JPH0686387B2

JPH0686387B2 - Licorice-derived cell activating agent

Info

Publication number: JPH0686387B2
Application number: JP63271819A
Authority: JP
Inventors: 義隆安藤; 裕安藤; 幸修西部; 徳久河合
Original assignee: Ichimaru Pharcos Co Ltd
Current assignee: Ichimaru Pharcos Co Ltd
Priority date: 1988-10-26
Filing date: 1988-10-26
Publication date: 1994-11-02
Anticipated expiration: 2009-11-02
Also published as: JPH02117687A

Description

【発明の詳細な説明】〔発明の目的〕本発明は、新規な細胞賦活作用剤（因子）の開発に関す
る。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION [Object of the Invention] The present invention relates to the development of a novel cell activating agent (factor).

さらに詳しくは、マメ科植物（Leguminosae）の甘草（G
lycyrrhizae Redix）から抽出される、ある特定な理化
学的諸性質を示す水溶性の分画を有効成分とする、新規
な細胞賦活作用剤に関するものである。More specifically, legumes (Leguminosae) licorice (G
lycyrrhizae Redix), which is a novel cell activating agent containing, as an active ingredient, a water-soluble fraction showing certain specific physicochemical properties.

「産業上の利用分野」本発明による甘草由来の水溶性分画は、細胞に対して優
れた賦活作用を示す。"Field of Industrial Application" The water-soluble fraction derived from licorice according to the present invention exhibits an excellent activating effect on cells.

よって本剤の利用分野としては、例えば、医薬品、医薬
部外品、あるいは化粧品（人及びその他の動物用）をは
じめとする皮膚外用剤などに配合して用いることが有用
である。Therefore, as the field of use of this agent, it is useful to use it in combination with, for example, a drug, a quasi drug, or a skin external preparation such as cosmetics (for humans and other animals).

また、組織培養などにおける培地への添加剤としての利
用も可能である。It can also be used as an additive to a medium in tissue culture and the like.

「従来の技術」甘草には、抗炎症作用、抗アレルギー作用、抗潰瘍作用
があるとされ、古くから医薬品あるいは食品などに用い
られてきた。"Prior Art" Licorice is said to have anti-inflammatory, anti-allergic, and anti-ulcer effects, and has been used for a long time in medicine or food.

特に、甘草からの抽出成分であるグリチルリチン、及び
そのサポゲニンであるグリチルリチン酸には、抗炎症、
抗アレルギー作用があることが知られている。In particular, glycyrrhizin which is an extract component from licorice, and glycyrrhizic acid which is its sapogenin have anti-inflammatory,
It is known to have an anti-allergic effect.

甘草は、また、消化性潰瘍にも用いられているが、その
有効物質については未だ確定されていないようである。
（高木敬次郎ら：和漢薬物学P73,南山堂刊（1982
年））。Licorice is also used in peptic ulcers, but its effective substance appears to be undetermined.
(Keijiro Takagi et al .: Japanese and Chinese Pharmacology P73, published by Nanzando (1982)
Year)).

「発明が解決しようとする課題」本発明者らの課題は、植物の有効利用をはかることにあ
り、特に、ヒトや動物の美容と健康に役立つような植物
由来の有効成分の開発とその応用を提供することにあ
る。[Problems to be Solved by the Invention] The problem of the present inventors is to make effective use of plants, and in particular, development and application of plant-derived active ingredients useful for beauty and health of humans and animals. To provide.

本発明者らは、この目的のため各種植物成分のスクリー
ニングを継続してきた。The present inventors have continued to screen various plant components for this purpose.

そして、その過程において、意外にもグリチルリチンや
グリチルリチン酸を含まない甘草の抽出物に、細胞に対
して強い賦活作用を有する成分が含まれていることを見
い出し、さらにその追求を試みたところ、次に示すごと
く理化学的データ及び生物学的データをもって特定する
ことに成功し、本発明を完成するに至った。And, in the process, surprisingly, it was found that the extract of licorice that does not contain glycyrrhizin or glycyrrhizic acid contained a component having a strong activating effect on cells, and further attempted its pursuit. As shown in the above, the present invention has been completed by succeeding in specifying it with physicochemical data and biological data.

[Structure of Invention]

本発明は、マメ科植物の甘草から抽出された、次の
（ａ）〜（ｄ）の性質を有する分画を有効成分とする細
胞賦活作用剤をもってなる。The present invention comprises a cell activating agent containing as an active ingredient a fraction having the following properties (a) to (d) extracted from legume licorice.

（ａ）分子量1,300付近（ｂ）ペーパークロマトグラム［展開溶媒：水・エタノ
ール混液（1:1）］のRf値が、0.80〜0.85にある。(A) Molecular weight around 1,300 (b) Rf value of paper chromatogram [developing solvent: water / ethanol mixed solution (1: 1)] is 0.80 to 0.85.

（ｃ）水及び80％エタノールに可溶無水エタノール、ｎ−ブタノール、酢酸エチル、クロロ
ホルム、石油エーテル、エーテルには不溶（ｄ）モーリッシュ反応及びニンヒドリン反応が陽性「課題を解決するための手段」〔Ａ〕製造法（抽出手段）本発明による細胞賦活成分は、マメ科植物の甘草を出発
原料となし、抽出、精製することによって製造出来る。
その際の出発原料は、組織培養法によって得られた甘草
を用いてもよい。その製造法は次のごとくである。(C) Soluble in water and 80% ethanol Insoluble in anhydrous ethanol, n-butanol, ethyl acetate, chloroform, petroleum ether, and ether (d) Positive for Maurish reaction and ninhydrin reaction "Means for solving the problem" [A] Production Method (Extraction Means) The cell activation component according to the present invention can be produced by extracting and purifying legume licorice as a starting material.
In that case, licorice obtained by the tissue culture method may be used as the starting material. The manufacturing method is as follows.

「実施例１」甘草（乾燥物）1Kgに対して、５〜10部の水を加え、４
℃にて時々撹拌しながら３日間浸漬する。その後、ろ過
してろ液をとり、減圧下において10〜20分の１量になる
まで濃縮し、この濃縮液に対してエタノールを50％濃度
になるように添加した後、遠心分離して上清液を分取す
る。“Example 1” 5 to 10 parts of water was added to 1 kg of licorice (dry product), and 4
Soak for 3 days at ℃ with occasional stirring. After that, the filtrate is collected, concentrated under reduced pressure to a volume of 10 to 1/20, and ethanol is added to the concentrated solution to a concentration of 50%, followed by centrifugation to obtain a supernatant. Separate the liquid.

次に、この上清液をセファデックスＧ−25メディウムを
充填したカラム（25×60cm）を用いてゲル濾過を行い、
Kav値で、0.4〜0.65に流出するフラクションを得る（第
１図）。Next, this supernatant liquid was subjected to gel filtration using a column (25 × 60 cm) packed with Sephadex G-25 medium,
Fractions with a Kav value of 0.4 to 0.65 are obtained (Fig. 1).

さらにこれを凍結乾燥して、本発明による細胞賦活成分
を得る。尚、上記方法によって得られたそれの収量は、
約10gである。Further, this is freeze-dried to obtain the cell activating component according to the present invention. The yield obtained by the above method is
It is about 10g.

〔Ｂ〕理化学的特性に関するデータ（ａ）分子量測定本発明による細胞賦活成分の分子量は、以下の試験法を
もって推定するとき、1,300前後であることが確認され
た。（第２図）。[B] Data on physicochemical properties (a) Molecular weight measurement It was confirmed that the molecular weight of the cell-activating component according to the present invention was around 1,300 when estimated by the following test method. (Fig. 2).

（測定法の概要）平均分子量1,000および3,000のポリエチレングリコール
（ポリエチレングリコール1,000,ポリエチレングリコー
ル4,000）を標準として、セファデックスＧ−25ファイ
ン（ファルマシア社製）で分画して分子量を推定する。(Outline of measuring method) Polyethylene glycol having an average molecular weight of 1,000 and 3,000 (polyethylene glycol 1,000, polyethylene glycol 4,000) is used as a standard to fractionate with Sephadex G-25 Fine (Pharmacia) to estimate the molecular weight.

（ｂ）ペーパークロマトグラム東洋ろ紙No.50を使用し、展開溶媒として、エタノール
・水混液（1:1）を使用した場合のクロマトグラム上のR
f値は、0.80〜0.85であることが確認された。(B) Paper chromatogram R on the chromatogram when Toyo Filter Paper No. 50 is used and ethanol / water mixture (1: 1) is used as the developing solvent.
It was confirmed that the f value was 0.80 to 0.85.

尚、アニリン−フタレート法によって、淡赤色に呈色す
ることが確認された。It was confirmed by the aniline-phthalate method that a light red color was formed.

（ｃ）溶媒に対する溶解性水及び80％エタノール水溶液には易溶であるが、無水エ
タノール、ｎ−ブタノール、酢酸エチル、クロロホル
ム、石油エーテル、エーテルには不溶である。(C) Solubility in solvent Although it is easily soluble in water and 80% aqueous ethanol solution, it is insoluble in anhydrous ethanol, n-butanol, ethyl acetate, chloroform, petroleum ether and ether.

（ｄ）その他の反応モーリッシュ反応：水に溶解した液に、15％α−ナフ
トールを滴下し硫酸を加える時、赤紫色を呈する。(D) Other reactions Maurish reaction: When 15% α-naphthol is added dropwise to a liquid dissolved in water and sulfuric acid is added, it exhibits a reddish purple color.

ニンヒドリン反応：水に溶解した液に、ニンヒドリン
試液を加え、水浴中で３分間加熱する時青紫色を呈す
る。Ninhydrin reaction: A ninhydrin reagent solution is added to a solution dissolved in water, and when it is heated in a water bath for 3 minutes, it exhibits a blue-purple color.

〔Ｃ〕発明の効果（１）細胞生着率の促進作用モルモットの初代線維芽細胞、さらにマウスの初代腹腔
マクロファージは、無血清のMEM中では、培養器に生着
せず死滅する。[C] Effects of the Invention (1) Effect of Promoting Cell Engraftment Primary fibroblasts of guinea pigs and mouse primary abdominal peritoneal macrophages die without engrafting in a culture vessel in serum-free MEM.

これに対して、実施例１で得た凍結乾燥物は、無血清の
培地において、細胞の生着性（率）を促進し、死滅する
ことを防止した。On the other hand, the freeze-dried product obtained in Example 1 promoted cell engraftment (rate) in the serum-free medium and prevented death.

すなわち、本成分を添加することにより細胞が生着し、
１週間以上生存することがわかった。That is, cells are engrafted by adding this component,
It was found to survive for over a week.

尚、その際の添加量は、培養液1mL当り50μｇである
（細胞数５×10⁴個/mL）。The amount added at that time was 50 μg per 1 mL of the culture solution (cell number 5 × 10 ⁴ cells / mL).

（２）コロニー形成からみた促進作用モルモットの初代培養線維芽細胞を用いて、コロニー形
成能（率）を求めてみると形成が良好である。この促進
作用は線維芽細胞に限らず、上皮細胞等においても同様
に確認された。(2) Accelerating effect from the viewpoint of colony formation When primary fibroblasts of guinea pig are used to determine the colony forming ability (rate), the formation is good. This promoting effect was confirmed not only in fibroblasts but also in epithelial cells and the like.

第１表（次表）は、10〜1,000個のモルモットの初代培
養線維芽細胞を、直径6.0cmのペトリ皿（培養液:MEM＋
５％FBS＜牛胎児血清＞）に播種し、本成分を培養液1mL
当り50μｇ添加し２週間後のコロニー数を測定した成績
結果である。Table 1 (next table) shows 10 to 1,000 guinea pig primary fibroblasts in a Petri dish (culture medium: MEM + 6.0 cm in diameter).
Seed in 5% FBS <fetal bovine serum>), and add 1 mL of this component to the culture solution.
The results are obtained by adding 50 μg of each and measuring the number of colonies after 2 weeks.

（３）安全性＜皮膚一次刺激性試験＞実施例１で得た甘草の水溶液分画について、１％水溶液
を調整し、背部を除毛した兎（１群３匹，体重3.9Kg前
後）の皮膚に貼付した。判定は、貼布後24,48,72時間に
一次刺激性の評点法により紅斑および浮腫を指標として
行った。 (3) Safety <Primary skin irritation test> Regarding the aqueous solution fraction of licorice obtained in Example 1, 1% aqueous solution was prepared and the back of the rabbit was dehaired (1 group, 3 animals, body weight: about 3.9 kg). It was attached to the skin. The evaluation was carried out 24, 48, and 72 hours after application by using the erythema and edema as indexes by the primary irritation scoring method.

その結果、何等、紅斑および浮腫を認めず陰性と判定さ
れた。As a result, no erythema or edema was observed and it was determined to be negative.

＜急性毒性試験＞試験前４時間絶食させたddY系マウス（１群５匹,30g前
後）を使用し、実施例１で得た甘草の水溶性分画を2,00
0mg/Kg量経口投与し、毒性症状の発現、程度等を経時的
に観察した。<Acute toxicity test> ddY mice (5 mice per group, around 30 g) that had been fasted for 4 hours before the test were used, and the water-soluble fraction of licorice obtained in Example 1 was 2,000.
Oral administration of 0 mg / Kg was performed, and the onset and extent of toxicity symptoms were observed over time.

その結果、すべてのマウスにおいて14日間何等異常を認
めず、また解剖の結果も異常がなかった。LD₅₀2,000mg/
Kg以上と判定された。As a result, no abnormality was observed in all mice for 14 days, and there was no abnormality in the autopsy result. LD ₅₀ 2,000mg /
It was judged to be over Kg.

（４）用途以上、本発明による甘草から得られた水溶性分画は、細
胞賦活作用に優れ、しかも安全な素材であることがわか
る。(4) Use As described above, it is understood that the water-soluble fraction obtained from licorice according to the present invention is a material having excellent cell activating action and being safe.

よって例えば、潰瘍部あるいは外傷部などの再生治癒の
促進剤、あるいは細胞賦活剤として、医薬品あるいは化
粧品など、美容や健康に役立つ製剤などに応用すること
が有用である。Therefore, for example, it is useful to be applied as a promoter for regenerative healing of ulcers or traumas or as a cell activating agent to pharmaceuticals, cosmetics, and other preparations useful for beauty and health.

特に、皮膚や頭髪用の化粧品（スキンケア，ヘアーケア
製品）などには、常用される基剤とともに、配合すれば
よく、その際、添加量については、先の有効性、安全性
の結果からみて甘草由来の有効成分が処方中の１％以下
の範囲となる量が望ましい。In particular, for cosmetics for skin and hair (skin care, hair care products), etc., it may be added together with a commonly used base, in which case the amount of licorice to be added is based on the above-mentioned efficacy and safety results. It is desirable that the amount of the active ingredient derived is within 1% or less of the formulation.

これまで甘草の有効利用に当たっては、そのほとんどが
甘草中の成分であるグリチルリチンやグリチルリチン酸
として利用され、また甘草の抽出エキスも、こうした成
分を指標に定量されたものが医薬品、化粧品、健康食
品、その他の食品などに用いられてきた。Until now, in the effective use of licorice, most of them are used as glycyrrhizin and glycyrrhizic acid, which are the components in licorice, and the extract of licorice is also quantified using these components as an index for pharmaceuticals, cosmetics, health foods, It has been used for other foods.

ところが本発明によれば、従来指標とされてきた主役成
分とは全く異なった分画を有効成分とする利用であり、
これにより甘草の有効的な利用法が大きく拡大されたも
のと考える。However, according to the present invention, the active ingredient is a fraction completely different from the main ingredient that has been conventionally used as an index,
We believe that this has significantly expanded the effective use of licorice.

[Brief description of drawings]

第１図は、本発明による甘草由来細胞賦活成分（実施例
１の工程で得られたフラクションのセフアデックスＧ−
25ファインによる分画）による溶出図である。第２図は、本発明による甘草由来細胞賦活成分の分子量
測定に当って、標準物質を用いて作成した、分子量とKa
v値による検量線である。第２図中、Ａはポリエチレングリコール1,000（平均分
子量1,000）、またＢはポリエチレングリコール4,000
（平均分子量3,000）を示す。FIG. 1 shows a licorice-derived cell activating component according to the present invention (the Sephadex G- fraction of the fraction obtained in the process of Example 1).
It is an elution diagram by 25 fine fractions). FIG. 2 shows the molecular weight and Ka of the licorice-derived cell-activating component according to the present invention, which were prepared by using a standard substance in measuring the molecular weight.
It is a calibration curve by v value. In Figure 2, A is polyethylene glycol 1,000 (average molecular weight 1,000), and B is polyethylene glycol 4,000.
(Average molecular weight 3,000) is shown.

Claims

[Claims]

1. A cell activating agent comprising a fraction having the following properties (a) to (d) extracted from licorice of legumes as an active ingredient. (A) Molecular weight around 1,300 (b) Rf value of paper chromatogram [developing solvent: water / ethanol mixed solution (1: 1)] is 0.80 to 0.85. (C) Soluble in water and 80% ethanol Insoluble in absolute ethanol, n-butanol, ethyl acetate, chloroform, petroleum ether, and ether (d) Positive for Maurish reaction and ninhydrin reaction