, added, stirred for 3 hours in the dark at room temperature, purified on a Sephadex G-25 (manufactured by Pharmacia) column, and lyophilized.

これをフロイントの完全アジユバント（初回のみ）及び
不完全アジユバントと混合し、ウサギに免疫した。This was mixed with Freund's complete adjuvant (first time only) and incomplete adjuvant to immunize rabbits.

得られた抗血清より硫酸アンモニウム法でグロブリン分
画を分離し、アフイニテイークロマトグラフイーでBSA
に吸着する抗体を除いた後に透析、凍結乾燥した。The globulin fraction was separated from the obtained antiserum by the ammonium sulfate method, and BSA was performed by affinity chromatography.
After removing the antibody adsorbed on, the mixture was dialyzed and freeze-dried.

（２）多孔質反応層の作製（ア）ヤギ抗ヒトIgG（米国カツペル社製）を0.05M
pH 9.6 炭酸・重炭酸緩衝液に10μg/mlの濃度で溶解
し、平均粒径21μｍのポリ（スチレン‐コ‐n-ブチルメ
タクリレート‐コ‐グリシジルアクリレート）〔75/15/
10〕の高分子重合体粒子単位を加えて４℃で一晩放置し
た。粒子を生理食塩水で洗浄後BSAを200μg/ml含む同様
の緩衝液に入れて３日間４℃で放置し、生理食塩水で洗
浄した。(2) Preparation of porous reaction layer (a) 0.05M of goat anti-human IgG (manufactured by US Kuppel)
pH 9.6 Dissolved in carbonate / bicarbonate buffer at a concentration of 10 μg / ml, poly (styrene-co-n-butyl methacrylate-co-glycidyl acrylate) with an average particle size of 21 μm [75/15 /
The polymer polymer particle unit of 10] was added and the mixture was allowed to stand overnight at 4 ° C. The particles were washed with physiological saline, then put in the same buffer containing 200 μg / ml of BSA, left at 4 ° C. for 3 days, and washed with physiological saline.

（イ）抗ヒトIgGの代りに（１）で作製した抗FITC抗
体を用いて、（ア）と同様の操作を行つた。(A) The same operation as (a) was performed using the anti-FITC antibody prepared in (1) instead of anti-human IgG.

（ウ）（ア）に準じた方法でBSAのみを物理吸着させ
た粒子を作成した。(C) Particles in which only BSA was physically adsorbed were prepared by the method according to (A).

以上（ア）〜（ウ）で作成した粒子を7:1:3の割合で均
一に混合し、５重量％のトライトンX-100（ノニオン界
面活性剤、ロームエンドハース社製）と共に乾燥膜厚約
350μｍになるようにポリエチレンテレフタレート支持
体上に塗布し、42℃、30分間乾燥を行い、成膜後、支持
体からはく離した。The particles prepared in (a) to (c) above were mixed uniformly at a ratio of 7: 1: 3, and a dry film thickness was obtained together with 5% by weight of Triton X-100 (nonionic surfactant, manufactured by Rohm Endhaas Co.). about
It was coated on a polyethylene terephthalate support so as to have a thickness of 350 μm, dried at 42 ° C. for 30 minutes, and peeled from the support after film formation.

（３）標識物含有層の作成下引済ポリエチレンテレフタレートフイルム上に次の組
成の試薬層を塗布乾燥により作成した。(3) Preparation of Labeled Material-Containing Layer A reagent layer having the following composition was applied and dried on a subbed polyethylene terephthalate film.

（４）分析素子の作成（３）で作成した標識物含有層の上に（２）で作成した
多孔質反応層を接着し、２×2cmの大きさに切断し分析
素子とした。 (4) Preparation of analytical element The porous reaction layer prepared in (2) was adhered onto the labeled substance-containing layer prepared in (3) and cut into a size of 2 x 2 cm to obtain an analytical element.

（５）ヒトIgGの測定ヒトIgG（米国カツペル社製）を640μg/mlから０μg/ml
の各種濃度で含有する0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液（p
H 7.6）を作成する。(5) Measurement of human IgG Human IgG (manufactured by Kuppel, Inc., USA) is changed from 640 μg / ml to 0 μg / ml.
0.01M sodium phosphate buffer solution (p
H 7.6).

各濃度のヒトIgG液10μｌを（４）で作成した分析素子
各１枚の上に滴下し、37℃で20分保温した後に試料滴下
側から蛍光測定（励起波長 490nm、蛍光波長 520nm）
したところ表５のような結果を得た。10 μl of human IgG solution at each concentration was dropped on each one of the analytical elements prepared in (4) and kept at 37 ° C for 20 minutes, after which fluorescence was measured from the sample dropping side (excitation wavelength 490 nm, fluorescence wavelength 520 nm).
As a result, the results shown in Table 5 were obtained.

実施例２（１）試薬層の作成下引済ポリエチレンテレフタレートのフイルム上に、下
記のような組成の発色試薬層を塗布、乾燥により作成し
た。 Example 2 (1) Preparation of Reagent Layer A color forming reagent layer having the following composition was applied onto a film of subbed polyethylene terephthalate and dried.

（２）標識物含有層の作成（１）で作成した試薬層の上に次の標識物含有層を塗
布、乾燥により作成した。 (2) Preparation of label-containing layer The following label-containing layer was applied onto the reagent layer prepared in (1) and dried.

（３）セルロース繊維への反応性基の導入粉末紙Ｄ（東洋紙社製）55gを1000mlの2.5Mリン酸
カリウム緩衝液（pH 12.1）に浸漬し、５〜10℃におい
てスターラーでかくはんしながら500mlのプロモシアン
溶液（0.05g/ml）を徐々に加えた。20分間反応させた後
に過し、氷冷した蒸留水、0.1M炭酸水素ナトリウムで
順に洗浄した。 (3) Introduction of Reactive Group into Cellulose Fiber 55 g of powdered paper D (manufactured by Toyo Paper Co., Ltd.) was immersed in 1000 ml of 2.5 M potassium phosphate buffer (pH 12.1), and stirred with a stirrer at 5 to 10 ° C. 500 ml of Promocyan solution (0.05 g / ml) was added slowly. After reacting for 20 minutes, the mixture was filtered, washed with ice-cooled distilled water and 0.1 M sodium hydrogencarbonate in that order.

（４）多孔性反応層の作成（ア）ヤギ抗ヒトIgG（米国カツペル社製） IgG留分1.0mg（抗体タン白量換算）を40mlの0.1M NaHC
O₃-0.5M NaCl溶液に溶解し、（３）で作成した活性化
紙の一部を入れ、室温で３時間振とうした。過後、
1Mトリス‐塩酸緩衝液（pH8.0）と室温で２時間振とう
する。(4) Preparation of porous reaction layer (a) Goat anti-human IgG (manufactured by Kuppel, USA) IgG fraction 1.0 mg (antibody protein amount conversion) 40 ml 0.1M NaHC
It was dissolved in O ₃ -0.5M NaCl solution, a part of the activated paper prepared in (3) was put therein, and shaken at room temperature for 3 hours. After the
Shake with 1 M Tris-HCl buffer (pH 8.0) for 2 hours at room temperature.

水、0.5M酢酸緩衝液（pH 4.0）、0.5M NaHCO₃、50mM
リン酸緩衝化生理食塩水（pH 7.2）で順次洗浄す
る。これを２％BSA含有50mM トリス・塩酸緩衝液（pH
8.0）に１晩浸漬し、蒸留水で洗浄し、BSAとシヨ糖の
水溶液を少量含有させてから凍結乾燥した。Water, 0.5M acetate buffer (pH 4.0), 0.5M NaHCO ₃ , 50 mM
Wash sequentially with phosphate buffered saline (pH 7.2). This is a 50 mM Tris-HCl buffer solution (pH: 2% BSA).
8.0) overnight, washed with distilled water, added a small amount of an aqueous solution of BSA and sucrose, and lyophilized.

（イ）（３）で作成した活性化紙の一部とo-ジアニ
シジンをpH ９、暗所室温で１晩反応させた。過後1M
1-アミノ‐2-プロパノールで処理し、水洗後（ア）と
同様BSA処理し、乾燥した。(A) A portion of the activated paper prepared in (3) was reacted with o-dianisidine at pH 9 in the dark at room temperature overnight. After 1M
It was treated with 1-amino-2-propanol, washed with water, treated with BSA as in (a), and dried.

（ウ）グルコースオキシターゼと（３）で作成した活
性化紙の一部を用いて（ア）と同様の操作を行つた。(C) The same operation as in (A) was performed using glucose oxidase and a part of the activated paper prepared in (3).

以上、３種類の処理済繊維を用いて次のような組成の繊
維分散液を調整し、（２）で作成した標識物含有層の上
に塗布乾燥した。As described above, a fiber dispersion having the following composition was prepared using the three types of treated fibers, and applied and dried on the marker-containing layer prepared in (2).

乾燥後、２×2cmの大きさに切断し分析素子とした。 After drying, it was cut into a size of 2 × 2 cm to obtain an analytical element.

各濃度のヒトIgG液10μｌを（４）で作成した分析素子
各１枚の上に滴下し、37℃で20分保温した後に支持体側
から492nmの反射濃度を測定した。その結果を表６に示
す。10 μl of human IgG solution at each concentration was dropped on each one of the analytical elements prepared in (4), and after keeping the temperature at 37 ° C. for 20 minutes, the reflection density at 492 nm from the support side was measured. The results are shown in Table 6.

〔発明の効果〕以上説明したように、本発明の分析素子によれば、単一
層内でB/F分離を行い、簡便な操作により感度、精度及
び再現性良く、流体試料中の比較的高い分子量の特定成
分を定量分析することができるという顕著な効果を奏す
ることができる。 [Effects of the Invention] As described above, according to the analysis element of the present invention, B / F separation is performed in a single layer, and sensitivity, accuracy and reproducibility are improved by a simple operation, and relatively high in a fluid sample. It is possible to exert a remarkable effect that a specific component having a molecular weight can be quantitatively analyzed.

[Brief description of drawings]

第１図及び第５図〜第10図は本発明の分析素子の１実施
の態様を示す断面概略図、第２図は第１図の拡大図、第
３図は標識物の模式図、第４図は本発明を説明する模式
図、第11図は本発明の好ましい態様の１例の断面図そし
て第12図は第11図の斜視図である。 1:多孔質反応層、2:担体（ａ）、3:担体（ｂ）、 4:調整のために添加された粒子、5:物質Ｂ、6:吸収物質
Ｅ、7:流体試料中の特定成分Ａ、8:物質Ｃ、9:標識、1
0:標識物Ｄ、11:光透過性支持体、12:光反射性支持体、
13:光反射層、14:標識物含有層、15:タイミング層、16:
試薬層、17:マウント1 and 5 to 10 are schematic sectional views showing an embodiment of the analytical element of the present invention, FIG. 2 is an enlarged view of FIG. 1, FIG. 3 is a schematic view of a marker, 4 is a schematic view for explaining the present invention, FIG. 11 is a sectional view of an example of a preferred embodiment of the present invention, and FIG. 12 is a perspective view of FIG. 1: Porous reaction layer, 2: Carrier (a), 3: Carrier (b), 4: Particles added for adjustment, 5: Substance B, 6: Absorbing substance E, 7: Specification in fluid sample Component A, 8: Substance C, 9: Label, 1
0: Marker D, 11: Light transmissive support, 12: Light reflective support,
13: light reflection layer, 14: marker-containing layer, 15: timing layer, 16:
Reagent layer, 17: Mount

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者石川匡代東京都日野市さくら町１番地小西六写真工業株式会社内 (56)参考文献特開昭58−17365（ＪＰ，Ａ) 特開昭57−103055（ＪＰ，Ａ) 特開昭58−18167（ＪＰ，Ａ) ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (72) Inventor Masayo Ishikawa 1 Sakura-cho, Hino City, Tokyo Konishi Roku Photo Industry Co., Ltd. (56) References JP-A-58-17365 (JP, A) JP-A-57 -103055 (JP, A) JP-A-58-18167 (JP, A)

Claims

[Claims]

1. A specific component A in a fluid sample
In the analysis element for measurement using a substance B capable of specifically binding to and a labeled substance D in which a substance C capable of specifically binding to a specific component A different from the substance B and a label are bound, (A) a carrier on which the substance B is immobilized, and (b) specifically binding to a labeling site of the labeled substance D which is not bound to the specific component A bound to the substance B, resulting from the labeling. An analytical element having a porous reaction layer formed using a mixture containing a carrier on which a substance E which modulates a signal is immobilized.