JPH0683666B2 - 腫瘍▲下−▼胎児に特異的なモノクロナ−ル抗体の調製方法および使用方法 - Google Patents
腫瘍▲下−▼胎児に特異的なモノクロナ−ル抗体の調製方法および使用方法Info
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- JPH0683666B2 JPH0683666B2 JP60505335A JP50533585A JPH0683666B2 JP H0683666 B2 JPH0683666 B2 JP H0683666B2 JP 60505335 A JP60505335 A JP 60505335A JP 50533585 A JP50533585 A JP 50533585A JP H0683666 B2 JPH0683666 B2 JP H0683666B2
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は一部、アメリカ合衆国政府基金を用いてなされ
た。アメリカ合衆国政府は、本発明においてある特定の
権利を有している。
た。アメリカ合衆国政府は、本発明においてある特定の
権利を有している。
技術範囲 本発明は腫瘍−胎児抗原、それに対する免疫反応性を有
するモノクロナール抗体、そのモノクロナール抗体の調
製方法および、それらの抗体の使用方法（例えば、癌の
診断および腫瘍のタイプの分類などに使用する方法）に
関するものである。
するモノクロナール抗体、そのモノクロナール抗体の調
製方法および、それらの抗体の使用方法（例えば、癌の
診断および腫瘍のタイプの分類などに使用する方法）に
関するものである。
背景 癌は、最も人間が挫折感を抱き、恐れている疾病のひと
つである。分明人の寿命がのびたために、明らかに、個
人が癌にかかる可能性が、非常に高くなつたのである。
癌が臨床的に認められると、癌制御に用いられる治療の
ほとんどは、大部分の致死的な癌に対しては、せいぜい
緩和するのが精一杯であるので、癌生物学者のフラスト
レーションが増大している。新しい癌制御方法を発達さ
せるために、数十億ドルの研究費および数百万の労働時
間が費やされたにもかかわらず、人がかかる主な癌の生
存率は、一般に改善していない。それ故、腫瘍学者およ
び腫瘍生物学者が癌生物学をよりよく理解することによ
り、癌診断および癌治療のためのよりよい手段を必死に
探究しているのは当然のことである。
つである。分明人の寿命がのびたために、明らかに、個
人が癌にかかる可能性が、非常に高くなつたのである。
癌が臨床的に認められると、癌制御に用いられる治療の
ほとんどは、大部分の致死的な癌に対しては、せいぜい
緩和するのが精一杯であるので、癌生物学者のフラスト
レーションが増大している。新しい癌制御方法を発達さ
せるために、数十億ドルの研究費および数百万の労働時
間が費やされたにもかかわらず、人がかかる主な癌の生
存率は、一般に改善していない。それ故、腫瘍学者およ
び腫瘍生物学者が癌生物学をよりよく理解することによ
り、癌診断および癌治療のためのよりよい手段を必死に
探究しているのは当然のことである。
他の方法では治療不可能である腫瘍が、自然に軽減する
という事例が、数少ないが有意に起こつているので、人
体が本来持つている防御機構が、腫瘍出現に対する抵抗
を改善するために用いられているのではないかと生物学
者は期待している。いつの日か、二度と癌にかからない
ようにヒトを免疫することが、少なくとも理論的には、
できるようになるであろうという延大な計画へと、この
希望的観察は拡張してきた。
という事例が、数少ないが有意に起こつているので、人
体が本来持つている防御機構が、腫瘍出現に対する抵抗
を改善するために用いられているのではないかと生物学
者は期待している。いつの日か、二度と癌にかからない
ようにヒトを免疫することが、少なくとも理論的には、
できるようになるであろうという延大な計画へと、この
希望的観察は拡張してきた。
ヒトの癌、および動物の実験用の癌の多くに関して、癌
宿主の免疫機構は、広範な種類の自然発生癌および人工
的に誘導した癌に存在している抗原決定群を確かに記憶
しているらしいという事に、この20年間に、生物学者は
気がついた。あるいはまた、免疫応答にする妨害を発見
した（例えば、抑制）。宿主の抗原性腫瘍増殖に対する
感受性にこの免疫的記憶が役目を果たす手段についての
正確な実体は、ごく最近に解明されてきたに過ぎない。
宿主の免疫機構は、広範な種類の自然発生癌および人工
的に誘導した癌に存在している抗原決定群を確かに記憶
しているらしいという事に、この20年間に、生物学者は
気がついた。あるいはまた、免疫応答にする妨害を発見
した（例えば、抑制）。宿主の抗原性腫瘍増殖に対する
感受性にこの免疫的記憶が役目を果たす手段についての
正確な実体は、ごく最近に解明されてきたに過ぎない。
何年もの間、癌生物学者は、腫瘍細胞の内部に、また
は、その表面に現われる新しい抗原を検出し、その特性
を調べることにたずさわつてきた。このような抗原決定
基の多くは、ウイルス性の動物の腫瘍、および化学的に
誘引した動物の腫瘍に出現する。SV40ウイルスのような
発癌性DNA含有ウイルスを不完全に感染させるか、RNA含
有レテロウイルスを感染させた結果、形質転換した細胞
の内部に、または、その細胞表面に出現する抗原のタイ
プは、これらのウイルスの各々を用いて形質転換した異
なる種の細胞にも存在することを一般に示すことができ
る。しかし、各々のウイルス種は、異なつた腫瘍ウイル
スにより誘導されたものに対して特異的な抗原を誘導す
る。化学的に誘導した腫瘍はその宿主中で抗原性を有す
ることが多いが、ウイルス性移植抗原を欠くこともあ
る。
は、その表面に現われる新しい抗原を検出し、その特性
を調べることにたずさわつてきた。このような抗原決定
基の多くは、ウイルス性の動物の腫瘍、および化学的に
誘引した動物の腫瘍に出現する。SV40ウイルスのような
発癌性DNA含有ウイルスを不完全に感染させるか、RNA含
有レテロウイルスを感染させた結果、形質転換した細胞
の内部に、または、その細胞表面に出現する抗原のタイ
プは、これらのウイルスの各々を用いて形質転換した異
なる種の細胞にも存在することを一般に示すことができ
る。しかし、各々のウイルス種は、異なつた腫瘍ウイル
スにより誘導されたものに対して特異的な抗原を誘導す
る。化学的に誘導した腫瘍はその宿主中で抗原性を有す
ることが多いが、ウイルス性移植抗原を欠くこともあ
る。
イン・ビトロ条件またはイン・ビボ条件のいずれかの条
件下での細胞の、ウイルス性形質転換の過程中、または
その後に出現する腫瘍関連抗原の内で最もよく知られて
いるものは(1)腫瘍関連細胞表面抗原、(2)膜関連腫瘍特
異的または腫瘍関連移植抗原、(3)主に核内に局在する
細胞内抗原で、腫瘍抗原またはＴ抗原と名づけられてお
り、腫瘍が大きくなり、壊死が生じる場合にのみ免疫原
として機能するもの、(4)ウイルス粒子上に、または細
胞膜内の成熟ウイルス自体の上に存在するウイルス関連
抗原、(5)SV40形質転換細胞をイン・ビトロで培養した
場合に、細胞表面上でおよび、また、細胞外液中で再発
現された胚または胎児性抗原。この胚または胎児性抗原
は、抗体を用いて、および移植拒絶試験によつても検出
することができる（この序文は本質的にコギン（Coggi
n）、Jr.およびアムブローゼ（Ambrose）、メソーズ・
イン・キヤンサー・リサーチ（Methods in Cancer Rese
arch）、18巻、10章、371−389ページから抜粋したもの
である）。
件下での細胞の、ウイルス性形質転換の過程中、または
その後に出現する腫瘍関連抗原の内で最もよく知られて
いるものは(1)腫瘍関連細胞表面抗原、(2)膜関連腫瘍特
異的または腫瘍関連移植抗原、(3)主に核内に局在する
細胞内抗原で、腫瘍抗原またはＴ抗原と名づけられてお
り、腫瘍が大きくなり、壊死が生じる場合にのみ免疫原
として機能するもの、(4)ウイルス粒子上に、または細
胞膜内の成熟ウイルス自体の上に存在するウイルス関連
抗原、(5)SV40形質転換細胞をイン・ビトロで培養した
場合に、細胞表面上でおよび、また、細胞外液中で再発
現された胚または胎児性抗原。この胚または胎児性抗原
は、抗体を用いて、および移植拒絶試験によつても検出
することができる（この序文は本質的にコギン（Coggi
n）、Jr.およびアムブローゼ（Ambrose）、メソーズ・
イン・キヤンサー・リサーチ（Methods in Cancer Rese
arch）、18巻、10章、371−389ページから抜粋したもの
である）。
診断薬および治療薬を調製することを目的として、腫瘍
抗原に対する抗体（ポリクローナルまたはモノクローナ
ル抗体）を開発するための多くの試みがなされててた。
この希望を持つて、以前に、２種類の免疫方法、すなわ
ち異種免疫および同種異系免疫が行なわれた。異種免疫
は、マウスまたはラツトなどの動物を、異種の動物（例
えば、ヒト）由来の動物組織（例えば、腫瘍組織）を用
いて免疫する方法である。同種異系免疫は、ある特定の
種の動物を、同種であるが異なる系（株）の動物由来の
組織を用いて免疫することにより得る。ヒト神経芽細胞
種に対するモノクロナール抗体を提供するマウスの異種
免疫の例は、ケネツト（Kennett）、R.H.、モノクロナ
ール抗体、ハイブリドーマ:A New Dimension In Bi
ological Analysis、10章、115−168ページ、に記載さ
れている。マウス脾細胞由来のヒト白血病細胞に対して
異種的に惹起させたモノクロナール抗体については例え
ば、サトウ（Sato）、らの「発育、増殖および文化」、
25:333−344（1983）に記載されている。異種免疫で調
製する抗体（ポリクロナールであろうともモノクロナー
ルであろうと）には、いくつかの問題点がある。おそら
く、その最も重要な問題点は、このような抗体の腫瘍に
対する完全な特異性を常に確立することが明らかに困難
であるということである。マウスまたはトラツトを、特
定のヒト腫瘍組織で異種免疫することにより得たモノク
ロナール抗体は、その特定の腫瘍クラスに対して完全な
特異性を示すものはほとんどなく、その多くは正常な成
人ヒト組織のあるものと反応する（例えば、ローゼンベ
ルグ（Rosenberg）、S.A.、ローゼンベルグ編集，「ヒ
ト癌抗原の血清学的分析」、ニューヨーク、アカデミツ
ク・プレス、1980参照）。これらの問題点は、ヒト腫瘍
細胞を、組織不適合性宿主に注射した場合、ヒト腫瘍細
胞は、腫瘍に特異的な抗原を有するのみならず、他の多
くの正常な非腫瘍関連抗原をも有しているという事実に
起因する。それ故、異種の、または異系の腫瘍細胞に対
して惹起せしめたポリクロナール血清は必然的に、腫瘍
に特異な抗原および腫瘍に非特異的な抗原の両方に対し
て免疫反応性を有している。特定の抗原決定基に対する
モノクロナール（MC）抗体を得ることができる様になつ
たので、ハイブリドーマ上清から無作為に選択して得た
モノクロナール抗体の内には、真実の腫瘍特異性を有し
ているものがあるかもしれないという期待が生れてき
た。しかし、これは単調でたいくつで、面倒な作業であ
り、結果が再現性を有している保証も乏しいのである。
その結果は「のるかそるか」であり、抗体を「惹起」さ
せるための古典的免疫学のアプローチが基礎となつてい
る。
抗原に対する抗体（ポリクローナルまたはモノクローナ
ル抗体）を開発するための多くの試みがなされててた。
この希望を持つて、以前に、２種類の免疫方法、すなわ
ち異種免疫および同種異系免疫が行なわれた。異種免疫
は、マウスまたはラツトなどの動物を、異種の動物（例
えば、ヒト）由来の動物組織（例えば、腫瘍組織）を用
いて免疫する方法である。同種異系免疫は、ある特定の
種の動物を、同種であるが異なる系（株）の動物由来の
組織を用いて免疫することにより得る。ヒト神経芽細胞
種に対するモノクロナール抗体を提供するマウスの異種
免疫の例は、ケネツト（Kennett）、R.H.、モノクロナ
ール抗体、ハイブリドーマ:A New Dimension In Bi
ological Analysis、10章、115−168ページ、に記載さ
れている。マウス脾細胞由来のヒト白血病細胞に対して
異種的に惹起させたモノクロナール抗体については例え
ば、サトウ（Sato）、らの「発育、増殖および文化」、
25:333−344（1983）に記載されている。異種免疫で調
製する抗体（ポリクロナールであろうともモノクロナー
ルであろうと）には、いくつかの問題点がある。おそら
く、その最も重要な問題点は、このような抗体の腫瘍に
対する完全な特異性を常に確立することが明らかに困難
であるということである。マウスまたはトラツトを、特
定のヒト腫瘍組織で異種免疫することにより得たモノク
ロナール抗体は、その特定の腫瘍クラスに対して完全な
特異性を示すものはほとんどなく、その多くは正常な成
人ヒト組織のあるものと反応する（例えば、ローゼンベ
ルグ（Rosenberg）、S.A.、ローゼンベルグ編集，「ヒ
ト癌抗原の血清学的分析」、ニューヨーク、アカデミツ
ク・プレス、1980参照）。これらの問題点は、ヒト腫瘍
細胞を、組織不適合性宿主に注射した場合、ヒト腫瘍細
胞は、腫瘍に特異的な抗原を有するのみならず、他の多
くの正常な非腫瘍関連抗原をも有しているという事実に
起因する。それ故、異種の、または異系の腫瘍細胞に対
して惹起せしめたポリクロナール血清は必然的に、腫瘍
に特異な抗原および腫瘍に非特異的な抗原の両方に対し
て免疫反応性を有している。特定の抗原決定基に対する
モノクロナール（MC）抗体を得ることができる様になつ
たので、ハイブリドーマ上清から無作為に選択して得た
モノクロナール抗体の内には、真実の腫瘍特異性を有し
ているものがあるかもしれないという期待が生れてき
た。しかし、これは単調でたいくつで、面倒な作業であ
り、結果が再現性を有している保証も乏しいのである。
その結果は「のるかそるか」であり、抗体を「惹起」さ
せるための古典的免疫学のアプローチが基礎となつてい
る。
この10−15年間にわたり、癌研究とは異なる系列の研究
と共に、ヒトおよび、げつ歯類の悪性腫瘍の大部分は、
同系宿主に於いて免疫原性を持つことができ、細胞原形
質膜に関連している共通の胚（胎児性）抗原決定基（E
A）を有しているという可能性がわかつて来た（例え
ば、コギン（（Coggin）、Jr.、「胎児性抗原と癌」、
ピツトマン（Pittman）、ロンドン（CIBA基金シンポジ
ウム96）、28−54ページ（1983）参照）。本明細書で用
いる定義によると、真のEAは胚芽の、（germinal）、胚
の（embryonic）、およびある胎児の細胞膜上で、特異
的に発現され、正常な成熟組織および再生組織において
は（免疫原性的に）発現されない。子宮内での、胎児の
発達における胚の抗原の免疫学的役割はまだ明らかでは
ない。子宮内で発現されたEAに反応して、母体抗体が生
成することが知られている。悪性細胞クローンの出現時
にEAを再発現させる発癌性プロセスの生物学的産物が宿
主において、腫瘍保護免疫応答の促進に親密な関係があ
るらしい。これらの応答は、EA+の胎児を妊婦の免疫攻
撃から保護するように動く妊娠時の免疫応答と類似して
いる。
と共に、ヒトおよび、げつ歯類の悪性腫瘍の大部分は、
同系宿主に於いて免疫原性を持つことができ、細胞原形
質膜に関連している共通の胚（胎児性）抗原決定基（E
A）を有しているという可能性がわかつて来た（例え
ば、コギン（（Coggin）、Jr.、「胎児性抗原と癌」、
ピツトマン（Pittman）、ロンドン（CIBA基金シンポジ
ウム96）、28−54ページ（1983）参照）。本明細書で用
いる定義によると、真のEAは胚芽の、（germinal）、胚
の（embryonic）、およびある胎児の細胞膜上で、特異
的に発現され、正常な成熟組織および再生組織において
は（免疫原性的に）発現されない。子宮内での、胎児の
発達における胚の抗原の免疫学的役割はまだ明らかでは
ない。子宮内で発現されたEAに反応して、母体抗体が生
成することが知られている。悪性細胞クローンの出現時
にEAを再発現させる発癌性プロセスの生物学的産物が宿
主において、腫瘍保護免疫応答の促進に親密な関係があ
るらしい。これらの応答は、EA+の胎児を妊婦の免疫攻
撃から保護するように動く妊娠時の免疫応答と類似して
いる。
実際に、胚の抗原は、げつ歯類およびヒトのあらゆる種
類の腫瘍によつて発現される。ヒト腫瘍（例えばメラノ
ーマ）において発現される胎児性抗原（腫瘍−胎児性抗
原またはOFA抗原と同意義）は、共通のEAも報告されて
はいるが、組織学上区別されるクラスに分類すべきであ
ると考えられる。アムブローゼ（Ambrose）、K.R.ら、
ネーチャー233:194（1971）；コギン（（Coggin）、J.
ら、「癌研究の発達」19:105（1974）および、コギン、
CIBAシンポジウム、（前述）は、共通する免疫原性抗原
決定群を持ち、種の進化において保存されたげつ歯類と
ヒトの胚の抗原は、げつ歯類の腫瘍におけると同様に、
ヒトの腫瘍においても、OFA抗原として再発現されると
いうことを報告している。この考えは、初めは、放射線
照射を受けたヒトの胎児の腎臓細胞および放射線照射を
受けた同系のハムスターの胎児細胞は共に、ハムスター
におけるSV40による発癌を妨害するという発見から生じ
た。成人ヒトの組織は同じように保護的ではなかつた。
このことは、げつ歯類の胚の抗原は、げつ歯類の腫瘍−
胎児性抗原と関連があり、げつ歯類の胚の抗原は、ヒト
の胚の抗原のあるものとは同一であることを意味してい
る。ヒト胎児の腎臓細胞上に存在する胚抗原は、SV40に
より活性化されたハムスターの胚の抗原に対して保護す
るので、少なくとも、ヒトの胚抗原の内には、げつ歯類
の腫瘍−胎児抗原と同じものが存在しているのである。
類の腫瘍によつて発現される。ヒト腫瘍（例えばメラノ
ーマ）において発現される胎児性抗原（腫瘍−胎児性抗
原またはOFA抗原と同意義）は、共通のEAも報告されて
はいるが、組織学上区別されるクラスに分類すべきであ
ると考えられる。アムブローゼ（Ambrose）、K.R.ら、
ネーチャー233:194（1971）；コギン（（Coggin）、J.
ら、「癌研究の発達」19:105（1974）および、コギン、
CIBAシンポジウム、（前述）は、共通する免疫原性抗原
決定群を持ち、種の進化において保存されたげつ歯類と
ヒトの胚の抗原は、げつ歯類の腫瘍におけると同様に、
ヒトの腫瘍においても、OFA抗原として再発現されると
いうことを報告している。この考えは、初めは、放射線
照射を受けたヒトの胎児の腎臓細胞および放射線照射を
受けた同系のハムスターの胎児細胞は共に、ハムスター
におけるSV40による発癌を妨害するという発見から生じ
た。成人ヒトの組織は同じように保護的ではなかつた。
このことは、げつ歯類の胚の抗原は、げつ歯類の腫瘍−
胎児性抗原と関連があり、げつ歯類の胚の抗原は、ヒト
の胚の抗原のあるものとは同一であることを意味してい
る。ヒト胎児の腎臓細胞上に存在する胚抗原は、SV40に
より活性化されたハムスターの胚の抗原に対して保護す
るので、少なくとも、ヒトの胚抗原の内には、げつ歯類
の腫瘍−胎児抗原と同じものが存在しているのである。
最近まで、EAの特徴を免疫化学的に特徴ずけるのに使用
できる試薬がなかつたので、EA抗原の性質は明らかでは
なかつた。しかし、多くの研究者が、モノクロナール抗
体を用いて精製を行なつてはいないけれども、種々の胎
児性抗原といわれているものを発見したことを報告して
いる。プライス（Price）,M.R.、Soc.Trans.、2:650（1
974）は、ラツト肝癌において、推定分子量（100KD）を
有する大きな特性の示されていない胎児に関連した抗原
を発見した。エバンス（Evans）ら、キヤンサー・リサ
ーチ（Can. Res.）、39:2006（1979）は、ラツトの肉腫
が、3.5KD〜10DKの範囲に入ると推定される２つの腫瘍
−胎児性抗原を示すことを発見した。デイツキンソンら
（Dickinson et al.）、Br. j. cancer、29:425（197
4）は、胸、子宮頸、膣および網膜のヒト腫瘍の抽出物
が、胎児性抗原に関連しているらしい、16〜18KDの大き
さをもつ、いくつかの小さな共通のたん白質を含んでい
ることを報告した。ジヨルンバールら（Jornvall et a
l.）、P.N.A.S.USA 79:287（1982）は、53KDの腫瘍−胎
児性たん白質を発見したと報告している。それは、配列
決定され、DNA結合能力を、ポリオーマ中型Ｔ抗原（55K
D）と共有しているものであつた。この形質転換に関連
したたん白質は、評価されたヒトおよび成人の腫瘍タイ
プのいくつかにおけるのと同様に、いくつかの種の妊娠
中期の胎児性細胞にも存在していた。
できる試薬がなかつたので、EA抗原の性質は明らかでは
なかつた。しかし、多くの研究者が、モノクロナール抗
体を用いて精製を行なつてはいないけれども、種々の胎
児性抗原といわれているものを発見したことを報告して
いる。プライス（Price）,M.R.、Soc.Trans.、2:650（1
974）は、ラツト肝癌において、推定分子量（100KD）を
有する大きな特性の示されていない胎児に関連した抗原
を発見した。エバンス（Evans）ら、キヤンサー・リサ
ーチ（Can. Res.）、39:2006（1979）は、ラツトの肉腫
が、3.5KD〜10DKの範囲に入ると推定される２つの腫瘍
−胎児性抗原を示すことを発見した。デイツキンソンら
（Dickinson et al.）、Br. j. cancer、29:425（197
4）は、胸、子宮頸、膣および網膜のヒト腫瘍の抽出物
が、胎児性抗原に関連しているらしい、16〜18KDの大き
さをもつ、いくつかの小さな共通のたん白質を含んでい
ることを報告した。ジヨルンバールら（Jornvall et a
l.）、P.N.A.S.USA 79:287（1982）は、53KDの腫瘍−胎
児性たん白質を発見したと報告している。それは、配列
決定され、DNA結合能力を、ポリオーマ中型Ｔ抗原（55K
D）と共有しているものであつた。この形質転換に関連
したたん白質は、評価されたヒトおよび成人の腫瘍タイ
プのいくつかにおけるのと同様に、いくつかの種の妊娠
中期の胎児性細胞にも存在していた。
ヒト腫瘍細胞に、げつ歯類のおよび／またはヒトの胚抗
原が存在するかどうかについて研究がなされる一方で、
同系の免疫を行なう研究者もいた。同系免疫は、免疫学
的方法によつて、検出できる組織不適合性抗原決定基を
除かれた動物システムにおいて誘導されるものである。
いいかえると、同系免疫は、特定の動物を、発生学的に
同一の（即ち、同種の，同系の）動物から得た組織で免
疫することにより得られる免疫である。
原が存在するかどうかについて研究がなされる一方で、
同系の免疫を行なう研究者もいた。同系免疫は、免疫学
的方法によつて、検出できる組織不適合性抗原決定基を
除かれた動物システムにおいて誘導されるものである。
いいかえると、同系免疫は、特定の動物を、発生学的に
同一の（即ち、同種の，同系の）動物から得た組織で免
疫することにより得られる免疫である。
コギンら（Coggin Jr.、 et al.）、ジヤーナル・オブ
・イムノロジー（The Journal of Immunology）105:524
（1970）およびコギン（Coggin）ら、「癌研究の発達」
（Adv. Can. Res.）19:105−165（1974）は、ハムスタ
ーおよびマウスの胎児細胞が、SV40により誘導された肉
腫および、他のウイルスにより誘導された、および化学
的に誘導された肉腫と交差反応する抗原を有し、その場
合に、この抗原は抗体生成を刺激することを報告した。
10日間放射線を照射したハムスターの胎児細胞を、成熟
した同系のハムスターに注射すると抗体が生成するが、
14日間照射を行なつたハムスターの胎児細胞を用いる場
合には抗体は生成しない。そして、その後、これらの動
物はSV40腫瘍細胞のチヤレンジに対して免疫能を示すこ
とが発見された。照射を受けなかつた胎児細胞は移植免
疫を引き起こさなかつた。
・イムノロジー（The Journal of Immunology）105:524
（1970）およびコギン（Coggin）ら、「癌研究の発達」
（Adv. Can. Res.）19:105−165（1974）は、ハムスタ
ーおよびマウスの胎児細胞が、SV40により誘導された肉
腫および、他のウイルスにより誘導された、および化学
的に誘導された肉腫と交差反応する抗原を有し、その場
合に、この抗原は抗体生成を刺激することを報告した。
10日間放射線を照射したハムスターの胎児細胞を、成熟
した同系のハムスターに注射すると抗体が生成するが、
14日間照射を行なつたハムスターの胎児細胞を用いる場
合には抗体は生成しない。そして、その後、これらの動
物はSV40腫瘍細胞のチヤレンジに対して免疫能を示すこ
とが発見された。照射を受けなかつた胎児細胞は移植免
疫を引き起こさなかつた。
ハンナ（Hanna）、Jr.、コギン（Coggin）ら、科学国際
アカデミー会報（Proceedings of the National Academ
y of Sciences）、U.S.A. 68:1748（1971）は、RLVビー
ルスに感染した細胞の成育およびプラズマ細胞癌に及ぼ
す、マウス胎児性抗原による免疫の抑制効果を研究し
た。若いBALB/c雄性マウスを３週間の間隔で、Ｘ線照射
した同系胚細胞を用いてプライムした。このマウスにお
いて、腫瘍の発達は抑制された。新生児の、または正常
の異種細胞を用いてプライムしたマウスにおいては同様
の現象は観察されなかつた。
アカデミー会報（Proceedings of the National Academ
y of Sciences）、U.S.A. 68:1748（1971）は、RLVビー
ルスに感染した細胞の成育およびプラズマ細胞癌に及ぼ
す、マウス胎児性抗原による免疫の抑制効果を研究し
た。若いBALB/c雄性マウスを３週間の間隔で、Ｘ線照射
した同系胚細胞を用いてプライムした。このマウスにお
いて、腫瘍の発達は抑制された。新生児の、または正常
の異種細胞を用いてプライムしたマウスにおいては同様
の現象は観察されなかつた。
ハムスターおよびBalb/c マウスにおける同系の胎児に
対する感作を使用するコギンら（Coggin、Jr. et al.）
（前述）により記載された研究に従い、ツイング（Tin
g），イン・ビトロ（In Vitro）14:207（1978）は、マ
ウス胎児細胞由来の胎児性抗原の発現を研究した。妊娠
期間１−２週間のマウス胎児から得た組織にＸ線照射
（5,000R）した組織を用いて同系免疫を行ない、抗血清
を製造した。胎児性抗原は、実際の胎児組織から得たイ
ン・ビトロで形質転換した細胞系において５年後でさえ
も維持されていることが発見された。
対する感作を使用するコギンら（Coggin、Jr. et al.）
（前述）により記載された研究に従い、ツイング（Tin
g），イン・ビトロ（In Vitro）14:207（1978）は、マ
ウス胎児細胞由来の胎児性抗原の発現を研究した。妊娠
期間１−２週間のマウス胎児から得た組織にＸ線照射
（5,000R）した組織を用いて同系免疫を行ない、抗血清
を製造した。胎児性抗原は、実際の胎児組織から得たイ
ン・ビトロで形質転換した細胞系において５年後でさえ
も維持されていることが発見された。
同系免疫を用いるこれらのすべての研究は、細胞上の胚
抗原の存在を分析し、宿主内の腫瘍に対する免疫性を誘
導することを目的として行なわれた。同系の宿主由来の
胎児組織についての胎児性特異抗原決定基に対するMc抗
体およびハイブリドーマの誘導については記載がない。
既知の妊娠時の、ハムスターのまたはマウスの胎児細胞
表面上の胚抗原決定基のいずれに対しても反応性のある
モノクロナール抗体を誘導することは、このような試み
は同系システム内での免疫を含むであろうから、いくら
よく見ても疑わしいと予想されていた。さらに複雑なこ
とは、モノクロナールについての文献中で、一般に報告
されている可溶性の、粗製の、胚の抗原調製物を用いる
通常の頻回免疫方法により、Ｔ−抑制リンパ球が活性化
し、量に依存して、腫瘍移植を妨げることが、すでに示
されているということであろう（ウエペナーら（Weppne
r,W.A.、et al.）、キヤンサー・リサーチ（Cancer Res
earch）40:1380（1980））。Ｂリンパ球の活性化に関し
て、同系の胎児による超免疫の効果もまた、本発明以前
には知られていなかつた。粉砕した胎児細胞を多く含ん
でいる放射線照射を行なつた、同系の胎児細胞調製物を
用いて直接免疫を行なつた場合、SV40肉腫細胞と交差反
応する胚抗原に対する静細胞IgGが発達することが、雌
性のげつ歯類で観察されたが、このような条件下では、
腫瘍抵抗性および、たぶん細胞毒性エフエクターＴ細胞
は発達しなかつた（アムブロゼ（Ambrose）、K.R.、
（前述）；コギン（Coggin）、J.H.、キヤンサー・リサ
ーチ39:2952（1979））。
抗原の存在を分析し、宿主内の腫瘍に対する免疫性を誘
導することを目的として行なわれた。同系の宿主由来の
胎児組織についての胎児性特異抗原決定基に対するMc抗
体およびハイブリドーマの誘導については記載がない。
既知の妊娠時の、ハムスターのまたはマウスの胎児細胞
表面上の胚抗原決定基のいずれに対しても反応性のある
モノクロナール抗体を誘導することは、このような試み
は同系システム内での免疫を含むであろうから、いくら
よく見ても疑わしいと予想されていた。さらに複雑なこ
とは、モノクロナールについての文献中で、一般に報告
されている可溶性の、粗製の、胚の抗原調製物を用いる
通常の頻回免疫方法により、Ｔ−抑制リンパ球が活性化
し、量に依存して、腫瘍移植を妨げることが、すでに示
されているということであろう（ウエペナーら（Weppne
r,W.A.、et al.）、キヤンサー・リサーチ（Cancer Res
earch）40:1380（1980））。Ｂリンパ球の活性化に関し
て、同系の胎児による超免疫の効果もまた、本発明以前
には知られていなかつた。粉砕した胎児細胞を多く含ん
でいる放射線照射を行なつた、同系の胎児細胞調製物を
用いて直接免疫を行なつた場合、SV40肉腫細胞と交差反
応する胚抗原に対する静細胞IgGが発達することが、雌
性のげつ歯類で観察されたが、このような条件下では、
腫瘍抵抗性および、たぶん細胞毒性エフエクターＴ細胞
は発達しなかつた（アムブロゼ（Ambrose）、K.R.、
（前述）；コギン（Coggin）、J.H.、キヤンサー・リサ
ーチ39:2952（1979））。
実際に、スエビンスキー（Shevinsky）ら、「細胞」（C
ell）,30:697−705（1982）は、胚で感作したマウスま
たはラツトの脾臓を用いてハイブリドーマを得ることは
非常に困難であると報告した。ただひとつの胚特異性モ
ノクロナール抗体（14の融合中、2,000のクローンの
内）を得、報告した。さらに、このことは、累種免疫で
も得られた。
ell）,30:697−705（1982）は、胚で感作したマウスま
たはラツトの脾臓を用いてハイブリドーマを得ることは
非常に困難であると報告した。ただひとつの胚特異性モ
ノクロナール抗体（14の融合中、2,000のクローンの
内）を得、報告した。さらに、このことは、累種免疫で
も得られた。
それ故、本発明以前には、診断および／または治療にお
いて有効なハイブリドーマーおよびモノクロナール抗体
を製造するのに有用なリンパ球を生成するには、同系免
疫は効果がなく、免疫原性を示すことさえもないであろ
うと予想される理由がいくつか、本分野において存在し
た。
いて有効なハイブリドーマーおよびモノクロナール抗体
を製造するのに有用なリンパ球を生成するには、同系免
疫は効果がなく、免疫原性を示すことさえもないであろ
うと予想される理由がいくつか、本分野において存在し
た。
ヒト腫瘍において保持されているEAまたはOFAの検出に
関して高い特異性を有する免疫性試薬を得る必要性が大
きかつたために、本発明を導びいた最初の研究を行なう
際には、本分野の以前の先入観を無視した。
関して高い特異性を有する免疫性試薬を得る必要性が大
きかつたために、本発明を導びいた最初の研究を行なう
際には、本分野の以前の先入観を無視した。
本発明の範囲 本発明は、非増殖性（例えば、致死量の放射線照射をう
けた）妊娠中期の同系胎児細胞を用いて動物の同系免疫
を行ない、リンパ球を、そして終局的にはげつ歯類およ
びヒトの胚の抗原に対して高度な特異性を有するモノク
ロナール抗体を製造することが可能であるという予期し
なかつた発見から生じた。このようにして感作したマウ
スから得た脾臓細胞を、ハイブリツド・ミエローマ（ハ
イブリドーマ）を調製するための既知の条件下にて、適
切な増殖し続ける細胞と融合することができ、選別、ス
クリーニングおよびクローニングの後、胚抗原に高い特
異性を有するモノクローナル抗体を産生することがわか
つた。これらのモノクロナール抗体は、げつ歯類および
ヒトのEA抗原と同一、またはほとんど同一であるらしい
ヒトの腫瘍−胎児性抗原の交差検出を行なうという特異
的な特徴を有する。このようなプロセスで得られたモノ
クロナール抗体は、今までに発行された文献中に記載の
ない特異な腫瘍胎児性ポリペプチド抗原決定基を特異的
に検出することができる。
けた）妊娠中期の同系胎児細胞を用いて動物の同系免疫
を行ない、リンパ球を、そして終局的にはげつ歯類およ
びヒトの胚の抗原に対して高度な特異性を有するモノク
ロナール抗体を製造することが可能であるという予期し
なかつた発見から生じた。このようにして感作したマウ
スから得た脾臓細胞を、ハイブリツド・ミエローマ（ハ
イブリドーマ）を調製するための既知の条件下にて、適
切な増殖し続ける細胞と融合することができ、選別、ス
クリーニングおよびクローニングの後、胚抗原に高い特
異性を有するモノクローナル抗体を産生することがわか
つた。これらのモノクロナール抗体は、げつ歯類および
ヒトのEA抗原と同一、またはほとんど同一であるらしい
ヒトの腫瘍−胎児性抗原の交差検出を行なうという特異
的な特徴を有する。このようなプロセスで得られたモノ
クロナール抗体は、今までに発行された文献中に記載の
ない特異な腫瘍胎児性ポリペプチド抗原決定基を特異的
に検出することができる。
それ故、本発明は、以下の工程（(a)〜(b)）により、ハ
イブリドーマおよびモノクロナール抗体を調製する方法
を提供するものである： （ａ） 適切な動物を、適量の、同系の非増殖性妊娠中
期胎児細胞調製物で免役し、 （ｂ） 該動物から感作したリンパ球を分離し、 （ｃ） 適切な融合条件下で、該リンパ球を不死細胞系
と融合し、その結果、ハイブリドーマを得、そして （ｄ） 該ハイブリドーマからモノクロナール抗体を得
る。
イブリドーマおよびモノクロナール抗体を調製する方法
を提供するものである： （ａ） 適切な動物を、適量の、同系の非増殖性妊娠中
期胎児細胞調製物で免役し、 （ｂ） 該動物から感作したリンパ球を分離し、 （ｃ） 適切な融合条件下で、該リンパ球を不死細胞系
と融合し、その結果、ハイブリドーマを得、そして （ｄ） 該ハイブリドーマからモノクロナール抗体を得
る。
本プロセスの重要な点のひとつは、非増殖性胎児細胞で
動物を同系免疫することである。細胞を含まない粗製の
抗原調製物を用いて、長期の免疫スケジユールを行なう
場合、胚の抗原は、イン・ビボ、すなわちBalb/cマウ
ス、ハムスターにおいて、免疫原性がないか、または免
疫原性に乏しく、免疫抑制的であり、イン・ビトロでは
胚の抗原は、厳密に、相に特異的に、その培養を妨げる
と一般に、信じられていたので、胚の抗原を免疫原とし
て使用することは難しいであろうという従来の信念およ
び先入観に、本発明の結果を得る能力は、対抗するもの
である。さらに、本発明方法は、げつ歯類およびヒト腫
瘍において広く発現される進化的に保存されて来た胚抗
原に対するMcIgを発達させることのできることを示すも
のである。
動物を同系免疫することである。細胞を含まない粗製の
抗原調製物を用いて、長期の免疫スケジユールを行なう
場合、胚の抗原は、イン・ビボ、すなわちBalb/cマウ
ス、ハムスターにおいて、免疫原性がないか、または免
疫原性に乏しく、免疫抑制的であり、イン・ビトロでは
胚の抗原は、厳密に、相に特異的に、その培養を妨げる
と一般に、信じられていたので、胚の抗原を免疫原とし
て使用することは難しいであろうという従来の信念およ
び先入観に、本発明の結果を得る能力は、対抗するもの
である。さらに、本発明方法は、げつ歯類およびヒト腫
瘍において広く発現される進化的に保存されて来た胚抗
原に対するMcIgを発達させることのできることを示すも
のである。
本発明は、また、本方法により得られたタイプのモノク
ロナール抗体に関するものであり、特に、以下に示す特
定の性質（(a)〜(b)）を有するモノクロナール抗体に関
するものである： （ａ） げつ歯類およびヒトの妊娠中期胚−胎児抗原に
対する免疫反応性、 （ｂ） ヒト腫瘍胎児性腫瘍抗原に対する免疫反応性、 （ｃ） げつ歯類妊娠後期胎児組織に対する、またはマ
ウス、ハムスター、またはヒトの成熟組織に対して、実
質的に検出不能の免疫反応性、 （ｄ） ヒト正常組織に対して実質的に検出不能の免疫
反応性。
ロナール抗体に関するものであり、特に、以下に示す特
定の性質（(a)〜(b)）を有するモノクロナール抗体に関
するものである： （ａ） げつ歯類およびヒトの妊娠中期胚−胎児抗原に
対する免疫反応性、 （ｂ） ヒト腫瘍胎児性腫瘍抗原に対する免疫反応性、 （ｃ） げつ歯類妊娠後期胎児組織に対する、またはマ
ウス、ハムスター、またはヒトの成熟組織に対して、実
質的に検出不能の免疫反応性、 （ｄ） ヒト正常組織に対して実質的に検出不能の免疫
反応性。
この抗体はアフイニテイクロマトグラフイーにより、腫
瘍関連抗原を単離するために使用することができ、原発
性の腫瘍、腫瘍の転移または腫瘍の分類の診断と検出に
より、OFA抗原を発現する腫瘍を同定するために使用す
ることができ、試薬または結合性細胞毒性薬剤を腫瘍細
胞へ特異的に輸送するのに使用することができ、そして
また、腫瘍細胞を細胞毒性で殺傷することにより滞在的
受動免疫を提供するために使用することができる。
瘍関連抗原を単離するために使用することができ、原発
性の腫瘍、腫瘍の転移または腫瘍の分類の診断と検出に
より、OFA抗原を発現する腫瘍を同定するために使用す
ることができ、試薬または結合性細胞毒性薬剤を腫瘍細
胞へ特異的に輸送するのに使用することができ、そして
また、腫瘍細胞を細胞毒性で殺傷することにより滞在的
受動免疫を提供するために使用することができる。
本発明は、また、腫瘍の診断のマーカーおよび／または
腫瘍分類のマーカーとして有用な、新規な腫瘍胎児性抗
原に関するものであり、その抗原の内のひとつは、分子
量が約44,000−48,000であるポリペプチドであり、他の
もう一つの抗原は、分子量が約200,000であるポリペプ
チド（上記のポリペプチドが共有結合した多重結合体で
あるらしい）である。
腫瘍分類のマーカーとして有用な、新規な腫瘍胎児性抗
原に関するものであり、その抗原の内のひとつは、分子
量が約44,000−48,000であるポリペプチドであり、他の
もう一つの抗原は、分子量が約200,000であるポリペプ
チド（上記のポリペプチドが共有結合した多重結合体で
あるらしい）である。
本発明は、ある種類の、真に腫瘍−胎児抗原に特異的な
試薬への道を開くものである。
試薬への道を開くものである。
図の説明 ハイブリドーマの10−12日培養上清中のいくつかのMc抗
体の、固相（sp）ELISA検定におけるプラスチツクマイ
クロウエルに固定した12dmfc（マウス胎児細胞の妊娠日
数）標的を用いる滴定を第１図に示す。IgG2aイソタイ
プであるMc58以外は、示されたすべての抗−EAモノクロ
ナールは、IgMイソタイプであつた。MPC11は、（IE検定
によると）胎児に関連した抗原決定基ではない未知の抗
原決定基に対するものであるので、MPC11は比較用に選
択された対照のIgGMc抗体である。MPC−11はすべての実
験において、負の対照として用いられており、各々の実
験においてバツクグラウンドのELISAレベルを確立する
ものである。
体の、固相（sp）ELISA検定におけるプラスチツクマイ
クロウエルに固定した12dmfc（マウス胎児細胞の妊娠日
数）標的を用いる滴定を第１図に示す。IgG2aイソタイ
プであるMc58以外は、示されたすべての抗−EAモノクロ
ナールは、IgMイソタイプであつた。MPC11は、（IE検定
によると）胎児に関連した抗原決定基ではない未知の抗
原決定基に対するものであるので、MPC11は比較用に選
択された対照のIgGMc抗体である。MPC−11はすべての実
験において、負の対照として用いられており、各々の実
験においてバツクグラウンドのELISAレベルを確立する
ものである。
他の抗−EAMc、IgM69.1の胎児特異性を第２図に示す。
成熟マウスの脾臓、肝臓、筋肉、胚、および皮膚細胞
（ ）の、または12−13妊娠日で初産のマウス胎児細胞
（○）の、または24日齢のマウス筋および脾臓細胞
（ ）の、濃度を上昇させてゆき、McIg（650ODユニツ
ト）をそれらとの初期吸着によつて、12時間４℃にて処
理し、遠心分離して、細胞小球を除去し、固相ELISA検
定において細胞滴定した。
成熟マウスの脾臓、肝臓、筋肉、胚、および皮膚細胞
（ ）の、または12−13妊娠日で初産のマウス胎児細胞
（○）の、または24日齢のマウス筋および脾臓細胞
（ ）の、濃度を上昇させてゆき、McIg（650ODユニツ
ト）をそれらとの初期吸着によつて、12時間４℃にて処
理し、遠心分離して、細胞小球を除去し、固相ELISA検
定において細胞滴定した。
試験開始４または24時間前に、イン・ビトロで培養する
か、あるいは収穫した12−13日妊娠日のマウス胎児細胞
を用いて、無作為に選んだハイブリドーマ上清の結合親
和性の変化（最大の反応性を示すまでの時間）を比較す
る免疫過ELISAの結果を第３図に示す。細胞は、すべ
ての場合において、同数に標準化し、同じ生存能力（10
％）を有していた。
か、あるいは収穫した12−13日妊娠日のマウス胎児細胞
を用いて、無作為に選んだハイブリドーマ上清の結合親
和性の変化（最大の反応性を示すまでの時間）を比較す
る免疫過ELISAの結果を第３図に示す。細胞は、すべ
ての場合において、同数に標準化し、同じ生存能力（10
％）を有していた。
新たに得て、直ちにもちいるか、あるいは液体窒素中に
一週間、凍結させておき、解凍して、免疫過ELISA検
定に用いるかのどちらかの方法で用いる13dmfcsとの第
３図に示した上清の反応能力について比較した結果を図
４に示す。両方の検定は、同じ試験中においては同じ日
に行なつた。ELISA反応は、クロモゲンを添加後の発色
の早さによつて示す（＋＋＋＋＝５分間以内に完全に呈
色、＋＋＋＝10分間以内に完全に呈色、＋＋＝15分間以
内に呈色、＋＝20分間以内に少し呈色、０＝呈色せ
ず）。
一週間、凍結させておき、解凍して、免疫過ELISA検
定に用いるかのどちらかの方法で用いる13dmfcsとの第
３図に示した上清の反応能力について比較した結果を図
４に示す。両方の検定は、同じ試験中においては同じ日
に行なつた。ELISA反応は、クロモゲンを添加後の発色
の早さによつて示す（＋＋＋＋＝５分間以内に完全に呈
色、＋＋＋＝10分間以内に完全に呈色、＋＋＝15分間以
内に呈色、＋＝20分間以内に少し呈色、０＝呈色せ
ず）。
セフアロース4B:表示したMc抗体に負荷した12dmfcsマウ
ス組織の、または成熟マウス組織のNP40抽出物（4ugs）
中の、胎児特異性44−48KDおよび200KDポリペプチドの
検出を第５図に示す。ゲル複合体を徹底的に洗浄し、溶
離し、その溶離液をSDS−PAGE電気泳動にかけ、コオマ
ジイ・ブルー（Coomassie blue）を用いて染色した。モ
ロニイ（Molony）肉腫ウイルス・エンベロープ・グリコ
プロテイン決定基（MSV）に対するマウスのMcIgMを胎児
細胞抽出物と共に対照Mcとして使用した。ｆ＝胎児抽出
物、ａ＝成熟組織抽出物。一番右のレーンは標準分子量
マーカーを示している。19−20日マウス胎児細胞は、前
記の成熟細胞の結果と同一の結果を示した。
ス組織の、または成熟マウス組織のNP40抽出物（4ugs）
中の、胎児特異性44−48KDおよび200KDポリペプチドの
検出を第５図に示す。ゲル複合体を徹底的に洗浄し、溶
離し、その溶離液をSDS−PAGE電気泳動にかけ、コオマ
ジイ・ブルー（Coomassie blue）を用いて染色した。モ
ロニイ（Molony）肉腫ウイルス・エンベロープ・グリコ
プロテイン決定基（MSV）に対するマウスのMcIgMを胎児
細胞抽出物と共に対照Mcとして使用した。ｆ＝胎児抽出
物、ａ＝成熟組織抽出物。一番右のレーンは標準分子量
マーカーを示している。19−20日マウス胎児細胞は、前
記の成熟細胞の結果と同一の結果を示した。
12日マウス胎児細胞のNP40抽出物から得た胎児特異性の
46KDのおよび200KDの、増加量のポリペプチドを除去す
るMc115 shIIIの能力を第６図に示す。レーン１＝標準
分子量、レーン２＝Mc115 shIII＋胎児抽出物（10μ
）、レーン３＝Mc115 shIII＋抽出物（20μ）、レ
ーン４＝Mc115 shIII＋抽出物（30μ）、レーン５＝M
c115 shIII＋10×成熟抽出物（10μ）、レーン６＝抽
出物（20μ）、レーン７＝抽出物（30μ）。
46KDのおよび200KDの、増加量のポリペプチドを除去す
るMc115 shIIIの能力を第６図に示す。レーン１＝標準
分子量、レーン２＝Mc115 shIII＋胎児抽出物（10μ
）、レーン３＝Mc115 shIII＋抽出物（20μ）、レ
ーン４＝Mc115 shIII＋抽出物（30μ）、レーン５＝M
c115 shIII＋10×成熟抽出物（10μ）、レーン６＝抽
出物（20μ）、レーン７＝抽出物（30μ）。
本発明を実施する最善の方法 プロセス 本発明は、動物を、非増殖性、妊娠中期の胎児細胞調製
物を用いて同系免疫を行なうことを基本としている。適
切な動物ならば、どのようなものでも用いてよく、例え
ば、げつ歯類（マウス、ラツトまたはハムスターのよう
な）、山羊、馬、にわとりなどを用いてよい。マウスを
用いるのが最も好ましい。実際に、多くの実験を行なつ
た結果、充分特徴が調べられている近交系マウスであ
り、本分野における熟練者に良く知られており、市販さ
れている、C57BL/6mが、最終的なハイブリドーマを得る
ために最も適していることが発見された。別の近交系マ
ウスであるBalb/cマウスは最初の実験に使用するのに容
易ではないであろう。同系の胎児細胞が、選択された種
の妊娠時の妊娠中期であるべきであり、初産の雌から得
るべきであるということは重要な点である。それ故、例
えば、マウスの妊娠中期は12−14日の間であり、一方、
ハムスターのそれは９−10日の間である。このことが必
要とされる理由は、胚の抗原が相（期）特異性であるか
らである。妊娠の初期に、抗原は陽性であるらしいが、
胎児組織の量が非常に少なく、これらの初期組織は有用
ではない。正常な成熟細胞、満期胎児細胞（19−21日の
マウスまたは15日のハムスター）、腫瘍細胞、成熟マウ
ス組織または成熟ハムスター組織を用いた場合には、満
足な結果を得ることはできない。
物を用いて同系免疫を行なうことを基本としている。適
切な動物ならば、どのようなものでも用いてよく、例え
ば、げつ歯類（マウス、ラツトまたはハムスターのよう
な）、山羊、馬、にわとりなどを用いてよい。マウスを
用いるのが最も好ましい。実際に、多くの実験を行なつ
た結果、充分特徴が調べられている近交系マウスであ
り、本分野における熟練者に良く知られており、市販さ
れている、C57BL/6mが、最終的なハイブリドーマを得る
ために最も適していることが発見された。別の近交系マ
ウスであるBalb/cマウスは最初の実験に使用するのに容
易ではないであろう。同系の胎児細胞が、選択された種
の妊娠時の妊娠中期であるべきであり、初産の雌から得
るべきであるということは重要な点である。それ故、例
えば、マウスの妊娠中期は12−14日の間であり、一方、
ハムスターのそれは９−10日の間である。このことが必
要とされる理由は、胚の抗原が相（期）特異性であるか
らである。妊娠の初期に、抗原は陽性であるらしいが、
胎児組織の量が非常に少なく、これらの初期組織は有用
ではない。正常な成熟細胞、満期胎児細胞（19−21日の
マウスまたは15日のハムスター）、腫瘍細胞、成熟マウ
ス組織または成熟ハムスター組織を用いた場合には、満
足な結果を得ることはできない。
免疫を成功させる、もう一つの別の条件として、同系の
免疫胎児細胞調製物において分裂を阻止する必要があ
る。DNA複製を停止させる多数の良く知られたプロセス
（例えば、Ｘ線照射、紫外線またはセシウム照射または
ヨウ化デオキシウリジン処理など）のいずれかのプロセ
スにより、増殖を停止させることができる。免疫を行な
う前に、細胞全体にＸ線照射（約4,000−6,000R）を行
なうのが望ましい。免疫期間中に連続的な細胞の複製が
起るようならば、胚の抗原は、細胞表面から迅速に消失
し（免疫抗原として）、所望のハイブリドーマを得るこ
とに失敗するだろう。
免疫胎児細胞調製物において分裂を阻止する必要があ
る。DNA複製を停止させる多数の良く知られたプロセス
（例えば、Ｘ線照射、紫外線またはセシウム照射または
ヨウ化デオキシウリジン処理など）のいずれかのプロセ
スにより、増殖を停止させることができる。免疫を行な
う前に、細胞全体にＸ線照射（約4,000−6,000R）を行
なうのが望ましい。免疫期間中に連続的な細胞の複製が
起るようならば、胚の抗原は、細胞表面から迅速に消失
し（免疫抗原として）、所望のハイブリドーマを得るこ
とに失敗するだろう。
（免疫に先立つて）胎児細胞を収穫し、分散する方法に
ついてはコギン（Coggin）、J.H.ら、「癌研究の発展」
（Advances in Cancer Research）、19:105（1974）に
記載がある。酸素分散を用いるのは好ましくない。
ついてはコギン（Coggin）、J.H.ら、「癌研究の発展」
（Advances in Cancer Research）、19:105（1974）に
記載がある。酸素分散を用いるのは好ましくない。
妊娠したドナーを用いる方法、すなわちBalb/cドナーに
胎児細胞を注射し、高投用量で長期間感作を行なうとい
う、通常のハイブリドーマ製造に用いる方法で行なつた
初期の免疫の多くの試みが成功しなかつたことは注目す
べきことである。最善の免疫を、最後のブースター（追
加抗原刺激）を含む合計３回の注射からなる短期のコー
スにおいて細胞により理想的に得る。細胞はそれのみを
注射してもよいし、マイコバクテリウム・スメガマテイ
テイス（Mycobacterium smegatitis）またはM.ツベルク
ロシス（M.tuberculosis）のいずれかを含むフロイント
のアジユバント中の細胞を注射してもよく、次に、胎児
細胞およびフロイントの不完全アジユバントを用いるブ
ースター注射を行ない、最終のブースター注射は胎児細
胞のみで行う。注射は腹腔内に行なつても静脈内に行な
つてもよいが、前者が最も適している。感作された脾臓
細胞を、通常、最後の抗原注射から約２−３週間後に行
なう最終のブースター注射から約３日後に得ることがで
きる。免疫に用いる胎児細胞の量は、通常、１回の注射
あたりだいたい106−108の間である。細胞全体、注意深
く調製した細胞膜または、その他のEAを含む細胞抽出調
製物を用いてもよいが、いずれの場合も抑制細胞の発達
が阻止されるように、免疫計画を厳格に調節しなければ
ならない（ウエプナーとコギン（Weppner ＆ Coggi
n）、セル・イムノロジー（Cell Imm.）、54:193、198
0）。
胎児細胞を注射し、高投用量で長期間感作を行なうとい
う、通常のハイブリドーマ製造に用いる方法で行なつた
初期の免疫の多くの試みが成功しなかつたことは注目す
べきことである。最善の免疫を、最後のブースター（追
加抗原刺激）を含む合計３回の注射からなる短期のコー
スにおいて細胞により理想的に得る。細胞はそれのみを
注射してもよいし、マイコバクテリウム・スメガマテイ
テイス（Mycobacterium smegatitis）またはM.ツベルク
ロシス（M.tuberculosis）のいずれかを含むフロイント
のアジユバント中の細胞を注射してもよく、次に、胎児
細胞およびフロイントの不完全アジユバントを用いるブ
ースター注射を行ない、最終のブースター注射は胎児細
胞のみで行う。注射は腹腔内に行なつても静脈内に行な
つてもよいが、前者が最も適している。感作された脾臓
細胞を、通常、最後の抗原注射から約２−３週間後に行
なう最終のブースター注射から約３日後に得ることがで
きる。免疫に用いる胎児細胞の量は、通常、１回の注射
あたりだいたい106−108の間である。細胞全体、注意深
く調製した細胞膜または、その他のEAを含む細胞抽出調
製物を用いてもよいが、いずれの場合も抑制細胞の発達
が阻止されるように、免疫計画を厳格に調節しなければ
ならない（ウエプナーとコギン（Weppner ＆ Coggi
n）、セル・イムノロジー（Cell Imm.）、54:193、198
0）。
感作した脾臓細胞を得た後、適切な融合条件下で所望の
不死細胞系と脾臓細胞を融合し、ハイブリドーマを得
る。ハイブリドーマを調製し、これを選別するプロセス
は、ケンネツト（Kennet）、マツケルン（Mckearn）お
よびベクトール（Bechtol）による「モノクロナール抗
体、ハイブリドーマ：生物学的分析における新しい単
位」、プレナム出版、ニューヨークおよびロンドン（19
82）に詳しく記載があり、特に、「モノクロナール抗体
の再生産および特徴づけ」という題名の補遺（pp.363−
417）に詳しい。これらを本明細書に参考として記載し
た。増殖し続ける（不死）細胞系で好ましいものの内の
ひとつはP3×63Ag8.653である。ポリエチレングリコー
ルの存在下、ネズミのミエローマ細胞と脾臓細胞との細
胞比率を1:10にして、融合を行うことができる。選別
は、普通、例えばHATのような選別溶媒中にて行なう。
ハイブリツド細胞はマクロフアージ細胞系RAW264.7から
得た上清を補足したHT溶媒中に保存する。この溶媒は、
活発に増殖するIgM製造ハイブリドーマを得るために必
須である。このマクロフアージ細胞系は、本出願の提出
期限前にアメリカン・タイプ・カルチヤー・コレクシヨ
ン（American Type Culture Collection）に寄託され、
その番号はCRL8668である。多量のハイブリドーマコロ
ニーのクローニングは、例えば、末端希釈法やメチルセ
ルロース内でのコロニー形成法などのような種々の方法
の内のいずれかを用いて行なつてもよい。免疫グロブリ
ンのクラスは、例えば、免疫拡散検定法により、およ
び、タイプを分類する抗体（抗−マウス免疫グロブリ
ン）を用いることにより明らかにしうる。本発明におけ
るすべての場合において、モノクロナール抗体は無傷の
胎児細胞を用いて誘導した場合にはIgMクラスであり、
溶解した胎児細胞を用いて誘導した場合はIgGイソタイ
プであることが発見された。しかし、このことは限定的
ではなく、その他のクラスも得ることができ、使用する
ことができる。
不死細胞系と脾臓細胞を融合し、ハイブリドーマを得
る。ハイブリドーマを調製し、これを選別するプロセス
は、ケンネツト（Kennet）、マツケルン（Mckearn）お
よびベクトール（Bechtol）による「モノクロナール抗
体、ハイブリドーマ：生物学的分析における新しい単
位」、プレナム出版、ニューヨークおよびロンドン（19
82）に詳しく記載があり、特に、「モノクロナール抗体
の再生産および特徴づけ」という題名の補遺（pp.363−
417）に詳しい。これらを本明細書に参考として記載し
た。増殖し続ける（不死）細胞系で好ましいものの内の
ひとつはP3×63Ag8.653である。ポリエチレングリコー
ルの存在下、ネズミのミエローマ細胞と脾臓細胞との細
胞比率を1:10にして、融合を行うことができる。選別
は、普通、例えばHATのような選別溶媒中にて行なう。
ハイブリツド細胞はマクロフアージ細胞系RAW264.7から
得た上清を補足したHT溶媒中に保存する。この溶媒は、
活発に増殖するIgM製造ハイブリドーマを得るために必
須である。このマクロフアージ細胞系は、本出願の提出
期限前にアメリカン・タイプ・カルチヤー・コレクシヨ
ン（American Type Culture Collection）に寄託され、
その番号はCRL8668である。多量のハイブリドーマコロ
ニーのクローニングは、例えば、末端希釈法やメチルセ
ルロース内でのコロニー形成法などのような種々の方法
の内のいずれかを用いて行なつてもよい。免疫グロブリ
ンのクラスは、例えば、免疫拡散検定法により、およ
び、タイプを分類する抗体（抗−マウス免疫グロブリ
ン）を用いることにより明らかにしうる。本発明におけ
るすべての場合において、モノクロナール抗体は無傷の
胎児細胞を用いて誘導した場合にはIgMクラスであり、
溶解した胎児細胞を用いて誘導した場合はIgGイソタイ
プであることが発見された。しかし、このことは限定的
ではなく、その他のクラスも得ることができ、使用する
ことができる。
胚の抗原に関するモノクロナール抗体の特異性の厳密な
試験は、新生児の、および成熟したマウスの組織（C57B
L/6nまたは新しく集めた全組織と共に）から調製したア
セトン粉末を用いるコロニー上清の吸着スクリーニング
により行なう。１パツクのアセトン粉末を同体積のハイ
ブリドーマ上清と混合し、インキユベーシヨンした。こ
の混合物を、酵素を結合させた免疫吸着検定（ELISA）
に使用する前に遠心分離する。吸着したハイブリドーマ
の上清が陽性の反応を与える場合は、真の決定基に対す
るものであるとみなし、クローニングのために処理す
る。
試験は、新生児の、および成熟したマウスの組織（C57B
L/6nまたは新しく集めた全組織と共に）から調製したア
セトン粉末を用いるコロニー上清の吸着スクリーニング
により行なう。１パツクのアセトン粉末を同体積のハイ
ブリドーマ上清と混合し、インキユベーシヨンした。こ
の混合物を、酵素を結合させた免疫吸着検定（ELISA）
に使用する前に遠心分離する。吸着したハイブリドーマ
の上清が陽性の反応を与える場合は、真の決定基に対す
るものであるとみなし、クローニングのために処理す
る。
生産物 前記のプロセスで得ることのできるモノクロナール抗体
は、もとの動物の妊娠中期の胚−胎児性抗原に対して実
質上免疫反応性を有し、もとの動物由来の妊娠後期の胎
児性組織に対しては、実質上、検出しうる免疫反応性は
有しておらず、またヒト正常細胞に対する実質上検出し
うる免疫反応性は有していない。
は、もとの動物の妊娠中期の胚−胎児性抗原に対して実
質上免疫反応性を有し、もとの動物由来の妊娠後期の胎
児性組織に対しては、実質上、検出しうる免疫反応性は
有しておらず、またヒト正常細胞に対する実質上検出し
うる免疫反応性は有していない。
免疫される動物がマウスである場合、本発明に係るモノ
クロナール抗体は、げつ歯類の妊娠中期の抗原に対して
免疫反応性を有するが、げつ歯類の妊娠後期の組織に対
しては、免疫反応性を有していない。
クロナール抗体は、げつ歯類の妊娠中期の抗原に対して
免疫反応性を有するが、げつ歯類の妊娠後期の組織に対
しては、免疫反応性を有していない。
妊娠中期における胚の抗原は、ヒト癌細胞中の腫瘍−胎
児性抗原として再現するが、ヒト正常成熟胎児細胞、新
生児の胎児細胞、および妊娠完了期の胎児細胞中におい
ては、検出可能濃度において存在していないので、得ら
れたモノクロナール抗体は胎児および癌に対して高度に
特異的である。実際、妊娠中期の同系細胞は、免疫した
宿主の抗原と異なるいかなる抗原（胚の抗原以外のも
の）も有していないので、それに由来したモノクロナー
ル抗体は、EAおよびOFAに真に特異的である。
児性抗原として再現するが、ヒト正常成熟胎児細胞、新
生児の胎児細胞、および妊娠完了期の胎児細胞中におい
ては、検出可能濃度において存在していないので、得ら
れたモノクロナール抗体は胎児および癌に対して高度に
特異的である。実際、妊娠中期の同系細胞は、免疫した
宿主の抗原と異なるいかなる抗原（胚の抗原以外のも
の）も有していないので、それに由来したモノクロナー
ル抗体は、EAおよびOFAに真に特異的である。
本発明に係るモノクロナール抗体の特異性に関して、10
日妊娠ハムスター胎児細胞に対して誘導したポリクロー
ナルインビボ吸着異種抗血清が、マウスの胎児細胞（12
−13日）またはハムスターの胎児細胞（10日）の3MKCl
抽出物、またはNP−40抽出物から得られる明らかな胎児
特異的ポリペプチドを免疫沈降するという発見は興味深
い。このような研究は、また、妊娠のこの時期には、い
くつかのポリペプチド（10−12）が存在し、新生児の組
織および成熟組織には存在しないことを示し、これらの
ポリペプチドには、より小さなポリペプチドの重合体で
あるものも存在していることを示している。検出された
胚の抗原のほとんどは、両方のげつ歯類（マウスおよび
ハムスター）において共通である。胚抗原が10日妊娠ハ
ムスター胎児細胞と共通することが知られている各種の
腫瘍系もまた、このポリクロナール抗血清により殺傷さ
れる。一方、検出できる腫瘍−胎児性抗原が、ハムスタ
ー胎児性細胞と共通しない腫瘍系は殺傷されない。両方
とも成人ヒトの正常な線維芽細胞ではない。ポリクロナ
ール血清中に存在している抗−EAIgG抗体は、いくつか
の胚の抗原決定基を特異的に免疫沈降させる。このこと
は、存在するIgG抗体により認識されるEAポリペプチド
はいくつかあるが、限定された数しかないということを
示している。
日妊娠ハムスター胎児細胞に対して誘導したポリクロー
ナルインビボ吸着異種抗血清が、マウスの胎児細胞（12
−13日）またはハムスターの胎児細胞（10日）の3MKCl
抽出物、またはNP−40抽出物から得られる明らかな胎児
特異的ポリペプチドを免疫沈降するという発見は興味深
い。このような研究は、また、妊娠のこの時期には、い
くつかのポリペプチド（10−12）が存在し、新生児の組
織および成熟組織には存在しないことを示し、これらの
ポリペプチドには、より小さなポリペプチドの重合体で
あるものも存在していることを示している。検出された
胚の抗原のほとんどは、両方のげつ歯類（マウスおよび
ハムスター）において共通である。胚抗原が10日妊娠ハ
ムスター胎児細胞と共通することが知られている各種の
腫瘍系もまた、このポリクロナール抗血清により殺傷さ
れる。一方、検出できる腫瘍−胎児性抗原が、ハムスタ
ー胎児性細胞と共通しない腫瘍系は殺傷されない。両方
とも成人ヒトの正常な線維芽細胞ではない。ポリクロナ
ール血清中に存在している抗−EAIgG抗体は、いくつか
の胚の抗原決定基を特異的に免疫沈降させる。このこと
は、存在するIgG抗体により認識されるEAポリペプチド
はいくつかあるが、限定された数しかないということを
示している。
ポリクロナール血清に関して得られたこれらの結果は、
本発明に係るモノクロナールの特異性と一致している。
本発明に係るモノクロナールは、せまい範囲の特異性を
有している。
本発明に係るモノクロナールの特異性と一致している。
本発明に係るモノクロナールは、せまい範囲の特異性を
有している。
すべての場合において、分子量が約44,000−48,000ダル
トンである特異的なポリペプチド（本明細書中では「46
DKポリペプチド」としても表わす）が確認される。ま
た、同じ胎児細胞から分子量約200,000ダルトンのポリ
ペプチドも確認される。後者のペプチドは、46KDポリペ
プチドの多重合体であるか、または、46KDたん白質上に
存在しているものと同じEA抗原決定基を有する第２のポ
リペプチドかもしれない。この46KDポリペプチドは、胚
の妊娠中期に特異的な抗体であり、真の胚の抗原、すな
わち、腫瘍胎児性抗原であるらしい。
トンである特異的なポリペプチド（本明細書中では「46
DKポリペプチド」としても表わす）が確認される。ま
た、同じ胎児細胞から分子量約200,000ダルトンのポリ
ペプチドも確認される。後者のペプチドは、46KDポリペ
プチドの多重合体であるか、または、46KDたん白質上に
存在しているものと同じEA抗原決定基を有する第２のポ
リペプチドかもしれない。この46KDポリペプチドは、胚
の妊娠中期に特異的な抗体であり、真の胚の抗原、すな
わち、腫瘍胎児性抗原であるらしい。
使用方法 本発明のモノクロナール抗体は広範囲にわたり利用する
ことができる。診断の、治療の、分析の計画および研究
に適用することができる。
ことができる。診断の、治療の、分析の計画および研究
に適用することができる。
利用できる診断技術の内で、本発明の１つの側面は、ヒ
ト腫瘍に関連する腫瘍胎児性抗原を検出する方法であ
り、その方法は、 （ａ） 該腫瘍胎児性抗原を含むと考えられるヒトのサ
ンプルを、本発明に係るモノクロナール抗体とともにイ
ンキユベーシヨンし、そして （ｂ） 該抗原と該抗体とが、実質上、結合しているか
どうかを決定することからなる。
ト腫瘍に関連する腫瘍胎児性抗原を検出する方法であ
り、その方法は、 （ａ） 該腫瘍胎児性抗原を含むと考えられるヒトのサ
ンプルを、本発明に係るモノクロナール抗体とともにイ
ンキユベーシヨンし、そして （ｂ） 該抗原と該抗体とが、実質上、結合しているか
どうかを決定することからなる。
腫瘍胎児性抗原の検出は、免疫分析技術の分野における
専門家に良く知られている方法で行なうことができる。
例えば、競合分析または免疫定量分析を用いることがで
きる。競合分析の場合には、モノクロナール抗体を、検
出可能なようにラベルした一定量の腫瘍胎児性抗原と共
に、および腫瘍胎児性抗原を未知量含有していると考え
られる標本と共に、インキユベーシヨンする。検出可能
なようにラベルした抗原と標本中に存在する抗原との間
で競合が起こり、比較的直接的な方法で、標本中の抗原
量を定量することができる。
専門家に良く知られている方法で行なうことができる。
例えば、競合分析または免疫定量分析を用いることがで
きる。競合分析の場合には、モノクロナール抗体を、検
出可能なようにラベルした一定量の腫瘍胎児性抗原と共
に、および腫瘍胎児性抗原を未知量含有していると考え
られる標本と共に、インキユベーシヨンする。検出可能
なようにラベルした抗原と標本中に存在する抗原との間
で競合が起こり、比較的直接的な方法で、標本中の抗原
量を定量することができる。
免疫定量分析の場合には、本発明に係るモノクロナール
抗体を（先にまたは後期に）適切な固相上に固定し、ヒ
ト腫瘍に関連しており、腫瘍胎児性抗原を含有している
と考えられる標本と共にインキユベーシヨンする。次
に、溶解性の、検出可能なようにラベルした、同じモノ
クロナール抗体または異なるモノクロナール抗体を、サ
ンプルと共にインキユベーシヨンし、適切な方法で洗浄
すると、複合体が形成され、固相にラベルが結合する。
ラベルした抗体の量とサンプル中に存在する腫瘍胎児性
抗原の量の間に直接的な比率関係を得ることができる。
免疫定量分析は、先の、逆の、または同時の方法で行う
ことができる。これらはすべて本分野における専門家に
よく知られている。例えば、デイビツド（David）らに
よる「モノクロナール抗体を用いる免疫定量分析」（米
国特許4,376,110）を参照せよ。多価の抗原に対するIgM
モノクロナール抗体を特別に用いる免疫定量分析につい
ては、例えばウエンズ（Wands）ら、PCT/US81/01270も
参照せよ。
抗体を（先にまたは後期に）適切な固相上に固定し、ヒ
ト腫瘍に関連しており、腫瘍胎児性抗原を含有している
と考えられる標本と共にインキユベーシヨンする。次
に、溶解性の、検出可能なようにラベルした、同じモノ
クロナール抗体または異なるモノクロナール抗体を、サ
ンプルと共にインキユベーシヨンし、適切な方法で洗浄
すると、複合体が形成され、固相にラベルが結合する。
ラベルした抗体の量とサンプル中に存在する腫瘍胎児性
抗原の量の間に直接的な比率関係を得ることができる。
免疫定量分析は、先の、逆の、または同時の方法で行う
ことができる。これらはすべて本分野における専門家に
よく知られている。例えば、デイビツド（David）らに
よる「モノクロナール抗体を用いる免疫定量分析」（米
国特許4,376,110）を参照せよ。多価の抗原に対するIgM
モノクロナール抗体を特別に用いる免疫定量分析につい
ては、例えばウエンズ（Wands）ら、PCT/US81/01270も
参照せよ。
検出ラベルは、ラベルした抗原に関してか、または、ラ
ベルした抗体に関してのどちらに利用してもよい。これ
らのラベルには、放射能ラベル（例えば、P32、125I、3
H、35S、14Gなど）がある。これらのラベルには、ELISA
技術にて使用される酵素（例えば、アルカリホスフアタ
ーゼ、ホースラデイツシユ・ペルオキテダーゼ、ペニシ
リナーゼなど）、螢光化合物（フルオレセインなど）、
バクテリオフアージ、NMR画像法に有用な金属、放射能
画像法に有用な他の放射能ラベルなどが含まれる。放射
能ラベルまたは酵素ラベルが、分析に適している。
ベルした抗体に関してのどちらに利用してもよい。これ
らのラベルには、放射能ラベル（例えば、P32、125I、3
H、35S、14Gなど）がある。これらのラベルには、ELISA
技術にて使用される酵素（例えば、アルカリホスフアタ
ーゼ、ホースラデイツシユ・ペルオキテダーゼ、ペニシ
リナーゼなど）、螢光化合物（フルオレセインなど）、
バクテリオフアージ、NMR画像法に有用な金属、放射能
画像法に有用な他の放射能ラベルなどが含まれる。放射
能ラベルまたは酵素ラベルが、分析に適している。
適切な、良く知られている、免疫分析に有用な固相なら
ばどれでも用いてよい。これらの固相には、ラテツクス
粒子、ポリスチレン・ビーズ、試験管、繊維、ウエル、
他の天然の、および／または人工の重合体などがある。
ばどれでも用いてよい。これらの固相には、ラテツクス
粒子、ポリスチレン・ビーズ、試験管、繊維、ウエル、
他の天然の、および／または人工の重合体などがある。
MC（モノクロナール）Igで精製した抗原は、OFAに対す
る感作用の通常の皮膚のテストに用いることができ、リ
ンパ球幼若化現象分析における抗原として用いることが
できる。この抗原は、また、腫瘍の発達または再発に対
抗する宿主の免疫系を感作するのに用いることもでき
る。
る感作用の通常の皮膚のテストに用いることができ、リ
ンパ球幼若化現象分析における抗原として用いることが
できる。この抗原は、また、腫瘍の発達または再発に対
抗する宿主の免疫系を感作するのに用いることもでき
る。
本発明にて発見した胚の抗原はまた、前記の標準的な免
疫分析による腫瘍の検出用および／または診断用のマー
カーとして使用することもできる。これらの分析には、
本発明に係る方法を用いて調製した抗体、または他の方
法で調製した、それに相当する他の類似抗体を使用して
もよい。この分析は、先に記載のポリペプチドを、検出
可能な様にラベルして利用してもよいし（例えば、競合
方法）、または、不溶形にして利用してもよい（抗体用
の凝集分析、または、抗体用の結合分析）。それ故、例
えば、本明細書中に記載した、胚の抗原−OFA特性を有
するポリペプチド（MW44,000−48,000）を検出可能な様
にラベルしたもの、または、固定したものも、また、本
発明の１部分である。
疫分析による腫瘍の検出用および／または診断用のマー
カーとして使用することもできる。これらの分析には、
本発明に係る方法を用いて調製した抗体、または他の方
法で調製した、それに相当する他の類似抗体を使用して
もよい。この分析は、先に記載のポリペプチドを、検出
可能な様にラベルして利用してもよいし（例えば、競合
方法）、または、不溶形にして利用してもよい（抗体用
の凝集分析、または、抗体用の結合分析）。それ故、例
えば、本明細書中に記載した、胚の抗原−OFA特性を有
するポリペプチド（MW44,000−48,000）を検出可能な様
にラベルしたもの、または、固定したものも、また、本
発明の１部分である。
このポリペプチドを含む抗原とモノクロナール抗体との
複合体も、また、本発明の１部分である。例えば、イン
・ビトロにおける診断用分析において、またはイン・ビ
ボにおける診断の、画像作製の、または治療のプロセス
において、モノクロナール抗体がそのポリペプチドと結
合した場合に、このような複合体が生成する。それ故、
モノクロナール抗体が放射性同位体または金属原子
（群）と結合する放射能画像作製方法（例えば、放射能
方法または、核磁気共鳴方法）において有用な複合体
も、また、本発明の１部分である。
複合体も、また、本発明の１部分である。例えば、イン
・ビトロにおける診断用分析において、またはイン・ビ
ボにおける診断の、画像作製の、または治療のプロセス
において、モノクロナール抗体がそのポリペプチドと結
合した場合に、このような複合体が生成する。それ故、
モノクロナール抗体が放射性同位体または金属原子
（群）と結合する放射能画像作製方法（例えば、放射能
方法または、核磁気共鳴方法）において有用な複合体
も、また、本発明の１部分である。
腫瘍の成長または広がりを抑制、阻害、または遅延する
能力のある化合物と、本発明に係るモノクロナール抗体
とを結合し、選択的な「魔法の弾丸」の治療薬として、
その結合物を利用することも、また、その使用方法に含
まれる。この抗体のその他の用途には、受身免疫療法が
ある。
能力のある化合物と、本発明に係るモノクロナール抗体
とを結合し、選択的な「魔法の弾丸」の治療薬として、
その結合物を利用することも、また、その使用方法に含
まれる。この抗体のその他の用途には、受身免疫療法が
ある。
抗原および／または抗体のその他の利用法は、妊娠が正
常であることを確認するためのヒト胎児上の胚抗原の検
出、胎児生物学における分化のマーカーの分析、胚抗原
および腫瘍胎児性抗原の精製、ヒトの腫瘍および動物の
腫瘍のタイプの分類、腫瘍患者における循環している腫
瘍胎児性抗原のスクリーニング、および、腫瘍識別マー
カーの分析がある。
常であることを確認するためのヒト胎児上の胚抗原の検
出、胎児生物学における分化のマーカーの分析、胚抗原
および腫瘍胎児性抗原の精製、ヒトの腫瘍および動物の
腫瘍のタイプの分類、腫瘍患者における循環している腫
瘍胎児性抗原のスクリーニング、および、腫瘍識別マー
カーの分析がある。
腫瘍のタイプの分類は、特に重要である。腫瘍のクラス
には４つの基本的なタイプ（悪性腫瘍（癌）、悪性リン
パ腫、白血病、肉腫）がある。その各々について、いく
つかのサブクラスがある。腫瘍胎児性抗原は種々の組織
に出現する。例えば、ある腫瘍胎児性抗原が、大腸癌に
出現し、それとは異なる腫瘍胎児性抗原が乳癌に出現す
る。それ故、本発明に従つて得られたモノクロナール抗
体のパネルを作成し、成人標本中の特定の腫瘍胎児性抗
原の存在のみならず、その抗原の分類（悪性腫瘍、悪性
リンパ腫、白血病または肉腫）、さらに、その組織源
（大腸、乳など）の分類を行なうことのできる迅速なス
クリーニング方法を実施することができる。
には４つの基本的なタイプ（悪性腫瘍（癌）、悪性リン
パ腫、白血病、肉腫）がある。その各々について、いく
つかのサブクラスがある。腫瘍胎児性抗原は種々の組織
に出現する。例えば、ある腫瘍胎児性抗原が、大腸癌に
出現し、それとは異なる腫瘍胎児性抗原が乳癌に出現す
る。それ故、本発明に従つて得られたモノクロナール抗
体のパネルを作成し、成人標本中の特定の腫瘍胎児性抗
原の存在のみならず、その抗原の分類（悪性腫瘍、悪性
リンパ腫、白血病または肉腫）、さらに、その組織源
（大腸、乳など）の分類を行なうことのできる迅速なス
クリーニング方法を実施することができる。
それ故、本発明は、上記の適用法を行うためのキツトの
調製に向いている。このようなキツトは１またはそれ以
上の容器を密着させて収容するための区切られた保持体
を有しており、その最初の容器は、例えば、本発明に係
るモノクロナール抗体を不溶の形で含んでいてもよく、
また、第２番目の容器は、上記のモノクロナール抗体ま
たは異なるモノクロナール抗体を、検出可能なラベルを
施された、溶解し得る形で含んでいてもよい。従つて、
使用者は特定の腫瘍胎児性抗原のための免疫検定を行な
うことができる。このキツトは、検量線を作成すること
ができるように、種々の濃度の腫瘍胎児性抗原を含む一
連の容器を含んでいてもよい。
調製に向いている。このようなキツトは１またはそれ以
上の容器を密着させて収容するための区切られた保持体
を有しており、その最初の容器は、例えば、本発明に係
るモノクロナール抗体を不溶の形で含んでいてもよく、
また、第２番目の容器は、上記のモノクロナール抗体ま
たは異なるモノクロナール抗体を、検出可能なラベルを
施された、溶解し得る形で含んでいてもよい。従つて、
使用者は特定の腫瘍胎児性抗原のための免疫検定を行な
うことができる。このキツトは、検量線を作成すること
ができるように、種々の濃度の腫瘍胎児性抗原を含む一
連の容器を含んでいてもよい。
さらに、腫瘍のタイプを分類するために、キツトは予め
各種のモノクロナール抗体を、検出可能なラベル体で、
または不溶形で、または、その両方の形で含む一連の容
器を含有してもよく、これにより、特定のヒト腫瘍サン
プル（例えば生検など）について、迅速なスクリーニン
グおよび特異的な分析を行なうことができる。
各種のモノクロナール抗体を、検出可能なラベル体で、
または不溶形で、または、その両方の形で含む一連の容
器を含有してもよく、これにより、特定のヒト腫瘍サン
プル（例えば生検など）について、迅速なスクリーニン
グおよび特異的な分析を行なうことができる。
以上、本発明を概説したが、本発明は以下に示す特定の
例を参照すればより良く理解できるだろう。ただし、本
明細書中に含まれるその例は、ただ、例示するのが目的
であり、特にことわりがなければ、本発明を限定する目
的のものではない。
例を参照すればより良く理解できるだろう。ただし、本
明細書中に含まれるその例は、ただ、例示するのが目的
であり、特にことわりがなければ、本発明を限定する目
的のものではない。
実施例１ 本実施例において記載したのは、マウスの胚（胎児）抗
原に対する、いくつかのモノクロナール抗体の開発に成
功した方法、無損傷マウス胎児細胞を用いてモノクロナ
ール抗体を迅速にスクリーニングする方法の確立、EAを
含む組織および細胞に対するモノクロナール抗体のイソ
タイプの定義づけ、およびその特異性の例示、および細
胞表面関連EAに対するモノクロナール抗体価を定量分析
するための固相ELISA法の説明についてである。このエ
ピトープは、ヒト、ハムスター、およびマウスの胎児、
および種々のゲツシ類の腫瘍で発現されることがわか
る。
原に対する、いくつかのモノクロナール抗体の開発に成
功した方法、無損傷マウス胎児細胞を用いてモノクロナ
ール抗体を迅速にスクリーニングする方法の確立、EAを
含む組織および細胞に対するモノクロナール抗体のイソ
タイプの定義づけ、およびその特異性の例示、および細
胞表面関連EAに対するモノクロナール抗体価を定量分析
するための固相ELISA法の説明についてである。このエ
ピトープは、ヒト、ハムスター、およびマウスの胎児、
および種々のゲツシ類の腫瘍で発現されることがわか
る。
用具および方法 化学試薬 ハンカー（Hanker）／ヤーテス（Yates）、
フエニルヒドラジンおよびジメチルスルホキシド（DMS
O）は市販品を購入した。
フエニルヒドラジンおよびジメチルスルホキシド（DMS
O）は市販品を購入した。
細胞 マウスのマクロフアージ細胞系（RAW264.7）は、
子ウシ胎児血清（CS、10％）、Ｌ−グルタミン（2m
M）、重炭酸ナトリウム（0.045％）を含むダルベツコ溶
媒中で培養した。これらの細胞の融合状態の培養物から
過した培養溶媒を、ハイブリドーマ増殖溶媒に追加す
るために用いた。マウスＬ細胞は、ウシ胎児血清（FB
S、５％）、Ｌ−グルタミン（2mM）および重炭酸ナトリ
ウム（0.045％）を補足したエール塩（Earle's Salts）
を含むエールの最小必須溶媒中で増殖した。WF5−1 SV4
0誘導ハムスター（LVG）肉腫細胞およびmKSA細胞、SV40
形質転換マウス（Balb/c）肉腫は、FBS（10％）、グル
タミン（2mM）および重炭酸ナトリウム（0.045％）を補
足した199溶媒中で増殖した。GD−36、SV40形質転換ハ
ムスター（LVG）リンパ腫細胞は、FBS（10％）、Ｌ−グ
ルタミン（2mM）および重炭酸ナトリウム（0.045％）を
含むRPMI1640中に保持した。
子ウシ胎児血清（CS、10％）、Ｌ−グルタミン（2m
M）、重炭酸ナトリウム（0.045％）を含むダルベツコ溶
媒中で培養した。これらの細胞の融合状態の培養物から
過した培養溶媒を、ハイブリドーマ増殖溶媒に追加す
るために用いた。マウスＬ細胞は、ウシ胎児血清（FB
S、５％）、Ｌ−グルタミン（2mM）および重炭酸ナトリ
ウム（0.045％）を補足したエール塩（Earle's Salts）
を含むエールの最小必須溶媒中で増殖した。WF5−1 SV4
0誘導ハムスター（LVG）肉腫細胞およびmKSA細胞、SV40
形質転換マウス（Balb/c）肉腫は、FBS（10％）、グル
タミン（2mM）および重炭酸ナトリウム（0.045％）を補
足した199溶媒中で増殖した。GD−36、SV40形質転換ハ
ムスター（LVG）リンパ腫細胞は、FBS（10％）、Ｌ−グ
ルタミン（2mM）および重炭酸ナトリウム（0.045％）を
含むRPMI1640中に保持した。
ハイブリツド細胞を得るための融合に使用するためのC5
7BL/6nマウスの免疫実験計画 同系の雄性受容体において、胎児性抗原に対する体液性
の反応を刺激するために、最も生産的な免疫プロトコー
ルを引き出す試みを行なつた。即ち種々の濃度の無傷
の、同系の、12日妊娠胎児細胞の3MKCl抽出物を、注射
による種々の投与方法および／またはタイムコースで投
与した７群に分けた動物群を用いて行なつた。免疫用の
胎児細胞を得て、分散する方法は、コギンら（Coggin e
t al.），「発達した癌研究」（Advanced Cancer Resea
rch）19:105（1974）に記載がある。酵素の分散は決し
て使用しなかつた。表１に示すように、同系の、致死量
の放射能（5000R）照射を受けた妊娠中期（10−12日）
のマウス胎児細胞を高濃度（107）または低濃度（106）
にて、マウス群に投与した。
7BL/6nマウスの免疫実験計画 同系の雄性受容体において、胎児性抗原に対する体液性
の反応を刺激するために、最も生産的な免疫プロトコー
ルを引き出す試みを行なつた。即ち種々の濃度の無傷
の、同系の、12日妊娠胎児細胞の3MKCl抽出物を、注射
による種々の投与方法および／またはタイムコースで投
与した７群に分けた動物群を用いて行なつた。免疫用の
胎児細胞を得て、分散する方法は、コギンら（Coggin e
t al.），「発達した癌研究」（Advanced Cancer Resea
rch）19:105（1974）に記載がある。酵素の分散は決し
て使用しなかつた。表１に示すように、同系の、致死量
の放射能（5000R）照射を受けた妊娠中期（10−12日）
のマウス胎児細胞を高濃度（107）または低濃度（106）
にて、マウス群に投与した。
表１ 胎児性抗原決定基（EAs)bに対する免疫性脾臓細胞（C57
Bl/6n）を刺激するための免疫群ａ 1.（SH）＝短期間の、高投与量群。生存能力のある13d
G57/BL/6n胎児細胞（107）を、１週間、間隔を開けて腹
腔内に２回注射した。２回目の投与後の３週間後であ
り、融合に用いる脾臓細胞を得る３日前に、同投与量の
ブースター注射を１回行なつた。
Bl/6n）を刺激するための免疫群ａ 1.（SH）＝短期間の、高投与量群。生存能力のある13d
G57/BL/6n胎児細胞（107）を、１週間、間隔を開けて腹
腔内に２回注射した。２回目の投与後の３週間後であ
り、融合に用いる脾臓細胞を得る３日前に、同投与量の
ブースター注射を１回行なつた。
2.（SL）＝短期間の、低投与量群。生存能力のある13d
G57/BL/6n胎児細胞を、106用いる以外は１に記載の方法
と同じである。
G57/BL/6n胎児細胞を、106用いる以外は１に記載の方法
と同じである。
3.（CFA Ms）＝マイコバクテリウム・スメグマテイテイ
ス（Mycobacterium smegmatitis）を用いたフロイント
の完全アジユバントおよび圧縮した胎児細胞の混合物
（1:1、v/v）を、各々の後足に１回注射（0.03ml）し、
背中の中心に１回皮下注射（0.04ml）した。１週間後
に、フロイントの不完全アジユバントを用いて接種を再
び行なつた。３週間後に、細胞だけからなる最後のブー
スター注射を行なつた。
ス（Mycobacterium smegmatitis）を用いたフロイント
の完全アジユバントおよび圧縮した胎児細胞の混合物
（1:1、v/v）を、各々の後足に１回注射（0.03ml）し、
背中の中心に１回皮下注射（0.04ml）した。１週間後
に、フロイントの不完全アジユバントを用いて接種を再
び行なつた。３週間後に、細胞だけからなる最後のブー
スター注射を行なつた。
4.（CFA Mt）＝M.ツベルクロシス（M. tuberculosis）
を用いたフロイントの完全アジユバントを用いる群。３
に記載した方法と同じであるが、マイコバクテリウム
（Mycobacterium）のみが異なる。
を用いたフロイントの完全アジユバントを用いる群。３
に記載した方法と同じであるが、マイコバクテリウム
（Mycobacterium）のみが異なる。
5.（LH）＝長期間の、高投与量群。SH群と同じ方法であ
るが、最後のブースター注射の前に１週間ごとに、５回
投与した。
るが、最後のブースター注射の前に１週間ごとに、５回
投与した。
6.（LL）＝長期間の、低投与量群。SL群と同じ方法であ
るが、最後のブースター注射の前に１週間ごとに、５回
投与した。
るが、最後のブースター注射の前に１週間ごとに、５回
投与した。
7.（3M KCl）＝胎児細胞を溶解した3M KClを用いる群。
13d C57 BL/6n胎児細胞の3M KCl抽出物を２回、腹腔内
投与し、各々、たん白質700μｇ、たん白質450μｇを共
に投与した。最後のブースター注射（たん白質、100μ
ｇ）は静脈内投与した。
13d C57 BL/6n胎児細胞の3M KCl抽出物を２回、腹腔内
投与し、各々、たん白質700μｇ、たん白質450μｇを共
に投与した。最後のブースター注射（たん白質、100μ
ｇ）は静脈内投与した。
(a) ４匹の成熟（５週齢）雄性C57 BL/6nマウスを１群
とした。
とした。
(b) 免疫に用いた胎児細胞は、すべて、新しく調製し
た13d同系細胞であり、注射前に、Ｘ線（5000R）を照射
した。
た13d同系細胞であり、注射前に、Ｘ線（5000R）を照射
した。
最後のブースター注射を含む系３回の注射を短期コース
で行なう方法か、または、計６回の注射を長期コースで
行なう方法で、細胞を投与した。他の２つの群は、マイ
コバクテリウム・スメグマテイス（Mycobacte−rium sm
egmatis）またはM.ツベルクロシス（M. tuberculosis）
を用いたフロイントのアジユバント中の胎児細胞を注射
し、その後、胎児細胞および不完全フロイントアジユバ
ントとを用いたブースター注射を行ない、最後のブース
ター注射は胎児細胞のみを用いて行なつた。アジユバン
トは、同容量の圧縮した細胞と混合し、その抗原調製物
（0.03ml）を、各々のマウスの両方の後足に注射し、次
いで各々のマウスの背中に抗原調製物（0.04ml）を皮下
注射した。マウスの１群は、3M KClに溶解した胎児細胞
膜（１匹のマウス当り、たん白質0.5mg）を２回腹腔内
注射し、次に、最後のブースター注射0.1mgを静注して
免疫した。最後のブースター注射は、すべての場合にお
いて、最後の抗原注射の後、２−３週間後に行なつた。
感作した脾臓細胞は、最後のブースター注射の３日後に
得た。
で行なう方法か、または、計６回の注射を長期コースで
行なう方法で、細胞を投与した。他の２つの群は、マイ
コバクテリウム・スメグマテイス（Mycobacte−rium sm
egmatis）またはM.ツベルクロシス（M. tuberculosis）
を用いたフロイントのアジユバント中の胎児細胞を注射
し、その後、胎児細胞および不完全フロイントアジユバ
ントとを用いたブースター注射を行ない、最後のブース
ター注射は胎児細胞のみを用いて行なつた。アジユバン
トは、同容量の圧縮した細胞と混合し、その抗原調製物
（0.03ml）を、各々のマウスの両方の後足に注射し、次
いで各々のマウスの背中に抗原調製物（0.04ml）を皮下
注射した。マウスの１群は、3M KClに溶解した胎児細胞
膜（１匹のマウス当り、たん白質0.5mg）を２回腹腔内
注射し、次に、最後のブースター注射0.1mgを静注して
免疫した。最後のブースター注射は、すべての場合にお
いて、最後の抗原注射の後、２−３週間後に行なつた。
感作した脾臓細胞は、最後のブースター注射の３日後に
得た。
ハイブリドーマの培養 マウスのミエローマ（P3×63Ag8.653）と、致死量の放
射能照射を受けた妊娠中期の同系の胎児細胞を用いて免
疫した成熟雄性C57 BL/6nマウスから得た脾臓細胞とを
融合して、ハイブリドーマ細胞を製造した。融合は、マ
ウスのミエローマ細胞と脾臓細胞を1:10の比率で、ポリ
エチレングリコール4000（50％、v/v）の存在下で用い
て、コーラー（Kohler）およびミルステイン（Milstei
n）の方法（ネーチヤー256:495（1975））に記載の方法
の変法により行なつた。ハイポキサンチン、アミノプテ
リン、チミジン、FBS（15％）、Ｌ−グルタミン（2m
M）、重炭酸ナトリウム（0.045％）およびゲンタマイシ
ン（50μg/ml）を含むRPMI 1640溶媒（HAT溶媒）中にて
ハイブリツド細胞を選別した。１つのウエル当たり細胞
を3.5×105個、96個のウエルを持つ平底リンブロ（Linb
ro）プレート内に接種した。ハイブリツド細胞は、24ウ
エルのリンブロプレートに移した後、ハイポキサンチ
ン、チミジン、FBS（15％）、Ｌ−グルタミン（2mM）、
重炭酸ナトリウム（0.045％）、およびゲンタマイシン
で補つたRPMI 1640溶媒（HT溶媒）中に保持した。この
移した溶媒は、また、マクロフアージ細胞系（RAW 264.
7）からの過滅菌した72時間培養上清10容量％を追加
した（HT＋RS溶媒）。ハイブリツド培養物が十分に適合
し、イン・ビトロにて継代する準備ができた時点で、培
養上清中に存在する胎児性抗原決定基に対する抗体を測
定した。
射能照射を受けた妊娠中期の同系の胎児細胞を用いて免
疫した成熟雄性C57 BL/6nマウスから得た脾臓細胞とを
融合して、ハイブリドーマ細胞を製造した。融合は、マ
ウスのミエローマ細胞と脾臓細胞を1:10の比率で、ポリ
エチレングリコール4000（50％、v/v）の存在下で用い
て、コーラー（Kohler）およびミルステイン（Milstei
n）の方法（ネーチヤー256:495（1975））に記載の方法
の変法により行なつた。ハイポキサンチン、アミノプテ
リン、チミジン、FBS（15％）、Ｌ−グルタミン（2m
M）、重炭酸ナトリウム（0.045％）およびゲンタマイシ
ン（50μg/ml）を含むRPMI 1640溶媒（HAT溶媒）中にて
ハイブリツド細胞を選別した。１つのウエル当たり細胞
を3.5×105個、96個のウエルを持つ平底リンブロ（Linb
ro）プレート内に接種した。ハイブリツド細胞は、24ウ
エルのリンブロプレートに移した後、ハイポキサンチ
ン、チミジン、FBS（15％）、Ｌ−グルタミン（2mM）、
重炭酸ナトリウム（0.045％）、およびゲンタマイシン
で補つたRPMI 1640溶媒（HT溶媒）中に保持した。この
移した溶媒は、また、マクロフアージ細胞系（RAW 264.
7）からの過滅菌した72時間培養上清10容量％を追加
した（HT＋RS溶媒）。ハイブリツド培養物が十分に適合
し、イン・ビトロにて継代する準備ができた時点で、培
養上清中に存在する胎児性抗原決定基に対する抗体を測
定した。
Mcを生産するハイブリドーマを得るための、ハイブリド
ーマ培養集団のクローニング ハイブリドーマコロニー集団のクローニングを、RAW26
4.7培養上清（10％）を補つたHT溶媒中にて、末端希釈
法を用いて行なつた。培養集団から得たハイブリドーマ
細胞（100個および200個）を、上記のクローニング溶媒
（10ml）中に懸濁し、HAT＋RS溶媒（100μｌ）／ウエル
を入れた96個のウエルプレートに分配した。次に、クロ
ーンを24個のウエルプレートに移し、後に、成熟したコ
ロニーを抗−EA活性について分析した。各々のハイブリ
ドーマに対して、１度またはそれ以上、再クローニング
を行なつた。
ーマ培養集団のクローニング ハイブリドーマコロニー集団のクローニングを、RAW26
4.7培養上清（10％）を補つたHT溶媒中にて、末端希釈
法を用いて行なつた。培養集団から得たハイブリドーマ
細胞（100個および200個）を、上記のクローニング溶媒
（10ml）中に懸濁し、HAT＋RS溶媒（100μｌ）／ウエル
を入れた96個のウエルプレートに分配した。次に、クロ
ーンを24個のウエルプレートに移し、後に、成熟したコ
ロニーを抗−EA活性について分析した。各々のハイブリ
ドーマに対して、１度またはそれ以上、再クローニング
を行なつた。
Mcイムノグロブリンのクラス モノクロナール抗体のイムノグロブリンのクラスを決定
するために、二様の免疫拡散分析を行なつた。ポリエチ
レングリコール−4000（2.5％）を含有するアガロース
（1.5％、5ml）を沸騰したH2O中で融解し、次に、15分
間、56℃に保つた。次に、そのアガロース溶液を免疫拡
散プレート（ミレス・ラボラトリー（Miles Laborator
y）、Inc.）中に注ぎ込み、30分間、25℃にて固化させ
た。アガロースを切り取り、5mmのウエルを作成し、中
心のウエルを６つのウエルが対称的に取り囲む様に配置
した。モノクロナールハイブリドーマ上清（25×濃縮、
10μｌ）を中心のウエル中に分配し、それを取り囲むウ
エル中には、抗−IgG1、抗−IgG2、抗−IgG2a、抗−IgG
2b、抗−IgG3、および抗−IgM（ミレス・ラボラトリ
ー、Inc.）含む６種類の抗−マウスのイムノグロブリン
上清（10μｌ）を分配した。プレートを25℃にて、48時
間インキユベーシヨンし、毎日、沈降線を観察した。正
常なマウスの血清、およびP3×63 Ag8.653培養上清を、
それぞれ陽性の対照、および陰性の対照として用いた。
するために、二様の免疫拡散分析を行なつた。ポリエチ
レングリコール−4000（2.5％）を含有するアガロース
（1.5％、5ml）を沸騰したH2O中で融解し、次に、15分
間、56℃に保つた。次に、そのアガロース溶液を免疫拡
散プレート（ミレス・ラボラトリー（Miles Laborator
y）、Inc.）中に注ぎ込み、30分間、25℃にて固化させ
た。アガロースを切り取り、5mmのウエルを作成し、中
心のウエルを６つのウエルが対称的に取り囲む様に配置
した。モノクロナールハイブリドーマ上清（25×濃縮、
10μｌ）を中心のウエル中に分配し、それを取り囲むウ
エル中には、抗−IgG1、抗−IgG2、抗−IgG2a、抗−IgG
2b、抗−IgG3、および抗−IgM（ミレス・ラボラトリ
ー、Inc.）含む６種類の抗−マウスのイムノグロブリン
上清（10μｌ）を分配した。プレートを25℃にて、48時
間インキユベーシヨンし、毎日、沈降線を観察した。正
常なマウスの血清、およびP3×63 Ag8.653培養上清を、
それぞれ陽性の対照、および陰性の対照として用いた。
免疫過ELISA用の装置 ＶアンドＰサイエンテイフイツク（V and P Scienti−f
ic）、Inc.、サン・ジエゴ（San Digeo）、カルフオル
ニア（California））から得た再使用が可能なマイクロ
フアルトTM（Reusable Microfold）装置を、ELISAの操
作を行なうために使用した。Ｖ＆Ｐサイエンテイフイツ
ク（Scientific）から得たガラス線維紙を、標的再を
獲得し、固定するために用いた。細胞を適用する前に、
熱湯（90℃）を用いて、ウエルの下から融解して取つた
ゼラチン（２％）を用いて、その過紙を予め処理し
た。
ic）、Inc.、サン・ジエゴ（San Digeo）、カルフオル
ニア（California））から得た再使用が可能なマイクロ
フアルトTM（Reusable Microfold）装置を、ELISAの操
作を行なうために使用した。Ｖ＆Ｐサイエンテイフイツ
ク（Scientific）から得たガラス線維紙を、標的再を
獲得し、固定するために用いた。細胞を適用する前に、
熱湯（90℃）を用いて、ウエルの下から融解して取つた
ゼラチン（２％）を用いて、その過紙を予め処理し
た。
免疫過ELISA用の標的細胞 ELISAの操作に使用する標的細胞は、新しく得た、初産
の、12−13日の妊娠期のC57 BL/6n胎児細胞であつた。
子宮から、完全な、生きている胎児を、無菌条件で取り
除き、新しいHBSS中に、37℃にて、20ゲージ針にて注入
する前に、ハンクスの平衡塩類溶液（HBSS、pH7.0、5
X）中で、徹底的にゆすいだ。穏やかに、２、３回、ピ
ペツテイングした後、細胞を無菌綿ガーゼ（４×４）パ
ツド（Pad）を通して過し、破片を除去した。低速度
遠心分離により、HBSS中で細胞を洗浄し、次にカウント
し、細胞（５×106）をリン酸平衡生理食塩水（PBS、10
mM、pH7.4）中のフエニルヒドラジン溶液（0.05％、10m
l）中に再び懸濁し、25℃にて30分間インキユベーシヨ
ンし、内因性のペルオキシダーゼ活性を阻害した。この
ように処理した細胞を、直接ELISAに使用した。
の、12−13日の妊娠期のC57 BL/6n胎児細胞であつた。
子宮から、完全な、生きている胎児を、無菌条件で取り
除き、新しいHBSS中に、37℃にて、20ゲージ針にて注入
する前に、ハンクスの平衡塩類溶液（HBSS、pH7.0、5
X）中で、徹底的にゆすいだ。穏やかに、２、３回、ピ
ペツテイングした後、細胞を無菌綿ガーゼ（４×４）パ
ツド（Pad）を通して過し、破片を除去した。低速度
遠心分離により、HBSS中で細胞を洗浄し、次にカウント
し、細胞（５×106）をリン酸平衡生理食塩水（PBS、10
mM、pH7.4）中のフエニルヒドラジン溶液（0.05％、10m
l）中に再び懸濁し、25℃にて30分間インキユベーシヨ
ンし、内因性のペルオキシダーゼ活性を阻害した。この
ように処理した細胞を、直接ELISAに使用した。
ELISA過で用いた培養腫瘍細胞系をフラスコからけず
りとり、ピペツテイングにより分散することにより懸濁
させた。次に、フエニルヒドラジン溶液中に再び懸濁す
る前に、HBSSを用いて２回、細胞を洗浄した。
りとり、ピペツテイングにより分散することにより懸濁
させた。次に、フエニルヒドラジン溶液中に再び懸濁す
る前に、HBSSを用いて２回、細胞を洗浄した。
再使用可能なマイクロフアルトTMを用いると、酵素−関
連性免疫吸着分析 免疫過ELISA方法で用いたのは、間接的な免疫ペルオ
キシダーゼ反応であつた。フエニルヒドラジンで処理し
た胎児細胞を、１ウエル当たり５×104個の細胞の割合
で、96ウエル再使用可能マイクロフアルトTM内に入れ
た。装置の中心と、その上のセクシヨンとの間にサンド
イツチしたガラス線維のフイルターに、真空により、細
胞を固定した。フイルター紙は、ゼラチン（３％）を用
いて前処理し、ウエル間の反応の交差混合を防いだ。使
用前に、ゼラチンで処理したフイルターを熱湯に通し
て、個々の過チヤンネル（channel）から、ゼラチン
をきれいに除いた。正常な山羊の血清（NGS、50μ）
と共に、25℃にて20分間、細胞をインキユベーシヨン
し、NGSを真空にして、再使用可能マイクロフアルトTM
装置中の細胞から取去した。次に、ハイブリツド細胞コ
ロニーの上清（100μ）を各々のウエルに加え、室温
にて60分間インキユベーシヨンした。次に、ペルオキシ
ダーゼと抱合した山羊の抗−マウスIgGおよびIgM血清
（アフイニテイーで精製し、ヒト血清に吸着したもの、
KPLインコーポレーテツド（Incorporated）、ガイセル
スブルグ（Gaithersburg）、マリーランド（Marylan
d））（100μ）を加える前に、細胞をバキユームし、
装置中の同じ場所で、CS（５％）を含むPBS（250μ）
を用いて６回洗浄した。ペルオキシダーゼと抱合した抗
血清は、CS（５％）を含むPBS中に1:300の比率で希釈し
て用いた。25℃にて30分間インキユベーシヨンした後、
細胞をPBS＋CS（3X）を用いて洗浄し、トリス平衡塩類
緩衝液（10mM、pH7.4、TBS、3X）を用いて洗浄した。10
0μのハンカー／ヤーテス（8mg/10ml、TBS）およびH2
O2（0.03％）をそのサンプルに加え、反応を30分間観察
した。陽性の反応では、濃い黒茶色の沈殿が生成した。
H2SO4（4N、25μ）を用いて反応を止め、過装置内
にて、真空乾燥した。並んだ陰性のウエルと陽性のウエ
ルとをお互に、容易に区別することができるだろう。ま
た、その紙は永久の記録として保つことができ、新し
くゼラチンで処理したフイルターを装置に備え付けて、
直ちに再使用した。
連性免疫吸着分析 免疫過ELISA方法で用いたのは、間接的な免疫ペルオ
キシダーゼ反応であつた。フエニルヒドラジンで処理し
た胎児細胞を、１ウエル当たり５×104個の細胞の割合
で、96ウエル再使用可能マイクロフアルトTM内に入れ
た。装置の中心と、その上のセクシヨンとの間にサンド
イツチしたガラス線維のフイルターに、真空により、細
胞を固定した。フイルター紙は、ゼラチン（３％）を用
いて前処理し、ウエル間の反応の交差混合を防いだ。使
用前に、ゼラチンで処理したフイルターを熱湯に通し
て、個々の過チヤンネル（channel）から、ゼラチン
をきれいに除いた。正常な山羊の血清（NGS、50μ）
と共に、25℃にて20分間、細胞をインキユベーシヨン
し、NGSを真空にして、再使用可能マイクロフアルトTM
装置中の細胞から取去した。次に、ハイブリツド細胞コ
ロニーの上清（100μ）を各々のウエルに加え、室温
にて60分間インキユベーシヨンした。次に、ペルオキシ
ダーゼと抱合した山羊の抗−マウスIgGおよびIgM血清
（アフイニテイーで精製し、ヒト血清に吸着したもの、
KPLインコーポレーテツド（Incorporated）、ガイセル
スブルグ（Gaithersburg）、マリーランド（Marylan
d））（100μ）を加える前に、細胞をバキユームし、
装置中の同じ場所で、CS（５％）を含むPBS（250μ）
を用いて６回洗浄した。ペルオキシダーゼと抱合した抗
血清は、CS（５％）を含むPBS中に1:300の比率で希釈し
て用いた。25℃にて30分間インキユベーシヨンした後、
細胞をPBS＋CS（3X）を用いて洗浄し、トリス平衡塩類
緩衝液（10mM、pH7.4、TBS、3X）を用いて洗浄した。10
0μのハンカー／ヤーテス（8mg/10ml、TBS）およびH2
O2（0.03％）をそのサンプルに加え、反応を30分間観察
した。陽性の反応では、濃い黒茶色の沈殿が生成した。
H2SO4（4N、25μ）を用いて反応を止め、過装置内
にて、真空乾燥した。並んだ陰性のウエルと陽性のウエ
ルとをお互に、容易に区別することができるだろう。ま
た、その紙は永久の記録として保つことができ、新し
くゼラチンで処理したフイルターを装置に備え付けて、
直ちに再使用した。
固相酵素免疫測定法（ELISA） ELISAによるMc抗−EA抗体の滴定を、以下の様に行なつ
た。BSA（１％）を含む緩衝グルタルアルデヒド（0.2
％）中に固定した、新しく得た洗浄（5X）した、完全な
C57Bl/6n胎児性細胞（100μ）を、平底の塩化ポリビ
ニルの微量滴定プレートの各々のウエルに加え、25℃に
て、２−３時間インキユベーシヨンした。細胞の懸濁溶
液をさつと出し、１つのウエル当たり、NGS（50％、100
μ）を加え、使用するまで４℃にてそのプレートを保
存した。ELISAの操作を開始するために、NGS（50％）の
混合物を除去し、PBS−BSA（１％）中にて希釈（続けて
２倍希釈）したモノクロナールハイブリドーマ上清（μ
）を各々のウエルに加え、そのプレートを室温で一夜
インキユベーシヨンした。この時点から、ペルオキシダ
ーゼ混合物（1:500に希釈）を用いて２時間、インキユ
ベーシヨンして、標準間接ELISAとしての操作を行なつ
た。クロモゲンを加えた30分後に、ABTSおよびH2O2を加
えて、ペルオキシダーゼ反応を活性化し、プレートを、
マルチスキヤンELISA分光計を用いて、414nmの光波長に
おいて計測した。胎児細胞は、コギン（Coggin）がキヤ
ンサー・リサーチ（Cancer Research）39:2752（1979）
に記載した様にして調製する。あるいはまた、コギン
（Coggin）がメソーズ・イン・キヤンサー・リサーチ
（Methods in Cancer Research）XVIII、371−389（19
79）に記載した方法を用いてもよい。
た。BSA（１％）を含む緩衝グルタルアルデヒド（0.2
％）中に固定した、新しく得た洗浄（5X）した、完全な
C57Bl/6n胎児性細胞（100μ）を、平底の塩化ポリビ
ニルの微量滴定プレートの各々のウエルに加え、25℃に
て、２−３時間インキユベーシヨンした。細胞の懸濁溶
液をさつと出し、１つのウエル当たり、NGS（50％、100
μ）を加え、使用するまで４℃にてそのプレートを保
存した。ELISAの操作を開始するために、NGS（50％）の
混合物を除去し、PBS−BSA（１％）中にて希釈（続けて
２倍希釈）したモノクロナールハイブリドーマ上清（μ
）を各々のウエルに加え、そのプレートを室温で一夜
インキユベーシヨンした。この時点から、ペルオキシダ
ーゼ混合物（1:500に希釈）を用いて２時間、インキユ
ベーシヨンして、標準間接ELISAとしての操作を行なつ
た。クロモゲンを加えた30分後に、ABTSおよびH2O2を加
えて、ペルオキシダーゼ反応を活性化し、プレートを、
マルチスキヤンELISA分光計を用いて、414nmの光波長に
おいて計測した。胎児細胞は、コギン（Coggin）がキヤ
ンサー・リサーチ（Cancer Research）39:2752（1979）
に記載した様にして調製する。あるいはまた、コギン
（Coggin）がメソーズ・イン・キヤンサー・リサーチ
（Methods in Cancer Research）XVIII、371−389（19
79）に記載した方法を用いてもよい。
EAsに対する抗体に特異的なハイブリツドコロニーを得
るためのスクリーニング 胎児細胞標的に対して陽性であるハイブリドーマコロニ
ー上清を、新生児マウスの、または成熟マウスの組織
（C57BL/6n）から調製した細胞懸濁液とハイブリドーマ
培養上清との吸着により、特異性に関してスクリーニン
グを行なつた。成熟マウスの脳、筋肉、心臓、肝臓、お
よび腎臓を集めて、HBSS（pH7.4）中へ入れた。これら
の組織から得た細胞を細かい金網（40メツシユ）のスク
リーンに圧縮して通し、分散し、HBSS中で、２回洗浄し
た。初産の供給体から得た13日妊娠期間の胎児細胞を、
EA陽性の対照として用いた。特定のMc上清（200μ）
と共に、胎児細胞（１×107〜３×108）を用いて、胎児
細胞用の標準吸着曲線を準備した。各々の細胞吸着サン
プルのOD値を、同じMc上清用の非吸着滴定曲線から得た
対応するOD値と比較した。希釈回数の差を計算し、除去
された活性比を、希釈当たり50％除去して決定した（す
なわち、１回の希釈は50％、２回の希釈は75％、３回の
希釈は87.5％など）。次に、除去された活性の比率対細
胞数を用いて、標準吸着のグラフを作成した。
るためのスクリーニング 胎児細胞標的に対して陽性であるハイブリドーマコロニ
ー上清を、新生児マウスの、または成熟マウスの組織
（C57BL/6n）から調製した細胞懸濁液とハイブリドーマ
培養上清との吸着により、特異性に関してスクリーニン
グを行なつた。成熟マウスの脳、筋肉、心臓、肝臓、お
よび腎臓を集めて、HBSS（pH7.4）中へ入れた。これら
の組織から得た細胞を細かい金網（40メツシユ）のスク
リーンに圧縮して通し、分散し、HBSS中で、２回洗浄し
た。初産の供給体から得た13日妊娠期間の胎児細胞を、
EA陽性の対照として用いた。特定のMc上清（200μ）
と共に、胎児細胞（１×107〜３×108）を用いて、胎児
細胞用の標準吸着曲線を準備した。各々の細胞吸着サン
プルのOD値を、同じMc上清用の非吸着滴定曲線から得た
対応するOD値と比較した。希釈回数の差を計算し、除去
された活性比を、希釈当たり50％除去して決定した（す
なわち、１回の希釈は50％、２回の希釈は75％、３回の
希釈は87.5％など）。次に、除去された活性の比率対細
胞数を用いて、標準吸着のグラフを作成した。
胎児細胞に対するMc抗体の特異性、および腫瘍細胞に対
する交差反応性OFAsの検出に対するMc抗体の特異性もま
た、固相（SP）ELISAを用いて、調べた。標的細胞とし
て、非酵素的に分散したげつ歯類腫瘍細胞系を用いた。
除去された活性のパーセントを、それに対応する同じ数
の胎児細胞で除去された活性のパーセントと比較するこ
とによつて、吸着した値に等しい胎児細胞値を決定し
た。これらの細胞のタイプには、ハムスターのSV40−形
質転換WF5−１およびGD−36系、およびマウスのSV40−
形質転換mKSA系が含まれていた。
する交差反応性OFAsの検出に対するMc抗体の特異性もま
た、固相（SP）ELISAを用いて、調べた。標的細胞とし
て、非酵素的に分散したげつ歯類腫瘍細胞系を用いた。
除去された活性のパーセントを、それに対応する同じ数
の胎児細胞で除去された活性のパーセントと比較するこ
とによつて、吸着した値に等しい胎児細胞値を決定し
た。これらの細胞のタイプには、ハムスターのSV40−形
質転換WF5−１およびGD−36系、およびマウスのSV40−
形質転換mKSA系が含まれていた。
結果 以前の研究（コギンら（Coggin、J. et al.）、チバ財
団シンポジウム（版）での、「悪性腫瘍および妊娠にお
ける胚抗原」：「免疫調節における共通の特徴」、ロン
ドン：ピツトマン（Pitman）ブツクス、28−54ページ）
において、イン・ビボで吸着された10日妊娠期間ハムス
ター胎児細胞に対して誘導され、イン・ビボで吸着させ
たポリクローナル外因性抗血清が、12−13dマウスのま
たは10dハムスターの胎児細胞の、ノニデツトＰ−40
（0.5％）抽出物およびKC（3M）抽出物から得た胎児
に特異的なポリペプチドを免疫沈殿することが観察され
た。SDS−PAGE分析において、いく本かの、明確な、胎
児に特異的なポリペプチド帯が存在した。ハムスター
の、または、マウスの胎児細胞表面上にある、これらの
EA抗原決定基のいずれに対するMc抗体の誘導も、感作す
るには、同系の胎児細胞を用いて免疫しなければならな
いので、困難であろうと考えられていた。妊娠した、同
系の雌性マウスおよびハムスターは、ハイブリドーマ融
合用のEAで感作したＢ細胞脾臓細胞の良好な供給源とし
て用いてもよいが、以前の研究では、これらの脾臓組織
中の抗−EA免疫反応に対抗する抑制の活性を検出し、そ
の抑制の活性が、ハイブリドーマの発達を制限する可能
性があるかもしれないと考えられていた。
団シンポジウム（版）での、「悪性腫瘍および妊娠にお
ける胚抗原」：「免疫調節における共通の特徴」、ロン
ドン：ピツトマン（Pitman）ブツクス、28−54ページ）
において、イン・ビボで吸着された10日妊娠期間ハムス
ター胎児細胞に対して誘導され、イン・ビボで吸着させ
たポリクローナル外因性抗血清が、12−13dマウスのま
たは10dハムスターの胎児細胞の、ノニデツトＰ−40
（0.5％）抽出物およびKC（3M）抽出物から得た胎児
に特異的なポリペプチドを免疫沈殿することが観察され
た。SDS−PAGE分析において、いく本かの、明確な、胎
児に特異的なポリペプチド帯が存在した。ハムスター
の、または、マウスの胎児細胞表面上にある、これらの
EA抗原決定基のいずれに対するMc抗体の誘導も、感作す
るには、同系の胎児細胞を用いて免疫しなければならな
いので、困難であろうと考えられていた。妊娠した、同
系の雌性マウスおよびハムスターは、ハイブリドーマ融
合用のEAで感作したＢ細胞脾臓細胞の良好な供給源とし
て用いてもよいが、以前の研究では、これらの脾臓組織
中の抗−EA免疫反応に対抗する抑制の活性を検出し、そ
の抑制の活性が、ハイブリドーマの発達を制限する可能
性があるかもしれないと考えられていた。
同系で妊娠させた、Balb/cマウスを、融合用およびハイ
ブリドーマ製造用のEAで感作した脾臓細胞の供給源とし
て繰り返し使用されたが、安定したハイブリドーマは得
られなかつた。さらに、ハムスター：マウスP3×63Ag8.
653ミエローマ細胞と、同系の胎児組織に対して感作し
たハムスターの脾臓細胞とのハイブリツドを誘導する目
的で、無傷の放射能を照射した同系の胎児細胞を、また
は、これらの細胞の可溶性抽出物を、LSHハムスターに
注射する試みも失敗した。さらに、標的細胞として12dm
fcsを用いるEI分析により、抗−EA＋反応性ハイブリド
ーマが少しは得られるけれども、Balb/cマウスもまた、
非常に応答が劣しいことが証明された。不幸なことに
は、これらのハイブリドーマはイン・ビトロで継代する
ことができなかつた。
ブリドーマ製造用のEAで感作した脾臓細胞の供給源とし
て繰り返し使用されたが、安定したハイブリドーマは得
られなかつた。さらに、ハムスター：マウスP3×63Ag8.
653ミエローマ細胞と、同系の胎児組織に対して感作し
たハムスターの脾臓細胞とのハイブリツドを誘導する目
的で、無傷の放射能を照射した同系の胎児細胞を、また
は、これらの細胞の可溶性抽出物を、LSHハムスターに
注射する試みも失敗した。さらに、標的細胞として12dm
fcsを用いるEI分析により、抗−EA＋反応性ハイブリド
ーマが少しは得られるけれども、Balb/cマウスもまた、
非常に応答が劣しいことが証明された。不幸なことに
は、これらのハイブリドーマはイン・ビトロで継代する
ことができなかつた。
しかし、C57Bl/6nマウスにおいては成功した。放射能を
照射した、12dmfcsを用いて免疫したC57Bl/6nマウス
は、所望の抗−EAイムノグロブリンを生産するハイブリ
ドーマを産生するための脾臓細胞の優秀な供給源である
ことが証明された。表２中に示すように、EI分析におい
て、EA+12dmfcsに対抗する抗体を生産する多量のハイブ
リツドのコロニーが、12dmfcsに対して感作したC57Bl/6
nマウスから得た脾臓細胞の融合から誘導された。
照射した、12dmfcsを用いて免疫したC57Bl/6nマウス
は、所望の抗−EAイムノグロブリンを生産するハイブリ
ドーマを産生するための脾臓細胞の優秀な供給源である
ことが証明された。表２中に示すように、EI分析におい
て、EA+12dmfcsに対抗する抗体を生産する多量のハイブ
リツドのコロニーが、12dmfcsに対して感作したC57Bl/6
nマウスから得た脾臓細胞の融合から誘導された。
種々の免疫計画について、得られるハイブリドーマの数
で反映される効力に、大きな差異があることが示され
た。12dmfcの無傷の胎児差異およびそのKCl（3M）抽出
物の両方を用いて、高容量、短期間の様式で免疫を行な
うと、EIスクリーニング分析において、同系の12dmfcに
対抗して陽性のELISA応答を与える抗−EAハイブリドー
マの数が最も多かつた。被験ハイブリドーマ上清を加え
る前に、内因性の差異ペルオキシダーゼを、山羊の血清
を用いて、適切に抑制することにより（詳しくは、方法
のセクシヨンを参照せよ）、グラシイら（Glassy）ら、
J. Immuno. Methods、58:119（1983）に記載の、ELISA
免疫過（EI）分析により、12日妊娠期間のマウスの胎
児細胞で発現されるEA抗原決定基に対する抗体を検出
し、迅速にスクリーニングすることができた。成熟マウ
ス組織および、19日のEA-（ウエツプナー（Weppner）、
W. A.およびコギン（Coggin）、J. H.、キヤンサー・リ
サーチ（Cancer Res.）、40:1380（1980）妊娠期マウス
細胞は、いかなるハイブリドーマ上清とも反応しなかつ
た。バツクグラウンド・レベルを高くしないために、正
確なクロモゲン濃度を選択する注意が必要であつた。胎
児細胞を用いたアジユバント免疫法も、長期間の、多数
回の接種を行う方法も、適切な抗−EAハイブリドーマを
生産することができなかつた。
で反映される効力に、大きな差異があることが示され
た。12dmfcの無傷の胎児差異およびそのKCl（3M）抽出
物の両方を用いて、高容量、短期間の様式で免疫を行な
うと、EIスクリーニング分析において、同系の12dmfcに
対抗して陽性のELISA応答を与える抗−EAハイブリドー
マの数が最も多かつた。被験ハイブリドーマ上清を加え
る前に、内因性の差異ペルオキシダーゼを、山羊の血清
を用いて、適切に抑制することにより（詳しくは、方法
のセクシヨンを参照せよ）、グラシイら（Glassy）ら、
J. Immuno. Methods、58:119（1983）に記載の、ELISA
免疫過（EI）分析により、12日妊娠期間のマウスの胎
児細胞で発現されるEA抗原決定基に対する抗体を検出
し、迅速にスクリーニングすることができた。成熟マウ
ス組織および、19日のEA-（ウエツプナー（Weppner）、
W. A.およびコギン（Coggin）、J. H.、キヤンサー・リ
サーチ（Cancer Res.）、40:1380（1980）妊娠期マウス
細胞は、いかなるハイブリドーマ上清とも反応しなかつ
た。バツクグラウンド・レベルを高くしないために、正
確なクロモゲン濃度を選択する注意が必要であつた。胎
児細胞を用いたアジユバント免疫法も、長期間の、多数
回の接種を行う方法も、適切な抗−EAハイブリドーマを
生産することができなかつた。
２次培養後、最初のハイブリドーマのコロニーの生き残
りが、抗−EA抗体を示すことも、また、表２中に示して
ある。生き残つた総計201のコロニー（70％）を、24ウ
エルプラスチツクプレートへ２次培養し、RAW264.7細胞
上清を補充したHT溶媒中で増殖したけれども、ハイブリ
ツド細胞が安定するにつれて大多数のコロニーが、後に
死滅した。次に、RAW上清（10％）を補充しないで試験
を行なうと、標準のリンパ球供給細胞が、ハイブリドー
マの安定化に有効でないことがわかつた。初産の、同系
EA+12−13日マウス妊娠細胞（12dmfcs）との特異的結合
について、ハイブリドーマのコロニーを継代した組織培
養を、EI分析によつて、最初にスクリーニングした結果
を表２に示す。表２、コラム４で報告した抗−EA抗体を
生産する陽性のハイブリドーマのコロニーは、すべて３
回継代したクローン化していないハイブリドーマの２次
培養を用いた最低３つの別個のELISA試験において、EA+
胎児細胞と反応した。12dmf標的細胞に関してEI分析で
試験する前に、新生児マウスの、または成熟マウスの細
胞（108/ml）を抗体中に懸濁して吸着標的として用いた
場合（表２中、コラム５および６）、そのハイブリドー
マは、一貫して、これらの非胎児組織との反応性を示さ
ず、抗体価は後の吸着の影響を受けなかつた。しかし、
EI分析にて検出された様に、106〜108の12dmfcsを用い
れば容易に抗体は完全に吸着された。
りが、抗−EA抗体を示すことも、また、表２中に示して
ある。生き残つた総計201のコロニー（70％）を、24ウ
エルプラスチツクプレートへ２次培養し、RAW264.7細胞
上清を補充したHT溶媒中で増殖したけれども、ハイブリ
ツド細胞が安定するにつれて大多数のコロニーが、後に
死滅した。次に、RAW上清（10％）を補充しないで試験
を行なうと、標準のリンパ球供給細胞が、ハイブリドー
マの安定化に有効でないことがわかつた。初産の、同系
EA+12−13日マウス妊娠細胞（12dmfcs）との特異的結合
について、ハイブリドーマのコロニーを継代した組織培
養を、EI分析によつて、最初にスクリーニングした結果
を表２に示す。表２、コラム４で報告した抗−EA抗体を
生産する陽性のハイブリドーマのコロニーは、すべて３
回継代したクローン化していないハイブリドーマの２次
培養を用いた最低３つの別個のELISA試験において、EA+
胎児細胞と反応した。12dmf標的細胞に関してEI分析で
試験する前に、新生児マウスの、または成熟マウスの細
胞（108/ml）を抗体中に懸濁して吸着標的として用いた
場合（表２中、コラム５および６）、そのハイブリドー
マは、一貫して、これらの非胎児組織との反応性を示さ
ず、抗体価は後の吸着の影響を受けなかつた。しかし、
EI分析にて検出された様に、106〜108の12dmfcsを用い
れば容易に抗体は完全に吸着された。
これらのもののハイブリドーマからクローン化されたハ
イブリドーマから誘導したMc抗体の特異性を次のセクシ
ヨンで証明する。短期間の、高投与量および3MKCl免疫
手順が他のすべての試験に比べてよりすぐれていると結
論された。RAWを補充した溶媒中の組織培養中で継代培
養を行ない、EA+胎児細胞標的を用いるEI分析において
陽性の結果を示した最初の、クローン化していないハイ
ブリドーマ培養（35個）を、さらに進んだ研究に用いる
ため、無作為に選択した。これらを２次培養し、次に、
EA-またはEA+の12dmfcの新生児マウス組織のアセトン粉
末を用いて、ハイブリドーマ上清を吸着して、EA特異性
を分析した（表２）。新生児のC57Bl/6nマウス組織を用
いて、繰り返し吸着を行なつた後、EA+の12dmfc標的細
胞を用いるとELISA反応が、培養液上清35個の内32個に
おいてまだ陽性で検出されたので、クローン化されてい
ない培養上清中に存在する抗−EA抗体が圧倒的な特異性
を有することが示された。EA+の12dmfcsを用いて、希釈
していないハイブリドーマ上清を１回吸着させた後、抗
−EA反応性イムノグロブリンの除去が、イン・ビトロで
継代培養したクローン化されていないハイブリドーマ32
個中の32個において起こつた。
イブリドーマから誘導したMc抗体の特異性を次のセクシ
ヨンで証明する。短期間の、高投与量および3MKCl免疫
手順が他のすべての試験に比べてよりすぐれていると結
論された。RAWを補充した溶媒中の組織培養中で継代培
養を行ない、EA+胎児細胞標的を用いるEI分析において
陽性の結果を示した最初の、クローン化していないハイ
ブリドーマ培養（35個）を、さらに進んだ研究に用いる
ため、無作為に選択した。これらを２次培養し、次に、
EA-またはEA+の12dmfcの新生児マウス組織のアセトン粉
末を用いて、ハイブリドーマ上清を吸着して、EA特異性
を分析した（表２）。新生児のC57Bl/6nマウス組織を用
いて、繰り返し吸着を行なつた後、EA+の12dmfc標的細
胞を用いるとELISA反応が、培養液上清35個の内32個に
おいてまだ陽性で検出されたので、クローン化されてい
ない培養上清中に存在する抗−EA抗体が圧倒的な特異性
を有することが示された。EA+の12dmfcsを用いて、希釈
していないハイブリドーマ上清を１回吸着させた後、抗
−EA反応性イムノグロブリンの除去が、イン・ビトロで
継代培養したクローン化されていないハイブリドーマ32
個中の32個において起こつた。
EA抗原決定基に対して誘導されたMcの特徴付けおよび滴
定 12dmfcsを用いる短期の、高投与量の免疫手順で誘導し
た大量のコロニーから、細胞をクローニングして、３つ
のモノクロナール抗体生産性ハイブリドーマ系を最初に
得た。これらの細胞のクローン化を行なう間、RAW上清
を補充した。あるクローン化されたハイブリドーマを3M
KCl群から得、また、短期間の低投与量群からも得た。
メチルセルロース中にてコロニーを形成し、液体溶媒中
で末端希釈を行なうことにより、各々をクローニングし
た。この研究課程では、付加末端希釈法および単一細胞
分離法を用いて、クローニングを行なつた。Mcの内、４
つはIgMイソタイプであり、ひとつはIgGイソタイプであ
つた。この５つのMc生産体は、すべて、多数の次に続い
て行なう試験におけるSPElisa中にて、12dmfcの細胞に
対しては特異的な反応性を有するが、成熟細胞に対して
は反応性がない抗体を産生した。IgMを生産する４つのM
cの内でイソタイプが入れ替る（IgM、IgG）ことは、た
とえ逆の培養シヨツク条件下であつても、観察されなか
つた。ゲル拡散法や、SPELISAにおいては、たとえ25倍
に濃縮した場合でも、その抗体は胎児子ウシ血清と、ま
たは通例の子ウシ血清と交差反応しなかつた。
定 12dmfcsを用いる短期の、高投与量の免疫手順で誘導し
た大量のコロニーから、細胞をクローニングして、３つ
のモノクロナール抗体生産性ハイブリドーマ系を最初に
得た。これらの細胞のクローン化を行なう間、RAW上清
を補充した。あるクローン化されたハイブリドーマを3M
KCl群から得、また、短期間の低投与量群からも得た。
メチルセルロース中にてコロニーを形成し、液体溶媒中
で末端希釈を行なうことにより、各々をクローニングし
た。この研究課程では、付加末端希釈法および単一細胞
分離法を用いて、クローニングを行なつた。Mcの内、４
つはIgMイソタイプであり、ひとつはIgGイソタイプであ
つた。この５つのMc生産体は、すべて、多数の次に続い
て行なう試験におけるSPElisa中にて、12dmfcの細胞に
対しては特異的な反応性を有するが、成熟細胞に対して
は反応性がない抗体を産生した。IgMを生産する４つのM
cの内でイソタイプが入れ替る（IgM、IgG）ことは、た
とえ逆の培養シヨツク条件下であつても、観察されなか
つた。ゲル拡散法や、SPELISAにおいては、たとえ25倍
に濃縮した場合でも、その抗体は胎児子ウシ血清と、ま
たは通例の子ウシ血清と交差反応しなかつた。
定量的な、PVCプレートで行なうSPELISA操作を用いる
と、５つのハイブリドーマから得た上清中のイムノグロ
ブリンは、モノクローンの４つに対する抗体価は＞1024
であり、標的抗原として同系の12dmfcsを用いた155（s
h）のMcに対する抗体価は＞2048であつた（Figure
1）。前記の方法（レフエル（Leffel）、M. S.およびコ
ギン（Coggin）、J. H. Cancer Res.、37:4112（1972）
およびシージエンスら（Sijens R. J. et al.）ハイブ
リドーマ、2:231−234（1983））で調製グルタルアルデ
ヒド固定化胎児細胞に対して試験を行ない、SPELISAに
おいて、標的抗原として使用したいくつかのMcを用い
て、極めて類似した結果を得た。
と、５つのハイブリドーマから得た上清中のイムノグロ
ブリンは、モノクローンの４つに対する抗体価は＞1024
であり、標的抗原として同系の12dmfcsを用いた155（s
h）のMcに対する抗体価は＞2048であつた（Figure
1）。前記の方法（レフエル（Leffel）、M. S.およびコ
ギン（Coggin）、J. H. Cancer Res.、37:4112（1972）
およびシージエンスら（Sijens R. J. et al.）ハイブ
リドーマ、2:231−234（1983））で調製グルタルアルデ
ヒド固定化胎児細胞に対して試験を行ない、SPELISAに
おいて、標的抗原として使用したいくつかのMcを用い
て、極めて類似した結果を得た。
抗−EA:Mc抗体の特異性 C57Bl/6nマウスの13dmfs、または完了期（19d）のマウ
ス胎児細胞、または成熟細胞、のいずれかを用いて吸着
を行なう方法で、前に列挙した５つのMcにより生産され
た５つの抗体の特異性を試験した。Mc69.1、すなわちIg
M生産物に関して第４図に示すように、SP ELISA分析に
おいて、吸収された上清を続けて、EA+12dmfcに対して
試験した場合、107個の13dmfcsを用いて、１回吸着を行
なうと、IgMを、バツクグラウンド・レベルにまで除去
するが、同数の成熟Mcを用いて行なつても除去しなかつ
た。第２の試験においては、12日妊娠期胎児細胞は、た
だ106個の細胞を用いるだけで、Mc69.1の活性をすべて
除去したが、一方、108個の成熟マウス細胞は有意に抗
体を除去しなかつた（データーには示されていない）。
上清のストツク（抗体価〉1024）を希釈して、IgMの、
またはIgGの600−800OD単位（SP ELISA）を得て、１
度、胎児マウス細胞または成熟マウス細胞を用いて（５
×106または107）吸着を行なつた場合に、第２図中で示
した結果と実質上同一の結果を他の４つのMcに対して得
た。
ス胎児細胞、または成熟細胞、のいずれかを用いて吸着
を行なう方法で、前に列挙した５つのMcにより生産され
た５つの抗体の特異性を試験した。Mc69.1、すなわちIg
M生産物に関して第４図に示すように、SP ELISA分析に
おいて、吸収された上清を続けて、EA+12dmfcに対して
試験した場合、107個の13dmfcsを用いて、１回吸着を行
なうと、IgMを、バツクグラウンド・レベルにまで除去
するが、同数の成熟Mcを用いて行なつても除去しなかつ
た。第２の試験においては、12日妊娠期胎児細胞は、た
だ106個の細胞を用いるだけで、Mc69.1の活性をすべて
除去したが、一方、108個の成熟マウス細胞は有意に抗
体を除去しなかつた（データーには示されていない）。
上清のストツク（抗体価〉1024）を希釈して、IgMの、
またはIgGの600−800OD単位（SP ELISA）を得て、１
度、胎児マウス細胞または成熟マウス細胞を用いて（５
×106または107）吸着を行なつた場合に、第２図中で示
した結果と実質上同一の結果を他の４つのMcに対して得
た。
EA+細胞または組織を用いて得たMc Igに対する吸着の結
果は、以前に、腫瘍移植分析（コギン（Coggin）、J.H.
およびアンダーソン（Anderson）、N.G.、Adv.Cancer R
es.、19:105（1974）およびコギン（Coggin）、J.H.お
よびアムブローゼ（Ambrose）、K.R.、Cancer Researc
h、XVIII巻、371−389ページ（アカデミツク・プレス
（Academic Press）、ニユーヨーク（1979））で検出し
た、これらの種々の組織または腫瘍が、マウスの、また
はハムスターの胎児細胞と交差反応する能力と、正確に
相関していた（表３）。
果は、以前に、腫瘍移植分析（コギン（Coggin）、J.H.
およびアンダーソン（Anderson）、N.G.、Adv.Cancer R
es.、19:105（1974）およびコギン（Coggin）、J.H.お
よびアムブローゼ（Ambrose）、K.R.、Cancer Researc
h、XVIII巻、371−389ページ（アカデミツク・プレス
（Academic Press）、ニユーヨーク（1979））で検出し
た、これらの種々の組織または腫瘍が、マウスの、また
はハムスターの胎児細胞と交差反応する能力と、正確に
相関していた（表３）。
a. 表示した吸着標的細胞を用いて、モノクロナール上
清の吸着を１回行ない、12dmfc細胞標的を用いた固相EL
ISAにより特異性を測定した。
清の吸着を１回行ない、12dmfc細胞標的を用いた固相EL
ISAにより特異性を測定した。
b. 非酵素的方法で細胞を懸濁し、PBS中のBSA（１％）
を用いて処理することにより、吸着標的細胞を調製し
た。（EA+）＝Ｔ−リンパ球介在腫瘍耐性を活性化する
ことが知られている細胞系。（EA-）＝腫瘍耐性を活性
化することが証明されていない細胞。アセトンで抽出し
た胎児組織または成熟組織を用いて、同一の結果を得る
ことができた。
を用いて処理することにより、吸着標的細胞を調製し
た。（EA+）＝Ｔ−リンパ球介在腫瘍耐性を活性化する
ことが知られている細胞系。（EA-）＝腫瘍耐性を活性
化することが証明されていない細胞。アセトンで抽出し
た胎児組織または成熟組織を用いて、同一の結果を得る
ことができた。
c. EA+の12dmfcsに関する免疫過ELISAに使用する前
に、モノクロナール上清および圧縮した吸着標的細胞を
同量ずつ混合し、37℃にて１時間、インキユベーシヨン
し、４℃にて18時間インキユベーシヨンした。
に、モノクロナール上清および圧縮した吸着標的細胞を
同量ずつ混合し、37℃にて１時間、インキユベーシヨン
し、４℃にて18時間インキユベーシヨンした。
d. ＋は、１回の吸着試験で490nmにおいて、抗体の〉4
00OD単位の完全な吸着を示している。−は、ELISA反応
で、12dmfc標的細胞を用いると、抗体反応性が〉350OD
ユニツト残る１回の吸着試験において、400ODユニツト
の抗体が吸着されないことを示している。NTは試験を行
なつていないことを示している。
00OD単位の完全な吸着を示している。−は、ELISA反応
で、12dmfc標的細胞を用いると、抗体反応性が〉350OD
ユニツト残る１回の吸着試験において、400ODユニツト
の抗体が吸着されないことを示している。NTは試験を行
なつていないことを示している。
e. 試験せず。
上清を含んでいるMc抗体は、異種の、LVGハムスターの1
0d. EA+胎児標的細胞と強く反応するが、これらげつ歯
類の成熟組織とは反応しなかつた（表３）。使用した最
も初期の上清は、定量的SP ELISA分析において、1:512
または、それ以上のMc抗体価を有していた。新しい成熟
げつ歯類組織およびアセトンで抽出した成熟組織（組織
とは、脳、肺、心臓、脾臓、または腎臓細胞である）は
両方ともについて試験を行ない、種々のMc上清から抗体
を除去することができなかつた。５つの培養系の各々か
ら得たMc抗体もまた、EI分析により、EA+ SV40−誘導ま
たは形質転換WF5−１細胞、GD−36およびmKSA細胞と反
応した（表３）が、長期、イン・ビトロで培養したＬ−
細胞（マウス）および接触阻害したBHK（ハムスター）
細胞とは反応しなかつた。
0d. EA+胎児標的細胞と強く反応するが、これらげつ歯
類の成熟組織とは反応しなかつた（表３）。使用した最
も初期の上清は、定量的SP ELISA分析において、1:512
または、それ以上のMc抗体価を有していた。新しい成熟
げつ歯類組織およびアセトンで抽出した成熟組織（組織
とは、脳、肺、心臓、脾臓、または腎臓細胞である）は
両方ともについて試験を行ない、種々のMc上清から抗体
を除去することができなかつた。５つの培養系の各々か
ら得たMc抗体もまた、EI分析により、EA+ SV40−誘導ま
たは形質転換WF5−１細胞、GD−36およびmKSA細胞と反
応した（表３）が、長期、イン・ビトロで培養したＬ−
細胞（マウス）および接触阻害したBHK（ハムスター）
細胞とは反応しなかつた。
抗体の各々が、第２の３カ月間のヒト胎児を、新たにホ
モジネートしたものにより吸着されるのは最も興味深い
（表３）。新しい、培養していない包皮細胞またはヒト
末梢血リンパ球の新しい、またはアセトン粉末はMc抗体
を吸着することができなかつた（表３）。
モジネートしたものにより吸着されるのは最も興味深い
（表３）。新しい、培養していない包皮細胞またはヒト
末梢血リンパ球の新しい、またはアセトン粉末はMc抗体
を吸着することができなかつた（表３）。
凍結によるEAの保存 12dmfcsを用いて、短期間、高投与量の免疫手順で感作
したマウスから得たクローン化していないハイブリドー
マの上清の最初にスクリーニングにおいて、新しく得た
胎児細胞を、イン・ビトロにて増殖溶媒中で24時間培養
した２つの胎児細胞と比較した場合、特定の上清の活性
のパターンに著しい変化が検出されるのに気づいた。具
体的に述べると、12dmfsに対するクローン化していない
ハイブリドーマからのIgMを含んでいる反応上清の多く
において、ELISA反応活性の程度が有意に変化する
（2+、3+の数字の反応性のコロニーが０または+1の数字
の反応性のコロニーに変化する）ことが検出された。第
４図に示すように、13dmfcsを、−70℃にて１カ月間凍
結したものを急速に解凍したものを用いると、EI ELISA
分析において、クローン化していないハイブリドーマ上
清のELISA反応性は、新しく得て、洗浄した13日mfcsを
用いて観察した場合と同じパターンおよび程度を保持し
ていた。
したマウスから得たクローン化していないハイブリドー
マの上清の最初にスクリーニングにおいて、新しく得た
胎児細胞を、イン・ビトロにて増殖溶媒中で24時間培養
した２つの胎児細胞と比較した場合、特定の上清の活性
のパターンに著しい変化が検出されるのに気づいた。具
体的に述べると、12dmfsに対するクローン化していない
ハイブリドーマからのIgMを含んでいる反応上清の多く
において、ELISA反応活性の程度が有意に変化する
（2+、3+の数字の反応性のコロニーが０または+1の数字
の反応性のコロニーに変化する）ことが検出された。第
４図に示すように、13dmfcsを、−70℃にて１カ月間凍
結したものを急速に解凍したものを用いると、EI ELISA
分析において、クローン化していないハイブリドーマ上
清のELISA反応性は、新しく得て、洗浄した13日mfcsを
用いて観察した場合と同じパターンおよび程度を保持し
ていた。
討論 同系の胚細胞を用いて３回以上注射したマウスから、安
定したハイブリドーマを得るのが難しいことはいくつか
の理由で説明できよう。EAを含む、可溶性胎児細胞抽出
物は、粗製EA+細胞抽出物を多数回注射するか、または
高濃度を注射するハムスターおよびマウスにおいて、抑
制の活性を誘導した（コギン（Coggin）、J.H.、千葉基
金シンポジウム、前記、ウエツプナーら（Weppner）、
W.A.、Cell Immunol.、54:445（1980）、ウエツプナー
（Weppner）、W.A.およびコギン（Coggin）、J. H. Can
cer Res.、40:1380（1980）、およびコギン（Coggi
n）、J.H.らJ. Natl. Cancer Inst.、72:853−862（198
4））。肉腫細胞上のEA抗原決定基に対する、腫瘍に特
異的な移植耐性に関係しているリンパ球および／または
マクロフアージに対して、この抑制活性が検出された。
雌性げつ歯類においては、放射能を照射した同系の胎児
細胞を用いて、直接免疫した場合、SV40肉腫細胞と交差
反応するEAsに対する細胞増殖抑制性IgGが発達すること
が発見されたが、腫瘍耐性は発達せず、たぶん、これら
の条件下では、雌性げつ歯類は細胞毒性エフエクターＴ
細胞も発達しなかつた（アムブローゼら（Ambrose 、K.
R. et al.）、J. Immunol.、105:524（1970）、コギン
J. H. Cancer Res.、39:2952（1979）、アリエら（Iri
e、R. F. et al.）J. Natl. Cancer Inst.、63:367（19
79））。放射線照射した12dmfcsを用いて免疫したBalb/
c雄有マウスの場合の様に、妊娠Balb/cマウスは、抗−E
Aを産生するハイブリドーマを産生できなかつた。ハム
スターの場合も、また、放射線照射した胎児細胞を用い
て免疫した場合、ハイブリドーマを産生できなかつた。
ハムスターおよびマウスの胎児細胞表面上に存在するEA
sは、通常、特徴付けるのが難しかつた。これらの抗原
決定基は、一定の胚または胎児の発達段階に対して、相
（期）−特異的であつた。胎児細胞はイン・ビトロ培養
に対しては抗原を発現するのを停止した（アリエら（Ir
ie、R. F. et al.）、J. Natl. Cancer Inst.、63:367
（1979）：ヘルストロームら（Hellstrom、I. et a
l.）、Inter. J. Cancer、7:1:10（1971）およびレツフ
エル（Leffell）、M.S.およびコギン（Coggin）、J.
H.、Cancer Res.、37:4112（1977）が、まれに例外はあ
つた（ツイング（Ting）、C.C.ら、In Vitro、14:207
（1978））。ツイング（Ting）（前述）がSV40形質転換
標的細胞を用いて示唆した様に、Balb/cマウスは同系の
胎児感作に対して応答性が乏しいことが証明された。
定したハイブリドーマを得るのが難しいことはいくつか
の理由で説明できよう。EAを含む、可溶性胎児細胞抽出
物は、粗製EA+細胞抽出物を多数回注射するか、または
高濃度を注射するハムスターおよびマウスにおいて、抑
制の活性を誘導した（コギン（Coggin）、J.H.、千葉基
金シンポジウム、前記、ウエツプナーら（Weppner）、
W.A.、Cell Immunol.、54:445（1980）、ウエツプナー
（Weppner）、W.A.およびコギン（Coggin）、J. H. Can
cer Res.、40:1380（1980）、およびコギン（Coggi
n）、J.H.らJ. Natl. Cancer Inst.、72:853−862（198
4））。肉腫細胞上のEA抗原決定基に対する、腫瘍に特
異的な移植耐性に関係しているリンパ球および／または
マクロフアージに対して、この抑制活性が検出された。
雌性げつ歯類においては、放射能を照射した同系の胎児
細胞を用いて、直接免疫した場合、SV40肉腫細胞と交差
反応するEAsに対する細胞増殖抑制性IgGが発達すること
が発見されたが、腫瘍耐性は発達せず、たぶん、これら
の条件下では、雌性げつ歯類は細胞毒性エフエクターＴ
細胞も発達しなかつた（アムブローゼら（Ambrose 、K.
R. et al.）、J. Immunol.、105:524（1970）、コギン
J. H. Cancer Res.、39:2952（1979）、アリエら（Iri
e、R. F. et al.）J. Natl. Cancer Inst.、63:367（19
79））。放射線照射した12dmfcsを用いて免疫したBalb/
c雄有マウスの場合の様に、妊娠Balb/cマウスは、抗−E
Aを産生するハイブリドーマを産生できなかつた。ハム
スターの場合も、また、放射線照射した胎児細胞を用い
て免疫した場合、ハイブリドーマを産生できなかつた。
ハムスターおよびマウスの胎児細胞表面上に存在するEA
sは、通常、特徴付けるのが難しかつた。これらの抗原
決定基は、一定の胚または胎児の発達段階に対して、相
（期）−特異的であつた。胎児細胞はイン・ビトロ培養
に対しては抗原を発現するのを停止した（アリエら（Ir
ie、R. F. et al.）、J. Natl. Cancer Inst.、63:367
（1979）：ヘルストロームら（Hellstrom、I. et a
l.）、Inter. J. Cancer、7:1:10（1971）およびレツフ
エル（Leffell）、M.S.およびコギン（Coggin）、J.
H.、Cancer Res.、37:4112（1977）が、まれに例外はあ
つた（ツイング（Ting）、C.C.ら、In Vitro、14:207
（1978））。ツイング（Ting）（前述）がSV40形質転換
標的細胞を用いて示唆した様に、Balb/cマウスは同系の
胎児感作に対して応答性が乏しいことが証明された。
本明細書中に記載した様に、C57Bl/6nマウスは、Ｘ線
（5000R）で不活性化した同系の胎児細胞を用いて免疫
した場合、EAに対する抗体を産生する安定したハイブリ
ドーマを多く誘導するのに成功した。最も効果的な免疫
方法は、短期間の免疫計画にて、同系の宿主を胎児細胞
に対して感作することであつた。
（5000R）で不活性化した同系の胎児細胞を用いて免疫
した場合、EAに対する抗体を産生する安定したハイブリ
ドーマを多く誘導するのに成功した。最も効果的な免疫
方法は、短期間の免疫計画にて、同系の宿主を胎児細胞
に対して感作することであつた。
無作為に抽出した最初の７つのハイブリドーマから、ク
ローニングにより、５つの安定なMcを産生した。無傷の
胎児細胞に対して誘導したMc抗体はすべて、IgM生産体
であつた。短期間の、および長期間の両方の方法におい
て、雄性マウスを、無傷の、放射線照射した胎児細胞に
対して感作して誘導したハイブリドーマは、すべて、Ig
M産生体のみを産することが、続いて観察された。IgGを
産生するハイブリドーマは、無傷のEA+胎児細胞ではな
く、可溶化した（3M KCl）胎児細胞抽出物を受容してい
るマウスのみから誘導することができた。このことが、
全胎児細胞に対して産生されるすべてのハイブリドーマ
にとつて完全な発見となるかどうかは不明であるが、数
ダースの異なるハイブリドーマのコロニーを調べた今の
ところの結果では、IgMを生産するMcのみが産生した。
ローニングにより、５つの安定なMcを産生した。無傷の
胎児細胞に対して誘導したMc抗体はすべて、IgM生産体
であつた。短期間の、および長期間の両方の方法におい
て、雄性マウスを、無傷の、放射線照射した胎児細胞に
対して感作して誘導したハイブリドーマは、すべて、Ig
M産生体のみを産することが、続いて観察された。IgGを
産生するハイブリドーマは、無傷のEA+胎児細胞ではな
く、可溶化した（3M KCl）胎児細胞抽出物を受容してい
るマウスのみから誘導することができた。このことが、
全胎児細胞に対して産生されるすべてのハイブリドーマ
にとつて完全な発見となるかどうかは不明であるが、数
ダースの異なるハイブリドーマのコロニーを調べた今の
ところの結果では、IgMを生産するMcのみが産生した。
最初の試験においては、無傷の胎児細胞に対して作成し
たハイブリドーマは、マウス脾臓細胞の培養層上の初期
の２次培養段階において消滅することが多かつた。RAW2
64.7細胞系などのマクロフアージから得た上清を、移転
溶媒に補充することにより、すぐれたハイブリドーマの
２次培養の生き残りを得て、IgMを生産するハイブリド
ーマを効果的にクローニングすることができた。培養マ
ウス脾臓細胞は、そのままでは、他の抗原に対するハイ
ブリドーマを得るのに有用ではなかつた。RAW培養液を
補充することは以前に報告がなく、培養細胞層を用いる
よりも、より容易に行うことができた。RAW264.7細胞
が、IgM−ハイブリドーマ産生細胞に必要な成育因子
（群）を提出しているのは明らかである。過したRAW
細胞上清を使用することにより、正常のマウス脾臓細胞
をハイブリドーマ培養に加えることによる潜在的汚染物
質源が除去された。
たハイブリドーマは、マウス脾臓細胞の培養層上の初期
の２次培養段階において消滅することが多かつた。RAW2
64.7細胞系などのマクロフアージから得た上清を、移転
溶媒に補充することにより、すぐれたハイブリドーマの
２次培養の生き残りを得て、IgMを生産するハイブリド
ーマを効果的にクローニングすることができた。培養マ
ウス脾臓細胞は、そのままでは、他の抗原に対するハイ
ブリドーマを得るのに有用ではなかつた。RAW培養液を
補充することは以前に報告がなく、培養細胞層を用いる
よりも、より容易に行うことができた。RAW264.7細胞
が、IgM−ハイブリドーマ産生細胞に必要な成育因子
（群）を提出しているのは明らかである。過したRAW
細胞上清を使用することにより、正常のマウス脾臓細胞
をハイブリドーマ培養に加えることによる潜在的汚染物
質源が除去された。
細胞表面上の本来のEAと反応する抗−胎児Mc抗体を産生
するハイブリドーマをスクリーニングするために、初産
の母体から新しく得た無傷の妊娠中期の胎児細胞を用い
ることができるのは、マイクロフアルトTM装置の大きな
利点であつた：標的細胞はグルタルアルデヒドを用いて
固定する必要がなく、ポリ−Ｌ−リジンで前処理して、
プレート上で遠心分離して付着しておく必要もなかつ
た。新しく組織から得た細胞をプロセスに用い、数分以
内に再使用可能マイクロフアルトTMフイルターに適用
し、ハイブリドーマ上清の大量のスクリーニングを、３
時間以内で完了した。他のタイプの細胞表面抗原に対す
るIgGを産生するヒトのハイブリドーマをスクリーニン
グする類似の方法が、最近、グラシイ（Glassy）ら（J.
Immuno. Methods、58:119（1983））により報告され
た。
するハイブリドーマをスクリーニングするために、初産
の母体から新しく得た無傷の妊娠中期の胎児細胞を用い
ることができるのは、マイクロフアルトTM装置の大きな
利点であつた：標的細胞はグルタルアルデヒドを用いて
固定する必要がなく、ポリ−Ｌ−リジンで前処理して、
プレート上で遠心分離して付着しておく必要もなかつ
た。新しく組織から得た細胞をプロセスに用い、数分以
内に再使用可能マイクロフアルトTMフイルターに適用
し、ハイブリドーマ上清の大量のスクリーニングを、３
時間以内で完了した。他のタイプの細胞表面抗原に対す
るIgGを産生するヒトのハイブリドーマをスクリーニン
グする類似の方法が、最近、グラシイ（Glassy）ら（J.
Immuno. Methods、58:119（1983））により報告され
た。
さらに、固定した胎児細胞または、胎児細胞膜のどちら
かを分析するためのSP ELISA（第１図）が発達し、粗製
の組織を用いて、EAに対する抗体の定量的吸着特異性分
析を行なうことが可能になつた。EAまたはOFA発現に対
して評価された組織を、イン・ビトロ培養、すなわち、
原発性腫瘍組織の、または正常組織のスクリーニングに
おける明らかな利点、を用いることなく分析することが
できるということは重要な点である。SP ELISAの手順
は、鋭敏であり、かつ、高度の再生産性も有していた。
かを分析するためのSP ELISA（第１図）が発達し、粗製
の組織を用いて、EAに対する抗体の定量的吸着特異性分
析を行なうことが可能になつた。EAまたはOFA発現に対
して評価された組織を、イン・ビトロ培養、すなわち、
原発性腫瘍組織の、または正常組織のスクリーニングに
おける明らかな利点、を用いることなく分析することが
できるということは重要な点である。SP ELISAの手順
は、鋭敏であり、かつ、高度の再生産性も有していた。
ヒト胎児（表３）と同じく、妊娠中期のハムスターで発
現される進化的に保存されて来た抗原決定期を、同系の
マウス胎児中のEAに対して誘導したマウスMc抗体を用い
て検出することは、腫瘍耐性を授与する場合における、
これらの胎児細胞のタイプの免疫原性に関連した以前の
発現と並行している（前述）。吸着分析によつても、ま
た、成熟組織からの免疫沈殿法（ミユラーら（Muller
R.）、ネーチヤー、229:640（1982））によつても、こ
れらの種の妊娠満期の胎児細胞または成人組織では、同
様の交差反応性パターンは検出されなかつた。このこと
は、真のEA胚−胎児特異抗原に対してのMc抗体の特異性
を示している。
現される進化的に保存されて来た抗原決定期を、同系の
マウス胎児中のEAに対して誘導したマウスMc抗体を用い
て検出することは、腫瘍耐性を授与する場合における、
これらの胎児細胞のタイプの免疫原性に関連した以前の
発現と並行している（前述）。吸着分析によつても、ま
た、成熟組織からの免疫沈殿法（ミユラーら（Muller
R.）、ネーチヤー、229:640（1982））によつても、こ
れらの種の妊娠満期の胎児細胞または成人組織では、同
様の交差反応性パターンは検出されなかつた。このこと
は、真のEA胚−胎児特異抗原に対してのMc抗体の特異性
を示している。
げつ歯類のSV40−誘導肉腫またはリンパ腫（EA+である
ことが知られている）に対しては異なつた結合反応性ま
たは吸着反応性があり、マウスＬ細胞とBHK−21細胞に
対しては結合反応性または吸着反応性がないという観察
は、今まで試験した５つのMcを用いて検出したEAの、腫
瘍に特異的な抑制能力または分散能力を示している。種
々の研究の結果（コギンら（Coggin、J. H. et al.）、
J. Natl. Cancer. Inst.、72:853−862:ローゼンベルグ
（Rosenberg）、S.A.ヒト癌抗原の血清学的分析、S.A.
ローゼンベルグ（編者）（アカデミツク・プレス、ニユ
ーヨーク）：およびブラウンら（Brown）、J. P. et a
l.）、J. Immunol.、127:539（1981））は、特定のEA
（OFA）は、特定の腫瘍の組織学上のクラスに制限され
る可能性を支持しているが、ヒト腫瘍上の共通のEAにつ
いての報告が、サリナズ（Salinas）ら「ヒト癌抗原の
血清学的分析」、S.A.ローゼンベルグ（Rosenberg）
（編者）（アカデミツク・プレス、ニユーヨーク）539
−564ページ、ブラウンら（Brown）、（J. Immunol.、1
27:539）、ジオルンバル（Jornvall）ら、（Proc. Nat
l. Acad. Sci.（US）、79:287−291（1981）およびガラ
ナテクら（Granatek）、（サイエンス、224:1198−1206
（1984））らによつてなされている。ヒト胎児は、大部
分の報告によれば、外因性のポリクロナール、およびこ
れらのOFAに対するMc Igsと反応し、また本発明のMc抗
体とも反応した。ポリクロナールの抗−12日マウス胎児
細胞または10日ハムスター胎児細胞によつて免疫沈降し
た、いくつかのポリペプチドを含んでいるEA種は、各
々、選択的に、SV40−誘導肉腫およびAdv.7−誘導肉腫
の間に分布していた。これらの肉腫は、SV40肉腫に対し
て交差した防衛免疫がないことを示している化学的に誘
導した肉腫の間では検出されない共通のOFAを共有して
いることが知られていた。160、45−48および23KDの種
類を含んでいる３つのポリペプチドは、SV40およびAdv.
7肉腫細胞に共通であることが発見された（ヒルストロ
ームら（Hillstrom）、I. et al.、Inter. J. Cancer、
7:1:10およびウエプナーら（Weppner）、W. A. et a
l.、Cell. Immunol.、54−445（1980））。
ことが知られている）に対しては異なつた結合反応性ま
たは吸着反応性があり、マウスＬ細胞とBHK−21細胞に
対しては結合反応性または吸着反応性がないという観察
は、今まで試験した５つのMcを用いて検出したEAの、腫
瘍に特異的な抑制能力または分散能力を示している。種
々の研究の結果（コギンら（Coggin、J. H. et al.）、
J. Natl. Cancer. Inst.、72:853−862:ローゼンベルグ
（Rosenberg）、S.A.ヒト癌抗原の血清学的分析、S.A.
ローゼンベルグ（編者）（アカデミツク・プレス、ニユ
ーヨーク）：およびブラウンら（Brown）、J. P. et a
l.）、J. Immunol.、127:539（1981））は、特定のEA
（OFA）は、特定の腫瘍の組織学上のクラスに制限され
る可能性を支持しているが、ヒト腫瘍上の共通のEAにつ
いての報告が、サリナズ（Salinas）ら「ヒト癌抗原の
血清学的分析」、S.A.ローゼンベルグ（Rosenberg）
（編者）（アカデミツク・プレス、ニユーヨーク）539
−564ページ、ブラウンら（Brown）、（J. Immunol.、1
27:539）、ジオルンバル（Jornvall）ら、（Proc. Nat
l. Acad. Sci.（US）、79:287−291（1981）およびガラ
ナテクら（Granatek）、（サイエンス、224:1198−1206
（1984））らによつてなされている。ヒト胎児は、大部
分の報告によれば、外因性のポリクロナール、およびこ
れらのOFAに対するMc Igsと反応し、また本発明のMc抗
体とも反応した。ポリクロナールの抗−12日マウス胎児
細胞または10日ハムスター胎児細胞によつて免疫沈降し
た、いくつかのポリペプチドを含んでいるEA種は、各
々、選択的に、SV40−誘導肉腫およびAdv.7−誘導肉腫
の間に分布していた。これらの肉腫は、SV40肉腫に対し
て交差した防衛免疫がないことを示している化学的に誘
導した肉腫の間では検出されない共通のOFAを共有して
いることが知られていた。160、45−48および23KDの種
類を含んでいる３つのポリペプチドは、SV40およびAdv.
7肉腫細胞に共通であることが発見された（ヒルストロ
ームら（Hillstrom）、I. et al.、Inter. J. Cancer、
7:1:10およびウエプナーら（Weppner）、W. A. et a
l.、Cell. Immunol.、54−445（1980））。
得られた胎児中において、抗原活性と同様に免疫原性活
性が消失することは、いくつかの胎児抗原決定基に対し
ては迅速で、完全であるらしい。イン・ビトロにてほん
の数時間の培養後に、EA+胎児細胞が、そのEA+腫瘍細胞
に対する細胞性免疫の活性化能力を、失うことが示さ
れ、培養前に致死量の放射線照射を行なわない場合は、
EA+胎児細胞は完全に免疫原性がなかつた（コギン（Cog
gin）、J.H.およびアンダーソン（Anderson）、N.G.、C
ancer Res.、40:1568（1980）およびコギン（Coggi
n）、J.H.およびアムブローゼ（Ambrose）、K.R.、Meth
od in Cancer Research（W.H.フイツシユマン（Fishma
n）およびH.ブツシユ（Busch、編者）、XVIII巻、371−
389ページ（アカデミツク・プレス、ニユーヨー
ク））。ハイブリドーマ上清およびEI分析を用いた本明
細書中に示した結果（第３図）は、標的12日妊娠マウス
胎児細胞を、短期間（24時間）培養した後に行なつた結
果であるが、この以前の観察と一致した。
性が消失することは、いくつかの胎児抗原決定基に対し
ては迅速で、完全であるらしい。イン・ビトロにてほん
の数時間の培養後に、EA+胎児細胞が、そのEA+腫瘍細胞
に対する細胞性免疫の活性化能力を、失うことが示さ
れ、培養前に致死量の放射線照射を行なわない場合は、
EA+胎児細胞は完全に免疫原性がなかつた（コギン（Cog
gin）、J.H.およびアンダーソン（Anderson）、N.G.、C
ancer Res.、40:1568（1980）およびコギン（Coggi
n）、J.H.およびアムブローゼ（Ambrose）、K.R.、Meth
od in Cancer Research（W.H.フイツシユマン（Fishma
n）およびH.ブツシユ（Busch、編者）、XVIII巻、371−
389ページ（アカデミツク・プレス、ニユーヨー
ク））。ハイブリドーマ上清およびEI分析を用いた本明
細書中に示した結果（第３図）は、標的12日妊娠マウス
胎児細胞を、短期間（24時間）培養した後に行なつた結
果であるが、この以前の観察と一致した。
時間を一致させた同系のマウスを増殖する効力が悪いた
めに、ルーチン分析用に、特定の妊娠時期の胎児細胞の
一定な供給を得ることは重要であり、困難である。胎児
細胞が、少数の、時間を一致させた妊娠供与体から、分
析用として用いることができる場合、その胎児細胞は特
定の日の実験に必要とされるよりも豊富であることが多
かつた。将来使用するために、過剰の胎児細胞を凍結す
る能力は、これらの得難い、高価な細胞の無駄をなく
す。また、グルタルアルデヒドで固定した胎児細胞は、
固相分析における感受性を減ずることなしに、４℃に
て、１週間、保存することができることがわかつた。
めに、ルーチン分析用に、特定の妊娠時期の胎児細胞の
一定な供給を得ることは重要であり、困難である。胎児
細胞が、少数の、時間を一致させた妊娠供与体から、分
析用として用いることができる場合、その胎児細胞は特
定の日の実験に必要とされるよりも豊富であることが多
かつた。将来使用するために、過剰の胎児細胞を凍結す
る能力は、これらの得難い、高価な細胞の無駄をなく
す。また、グルタルアルデヒドで固定した胎児細胞は、
固相分析における感受性を減ずることなしに、４℃に
て、１週間、保存することができることがわかつた。
以下の実施例に報告した研究においては、抗−EAモノク
ロナール抗体と反応する胎児細胞中のポリペプチドが特
徴付けられた。表３中に例示したMc抗体の５つすべて
が、SDS−アクリルアミドゲル等電点電気泳動分析によ
り明らかに同じポリペプチドであることが示されたポリ
ペプチドと反応することは注目に値する。
ロナール抗体と反応する胎児細胞中のポリペプチドが特
徴付けられた。表３中に例示したMc抗体の５つすべて
が、SDS−アクリルアミドゲル等電点電気泳動分析によ
り明らかに同じポリペプチドであることが示されたポリ
ペプチドと反応することは注目に値する。
実施例２ 実施例１において調製したモノクロナール抗体と反応す
るポリペプチドの同定 用具および方法 腫瘍細胞 （ペイン（Payne）、W.J.およびコギン（Coggin）、J.
H.、J. Natl. Cancer Inst.（1984））に記載されてい
る方法で、金網を通してふるいにかけることにより、SV
40誘導マウス肉腫細胞（mksa）またはハムスターのリン
パ腫細胞（GD−36）を同系マウスまたはハムスターにお
ける小さな腫瘍移植から得た。
るポリペプチドの同定 用具および方法 腫瘍細胞 （ペイン（Payne）、W.J.およびコギン（Coggin）、J.
H.、J. Natl. Cancer Inst.（1984））に記載されてい
る方法で、金網を通してふるいにかけることにより、SV
40誘導マウス肉腫細胞（mksa）またはハムスターのリン
パ腫細胞（GD−36）を同系マウスまたはハムスターにお
ける小さな腫瘍移植から得た。
国際癌機関の援助を受けているアラバマ（Alabama）
（ビルミングハム（Birmingham）、アラバマ（Alabam
a））癌銀行大学から、ヒト腫瘍を、新しく凍結した原
発性腫瘍として得た。すべての腫瘍は、病理学のパネル
により組織学的に分類し、保存溶媒中に凍結した。凍結
した腫瘍のフラグメントを、さつと融解し、酵素分離せ
ずに金網を通して分散して、粗製の細胞懸濁物を調製
し、前記の様に洗浄し、前記の方法で吸着の実験に使用
した（ペイン（Payne）、W.J.およびコギン（Coggi
n）、J.H.、前述）。多くの場合、対照である正常組織
は、腫瘍に近接した組織学的に正常な組織から、また
は、そうでなければ必須の外科手術を行なう目的で傷を
つけた組織と共に除去した正常な患者の組織から得た。
（ビルミングハム（Birmingham）、アラバマ（Alabam
a））癌銀行大学から、ヒト腫瘍を、新しく凍結した原
発性腫瘍として得た。すべての腫瘍は、病理学のパネル
により組織学的に分類し、保存溶媒中に凍結した。凍結
した腫瘍のフラグメントを、さつと融解し、酵素分離せ
ずに金網を通して分散して、粗製の細胞懸濁物を調製
し、前記の様に洗浄し、前記の方法で吸着の実験に使用
した（ペイン（Payne）、W.J.およびコギン（Coggi
n）、J.H.、前述）。多くの場合、対照である正常組織
は、腫瘍に近接した組織学的に正常な組織から、また
は、そうでなければ必須の外科手術を行なう目的で傷を
つけた組織と共に除去した正常な患者の組織から得た。
モノクロナール抗体 既述した様に、同系の受容者におけるC56Bl/6nマウス胎
児に対するMc Ig、69.1、38.7、８および14を誘導し
た。Mc69.1、38.7、および８はIgMであり、無傷の胎児
細胞により刺激されたが、一方、Mc14は胎児細胞のKCl
抽出物を用いて誘導し、IgGのイソタイプであつた。固
相（SP）ELISAの手順（前述）において、12dmfcsに対し
て試験を行なうと、すべてが〉1024の抗体価を有した。
児に対するMc Ig、69.1、38.7、８および14を誘導し
た。Mc69.1、38.7、および８はIgMであり、無傷の胎児
細胞により刺激されたが、一方、Mc14は胎児細胞のKCl
抽出物を用いて誘導し、IgGのイソタイプであつた。固
相（SP）ELISAの手順（前述）において、12dmfcsに対し
て試験を行なうと、すべてが〉1024の抗体価を有した。
EAの分離および分子量の測定 抗−マウスのイムノグロブリンと組み合わせたセフアロ
ース（Sepharose）4Bの親和性ゲルカラムを用いて、胎
児性抗原（群）を分離した。各々のMcの、２週間齢の、
高密培養上清を、洗浄し平衡化した親和性ゲルと混合
し、４℃にて、12時間インキユベーシヨンした。そのゲ
ルを、トリス緩衝生理食塩水（TBS、10mM、pH7.4）を10
0×の体積を用いて洗浄し、標準NP40（40μg/0.1ml、5m
l）を、または12dmfcsの細胞の、または成熟細胞のKCl
抽出物（10μg/0.1ml、5ml）を、そのゲルと混合した。
ース（Sepharose）4Bの親和性ゲルカラムを用いて、胎
児性抗原（群）を分離した。各々のMcの、２週間齢の、
高密培養上清を、洗浄し平衡化した親和性ゲルと混合
し、４℃にて、12時間インキユベーシヨンした。そのゲ
ルを、トリス緩衝生理食塩水（TBS、10mM、pH7.4）を10
0×の体積を用いて洗浄し、標準NP40（40μg/0.1ml、5m
l）を、または12dmfcsの細胞の、または成熟細胞のKCl
抽出物（10μg/0.1ml、5ml）を、そのゲルと混合した。
被験組織のまたは細胞の圧縮した細胞小球を、PMSF（1m
M）を含むリン酸緩衝生理食塩水中のNP40（0.5％、容量
10×）を用いて処理して、細胞の抽出物を調製した。25
℃にて１時間後、細胞を1500rpmsにおいて小球にし、そ
の後、その上清を遠心分離（50,000×ｇ、30分間）し
た。抽出物および親和性ゲルを、４℃にて12−15時間、
インキユベーシヨンし、次に、洗浄液中に、たん白質が
検出されなくなるまで、抽出緩衝液中で洗浄した。KCl
抽出物は、前記の如く作成した。
M）を含むリン酸緩衝生理食塩水中のNP40（0.5％、容量
10×）を用いて処理して、細胞の抽出物を調製した。25
℃にて１時間後、細胞を1500rpmsにおいて小球にし、そ
の後、その上清を遠心分離（50,000×ｇ、30分間）し
た。抽出物および親和性ゲルを、４℃にて12−15時間、
インキユベーシヨンし、次に、洗浄液中に、たん白質が
検出されなくなるまで、抽出緩衝液中で洗浄した。KCl
抽出物は、前記の如く作成した。
次に、基本容量と同じ容量の5M MgCl2を用いて、１時
間、その抗体−抗原−セフアロース4B複合体を容離し
た。このステツプを再び繰り返した。得られた溶離液
を、TBS（容量100×）を用いて透析し、SDS−PAGEに使
用した。その溶離液を、トリス（12.5mM）中にSDS（2.5
％）、尿素（1.25mM）、およびＢ−メルカプトエタノー
ル（１％）を可溶化した緩衝液を用いて処理した。次
に、このサンプルを、ラエミリー（Laemmili）の不連続
緩衝液システムを用いたアクリルアミド勾配スラブゲル
（20％から７％、底から頂上）において等電点電気泳動
を行なつた。等電点電気泳動後、そのゲルを、酢酸：メ
タノール：水（7:40:53）中のコマシイ（Commasie）青
Ｒ−250（バイオラドラブズ（Bio Rad Labs）、インコ
ーポレーテイド（Incorporated）、リツチモンド（Rich
mond）、バージニア（Virginia））を用いて染色し、後
者の溶液中で脱色した。
間、その抗体−抗原−セフアロース4B複合体を容離し
た。このステツプを再び繰り返した。得られた溶離液
を、TBS（容量100×）を用いて透析し、SDS−PAGEに使
用した。その溶離液を、トリス（12.5mM）中にSDS（2.5
％）、尿素（1.25mM）、およびＢ−メルカプトエタノー
ル（１％）を可溶化した緩衝液を用いて処理した。次
に、このサンプルを、ラエミリー（Laemmili）の不連続
緩衝液システムを用いたアクリルアミド勾配スラブゲル
（20％から７％、底から頂上）において等電点電気泳動
を行なつた。等電点電気泳動後、そのゲルを、酢酸：メ
タノール：水（7:40:53）中のコマシイ（Commasie）青
Ｒ−250（バイオラドラブズ（Bio Rad Labs）、インコ
ーポレーテイド（Incorporated）、リツチモンド（Rich
mond）、バージニア（Virginia））を用いて染色し、後
者の溶液中で脱色した。
リンパ球幼若化活性の評価 12dmfcsのKCl抽出物を与えた場合、EA陽性であり、刺激
をうけることが知られている、放射線照射を受けたmKsa
細胞に対して感作した脾臓細胞を用いて、リンパ球の形
質転換の分析（LTA）を行なつた。成熟マウス細胞のKCl
抽出物は、刺激を与える物質ではなかつた。LTAにおけ
る分析の条件は、ウエプナー（Weppner）、W.A.および
コギン（Coggin）、J.H.、Cell Immunol.、54:193（198
0）に報告があつた。抽出物を0.01〜0.05g使用して、最
大の刺激を達成し、その刺激インデツクスの推定は記載
した如くであった。
をうけることが知られている、放射線照射を受けたmKsa
細胞に対して感作した脾臓細胞を用いて、リンパ球の形
質転換の分析（LTA）を行なつた。成熟マウス細胞のKCl
抽出物は、刺激を与える物質ではなかつた。LTAにおけ
る分析の条件は、ウエプナー（Weppner）、W.A.および
コギン（Coggin）、J.H.、Cell Immunol.、54:193（198
0）に報告があつた。抽出物を0.01〜0.05g使用して、最
大の刺激を達成し、その刺激インデツクスの推定は記載
した如くであった。
結果 Mcに特異的なポリペプチドの分離 ３つのIgM McのIg（69.1、38.7および８）およびIgG Mc
のIgは、すべてポリペプチド（44−48KD）とともに、よ
り大きなポリペプチドの重合体（200KD）とも選択的に
結合することが観察された。そのたん白質（46KD）は、
胎児細胞の抽出物中にのみ検出され、成熟マウスの組織
（筋肉、皮膚、肝臓、脾臓、心臓、腸、脳、を含んでい
る）中、またはC57BL/6nマウスの19−21日胎児の動物全
体のホモジネート中には存在しなかつた。12−13dmfcs
の胎児抽出物中に存在している濃度の25倍に濃縮した成
熟抽出物を使用した場合でさえ、この結果は同じであっ
た。
のIgは、すべてポリペプチド（44−48KD）とともに、よ
り大きなポリペプチドの重合体（200KD）とも選択的に
結合することが観察された。そのたん白質（46KD）は、
胎児細胞の抽出物中にのみ検出され、成熟マウスの組織
（筋肉、皮膚、肝臓、脾臓、心臓、腸、脳、を含んでい
る）中、またはC57BL/6nマウスの19−21日胎児の動物全
体のホモジネート中には存在しなかつた。12−13dmfcs
の胎児抽出物中に存在している濃度の25倍に濃縮した成
熟抽出物を使用した場合でさえ、この結果は同じであっ
た。
親和性ゲルから得た溶離液中に存在する他のバンドは、
加えたモノクロナール抗体からのIgMの軽鎖＋Ｊ鎖（20
−23KD）、サンドイツチ親和性ゲルにて、マウスMc IgM
と結合するために用いたIgGからの重鎖（57KD）、血清
アルブミン（70KD）、およびIgM重鎖（75KD）であり、
これらと共に、たぶんEAたん白質モノマー（46KD）の重
合体である胎児に特異的なポリペプチド（200KD）があ
つた。親和性ゲルから得た抗体のフラグメントは、予期
されたように、胎児の親和ゲルを表わすレーンと同じ
く、成熟親和ゲルを表わすレーンの両方に存在してい
た。加えたEA特異性Mc Igに対しての、ポリペプチド（4
6KDおよび200KD）が結合している親和性ゲルの特異性
を、モロネイ（Moloney）肉腫ウイルス抗原決定基グリ
コプロテイン（MSV）に対して特異的であることが知ら
れている関連性のないマウスMc IgMを用いて証明したこ
とは重要であつた。
加えたモノクロナール抗体からのIgMの軽鎖＋Ｊ鎖（20
−23KD）、サンドイツチ親和性ゲルにて、マウスMc IgM
と結合するために用いたIgGからの重鎖（57KD）、血清
アルブミン（70KD）、およびIgM重鎖（75KD）であり、
これらと共に、たぶんEAたん白質モノマー（46KD）の重
合体である胎児に特異的なポリペプチド（200KD）があ
つた。親和性ゲルから得た抗体のフラグメントは、予期
されたように、胎児の親和ゲルを表わすレーンと同じ
く、成熟親和ゲルを表わすレーンの両方に存在してい
た。加えたEA特異性Mc Igに対しての、ポリペプチド（4
6KDおよび200KD）が結合している親和性ゲルの特異性
を、モロネイ（Moloney）肉腫ウイルス抗原決定基グリ
コプロテイン（MSV）に対して特異的であることが知ら
れている関連性のないマウスMc IgMを用いて証明したこ
とは重要であつた。
この関連性のないMc Igは、前記のMcを用いて検出した
ポリペプチドを生産する抗原決定基のいずれとも結合し
なかつた。
ポリペプチドを生産する抗原決定基のいずれとも結合し
なかつた。
MC 69.1の濃縮物（25×）を調製し、前記の親和性ゲル
を用いて、12dmfcsのKCl抽出物（たん白質、500μｇ）
を吸着するのに使用した。Mc IgMにより除去した結合EA
を用いて、その抽出物をゲルから回収し、それの元の体
積にまで濃縮した。サンプルを、SDS−PAGE分析により
再評価し、元のKCl抽出物と比較した。すべての検出可
能なバンド（46KDおよび200KD）を除去したことをこの
結果は示した。
を用いて、12dmfcsのKCl抽出物（たん白質、500μｇ）
を吸着するのに使用した。Mc IgMにより除去した結合EA
を用いて、その抽出物をゲルから回収し、それの元の体
積にまで濃縮した。サンプルを、SDS−PAGE分析により
再評価し、元のKCl抽出物と比較した。すべての検出可
能なバンド（46KDおよび200KD）を除去したことをこの
結果は示した。
次に、この親和性吸着した抽出物を、LTAにて試験し、
ポリペプチド（46KD、またはそれの重合体）を除去する
と、ウエツプナー（Weppner）、W.A.およびコギン（Cog
gin）、J.H.、Cell Immunol.、54−193（1980）に記載
の如く調製したEAで感作したマウス脾臓の刺激が妨害さ
れるかどうかを調べた。その結果は表４に示したよう
に、実際に、IgMを吸着していないKCl抽出物が刺激を行
なうのにもかかわらず、IgMを吸着した抽出物はEAで感
作したリンパ球を刺激しえないことを示した。
ポリペプチド（46KD、またはそれの重合体）を除去する
と、ウエツプナー（Weppner）、W.A.およびコギン（Cog
gin）、J.H.、Cell Immunol.、54−193（1980）に記載
の如く調製したEAで感作したマウス脾臓の刺激が妨害さ
れるかどうかを調べた。その結果は表４に示したよう
に、実際に、IgMを吸着していないKCl抽出物が刺激を行
なうのにもかかわらず、IgMを吸着した抽出物はEAで感
作したリンパ球を刺激しえないことを示した。
ヒト腫瘍中の46KDたん白質 表５中に示す様に、肺の、乳の、大腸の、および直腸の
肉腫からなるヒト腫瘍のスペクトルは、12mfcsに関して
SP ELISA分析において続けて分析した場合、選択的に、
前記のMcのいくつかを吸着することが観察された。その
腫瘍が同様の腫瘍からなる数人の患者から得た、成人対
照組織および正常組織は、前記のMcを吸着しなかつた。
２つの肺の腺ガンのKCl抽出物を親和性ゲル分析する
と、両方の腫瘍において、有意に46KDのバンドが、およ
び、200KDのバンドの痕跡が示され、等しいたん白質濃
度の正常な成人組織中には、これらのポリペプチドは存
在しなかつた。
肉腫からなるヒト腫瘍のスペクトルは、12mfcsに関して
SP ELISA分析において続けて分析した場合、選択的に、
前記のMcのいくつかを吸着することが観察された。その
腫瘍が同様の腫瘍からなる数人の患者から得た、成人対
照組織および正常組織は、前記のMcを吸着しなかつた。
２つの肺の腺ガンのKCl抽出物を親和性ゲル分析する
と、両方の腫瘍において、有意に46KDのバンドが、およ
び、200KDのバンドの痕跡が示され、等しいたん白質濃
度の正常な成人組織中には、これらのポリペプチドは存
在しなかつた。
1.例示した各々の型の標準化したMc Igを、表示された
数の腫瘍細胞または、正常対照組織の混合物（脾臓、心
臓、筋肉、大腸、肺、および肝臓）を用いて、12時間吸
着を行ない、EA+12日妊娠マウス胎児細胞を用いて、固
相ELISAにて再び分析した。
数の腫瘍細胞または、正常対照組織の混合物（脾臓、心
臓、筋肉、大腸、肺、および肝臓）を用いて、12時間吸
着を行ない、EA+12日妊娠マウス胎児細胞を用いて、固
相ELISAにて再び分析した。
3.被験腫瘍の、または正常の標的細胞の吸着比（A. R）
を、例示した各々の型の標準Mc Igに対する12dmfcsのAR
と比較することにより決定した。
を、例示した各々の型の標準Mc Igに対する12dmfcsのAR
と比較することにより決定した。
討論 成熟マウス細胞の、または、マウスまたはヒトの妊娠完
了期の細胞の抽出物中においては検出されないいくつか
の抗−EA特異性Mc Igと反応性のあるマウス胎児細胞中
に、共通の46および200KDポリペプチドがこれらの結果
により確認される。このたん白質は、また、ヒトの癌ス
ペクトル中にて検出されるが、大腸、脾臓、脳、皮膚お
よび筋肉を含む、試験を行なつた正常ヒト組織中には検
出されなかつた。Mc Igのすべてによるセフアロース4B
親和性ゲル中に結合した200KDの胎児特異性ポリペプチ
ドが存在することは、Mc Igの抗原決定基が、胎児細胞
および腫瘍細胞中に、本来の形で、46KDのたん白質の重
合体にて存在しているらしいことを示唆した。
了期の細胞の抽出物中においては検出されないいくつか
の抗−EA特異性Mc Igと反応性のあるマウス胎児細胞中
に、共通の46および200KDポリペプチドがこれらの結果
により確認される。このたん白質は、また、ヒトの癌ス
ペクトル中にて検出されるが、大腸、脾臓、脳、皮膚お
よび筋肉を含む、試験を行なつた正常ヒト組織中には検
出されなかつた。Mc Igのすべてによるセフアロース4B
親和性ゲル中に結合した200KDの胎児特異性ポリペプチ
ドが存在することは、Mc Igの抗原決定基が、胎児細胞
および腫瘍細胞中に、本来の形で、46KDのたん白質の重
合体にて存在しているらしいことを示唆した。
マウスおよびヒトの胎児細胞および腫瘍細胞が、進化的
に保存された46KDおよび200KDのポリペプチドを共有し
ているという発見は大変意味深かつた。Mc IgMを用い
て、親和性クロマトグラフイーを行ない、このポリペプ
チドを選択的に除去すると、その抽出物は、EAまたは腫
瘍細胞および胎児細胞に対して感作したリンパ球に対し
て非刺激物となるというもう１つの発見も、また、興味
深い。これらのペプチドは、同系マウスおよびハムスタ
ーにおける胎児細胞またはその抽出物により誘導される
交差して保護的腫瘍移植耐性を誘導する原因となるEA決
定基を少なくともひとつ含んでいることを、この発見は
明らかに示唆している。
に保存された46KDおよび200KDのポリペプチドを共有し
ているという発見は大変意味深かつた。Mc IgMを用い
て、親和性クロマトグラフイーを行ない、このポリペプ
チドを選択的に除去すると、その抽出物は、EAまたは腫
瘍細胞および胎児細胞に対して感作したリンパ球に対し
て非刺激物となるというもう１つの発見も、また、興味
深い。これらのペプチドは、同系マウスおよびハムスタ
ーにおける胎児細胞またはその抽出物により誘導される
交差して保護的腫瘍移植耐性を誘導する原因となるEA決
定基を少なくともひとつ含んでいることを、この発見は
明らかに示唆している。
本明細書中にて、無作為に、特定の追加研究を行なうた
めに選択した５つのハイブリドーマは、出願日前に、AT
CC、ロツクビレ（Rockville）、マリーランド（Marylan
d）に、30年間、寄託した。その受諾番号は以下の通り
である： ハイブリドーマ８（また、8KClIIIで示される）:ATCC
番号 HB−8663、 ハイブリドーマ69.1（また、69.1 shIIIで示される）:A
TCC 番号 HB−8664、 ハイブリドーマ38.46（また、38.46 shIIIで示され
る）:ATCC 番号 HB−8665、 ハイブリドーマ38.7（また、38.7 shIIIで示される）:A
TCC 番号 HB−8666、および、 ハイブリドーマ115（また、115 shIIIで示される）:ATC
C 番号 HB−8667。
めに選択した５つのハイブリドーマは、出願日前に、AT
CC、ロツクビレ（Rockville）、マリーランド（Marylan
d）に、30年間、寄託した。その受諾番号は以下の通り
である： ハイブリドーマ８（また、8KClIIIで示される）:ATCC
番号 HB−8663、 ハイブリドーマ69.1（また、69.1 shIIIで示される）:A
TCC 番号 HB−8664、 ハイブリドーマ38.46（また、38.46 shIIIで示され
る）:ATCC 番号 HB−8665、 ハイブリドーマ38.7（また、38.7 shIIIで示される）:A
TCC 番号 HB−8666、および、 ハイブリドーマ115（また、115 shIIIで示される）:ATC
C 番号 HB−8667。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 15/04 8318−4Ｈ Ｃ１２Ｐ 21/08 8214−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/574 Ｅ 8310−2Ｊ 33/577 Ｂ 8310−2Ｊ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (56)参考文献 特開 昭59−5120（ＪＰ，Ａ) 特表 昭57−500195（ＪＰ，Ａ) 国際公開84／2983（ＷＯ，Ａ) Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，105（２），524 −526（1970）；132（６），2992−3004 （1984) Ａｄｖ．Ｃａｎｄｅｒ Ｒｅｓ．，19, 105−165（1974) Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ，ＵＳＡ，68（８），1748−1752 （1971) Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ（Ｒｏｃｋｖｉｌ ｅ），14（２），207−211（1978) Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，43（２）, 679−685（1983) Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，44（３）, 371−380（1981)
Claims (9)
- 【請求項１】（ｉ）げっ歯目類の妊娠中期抗原に対する
免疫応答能があり、 （ii）ヒト腫瘍胎児性腫瘍抗原に対する免疫応答能があ
り、 （iii）げっ歯目類の妊娠後期の胎児組織に対して実質
上免疫応答性がなく、 （iv）ヒト正常組織に対して実質上免疫応答性がない、 という特異性を有するモノクロナール抗体を分泌するハ
イブリドーマの調製方法であって、 （ａ）非増殖性の同系の妊娠中期胎児細胞の調製物の免
疫量でヒト以外の動物を免疫し、 （ｂ）該動物から感作したリンパ球を得、そして、 （ｃ）適切な融合条件下で、該リンパ球と不死細胞系と
を融合して、該ハイブリドーマを得ること、 からなる方法。 - 【請求項２】該ハイブリドーマを、RAW264.7マウスマク
ロファージ細胞系から得られる濾過滅菌した培養上清の
存在下で培養することからなる第１項に記載の方法。 - 【請求項３】免疫される該動物が、げっ歯目である第１
項に記載の方法。 - 【請求項４】該ハイブリドーマによって分泌された該モ
ノクロナール抗体が、げっ歯目類およびヒトの胚と胎児
細胞、および、げっ歯目並びにヒトの腫瘍細胞に対して
特異的である第１項に記載の方法。 - 【請求項５】マウスリンパ球とマウスミエローマ細胞の
融合生成物であるハイブリーマであって、 （ｉ）げっ歯目類の妊娠中期抗原に対する免疫応答能が
あり、 （ii）ヒト腫瘍胎児性腫瘍抗原に対する免疫応答能があ
り、 （iii）げっ歯目類の妊娠後期の胎児組織に対して実質
上免疫応答性がなく、 （iv）ヒト正常組織に対して実質上免疫応答性がない； という特異性を有するモノクロナール抗体を生産し、 （ａ）非増殖性の同系の妊娠中期胎児細胞の調製物の免
疫量でヒト以外の動物を免疫し、 （ｂ）該動物から感作したリンパ球を得、そして、 （ｃ）適切な融合条件下で、該リンパ球と不死細胞系と
を融合して、該ハイブリドーマを得ること、 からなる方法によって生産されるハイブリドーマ。 - 【請求項６】該モノクロナール抗体が、分子量約44,000
〜48,000ダルトンである腫瘍胎児性ポリペプチドに対し
て免疫応答性を有している第５項に記載のハイブリドー
マ。 - 【請求項７】免疫したC57BL/6nマウスから得られるリン
パ球とマウスミエローマ細胞の融合生成物である第５項
または第６項に記載のハイブリドーマ。 - 【請求項８】該モノクロナール抗体がIgMクラスに属す
る第５項または第６項に記載のハイブリドーマ。 - 【請求項９】ATCC番号HB−8663、HB−8664、HB−8665、
HB−8666またはHB−8667と同一の特性を有している第５
項に記載のハイブリドーマ。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US673794 | 1984-11-21 | ||
| US06/673,794 US4686180A (en) | 1984-11-21 | 1984-11-21 | Onco-fetal specific monoclonal antibodies, methods of preparation and use |
| PCT/US1985/002258 WO1986003223A1 (en) | 1984-11-21 | 1985-11-15 | Onco-fetal specific monoclonal antibodies, methods of preparation and use |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62501189A JPS62501189A (ja) | 1987-05-14 |
| JPH0683666B2 true JPH0683666B2 (ja) | 1994-10-26 |
Family
ID=24704144
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60505335A Expired - Lifetime JPH0683666B2 (ja) | 1984-11-21 | 1985-11-15 | 腫瘍▲下−▼胎児に特異的なモノクロナ−ル抗体の調製方法および使用方法 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4686180A (ja) |
| EP (1) | EP0203967B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0683666B2 (ja) |
| AU (1) | AU593229B2 (ja) |
| CA (1) | CA1307218C (ja) |
| DE (1) | DE3583296D1 (ja) |
| FI (1) | FI92222C (ja) |
| NO (1) | NO170691C (ja) |
| WO (1) | WO1986003223A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0859089A (ja) * | 1994-08-18 | 1996-03-05 | Towa Kogyo Kk | ボビン搬送用トレイ |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4675287A (en) * | 1984-07-26 | 1987-06-23 | Scripps Clinic And Research Foundation | Monoclonal antibody directed to human ganglioside GD2 |
| FR2571146B1 (fr) * | 1984-10-01 | 1988-02-26 | Centre Nat Rech Scient | Antigenes carcino-foetaux du pancreas humain et un procede de purification, antiserum contre ces antigenes et son procede de preparation et compositions diagnostiques les contenant |
| US5320941A (en) * | 1986-06-06 | 1994-06-14 | Dallan Young | DNA sequence encoding mas onhcogene, polypeptides encoded therefrom and diagnostic and other methods based therefrom |
| ATE432339T1 (de) | 1996-04-05 | 2009-06-15 | Univ South Alabama | Verwendung von onkofötal-antigen spezifischen cd4,cd8 zytotoxischen, suppressor t-zellen und interleukin-10 |
| US20030124125A1 (en) * | 1996-04-05 | 2003-07-03 | South Alabama Medical Science Foundation | Oncofetal antigen specific T-lymphocyte mediated immune response: manipulation and uses of oncofetal antigen specific CD4, CD8 cytotoxic and suppressor T cells and interleukin-10 |
| DE10346627A1 (de) * | 2003-10-08 | 2005-05-19 | Weiss, Stefan, PD Dr. | Single-chain-Antikörper gegen den 37 kDa/67 kDa Lamininrezeptor als Werkzeuge zur Diagnose und Therapie von Prionerkrankungen und Krebs, deren Herstellung und Verwendung |
| GB0510790D0 (en) | 2005-05-26 | 2005-06-29 | Syngenta Crop Protection Ag | Anti-CD16 binding molecules |
| US20070048795A1 (en) * | 2005-08-26 | 2007-03-01 | Xiangming Fang | Immunoaffinity separation and analysis compositions and methods |
| JP2024503933A (ja) | 2021-01-27 | 2024-01-29 | イノベント バイオロジクス（スーチョウ）カンパニー，リミティド | Ｃｄ１６ａに対する単一ドメイン抗体およびその使用 |
Citations (1)
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| JPS595120A (ja) * | 1982-06-30 | 1984-01-12 | Yuji Matsuoka | 単クロ−ン性抗ｃｅａ抗体 |
Family Cites Families (4)
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| US4440863A (en) * | 1978-02-22 | 1984-04-03 | Duke University | Breast cyst fluid protein assay |
| US4272504A (en) * | 1978-12-14 | 1981-06-09 | Abbott Laboratories | Antibody adsorbed support method for carcinoembryonic antigen assay |
| US4349528A (en) * | 1979-11-21 | 1982-09-14 | The Wistar Institute | Monocolonal hybridoma antibody specific for high molecular weight carcinoembryonic antigen |
| EP0072902B1 (de) * | 1981-08-21 | 1985-04-24 | F. HOFFMANN-LA ROCHE & CO. Aktiengesellschaft | Verfahren zur Bestimmung von carcinoembryonalem Antigen (CEA) und zur Bestimmung geeignete Antikörperlösung |
-
1984
- 1984-11-21 US US06/673,794 patent/US4686180A/en not_active Expired - Lifetime
-
1985
- 1985-11-15 WO PCT/US1985/002258 patent/WO1986003223A1/en not_active Ceased
- 1985-11-15 AU AU51964/86A patent/AU593229B2/en not_active Ceased
- 1985-11-15 DE DE8585906109T patent/DE3583296D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-11-15 JP JP60505335A patent/JPH0683666B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1985-11-15 EP EP85906109A patent/EP0203967B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-11-20 CA CA000495803A patent/CA1307218C/en not_active Expired - Lifetime
-
1986
- 1986-07-18 FI FI862978A patent/FI92222C/fi not_active IP Right Cessation
- 1986-07-18 NO NO862920A patent/NO170691C/no not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，４３（２），６７９−６８５（１９８３） |
| ＩｎＶｉｔｒｏ（Ｒｏｃｋｖｉｌｅ），１４（２），２０７−２１１（１９７８） |
| Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１０５（２），５２４−５２６（１９７０）；１３２（６），２９９２−３００４（１９８４） |
| Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ，６８（８），１７４８−１７５２（１９７１） |
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| JPH0859089A (ja) * | 1994-08-18 | 1996-03-05 | Towa Kogyo Kk | ボビン搬送用トレイ |
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| NO862920D0 (no) | 1986-07-18 |
| AU5196486A (en) | 1986-06-18 |
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| NO170691B (no) | 1992-08-10 |
| FI92222C (fi) | 1994-10-10 |
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| AU593229B2 (en) | 1990-02-08 |
| EP0203967A4 (en) | 1987-04-10 |
| WO1986003223A1 (en) | 1986-06-05 |
| NO170691C (no) | 1992-11-18 |
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| FI862978A0 (fi) | 1986-07-18 |
| FI862978L (fi) | 1986-07-18 |
| FI92222B (fi) | 1994-06-30 |
| US4686180A (en) | 1987-08-11 |
| EP0203967B1 (en) | 1991-06-19 |
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