JPH0678358B2 - スルホ化カルシトニン誘導体及びその製造方法 - Google Patents
スルホ化カルシトニン誘導体及びその製造方法Info
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- JPH0678358B2 JPH0678358B2 JP1152310A JP15231089A JPH0678358B2 JP H0678358 B2 JPH0678358 B2 JP H0678358B2 JP 1152310 A JP1152310 A JP 1152310A JP 15231089 A JP15231089 A JP 15231089A JP H0678358 B2 JPH0678358 B2 JP H0678358B2
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- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は骨粗鬆症、高カルシウム血症、骨ページェット
症などの治療や、骨形成促進のために用いられるスルホ
化カルシトニン及びそれらを製造する方法に関する。
症などの治療や、骨形成促進のために用いられるスルホ
化カルシトニン及びそれらを製造する方法に関する。
〔従来の技術〕 カルシトニン（calcitonin）は、哺乳動物の血清カルシ
ウム低下活性を有するポリペプチドとして広く知られて
いる。カルシトニンはヒト、ブタ、ウシ、ヒツジなどの
哺乳動物では甲状腺から分泌される。ニワトリなどの鳥
類、サケ、ウナギなどの魚類その他両棲類、爬虫類等で
は鰓後腺（ultimobranchial body）から分泌される。こ
れらは、それぞれ分離、精製されそれぞれアミノ酸構造
が明らかにされている。
ウム低下活性を有するポリペプチドとして広く知られて
いる。カルシトニンはヒト、ブタ、ウシ、ヒツジなどの
哺乳動物では甲状腺から分泌される。ニワトリなどの鳥
類、サケ、ウナギなどの魚類その他両棲類、爬虫類等で
は鰓後腺（ultimobranchial body）から分泌される。こ
れらは、それぞれ分離、精製されそれぞれアミノ酸構造
が明らかにされている。
近年、化学合成手法や遺伝子組換え手法で生産されたカ
ルシトニンやカルシトニン様化合物が報告されており、
サケカルシトニン、ウナギカルシトニン、ブタカルシト
ニン、ヒトカルシトニン等は既に臨床で用いられてい
る。
ルシトニンやカルシトニン様化合物が報告されており、
サケカルシトニン、ウナギカルシトニン、ブタカルシト
ニン、ヒトカルシトニン等は既に臨床で用いられてい
る。
これらの各種カルシトニンはいずれも32個の構成アミノ
酸からなるポリペプチドであって、その１番目と７番目
のアミノ酸がＬ−システインであり、両者のメルカプト
基がジスルフィド架橋（シスチン残基）を形成している
点で全て共通している。この１番目と７番目のアミノ酸
のジスルフィド架橋あるいはエチレン結合による架橋構
造が、カルシトニンの生物活性発現に必須な構造である
とされている。
酸からなるポリペプチドであって、その１番目と７番目
のアミノ酸がＬ−システインであり、両者のメルカプト
基がジスルフィド架橋（シスチン残基）を形成している
点で全て共通している。この１番目と７番目のアミノ酸
のジスルフィド架橋あるいはエチレン結合による架橋構
造が、カルシトニンの生物活性発現に必須な構造である
とされている。
しかしながら、カルシトニンが有するこの様なジスルフ
ィド架橋構造は物理化学的には不安定であるため、精製
過程あるいは保存中に分解しやすく、この点がカルシト
ニンの製剤化における問題点となっている。また、生体
内に投与されたカルシトニンの血中半減期は短いが、そ
れは、生体内酵素によるかかるジスルフィド架橋構造の
分解も、その一因であると考えられている。
ィド架橋構造は物理化学的には不安定であるため、精製
過程あるいは保存中に分解しやすく、この点がカルシト
ニンの製剤化における問題点となっている。また、生体
内に投与されたカルシトニンの血中半減期は短いが、そ
れは、生体内酵素によるかかるジスルフィド架橋構造の
分解も、その一因であると考えられている。
従って、カルシトニンの不安定の原因であるジスルフィ
ド結合を有さず、しかも生来のカルシトニンと同様の生
物学的活性を有する新規なカルシトニンが求められてい
る。本発明はこの様な、新しいタイプのカルシトニンを
提供しようとするものである。
ド結合を有さず、しかも生来のカルシトニンと同様の生
物学的活性を有する新規なカルシトニンが求められてい
る。本発明はこの様な、新しいタイプのカルシトニンを
提供しようとするものである。
本発明者らは、前記のごとき性質を有する新規なタイプ
のカルシトニンを開発すべく種々検討した結果、カルシ
トニンの第１位及び第７位に存在する２個のシステイの
内少なくとも１個のシステインをＳ−スルホ化してジス
ルフィド結合を除去することにより理化学的に安定なカ
ルシトニン誘導体が得られ、しかもこの様な誘導体が生
来のカルシトニンと同等の生物学的活性を有するという
全く新しく、且つ驚くべき知見を得、この知見に基いて
本発明を完成した。
のカルシトニンを開発すべく種々検討した結果、カルシ
トニンの第１位及び第７位に存在する２個のシステイの
内少なくとも１個のシステインをＳ−スルホ化してジス
ルフィド結合を除去することにより理化学的に安定なカ
ルシトニン誘導体が得られ、しかもこの様な誘導体が生
来のカルシトニンと同等の生物学的活性を有するという
全く新しく、且つ驚くべき知見を得、この知見に基いて
本発明を完成した。
従って、本発明は、カルシトニンの第１位のシステイン
及び第７位のシステインの内の少なくとも１個がＳ−ス
ルホ化されているスルホ化カルシトニン誘導体及びその
塩；カルシトニンを亜硫酸イオンと、又は亜硫酸イオン
及び酸化剤と反応せしめることを特徴とする前記スルホ
化カルシトニンの誘導体及びその塩の製造方法；並びに
前記スルホ化カルシトニン又はその塩を含んで成る医薬
を提供するものである。
及び第７位のシステインの内の少なくとも１個がＳ−ス
ルホ化されているスルホ化カルシトニン誘導体及びその
塩；カルシトニンを亜硫酸イオンと、又は亜硫酸イオン
及び酸化剤と反応せしめることを特徴とする前記スルホ
化カルシトニンの誘導体及びその塩の製造方法；並びに
前記スルホ化カルシトニン又はその塩を含んで成る医薬
を提供するものである。
本発明で用いられるカルシトニンは、動物の甲状腺、鰓
性器官等から抽出された、あるいは遺伝子組換え手法に
より産生された、あるいは化学合成されたヒトカルシト
ニン、ブタカルシトニン、ウシカルシトニン、ヒツジカ
ルシトニン、ニワトリカルシトニン、サケカルシトニン
−Ｉ、サケカルシトニン−II、サケカルシトニン−II
I、ウナギカルシトニンなどのカルシトニン及びその他
これらのカルシトニンと生物学的に同等のアミノ酸配列
を有するポリペプチドを意味する。好ましいのは、サケ
カルシトニン、ウナギカルシトニン、ブタカルシトニ
ン、ウシカルシトニン、ヒツジカルシトニン、ニワトリ
カルシトニン又はヒトカルシトニンである。本発明にお
いて特に好ましいカルシトニンはサケカルシトニン−
Ｉ、及びこれと同等な生物学的活性を有するポリペプチ
ドである。
性器官等から抽出された、あるいは遺伝子組換え手法に
より産生された、あるいは化学合成されたヒトカルシト
ニン、ブタカルシトニン、ウシカルシトニン、ヒツジカ
ルシトニン、ニワトリカルシトニン、サケカルシトニン
−Ｉ、サケカルシトニン−II、サケカルシトニン−II
I、ウナギカルシトニンなどのカルシトニン及びその他
これらのカルシトニンと生物学的に同等のアミノ酸配列
を有するポリペプチドを意味する。好ましいのは、サケ
カルシトニン、ウナギカルシトニン、ブタカルシトニ
ン、ウシカルシトニン、ヒツジカルシトニン、ニワトリ
カルシトニン又はヒトカルシトニンである。本発明にお
いて特に好ましいカルシトニンはサケカルシトニン−
Ｉ、及びこれと同等な生物学的活性を有するポリペプチ
ドである。
上記の種々のカルシトニン又はその誘導体から誘導され
る本発明のＳ−スルホ化カルシトニンには、１位のシス
テインがＳ−スルホ化されたモノ−スルホ化カルシトニ
ン、７位のシステインがＳ−スルホ化されたモノ−スル
ホ化カルシトニン、及び１位のシステイン及び７位のシ
ステインの両者がスルホ化されたジ−スルホ化カルシト
ニンが含まれる。ジ−スルホ化カルシトニンが好まし
く、特にジ−スルホ化・サケカルシトニンが好ましい。
本発明のスルホ化カルシトニンの代表例として、次の
式： （式〔Ｉ〕において、Ｘは水素又はアルカリ金属を表わ
す。） で表わされる、１位及び７位の両システイン残基がＳ−
スルホ化されたサケカルシトニン−Ｉの誘導体である。
る本発明のＳ−スルホ化カルシトニンには、１位のシス
テインがＳ−スルホ化されたモノ−スルホ化カルシトニ
ン、７位のシステインがＳ−スルホ化されたモノ−スル
ホ化カルシトニン、及び１位のシステイン及び７位のシ
ステインの両者がスルホ化されたジ−スルホ化カルシト
ニンが含まれる。ジ−スルホ化カルシトニンが好まし
く、特にジ−スルホ化・サケカルシトニンが好ましい。
本発明のスルホ化カルシトニンの代表例として、次の
式： （式〔Ｉ〕において、Ｘは水素又はアルカリ金属を表わ
す。） で表わされる、１位及び７位の両システイン残基がＳ−
スルホ化されたサケカルシトニン−Ｉの誘導体である。
本発明のカルシトニン誘導体は１個又は２個のスルホ基
を有するから、塩として存在し得る。この様な塩として
は、アルカリ金属塩、例えばリチウム塩、ナトリウム塩
及びカリウム塩；アルカリ土類金属塩、例えばカルシウ
ム塩及びマグネシウム塩；並びにアンモニウム塩、等が
挙げられる。
を有するから、塩として存在し得る。この様な塩として
は、アルカリ金属塩、例えばリチウム塩、ナトリウム塩
及びカリウム塩；アルカリ土類金属塩、例えばカルシウ
ム塩及びマグネシウム塩；並びにアンモニウム塩、等が
挙げられる。
本発明のＳ−スルホ化誘導体は、例えば次の様にして製
造されると考えられる。カルシトニンは亜硫酸イオンと
反応して、次の反応式（Ｉ〕： によりモノ−スルホ化カルシトニン誘導体が生成する。
造されると考えられる。カルシトニンは亜硫酸イオンと
反応して、次の反応式（Ｉ〕： によりモノ−スルホ化カルシトニン誘導体が生成する。
ジ−スルホ化カルシトニン誘導体を得るには、前記の反
応を酸化剤の存在下で行う。すなわち、前記〔Ｉ〕の反
応により生成した、例えば式（Ａ）で表わされるモノ−
スルホ化カルシトニン中間体は、酸化剤の存在下で、次
の反応〔II〕： に従って酸化されてジスルフィド結合により分子間連結
された二量体（Ｂ）を生成する。
応を酸化剤の存在下で行う。すなわち、前記〔Ｉ〕の反
応により生成した、例えば式（Ａ）で表わされるモノ−
スルホ化カルシトニン中間体は、酸化剤の存在下で、次
の反応〔II〕： に従って酸化されてジスルフィド結合により分子間連結
された二量体（Ｂ）を生成する。
次に、この二量体は亜硫酸イオンと反応し、次の反応式
〔III〕： に従って１分子のジ−スルホ化カルシトニン（Ｐ）と１
分子のモノ−スルホ化中間体（Ａ）を生成する。上記反
応〔II〕及び〔III〕から成る連鎖反応を続けることに
より、実質的にすべてのカルシトニンを、目的とするジ
−スルホ化カルシトニン誘導体に転換することができ
る。
〔III〕： に従って１分子のジ−スルホ化カルシトニン（Ｐ）と１
分子のモノ−スルホ化中間体（Ａ）を生成する。上記反
応〔II〕及び〔III〕から成る連鎖反応を続けることに
より、実質的にすべてのカルシトニンを、目的とするジ
−スルホ化カルシトニン誘導体に転換することができ
る。
あるいは、酸化剤としてテトラチオン酸イオンを用いる
場合、次の反応式〔IV〕： に従って、前記モノ−スルホ化カルシトニン中間体がテ
トラチオン酸イオンと反応してＳ−チオサルフェート中
間体となり、これが開裂してジ−スルホ化生成物（Ｐ）
を生成すると考えられる。
場合、次の反応式〔IV〕： に従って、前記モノ−スルホ化カルシトニン中間体がテ
トラチオン酸イオンと反応してＳ−チオサルフェート中
間体となり、これが開裂してジ−スルホ化生成物（Ｐ）
を生成すると考えられる。
前記の反応〔Ｉ〕及び〔III〕において反応する亜硫酸
イオンの供給源としては、用いられる反応媒体中で亜硫
酸イオンをもたらすものであればよく、例えば、亜硫
酸、亜硫酸塩又は亜硫酸水素塩、例えば亜硫酸ナトリウ
ム、亜硫酸カリウム、亜硫酸水素ナトリウム又は亜硫酸
水素カリウム、メタ亜硫酸、メタ亜硫酸塩、例えばメタ
亜硫酸ナトリウム又はメタ亜硫酸カリウム、あるいは５
−スルホチオ−２−ニトロ安息香酸又はその塩、例えば
５−スルホチオ−２−ニトロ安息香酸ナトリウム、等が
用いられる。
イオンの供給源としては、用いられる反応媒体中で亜硫
酸イオンをもたらすものであればよく、例えば、亜硫
酸、亜硫酸塩又は亜硫酸水素塩、例えば亜硫酸ナトリウ
ム、亜硫酸カリウム、亜硫酸水素ナトリウム又は亜硫酸
水素カリウム、メタ亜硫酸、メタ亜硫酸塩、例えばメタ
亜硫酸ナトリウム又はメタ亜硫酸カリウム、あるいは５
−スルホチオ−２−ニトロ安息香酸又はその塩、例えば
５−スルホチオ−２−ニトロ安息香酸ナトリウム、等が
用いられる。
前記反応〔II〕における酸化剤としてはテトラチオン酸
イオン、酸素、二価の銅イオン等が挙げられる。酸化剤
として用いられるテトラチオン酸イオン源としては、反
応媒体中でテトラチオン酸イオンを発生するものであれ
ば如何なる化合物でも使用しうるが、好適なものはとし
ては例えば、テトラチオン酸ナトリウム、テトラチオン
酸カリウムの如きテトラチオン酸アルカリ金属塩等であ
る。酸素の給源としては、空気を用いるのが便利であ
る。二価の銅イオン源としては硫酸第二銅、塩化第二銅
等が用いられる。
イオン、酸素、二価の銅イオン等が挙げられる。酸化剤
として用いられるテトラチオン酸イオン源としては、反
応媒体中でテトラチオン酸イオンを発生するものであれ
ば如何なる化合物でも使用しうるが、好適なものはとし
ては例えば、テトラチオン酸ナトリウム、テトラチオン
酸カリウムの如きテトラチオン酸アルカリ金属塩等であ
る。酸素の給源としては、空気を用いるのが便利であ
る。二価の銅イオン源としては硫酸第二銅、塩化第二銅
等が用いられる。
反応媒体としては水性媒体が好ましく、例えば水、水性
緩衝液、例えばトリス緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸
緩衝液、ドック緩衝液等が用いられる。
緩衝液、例えばトリス緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸
緩衝液、ドック緩衝液等が用いられる。
モノスルホ化カルシトニンの製造においては亜硫酸イオ
ンの量はカルシトニン蛋白に対して１倍モル以上が好ま
しく、そしてジ−スルホ化カルシトニンの製造において
は亜硫酸イオン及び酸化剤の量は、カルシトニン蛋白に
対してそれぞれ２倍モル以上及び１倍モル以上とするの
が好ましい。反応温度は50℃以下が好ましく、通常、反
応は室温において行なわれる。
ンの量はカルシトニン蛋白に対して１倍モル以上が好ま
しく、そしてジ−スルホ化カルシトニンの製造において
は亜硫酸イオン及び酸化剤の量は、カルシトニン蛋白に
対してそれぞれ２倍モル以上及び１倍モル以上とするの
が好ましい。反応温度は50℃以下が好ましく、通常、反
応は室温において行なわれる。
本発明方法は、蛋白質変性剤としての尿素とかグアニジ
ンの存在下で行うことができるが、非存在下でも可能で
ある。
ンの存在下で行うことができるが、非存在下でも可能で
ある。
反応時間は、カルシトニンの種類、試薬量、反応温度、
尿素などの変性剤添加の有無によって異なる。反応液の
pHは6.0〜10.0の範囲が好ましい。また反応系への試薬
の添加順序には特に制約はない。
尿素などの変性剤添加の有無によって異なる。反応液の
pHは6.0〜10.0の範囲が好ましい。また反応系への試薬
の添加順序には特に制約はない。
本発明で得られるスルホ化カルシトニンは、それ自体公
知の分離、精製法を適当に組み合わせて反応液中より分
離、精製することができる。これらの公知の分離、精製
法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する
方法、透析法、限外濾過法、ゲル濾過法及びSDS−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の
差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィー、イ
オン交換高速液体クロマトグラフィーなどの荷電の差を
利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなど
の特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマト
グラフィーなどの疎水性の差を使用する方法、等電点電
気泳動法などの等電点の差を利用する方法などがあげら
れる。
知の分離、精製法を適当に組み合わせて反応液中より分
離、精製することができる。これらの公知の分離、精製
法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する
方法、透析法、限外濾過法、ゲル濾過法及びSDS−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の
差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィー、イ
オン交換高速液体クロマトグラフィーなどの荷電の差を
利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなど
の特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマト
グラフィーなどの疎水性の差を使用する方法、等電点電
気泳動法などの等電点の差を利用する方法などがあげら
れる。
本発明のスルホ化カルシトニンは、カルシトニンと異な
りシスチン結合を持たないため、精製過程あるいは実施
例６及び７に示すように保存中の安定性が良いという特
徴を有する。
りシスチン結合を持たないため、精製過程あるいは実施
例６及び７に示すように保存中の安定性が良いという特
徴を有する。
このスルホ化カルシトニンは、必要によりこれを凍結乾
燥により粉末とすることができる。凍結乾燥に際して
は、例えば、ソルビトール、マンニトール、デキストロ
ース、マルトース、グリセロール、ヒト血清アルブミン
（HSA）などの安定剤を加えることができる。
燥により粉末とすることができる。凍結乾燥に際して
は、例えば、ソルビトール、マンニトール、デキストロ
ース、マルトース、グリセロール、ヒト血清アルブミン
（HSA）などの安定剤を加えることができる。
本発明のスルホ化カルシトニンは、ラットを用いた動物
試験で血清カルシウム低下活性を有することが判った。
従って、従来のカルシトニンと同様、医薬としての用
途、即ち血清カルシウム含量の低下が所望される各種疾
患治療、症状改善に利用できる。具体的には、例えば、
血中カルシウムの骨への固定が所望されるあらゆる骨の
病気、種々の原因による（副腎皮質ホルモン治療又は不
動性に起因する、あるいは更年期後に生じる、あるいは
外傷後に継発する）骨粗鬆症、骨折、骨軟化症、くる
病、腎性骨異栄養症及び高カルシウム血症、骨ページェ
ット症などの治療に適用できる。
試験で血清カルシウム低下活性を有することが判った。
従って、従来のカルシトニンと同様、医薬としての用
途、即ち血清カルシウム含量の低下が所望される各種疾
患治療、症状改善に利用できる。具体的には、例えば、
血中カルシウムの骨への固定が所望されるあらゆる骨の
病気、種々の原因による（副腎皮質ホルモン治療又は不
動性に起因する、あるいは更年期後に生じる、あるいは
外傷後に継発する）骨粗鬆症、骨折、骨軟化症、くる
病、腎性骨異栄養症及び高カルシウム血症、骨ページェ
ット症などの治療に適用できる。
本発明のスルホ化カルシトニンは、経口投与あるいは非
経口投与〔静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、経皮投
与、経直腸投与、経気道投与（経肺あるいは経鼻投
与）、関節内投与、iontophoretic deviceを用いた投
与〕などに適した製剤の形で使用できる。
経口投与〔静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、経皮投
与、経直腸投与、経気道投与（経肺あるいは経鼻投
与）、関節内投与、iontophoretic deviceを用いた投
与〕などに適した製剤の形で使用できる。
本発明のカルシトニン誘導体は第１位のシステインと第
７位のシステインとの間ジスルフィド結合を有しないた
め、従来のカルシトニンに比べて貯蔵安定性が極めて高
い。従って、従来のカルシトニン製剤が液剤として供給
できなかったのに対して、本発明のＳ−スルホ化カルシ
トニンを有効成分とする医薬製剤は、例えば非経口投与
のための、液剤として供給することが可能であり、この
点が本発明のカルシトニン誘導体の大きな特徴のひとつ
である。
７位のシステインとの間ジスルフィド結合を有しないた
め、従来のカルシトニンに比べて貯蔵安定性が極めて高
い。従って、従来のカルシトニン製剤が液剤として供給
できなかったのに対して、本発明のＳ−スルホ化カルシ
トニンを有効成分とする医薬製剤は、例えば非経口投与
のための、液剤として供給することが可能であり、この
点が本発明のカルシトニン誘導体の大きな特徴のひとつ
である。
以下、実施例により本発明を詳述する。
実施例1. サケカルシトニン−Ｉ、1mgをスルホ化試薬（7M尿素−
0.1M亜硫酸ナトリウム−0.01Mテトラチオン酸ナトリウ
ム−0.5Mトリス緩衝液（pH8.2）1mlに溶かして、37℃で
１時間反応させた。その反応液を４℃で純水１に対し
て透析（３回）を行ない、透析内液を凍結乾燥させスル
ホ化サケカルシトニン1mgを得た。
0.1M亜硫酸ナトリウム−0.01Mテトラチオン酸ナトリウ
ム−0.5Mトリス緩衝液（pH8.2）1mlに溶かして、37℃で
１時間反応させた。その反応液を４℃で純水１に対し
て透析（３回）を行ない、透析内液を凍結乾燥させスル
ホ化サケカルシトニン1mgを得た。
逆相HPLCによる試験の結果、かくして得られたスルホ化
サケカルシトニンは非常に純粋であることが確認され
た。本スルホ化サケカルシトニン−Ｉが、サケカルシト
ニン−Ｉのジスルフィド架橋が切断され、２個のＳ−ス
ルホ基を有するものであることは以下の方法で確認され
た。
サケカルシトニンは非常に純粋であることが確認され
た。本スルホ化サケカルシトニン−Ｉが、サケカルシト
ニン−Ｉのジスルフィド架橋が切断され、２個のＳ−ス
ルホ基を有するものであることは以下の方法で確認され
た。
（１）Ｎ−末端アミノ酸配列の解析。
この結果、１位及び７位のシステイン以外のアミノ酸配
列は報告されているサケカルシトニン−Ｉのそれと完全
に一致していた。この分析法においてはシステインは検
出できない。
列は報告されているサケカルシトニン−Ｉのそれと完全
に一致していた。この分析法においてはシステインは検
出できない。
（２）〔35S〕ラベルNa2SO3を用いた実験。
サケカルシトニン−I1モル当たり、２モルの−35SO3基
が結合していた。
が結合していた。
（３）ジチオスレイトールを用いた誘導体形成による確
認。
認。
サケカルシトニン−Ｉをジチオスレイトール処理した化
合物と、スルホ化サケカルシトニン−Ｉをジチオスレイ
トール処理した化合物の逆相HPLCパターンが完全に一致
した。
合物と、スルホ化サケカルシトニン−Ｉをジチオスレイ
トール処理した化合物の逆相HPLCパターンが完全に一致
した。
（４）アミノ酸の組成分析 スルホ化サケカルシトニン−I1モル当たり２モルのＳ−
スルホ化システインが存在していることが確認された。
スルホ化システインが存在していることが確認された。
（５）FAB−Mass分析 日本電子（株）製質量分析計JMS−SX102を用いたFAB（f
ast atom bombardment）mass spectorometryで分析した
ところm/e3594.5のピークが得られた。サケカルシトニ
ン−Ｉの分子量は3432.4であり、本データーは、サケカ
ルシトニン−Ｉ分子中に２個存在するシステイン残基が
−Ｓ−SO3Hに修飾されている事を示している。
ast atom bombardment）mass spectorometryで分析した
ところm/e3594.5のピークが得られた。サケカルシトニ
ン−Ｉの分子量は3432.4であり、本データーは、サケカ
ルシトニン−Ｉ分子中に２個存在するシステイン残基が
−Ｓ−SO3Hに修飾されている事を示している。
実施例2. スルホ化試薬として、7M尿素−0.1Mメタ亜硫酸ソーダ−
0.5Mトリス緩衝液（pH8.2）を用いて、実施例１と同様
の処理を行ないスルホ化サケカルシトニン−Ｉを得た。
0.5Mトリス緩衝液（pH8.2）を用いて、実施例１と同様
の処理を行ないスルホ化サケカルシトニン−Ｉを得た。
実施例3. スルホ化試薬として５−スルホチオ−２−ニトロ安息香
酸（Thannhouserら、Biochemistry 24,7681−7688,198
5）0.5Mトリス緩衝液（pH8.2）を用い、実施例１と同様
の処理を行ない、スルホ化サケカルシトニン−Ｉを得
た。
酸（Thannhouserら、Biochemistry 24,7681−7688,198
5）0.5Mトリス緩衝液（pH8.2）を用い、実施例１と同様
の処理を行ない、スルホ化サケカルシトニン−Ｉを得
た。
実施例4. ヒトカルシトニン0.5mgを、スルホ化試薬（7M尿素−0.1
M亜硫酸ナトリウム−0.01Mテトラチオン酸ナトリウム−
0.5Mトリス緩衝液（pH8.2））0.5mlに溶かして、37℃で
30分反応させた。
M亜硫酸ナトリウム−0.01Mテトラチオン酸ナトリウム−
0.5Mトリス緩衝液（pH8.2））0.5mlに溶かして、37℃で
30分反応させた。
反応液を４℃で純水１に対して透析（３回）を行な
い、透析内液を凍結乾燥することによってスルホ化ヒト
カルシトニン0.5mgを得た。
い、透析内液を凍結乾燥することによってスルホ化ヒト
カルシトニン0.5mgを得た。
実施例5. スルホ化サケカルシトニン−１の生物学的活性 前記の方法で合成したスルホ化サケカルシトニン−Ｉの
生物学的活性を、ラットにおける血清カルシウム低下作
用を指標として検討した。
生物学的活性を、ラットにおける血清カルシウム低下作
用を指標として検討した。
実験方法 体重120〜140グラムのウイスター系雄性ラットを一夜絶
食後、後述する生理的リン酸緩衝液（PBS（−））、ス
ルホ化サケカルシトニン−Ｉ液、あるいはサケカルシト
ニン−Ｉ液をラット一匹あたり1ml/kg背部皮下に投与
し、投与後１時間及び２時間に眼底静脈叢より血液約0.
2mlを採取した。血液は採取後、日立遠心器（SCT5BA）
を用い毎分3000回転で10分間遠心し、上清を血清画分と
した。
食後、後述する生理的リン酸緩衝液（PBS（−））、ス
ルホ化サケカルシトニン−Ｉ液、あるいはサケカルシト
ニン−Ｉ液をラット一匹あたり1ml/kg背部皮下に投与
し、投与後１時間及び２時間に眼底静脈叢より血液約0.
2mlを採取した。血液は採取後、日立遠心器（SCT5BA）
を用い毎分3000回転で10分間遠心し、上清を血清画分と
した。
血清カルシウム濃度は、市販のカルシウム測定用試液
（CaSET）（ヤトロン社製）を使用し、ｏ−クレゾール
フタレインコンプレクソン（OCPC）法により測定した。
即ち血清50μを試験管にとり、ｏ−クレゾールフタレ
インコンプレクソンと８−ハイドロオキシキノリンを含
む呈色試薬（RM117−２）0.5mlを加えて撹拌する。次い
でモノエタノールアミンホウ酸緩衝液（RM117−１）5.0
mlを加えて撹拌し、90分以内に自記分光光度計（島津製
作所、MPS−2000）を使用して575nmの波長で吸光度を測
定した。カルシウム濃度は吸光度より計算して求めた。
実験に供したPBS（−）、スルホ化サケカルシトニン−
Ｉ液、ならびにサケカルシトニン−Ｉ液の調製法を以下
に述べる。
（CaSET）（ヤトロン社製）を使用し、ｏ−クレゾール
フタレインコンプレクソン（OCPC）法により測定した。
即ち血清50μを試験管にとり、ｏ−クレゾールフタレ
インコンプレクソンと８−ハイドロオキシキノリンを含
む呈色試薬（RM117−２）0.5mlを加えて撹拌する。次い
でモノエタノールアミンホウ酸緩衝液（RM117−１）5.0
mlを加えて撹拌し、90分以内に自記分光光度計（島津製
作所、MPS−2000）を使用して575nmの波長で吸光度を測
定した。カルシウム濃度は吸光度より計算して求めた。
実験に供したPBS（−）、スルホ化サケカルシトニン−
Ｉ液、ならびにサケカルシトニン−Ｉ液の調製法を以下
に述べる。
ａ）PBS（−）：ダルベッコPBS（−）（日水製薬）9.6g
を再蒸溜水１に溶解して調製した。
を再蒸溜水１に溶解して調製した。
ｂ）スルホ化サケカルシトニン−I:スルホ化サケカルシ
トニン−Ｉを上述のPBS（−）で希釈し、溶液1ml中にス
ルホ化サケカルシトニン−Ｉを31.25ng,62.5ng,125ng,2
50ng含むように調製した。
トニン−Ｉを上述のPBS（−）で希釈し、溶液1ml中にス
ルホ化サケカルシトニン−Ｉを31.25ng,62.5ng,125ng,2
50ng含むように調製した。
ｃ）サケカルシトニン−Ｉ液：サケカルシトニン−Ｉ
（PENINSULA LABORATORIES,INC.製）を上述のPBS（−）
で希釈して、溶液1ml中にサケカルシトニン−Ｉを31.25
ng,62.5ng,125ng,250ng含むように調製した。
（PENINSULA LABORATORIES,INC.製）を上述のPBS（−）
で希釈して、溶液1ml中にサケカルシトニン−Ｉを31.25
ng,62.5ng,125ng,250ng含むように調製した。
実験成績 第１表に実験成績を示す。スルホ化サケカルシトニン−
Ｉをそれぞれ31.25,62.5,125,250,ng/kg皮下投与された
ラットの投与後１時間の血清カルシウム濃度は、125ng/
kg以上の投与量で、また投与後２時間の血清カルシウム
濃度は250ng/kg投与量で、PBS（−）投与群と比べ有意
に低下した。スルホ化サケカルシトニン−Ｉ投与後１時
間及び２時間の血清カルシウム濃度の低下は、サケカル
シトニン−Ｉ投与後１時間及び２時間の血清カルシウム
濃度の低下と同等であり、本実験において、スルホ化サ
ケカルシトニン−Ｉはサケカルシトニン−Ｉと同等の血
清カルシウム低下活性を有するものと推察された。
Ｉをそれぞれ31.25,62.5,125,250,ng/kg皮下投与された
ラットの投与後１時間の血清カルシウム濃度は、125ng/
kg以上の投与量で、また投与後２時間の血清カルシウム
濃度は250ng/kg投与量で、PBS（−）投与群と比べ有意
に低下した。スルホ化サケカルシトニン−Ｉ投与後１時
間及び２時間の血清カルシウム濃度の低下は、サケカル
シトニン−Ｉ投与後１時間及び２時間の血清カルシウム
濃度の低下と同等であり、本実験において、スルホ化サ
ケカルシトニン−Ｉはサケカルシトニン−Ｉと同等の血
清カルシウム低下活性を有するものと推察された。
実施例6. 50μｇのスルホ化サケカルシトニン−Ｉ及びサケカルシ
トニン−Ｉを2.5mMクエン酸緩衝液（pH2.8）100μに
溶解後、凍結状態（−80℃）での経時的安定性について
検討した。結果を第２表に示した。
トニン−Ｉを2.5mMクエン酸緩衝液（pH2.8）100μに
溶解後、凍結状態（−80℃）での経時的安定性について
検討した。結果を第２表に示した。
尚、残存量は逆相HPLCを用いて定量した。
以上の通り、本発明のスルホ化カルシトニンはその天然
型カルシトニンに比べて安定性が非常に優れている。
型カルシトニンに比べて安定性が非常に優れている。
実施例7. スルホ化サケカルシトニン−Ｉ及びサケカルシトニン−
Ｉ各50μｇを100μの50mM Tris−HCl（pH7.2）に溶解
後、37℃での経時的安定性について検討した。尚、残存
量は逆相HPLCを用いて定量した。
Ｉ各50μｇを100μの50mM Tris−HCl（pH7.2）に溶解
後、37℃での経時的安定性について検討した。尚、残存
量は逆相HPLCを用いて定量した。
以上の通り、本発明のスルホ化カルシトニンは、その水
性溶液中でも、天然型に比べて非常に高い貯蔵安定性を
示す。
性溶液中でも、天然型に比べて非常に高い貯蔵安定性を
示す。
Claims (10)
- 【請求項１】カルシトニンの第１位のシステイン及び第
７位のシステインの内の少なくとも１個がＳ−スルホ化
されているスルホ化カルシトニン誘導体、及びその塩。 - 【請求項２】前記カルシトニンがサケカルシトニン−
Ｉ、−IIもしくは−III、ウナギカルシトニン、ブタカ
ルシトニン、ウシカルシトニン、ヒツジカルシトニン、
ニワトリカルシトニン又はヒトカルシトニンのいずれか
である、請求項１記載のスルホ化カルシトニン誘導体及
びその塩。 - 【請求項３】前記第１位のシステイン及び第７位のシス
テインの両者がＳ−スルホ化されている、請求項１記載
のスルホ化カルシトニン誘導体及びその塩。 - 【請求項４】次の式： （式〔Ｉ〕において、Ｘは水素又はアルカリ金属を表わ
す。） で表わされるアミノ酸配列又はそれと生物学的に同等の
アミノ酸配列を有するスルホ化カルシトニン誘導体及び
その塩。 - 【請求項５】カルシトニンの第１位のシステイン及び第
７位のシステインの内いずれか一方がＳ−スルホ化され
ているモノ−スルホ化カルシトニン誘導体又はその塩の
製造方法であって、カルシトニンと亜硫酸イオンとを反
応せしめ、そして所望のモノ−スルホ化カルシトニンを
採取することを特徴とする方法。 - 【請求項６】カルシトニンの第１位のシステイン及び第
７位のシステインの両者がＳ−スルホ化されているジ−
スルホ化カルシトニン誘導体の製造方法であって、カル
シトニンを亜硫酸イオン及び酸化剤と反応せしめること
を特徴とする方法。 - 【請求項７】前記亜硫酸イオンを亜硫酸もしくはその
塩、メタ亜硫酸もしくはその塩又は５−スルホチオ−２
−ニトロ安息香酸もしくはその塩により供給する、請求
項５又は６に記載の方法。 - 【請求項８】前記酸化剤がテトラチオン酸イオン、酸素
又は二価の銅イオンである、請求項６に記載の方法。 - 【請求項９】カルシトニンの第１位のシステイン及び第
７位のシステインの内の少なくとも１個がＳ−スルホ化
されているスルホ化カルシトニン誘導体又はその医薬と
して許容される塩を活性成分として含んで成るカルシウ
ム低下剤。 - 【請求項１０】カルシトニンの第１位のシステイン及び
第７位のシステインの内の少なくとも１個がＳ−スルホ
化されているスルホ化カルシトニン誘導体又はその医薬
として許容される塩を活性成分として含んで成る骨形成
促進剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1152310A JPH0678358B2 (ja) | 1988-06-16 | 1989-06-16 | スルホ化カルシトニン誘導体及びその製造方法 |
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14696188 | 1988-06-16 | ||
| JP63-146961 | 1988-06-16 | ||
| JP63-318476 | 1988-10-19 | ||
| JP31847688 | 1988-12-19 | ||
| JP1152310A JPH0678358B2 (ja) | 1988-06-16 | 1989-06-16 | スルホ化カルシトニン誘導体及びその製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02262596A JPH02262596A (ja) | 1990-10-25 |
| JPH0678358B2 true JPH0678358B2 (ja) | 1994-10-05 |
Family
ID=26477649
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1152310A Expired - Lifetime JPH0678358B2 (ja) | 1988-06-16 | 1989-06-16 | スルホ化カルシトニン誘導体及びその製造方法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5153308A (ja) |
| EP (1) | EP0347105B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0678358B2 (ja) |
| KR (1) | KR930008096B1 (ja) |
| AU (1) | AU629552B2 (ja) |
| DE (1) | DE68913080T2 (ja) |
| NZ (1) | NZ229483A (ja) |
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| US6034064A (en) * | 1995-04-07 | 2000-03-07 | Hoechst Pharmaceuticals & Chemicals K.K. | Peptides and therapeutic agent for autoimmune diseases containing the same |
| US6083480A (en) | 1997-05-01 | 2000-07-04 | Diatide, Inc. | Calcitonin receptor binding reagents |
| WO2004084859A2 (en) | 2003-03-21 | 2004-10-07 | Nastech Pharmaceutical Company Inc. | Nasal calcitonin formulations containing chlorobutanol |
| WO2016034604A1 (en) | 2014-09-04 | 2016-03-10 | Novo Nordisk A/S | Novel amylin and calcitonin receptor agonist |
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| EP0188400B1 (de) * | 1985-01-16 | 1992-07-08 | Ciba-Geigy Ag | Oligopeptide sowie Zwischenprodukte und Verfahren zu ihrer Herstellung |
| JPS6229997A (ja) * | 1985-04-08 | 1987-02-07 | Sankyo Co Ltd | Ｃ末端にプロリンアミドを有するペプチドの製法 |
| GB8523156D0 (en) * | 1985-09-19 | 1985-10-23 | Celltech Ltd | Polypeptide production |
| NL8602950A (nl) * | 1985-12-04 | 1987-07-01 | Sandoz Ag | Calcitonine-derivaten en werkwijzen voor het bereiden van deze derivaten en van farmaceutische preparaten die ze bevatten. |
| US4658014A (en) * | 1985-12-20 | 1987-04-14 | Kempe Tomas G | Synthetic peptides with calcitonin-like activity |
| US4820804A (en) * | 1987-04-21 | 1989-04-11 | Rorer Pharmaceutical Corporation | Analogs of [1,7-di-alanine, des-19-leucine]calcitonin |
-
1989
- 1989-06-07 US US07/362,855 patent/US5153308A/en not_active Expired - Fee Related
- 1989-06-07 AU AU36141/89A patent/AU629552B2/en not_active Ceased
- 1989-06-09 NZ NZ229483A patent/NZ229483A/en unknown
- 1989-06-09 EP EP89305813A patent/EP0347105B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-06-09 DE DE68913080T patent/DE68913080T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1989-06-16 KR KR1019890008343A patent/KR930008096B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 1989-06-16 JP JP1152310A patent/JPH0678358B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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| DE68913080D1 (de) | 1994-03-24 |
| DE68913080T2 (de) | 1994-09-08 |
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| EP0347105A3 (en) | 1990-10-10 |
| EP0347105A2 (en) | 1989-12-20 |
| AU3614189A (en) | 1990-02-08 |
| KR930008096B1 (ko) | 1993-08-25 |
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| NZ229483A (en) | 1991-06-25 |
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