JPH0684396B2 - デオキシヌクレオシドホスホルスルフイド化合物 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はオリゴデオキシヌクレオチドを製造するための
中間化合物、さらに詳しくはホスフアイトトリエステル
法によるオリゴデオキシヌクレオチド製造のためのデオ
キシヌクレオシド−３′−ホスフアイト化合物に関する
ものである。

従来の技術 オリゴデオキシヌクレオチドを製造するための方法とし
ては、現在、リン酸トリエステル法およびホスフアイト
トリエステル法が広く使用されている。リン酸トリエス
テル法には、一般に、つぎに示すようなデオキシヌクレ
オシド−３′−ホスフエート化合物〔II〕が、またホス
フアイトトリエステル法には、デオキシヌクレオシド−
３′−ホスホルクロリド化合物〔III〕およびデオキシ
ヌクレオシド−３′−ホスホルアミダイト化合物〔IV〕
が、それぞれその製造中間体として用いられている（化
合物〔II〕の製造法とその使用法については、C.B.Rees
e、Tetrahedron,34、3143（1978）、化合物〔III〕につ
いては、R.L.Letsingerら、J.Am.Chem.Soc.、97,3278
（1975）、また化合物〔IV〕については、M.H.Caruther
sら、Tetra−hedron Lett.、22,1859（1981）を参照さ
れたい。） （式中、R¹およびR²は保護基を、Ｂは保護基を有するこ
ともある塩基残基を、そしてR⁴はアルキル基をあらわ
す。） 発明が解決しようとする問題点 中間化合物として化合物〔II〕を用いてオリゴデオキシ
ヌクレオチドを製造する場合の利点は、化合物〔II〕が
酸素および水に対して安定である故に、化合物〔II〕の
製造および取扱いが容易であることである。したがつて
中間化合物として化合物〔II〕を用いる方法（リン酸ト
リエステル法）が、オリゴデオキシヌクレオチド製造法
の主流を占めてきた。しかし、この方法には、化合物
〔II〕と５′−Ｏ−デオキシヌクレオシドあるいは５′
−Ｏ−デオキシヌクレオチドとの縮合反応、いわゆるイ
ンターヌクレオチド形成反応がさほど速くないために、
オリゴ体の製造に時間を要するという欠点がある。

一方、化合物〔III〕または化合物〔IV〕を使用するホ
スフアイトトリエステル法は、化合物〔III〕および〔I
V〕が５′−Ｏ−デオキシヌクレオシドあるいは５′−
Ｏ−デオキシヌクレオチドのアルコール性水酸基との反
応性が大きいために、インターヌクレオチド形成反応が
速く、そのために目的とするオリゴデオキシヌクレオチ
ドを短時間に得ることができるという長所がある。とく
にこれらの方法は固相法によるオリゴデオキシヌクレオ
チドの製造に有効である。しかし、これらの化合物〔II
I〕および〔IV〕、とりわけ化合物〔III〕は、その製造
と取扱いが簡単ではないこと、また酸素および水に対し
て不安定であるために、その保存中に分解しないように
注意を払う必要があること等の欠点がある。実際、化合
物〔III〕は一般に生成系からの単離が困難であるほど
に不安定な化合物であり、また化合物〔IV〕は、弱酸の
存在下でさえもＰ−Ｎ結合が容易に切断される程度に不
安定であることが知られている。

問題点を解決するための手段，作用および効果 本発明者らは、上述のごとき従来技術の状況にかんが
み、製造が容易でかつ安定であり、さらにすみやかにオ
リゴデオキシヌクレオチドを製造しうる中間化合物を探
索した結果、下記一般式〔Ｉ〕で示されるデオキシヌク
レオシドホスホルスルフイド化合物を創製し、該化合物
を使用することにより、この目的を有利に達成しうるこ
とを見い出した。

（式中、R¹およびR²は保護基を、R³はアリール基を、そ
してＢは保護基を有することもある塩基残基をあらわ
す。） したがつて、本発明は、上述したようなオリゴデオキシ
ヌクレオチドを製造するための従来の中間化合物の利
点、すなわちその製造が容易でかつすみやかなインター
ヌクレオチド結合形成反応を提供する一般式〔Ｉ〕の新
規デオキシヌクレオシド化合物に関するものであり、以
下に該新規化合物〔Ｉ〕について具体的に説明する。

一般式〔Ｉ〕で示されるホスホルスルフイド化合物の保
護基R¹としては、基本的にはすべてのヒドロキシ保護基
が可能である。具体的にはオリゴヌクレオチドを製造す
る際に、その有用性が認められたヒドロキシ保護基、た
とえばトリフエニルメチル基、４−メトキシトリフエニ
ルメチル基、4,4′−ジメトキシトリフエニルメチル基
等のトリアリールメチル基、ピキシル基（すなわち９−
フエニルキサンテン−９−イル基）、アルコキシカルボ
ニル基、アリールオキシカルボニル基、アリールチオア
ルキルオキシカルボニル基、さらにｔ−ブチルジメチル
シリル基のようなトリアルキルシリル基等を挙げること
ができる。これらのヒドロキシ保護基の中から化合物
〔Ｉ〕のR¹としてどれを選ぶかについては限定的ではな
いが、トリアリールメチル基についていえば、それらの
導入と脱保護が容易であること、また後述するように化
合物〔Ｉ〕を製造する際に原料として用いる５′−Ｏ
−,N−保護デオキシヌクレオシドのうちで、５′−Ｏ−
トリアリールメチル−Ｎ−保護デオキシヌクレオシドは
市販されているものもある等、その入手が容易であるこ
とを考慮すると、それらが好ましく用いられる。

また化合物〔Ｉ〕の有機基R²としては、基本的にはすべ
てのリン酸塩保護基が可能である。具体的には、オリゴ
ヌクレオチドを製造するために研究開発された保護基、
たとえば炭素数が５までの低級アルキル基、アリル基、
シアノアルキル基、ハロアルキル基、アリールスルホニ
ルアルキル基、アリール基、ハロアリール基等を挙げる
ことができる。これらの保護基のうちで、化合物〔Ｉ〕
のR²としてどれを選ぶかについては限定的ではないが、
オリゴヌクレオチド製造のためのリン酸塩保護基として
広く研究され、その有用性が確認されているメチル基，
アリル基，β−シアノエチル基および２−クロロフエニ
ル基等が好んで用いられる。

つぎに化合物〔Ｉ〕の有機基R³について説明すると、そ
れはアリール基であればよく、具体的にはフエニル基、
２−メチルフエニル基、４−メチルフエニル基、2,4−
ジメチルフエニル基、2,6−ジメチルフエニル基、2,4,6
−トリメチルフエニル基、２−クロロフエニル基、４−
クロロフエニル基、3,4−ジクロロフエニル基、α−ナ
フチル基等を挙げることができる。これらのアリール基
のうちでR³としてどれを選ぶかについては、化合物
〔Ｉ〕における保護基R²の種類により異なるので限定す
ることはできないが、化合物〔Ｉ〕の製造の容易さおよ
び安定性等を考慮すると、一般にそれが容易でかつ良好
な安定性を与える２−メチルフエニル基、2,6−ジメチ
ルフエニル基および２−クロロフエニル基等のα−位に
置換基をもつアリール基が好んで用いられる。

つぎに化合物〔Ｉ〕における塩基残基Ｂについて説明す
ると、代表的なＢとしては、下記一般式〔Ｖ〕で示され
る３位に保護基を有することもあるチミン残基、一般式
〔VI〕で示される４位のアミノ基に保護基を有すること
もあるシトシン残基、一般式〔VII〕で示される６位の
アミノ基に保護基を有することもあるアデニン残基、一
般式〔VIII〕で示される1,2,6−位のアミド基、アミノ
基およびケト基に保護基を有することもあるグアニン残
基等を挙げることができる。

これら塩基の保護基としては、限定的ではないが、現在
までオリゴヌクレオチド製造のために開発されたトリア
リールメチル基、トリアルキルシリルアルキル基、アリ
ールチオアルキル基、フタロイル基、アリールオキシカ
ルボニル基、アルコキシカルホニル基、ジアリールカル
バモイル基、アリールカルボニル基、アルキルカルボニ
ル基、1,2−ジアルキルカルボニルオキシエチレン基を
挙げることができる（一般式〔Ｖ〕−〔VIII〕で示され
る塩基残基にどの保護基を用いるかについては、すでに
多くの報文や総説に示されている。たとえば、畑辻明
ら、有機合成化学協会誌、42、429（1984）を参照され
たい）。

本発明に従う一般式〔Ｉ〕のデオキシヌクレオシドホス
ホルスルフイド化合物は、下記反応式（１）に示すよう
に、一般式〔IX〕で示されるデオキシヌクレオシドと一
般式〔Ｘ〕で示される1,2,4−トリアゾリルホスフイン
化合物との反応により製造することができる。

（式中、R¹，R²，R³およびＢは前記と同じ意味をあらわ
す。）たとえば、５′−Ｏ−ジメトキシリチルチミジン
と等モルの２−クロロフエニルオキシー２−メチルフエ
ニルチオ−1,2,4−トリアゾリルホスフインとを重クロ
ロホルム中で室温下に1.5時間反応させた後、その反応
溶液の¹HNMRを測定すると、原料である５′−Ｏ−ジメ
トキシトリチルチミジンの３′−OH基のプロトンのシグ
ナル（δ3.45ppm），さらに２−クロロフエニルオキシ
−２−メチルフエニルチオ−1,2,4−トリアゾリルホス
フインのメチル基（δ2.31ppm）および1,2,4−トリアゾ
リル基（δ8.12および8.44ppm）の吸収が消失し、新た
にあらわれた吸収は５′−Ｏ−ジメトキシトリチルチミ
ジン−３′−（２−クロロフエニルオキシ−２−メチル
フエニルチオ）ホスフイン〔主な有機基のシグナルは、
δ1.46（チミン残基の５−メチル基）、2.28および2.38
（２−メチルフエニルチオ基のメチル基）、3.69および
3.70（ジメトキシトリチル基のメトキシ基）ppm〕と1H
−1,2,4−トリアゾール〔δ8.16（３および５位の水
素）、12.8（１位の水素）ppm〕がほぼ定量的に生成し
ていることを示した。さらに、この溶液を飽和食塩水で
洗浄、乾燥、濃縮後、これをｎ−ペンタンに滴下するこ
とにより、微粉末状の５′−Ｏ−ジメトキシトリチルチ
ミジン−３′−（２−クロロフエニルオキシ−２−メチ
ルフエニルチオ）ホスフインがほぼ定量的に得られた。

このように一般式〔Ｉ〕で示されるデオキシヌクレオシ
ドホスホルスルフイド化合物は反応（１）により高収率
で得られるが、その原料である一般式〔IX〕で示される
デオキシヌクレオシドは、すでに知られている方法（た
とえば、畑辻明ら、有機合成化学協会誌、42、429（198
4）とその引用文献を参照）で製造したものであるいは
市販されているものを用いることができるが、使用に際
しては適当な手段により十分乾燥した方がよい。

また1,2,4−トリアゾリルホスフイン化合物〔Ｘ〕は、
クリヒルドルフらの方法（Angew.Chem.Int.Ed.Engl.15,
305（1976））に準じて製造することができる（反応式
（２））。

（式中、R²およびR³は前記と同じ意味をあらわす。）す
なわち、一般式〔XI〕で示されるアルコキシまたはアリ
ールオキシアリールチオクロロホスフインとトリメチル
シリル−1,2,4−トリアゾール〔XII〕とをクロロホル
ム、塩化メチレン、ベンゼンおよびトルエン等の有機溶
媒中で、モル比1:1〜1.5で室温下に５分程度反応させた
のち、上記有機溶媒および副生したトリメチルクロロシ
ラン〔XIII〕を減圧下に留去すると、化合物〔Ｘ〕が残
渣として得られる。化合物〔Ｘ〕は蒸留あるいはクロマ
トグラフイー等により精製できるほど熱および水に対し
て安定ではないが、上記の方法により得た化合物〔Ｘ〕
はほぼ純粋であり、このことは上記の残渣の¹HNMRを測
定することにより容易に示される。このようにして得ら
れた化合物〔Ｘ〕に反応（１）を行なわせるための有機
溶媒が加えられ、デオキシヌクレオシド〔IX〕との反応
に用いられる。

つぎに反応（２）の原料であるアルコキシまたはアリー
ルオキシアリールチオクロロホスフイン化合物〔XI〕お
よびトリメチルシリル−1,2,4−トリアゾール〔XII〕に
ついて説明すると、いずれも文献に記載されている方
法、すなわち下記の反応（３）および（４）により容易
に製造することができる（化合物〔XI〕の製造法につい
ては、たとえばG.M.Kosolapoffら、“Organic Phosphor
us Compounds",Vol.5,John Wiley ＆ Sons（New Yor
k）,1973年とその引用文献を、また化合物〔III〕につ
いては、L.Birkoferら、Chem.Ber.,93,2804（1960）を
それぞれ参照されたい）。

（式中、R²およびR³は前記と同じ意味をあらわし、塩基
はトリエチルアミン等の塩基をあらわす。） 本発明に係る反応（１）は、有機溶媒中でより円滑に進
行し、かかる溶媒としては、クロロホルム、塩化メチレ
ン、1,2−ジクロロエタン、ベンゼン、テトラヒドロフ
ラン、ｐ−ジオキサン等が挙げられる。これらの溶媒は
適当な乾燥剤で十分脱水したのち、蒸留等により精製し
たものが好んで用いられる。本発明に従う反応（１）に
おいて、化合物〔IX〕と化合物〔Ｘ〕のモル比は、1:1
〜10の範囲であり得るが、経済面を考慮すると化合物
〔Ｘ〕を大過剰に用いない方が得策であり、1:1〜２の
範囲が好適である。また実際に反応（１）を行うにあた
つては、化合物〔IX〕の上記有機溶媒溶液あるいは懸濁
液に、化合物〔Ｘ〕の上記有機溶媒溶液をゆつくり加え
ることが望ましい。反応は、０°〜35℃の範囲で行なわ
せることが望ましい。また反応時間は、化合物〔IX〕と
化合物〔Ｘ〕のモル比、さらに化合物〔IX〕の保護基R¹
および塩基残基Ｂ、あるいは化合物〔Ｘ〕の保護基R²お
よび有機基R³の種類により異なるが、概して10分〜２時
間の範囲である。しかし、実際に反応（１）を行なうに
際しては、薄層クロマトグラフイー（TLC）や¹HNMR等に
より反応の終結を確認した方がよい。

本発明に従う反応（１）により製造されたデオキシヌク
レオシドホスホルスルフイド化合物〔Ｉ〕は、化合物
〔IX〕と化合物〔Ｘ〕の反応溶液をそのまま、いわゆる
in situ,で次後の反応に使用してもよいが、通常はつぎ
に示す方法で単離したものが次後の反応等に用いられ
る。上記方法により反応（１）の終結を確認した後に、
反応溶液を飽和食塩水等で洗浄した後、有機層を無水硫
酸ナトリウム等で乾燥し、有機溶媒を減圧下でほとんど
留去する。濃縮された化合物〔Ｉ〕を含む溶液は、攪拌
してあるｎ−ペンタンあるいはｎ−ヘキサン中に滴下さ
れる。析出した微粉末状の化合物〔Ｉ〕を別し、減圧
下で乾燥する。また場合によつては、上記の濃縮された
化合物〔Ｉ〕を含む溶液をシリカゲルのカラムクロマト
グラフイーにかけ、クロロホルム、塩化メチレンあるい
は酢酸エチル等を溶媒として展開し、化合物〔Ｉ〕を含
む留出液を減圧下に濃縮乾固し、あわ状固体として単離
することもできる。

このようにして得られたデオキシヌクレオシドホスホル
スルフイド化合物〔Ｉ〕は安定であり、たとえば５′−
Ｏ−ジメトキシトリチルチミジン−３′−（２−クロロ
フエニルオキシ−２−メチルフエニルチオ）ホスフイン
は−20℃で５ヶ月は安定に保存することができる。また
化合物〔Ｉ〕を用いてオリゴデオキシヌクレオチドの合
成を行なうとジデオキシヌクレオチドが得られる。たと
えば、トリ−ｎ−ブチルスタンニル−1,2,4−トリアゾ
ールの存在下で、５′−Ｏ−ジメトキシトリチルチミジ
ン−３′−（２−クロロフエニルオキシ−２−メチルフ
エニルチオ）ホスフインと３′−０−ｔ−ブチルジメチ
ルシリルチミジンを塩化メチレン中で反応させたのち、
ヨウ素酸化すると、５′−Ｏ−ジメトキシトリチルチミ
ジン（３′→５′）−３′−ｔ−ブチルジメチルシリル
チミジン−３′−０−（P1−２−クロロフエニル）ホス
フエートが好収率で得られる。

なお本明細書において使用する略号の意味および各塩基
残基の構造はつぎのとおりである。

Me;メチル基、 MMTr;モノメトキシトリチル基、 DMTr;ジメトキシトリチル基、 実施例 以下実施例によつて、本発明を具体的に説明するが、本
発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

なお、各実施例で使用した1,2,4−トリアゾリルホスフ
イン化合物〔Ｘ〕は、以下の参考例１〜３によつて合成
したものである。

参考例１ クロロホスフイン化合物〔XI〕として、２−クロロフエ
ニルオキシ−２−メチルフエニルチオクロロホスフイン
を0.3ミリモル（0.095g）含むトルエン溶液2mlに、トリ
メチルシリル−1,2,4−トリアゾール〔XII〕を0.33ミリ
モル（0.046g）含むトルエン溶液を０℃で加え、この温
度で10分間攪拌し、低沸点留分を減圧下において−78℃
でトラツプした。残渣として1,2,4−トリアゾリルホス
フイン化合物〔Ｘ〕、すなわち２−クロロフエニルオキ
シ−２−メチルフエニルチオ−1,2,4−トリアゾリルホ
スフインを、またトラツプされた留分の分留によりトリ
メチルクロロシラン〔XIII〕をそれぞれ得た。結果は後
記第２表に示すとおりである。

参考例２ クロロホスフイン化合物〔XI〕として、メトキシ−２−
メチルフエニルチオクロロホスフイン５ミリモルを含む
トルエン溶液30mlと、トリメチルシリル−1,2,4−トリ
アゾール〔XII〕５ミリモルを含むトルエン溶液20mlを
用いた以外は参考例１と同様にしてメトキシ−２−メチ
ルフエニルチオ−1,2,4−トリアゾリルホスフイン
〔Ｘ〕を合成した結果は後記第２表に示すとおりであ
る。

参考例３ クロロホスフイン化合物〔XI〕として、２−クロロフエ
ニルオキシ−2,6−ジメチルフエニルチオクロロホスフ
イン５ミリモルを用いた以外は参考例２と同じ方法によ
り後記第２表に示すごとく２−クロロフエニル−2,6−
ジメチルフエニルチオ−1,2,4−トリアゾリルホスフイ
ン〔Ｘ〕を得た。

実施例１ ５′−Ｏ−ジメトキシトリチルチミジン〔IX〕（0.163
g、0.3ミリモル）の重クロロホルム（0.5ml）の懸濁液
に、参考例１で合成した２−クロロフエニルオキシ−２
−メチルフエニルチオ−1,2,4−トリアゾリルホスフイ
ン〔Ｘ〕の重クロロホルム（1ml）溶液を、０℃でゆつ
くり加えた。室温にもどし、1.5時間その温度で攪拌し
た後、その溶液の¹HNMRを測定した。¹ HNMR（CDCl₃,TMS）δ;1.46（s,3H,5−CH₃）、2.20−2.
85（m,5H,2.28と2.38ppmに一重線を含む。２′およびCH
₃C₆H₄Ｓ−）,3.35−3.65（m,2H,5′）,3.69（s,3H,CH₃O
C₆H₄−）,3.70（s,3H,CH₃OC₆H₄−）,4.25−4.50（m,1H,
4′）,5.45−5.80（m,1H,3′）,6.49（t,1H,J＝7.0Hz,
1′）,6.65−6.90（m,4H,ph）,6.90−7.75（m,18H,phお
よび６）,8.16（s,2H,HNC₂H₂N₂）,10.3（s,1H,NH）,12.
8（s,1H,HNC₂H₂N₂）。

その後、この溶液にクロロホルム（50ml）を加え、クロ
ロホルム溶液を飽和食塩水（30ml）で洗浄し、無水硫酸
ナトリウムで乾燥した。クロロホルムを減圧下でほとん
ど留去し、残渣（約2ml）を攪拌してあるｎ−ペンタン
（200ml）中に０℃で滴下すると白色の粉末が直ちに析
出した。そのまま30分攪拌し、その粉末を別し、室温
で８時間減圧下乾燥し、0.235g（95％）の５′−Ｏ−ジ
メトキシトリチルチミジン−３′−（２−クロロフエニ
ルオキシ−２−メチルフエニルチオ）ホスフイン〔Ｉ〕
を得た。Rf（CHCl₃:MeOH＝80:1）＝0.30。

実施例２〜８ 第２表に記載したデオキシヌクレオシド〔IX〕と参考例
１〜３で合成した1,2,4−トリアゾリルホスフイン化合
物〔Ｘ〕を、重クロロホルム中、第２表に示したモル比
で、所定の時間反応させたのち、実施例１と同様の操作
を行ない、第２表に示したデオキシヌクレオシドホスホ
ルスルフイド化合物〔Ｉ〕を得た。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】一般式〔Ｉ〕で示されるデオキシヌクレオ
   シドホスホルスルフイド化合物。 （式中、R¹およびR²は保護基を、R³はアリール基を、そ
   してＢは保護基を有することもある塩基残基をあらわ
   す。）