JPH0684389B2

JPH0684389B2 - 細胞増殖促進物質ＷＡＳ−α３９１１０１

Info

Publication number: JPH0684389B2
Application number: JP60174180A
Authority: JP
Inventors: 秀男並木; 春美緒方; 直一古賀; 慎一郎楠
Original assignee: Advance KK
Current assignee: Advance KK
Priority date: 1985-08-09
Filing date: 1985-08-09
Publication date: 1994-10-26
Anticipated expiration: 2009-10-26
Also published as: JPS6236324A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、ヒト胎児由来線維芽細胞、ヒト成人皮膚由来
線維芽細胞、マウス胎児由来正常線維芽細胞、マウスリ
ンパ細胞性腹水腫瘍由来細胞等々の各種細胞に対し増殖
促進作用を有する、新規細胞増殖促進物質WAS−α39110
1及びその製法、当該物質含有細胞増殖促進剤等に関す
る。

本発明者らは、ラットやネコ等の有毛哺乳動物のフィシ
ーズ（feces）中には多量の体毛が混入していることに
着目し、その生態学的意義究明の観点から鋭意研究の結
果、哺乳動物体毛中にはヒト胎児由来線維芽細胞、ヒト
成人皮膚由来線維芽細胞、マウス胎児由来正常線維芽細
胞、マウスリンパ細胞性腹水腫瘍由来細胞等々の各種細
胞に対し強い増殖促進活性を有する生理活性物質が存在
することを知見し、更にその単離、同定に成功して本発
明に到達したものである。

すなわち、本発明物質WAS−α391101は正常細胞に対し
その形質転換を伴うことなくその細胞増殖を促進し、し
かもその作用は可逆的であるため創傷治療剤、潰瘍治療
剤、発毛促進剤等々として極めて有用なものと云いう
る。

以下、本発明物質WAS−α391101の理化学的性質、製
法、生理学的性質及び使用態様等につき詳細に分説す
る。

WAS−α391101の理化学的性質ｉ）元素分析値 C:36.02％、H:7.54％、N:14.24％及び残部酸素。

ii）紫外線吸収スペクトル添付第１図に示す通りであり、これより iii）赤外線吸収スペクトル KBr錠剤法で測定したスペクトルは添付第２図の通りで
あり、その特性吸収は、 iv）¹³C−NMRスペクトル溶媒；重水、内部標準；テトラメチルシランに於けるス
ペクトルは第３図に示す通りでありその化学シフト値は
δ（ppm）、17.391、20.750,24.975、30.177、42.747、
44.427、47.352、51.849、57.647、61.440、61.656、6
7.129、72.384、73.685、171.699、173.484及び176.900
ppm。

ｖ）融点 60℃（分解） vi）酸加水分解物のアミノ酸分析 6N塩酸を用いて20時間110℃で加水分解し、自動アミノ
酸分析計によって分析を行なったところ、第４図に示す
とおりグリシン、アラニン、セリン、スレオニンが検出
された。

vii）溶解性水に易溶。アセトニトリル、ジメチルスルホキシドに可
溶。アルコール、エーテル、クロロホルム、ベンゼンに
不溶。

viii）外観わずかに黄色味を帯びた白色あめ状。

ix）推定分子量高分解能ガスクロマトグラフィーマススペクトロメータ
ー（日本電子JMS−DX300型）による推定分子量は468で
ある。

前記分析諸データによりWAS−α391101はオリゴペプチ
ドを主要な構造成分とする単一物質と同定された。

尚、測定機器の型式を付言すれば、紫外分光光度計（日
立220A型ダブルビーム分光光度計）赤外分光光度計（島
津IR−420型赤外分光光度計）、NMRスペクトロメータ
（日本電子JMN−FX90Q型FT−NMRスペクトロメータ）、
自動アミノ酸分析計（日立655型高速液体クロマトグラ
フ日立Ｆ−1000型分光蛍光光度計）等である。

WAS−α391101の製造ラット、マウス、ヒツジ等々の哺乳動物体毛を水抽出処
理し、水可溶性画分を得、前記理化学的性質に基づいて
透析法、ゲル濾過法、イオン交換法、逆相クロマトグラ
フ法等々、周知の各種分画、精製手段を適宜使用するこ
とにより単離、調製され得る。

WAS−α391101の生理学的性質後記実験例に示す通り、本発明物質WAS−α391101は細
胞の増殖に強い促進活性を示し、その作用は正常細胞の
形質転換を伴なうことなく、可逆的であり、したがって
創傷治療剤、潰瘍治療剤、発毛促進剤、又、吸湿性が大
きいため、化粧料としても極めて有用に使用し得る。

急性毒性後記実施例に示す通り、本発明物質WAS−α391101のLD
₅₀値は皮下投与で492.5mg/kg体重・マウス、経口投与で
1950mg/kg体重・マウスである。

WAS−α391101の使用態様本発明物質WAS−α391101は経口投与、皮下注射または
静脈注射等の手段で通用され得、その用量は通常約10μ
ｇ〜0.5g/kg体重（１回）、より好ましくは経口投与で
約100μｇ〜約0.1g/kg体重（１回）程度であり、その剤
型としては、生理食塩水等への溶解液剤、注射液剤、乳
化製剤、凍結乾燥等による粉末剤あるいは座剤、腸溶
剤、舌下錠、顆粒剤、錠剤、カプセル剤等々通常の剤型
を適当なキャリア、増量剤、希釈剤等と共に適宜選択し
得る。

さらに、損傷皮膚の修復には軟膏形態が好ましく、軟膏
の基剤としては、精製ラノリン、流動パラフィン、白色
ワセリン、ポリエチレングリコール類、高級脂肪族アル
コール、植物油等の通常基剤が用いられる。又、その製
法は常法に従う。

実験例1WAS−α391101の製法及び精製ウィスター系無菌ラット（JCL−ウィスターGF:クレアー
ジャパン社）の体毛100gを採取し、滅菌蒸留水（以下、
純水という）で洗浄後、氷冷純水2lに24時間、浸漬・攪
拌した。次いで浸漬液をミリポアフィルタ（平均孔径0.
45μｍ、HAWP、ミリポア社）で濾過し、凍結乾燥処理に
付した。凍結乾燥物を約200mlの純水に懸濁し、透析チ
ューブ（ユニオンカーバイド社脱塩用セルロースチュー
ブ、ポアサイズ24Å）により１の純水に対し、２回各
一昼夜透析処理し、透析外液を凍結乾燥して粗標品約1g
を得た。次にこれをトヨパールHW−40Fカラム（分画分
子量100〜10,000、φ2cm×50cm、東洋曹達社）を用い、
0.01Mギ酸−アンモニア緩衝液（pH3.0）を溶出液として
溶出速度1ml/分でゲル濾過処理した。その紫外線吸収21
4nmによる溶出パターンを第５図（図中、１フラクショ
ンは10mlに相当）に示す。次いで、後記実験例IIに示す
活性検定法により、活性画分と認められる同図中斜線部
分を分取し、ゲル濾過カラム（東洋曹達TSKgelG1000P
W、φ21.5mm×60cm、溶出後:0.01Mギ酸−アンモニア緩
衝液（pH3.0）溶出速度3ml/分）を用いて高速液体クロ
マトグラフィ処理した。その紫外吸収214nmによる溶出
パターンを第６図に示す。同図の斜線部分である活性画
分を分取し、さらに逆相カラム（山村化学YMC−SH345、
φ2cm×50cm、溶出液:0.01Mギ酸−アンモニア緩衝液（p
H3.0）とアセトニトリルとの85:15混合液、溶出速度5ml
/分）を用いて高速液体クロマトグラフィ処理し、精製
標品10mgを得た。214nmにおける吸光度で検量した溶出
パターンを第７図に示す。尚、同図中、斜線部分は活性
部分であり、したがって活性因子はこの段階でほぼ完全
に単離されたものと言い得る。

このようにして得られた精製標品の理化学的性質等は前
記の通りである。

実験例IIWAS−α391101の生理活性 1.線維芽細胞増殖促進効果（活性検定法）マウス胎児由来正常線維芽細胞SC−１を、96穴マルチプ
レートに各穴（well）当たり1500個播き、５％牛胎児血
清含有0.2mlイーグルMEM培地（アール塩、ギブコ社）中
で37℃、５％CO₂残部空気の条件下一昼夜培養し、次い
で培地を１％牛胎児血清含有0.2mlMEM培地に換えて更に
５日間培養を継続し、WAS−α391101精製標品１μg/ml
（培地）添加穴の細胞数をコールターカウンタ（コール
タエレクトロニクス社モデルZM）により計測した。

尚、対照は標品無添加群であり、結果を第８図に要約し
て示す。図中、符号Ｃは対照群平均細胞数、同Ｓは標品
添加群の夫を表わす。

2.ヒト成人皮膚由来線維芽細胞を96穴マルチプレートに
各穴当たり1500個播き５％牛胎児血清含有0.2mlイーグ
ルMEM培地（アール塩、ギブコ社）中で37℃、５％CO₂残
部空気の条件下一昼夜培養し、次いで培地を１％牛胎児
血清含有0.2mlMEM培地に換えて更に５日間培養を継続
し、WAS−α391101精製標品１μg/ml（培地）添加穴の
細胞数をコールターカウンタ（コールタエレクトロニク
ス社モデルZM）により計測した。

尚、対照は標品無添加群であり、結果を第９図に要約し
て示す。図中、符号Ｃは対照群平均細胞数、同Ｓは標品
添加群の夫を表わす。

3.マウスリンパ細胞性腹水腫瘍由来細胞L5178Yを96穴マ
ルチプレートに各穴当たり2000個播き、１％牛胎児血清
含有0.2mlイーグルMEM培地（アール塩、ギブコ社）中で
37℃、５％CO₂残部空気の条件下２日間培養し、WAS−α
391101精製標品１μg/ml（培地）添加穴の細胞数をコー
ルターカウンタ（コールタエレクトロニクス社モデルZ
M）により計測した。

尚、対照は標品無添加群であり、結果を第10図に要約し
て示す。図中符号Ｃは対照群平均細胞数、同Ｓは標品添
加群の夫を表わす。

4.ヒト胎児皮膚由来線維芽細胞を96穴マルチプレートに
各穴当たり1300個播き、５％牛胎児血清含有0.2mlイー
グルMEM培地（アール塩、ギブコ社）中で37℃、５％CO₂
残部空気の条件下一昼夜培養し、次いで培地を１％牛胎
児血清含有0.2mlMEM培地に換えて更に５日間培養を継続
し、WAS−α391101精製標品１μg/ml（培地）添加穴の
細胞数をコールターカウンタ（コールタエレクトロニク
ス社モデルZM）により計測した。

尚、対照は標品無添加群であり、結果を第11図に要約し
て示す。図中、符号Ｃは対照群平均細胞数、同Ｓは標品
添加群の夫を表わす。

5.ウィスター系ラット（雄、10週令、平気体重250g−群
５匹）を16時間絶食させ、ストレスケージに入れて23℃
の恒温水槽に浸漬し、16時間後にラットを取り出し、ス
トレス性潰瘍を生じさせた。生理食塩水0.5mlに溶解し
たWAS−α391101 10μg/匹を１日１回３日間経口投与
し、ラットを殺して脱血し、胃を取り出してホルマリン
固定し、線状潰瘍の長さを計り、その総和をストレス潰
瘍係数（mm）で表わし、第１表に示した。対照は、生理
食塩水投与群である。

6.ウイスター系ラット（雄、10週令、平気体重250g−群
５匹）を16時間絶食させたのち、生理食品水0.5mlに溶
解した、WAS−α391101 10μg/匹を経口投与し、ストレ
スケージに入れて23℃の恒温水槽に浸漬し、16時間放置
した。取り出したラットを直ちに殺して開腹し、胃を取
り出してホルマリン固定し、線状潰瘍の長さを計りその
総和をストレス潰瘍係数（mm）で表わし、第２表に示し
た。対照は生理食塩水投与群である。

7.ウイスター系ラット（雄、８週令、平気体重200g−群
５匹）をエーテル麻酔し、背部をヘアーリムーバー（資
生堂社製）で除毛後、皮膚をつまみあげ、直径10mmのタ
ガネで打ち抜いた。WAS−α391101 100mgを1kgの白色ワ
セリン軟膏中に加え製剤化し、１日２回、１回100mgの
軟膏を創面に塗布し、毎日創面の面積を測定し、作創日
を100％として創面減少率を求めた。対照は白色ワセリ
ン軟膏であり、結果を第３表に示す。

8.ICR系マウス（雄、６週令、平均体重30.0±0.3g、各
群10匹）を使用し、生理食塩水0.5mlに溶解した6mg、1
0.5mg、15mg、19.5mg、24mgの５段階の本発明物質WAS−
α391101を皮下投与し、７日間その生死を観察し、Behr
ens−ｋrber法に従って算出したLD₅₀値は492.5mg/kg
体重マウスであった。

9.ICR系マウス（雄、６週令、平均体重30.0±0.3g、各
群10匹）を使用し、生理食塩水0.5mlに溶解した30mg、4
5mg、60mg、75mg、90mgの５段階の本発明物質WAS−α39
1101を皮下投与し、７日間その生死を観察しBehrens−
ｋrber法に従って算出したLD₅₀値は1950mg/kg体重マ
ウスであった。

製剤例 1.WAS−α391101 10μｇを滅菌した生理食塩水1mlに溶
解し、注射剤を調整した。

2.WAS−α391101 100mgに薬局方白色軟膏を徐々に加え
練合して、全量を1kgとし軟膏剤を調製した。

3.WAS−α391101 10mgを滅菌蒸留水50mlに溶解し、コレ
ステロール0.05gをエタノール50mlに溶解したものと混
合し、香料適量を加えて塗擦用外用液剤を調製した。

4.WAS−α391101 50mg、メントール0.6mg、チモール0.6
mg、ユーカリ油0.002ml及びレモン油0.02mlを乳糖950mg
と充分に混和し、結合剤として５％デンプン糊液を使用
し、湿式法により顆粒をつくり、打錠して１錠約1gのト
ローチ剤を調製した。

5.WAS−α391101 50mgを乳糖950mgと充分に混合し、結
合剤として５％デンプン糊液を用いて湿式法により顆粒
をつくり、打錠して錠剤とした。

このように本発明物質WAS−α391101は、前記標準用量
等に基づいて薬学的に許容され得る担体への溶解、混合
により、所定の活性を有する所望の剤型とすることがで
きる。

【図面の簡単な説明】

第１乃至第４図は、本発明物質の理化学的性質を示す説
明図である。第５乃至第７図は本発明実験例Ｉの説明図である。第８乃至第11図は本発明実験例II−１、II−２、II−３
及びII−４の説明図である。尚、グラフ上部の縦線長さ
は標準誤差を示す。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】（ａ）推定分子量:468（マススペクトル
法）（ｂ）融点:60℃（分解）（ｃ）溶解性：水に易溶。アセトニトリル、ジメチルス
ルホキシドに可溶。エチルアルコール、エーテル、クロ
ロホルム、ベンゼンに不溶。（ｄ）紫外線吸収極大波長：（ｅ）赤外線吸収スペクトル（KBr法）：添付第２図に
示す通りである。（ｆ）炭素13の核磁気共鳴スペクトル（溶媒；重水内部
標準；テトラメチルシラン）：添付第３図に示す通りで
ある。ことを特徴とする細胞増殖促進物質WAS−α391101。