JPH0697989B2 - 酵素活性測定用センサとこれを用いた測定装置及び方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、試料との接触反応による酵素活性の光学的測
定に用いる光ファイバセンサとそれを組み込んだ酵素活
性測定装置及び測定方法に関する。

酵素活性の測定は生化学や臨床分析において大変重要な
役割をもっている。基準活性からの偏差は、ある種の病
気の発生を意味する。例えば、酵素「酸性フォスファタ
ーゼ」の活性は骨腫瘤又は前立せん腫瘤が生じた場合に
顕著に高くなる。

〔従来の技術〕

酵素の活性を測定するための多くの方法が知られてい
る。例えば、Ｇ・G.ギルボールト（GUILBAULT）著の
「分析の酵素法（Enzymatic Methcds of Analysis）」
（パーガモン・プレス、オックスフォード、1970年）、
及び、Ｈ・ベルクマイヤ（ERGMEYER）著の「酵素分析の
基礎（Grundlagen der enzymatischen Analyse）」（フ
ェアラーク・ヘミー、ワインハイム−ニューヨーク、19
77年）に記載されている。又、プロテアーゼ基質を用い
るバクテリア病因の確認にも最近興味が集まっている
（コバーン（COBURN）、ライトル（LYTLE）、フーバ（H
UBER）による「分析化学（Anal.Chem）57」（1669、198
5年）参照）。例えば、合成の色素即ち蛍光の基質を用
いて酵素の活性を測定することが知られている。この測
定に、酵素の影響下で色素生成物に分解する酵素基質が
使用される。時間と共に変化する色や蛍光の増加は、酵
素活性の測定値として用いられる。特にこの方法に適し
た測定可能な加水分解酵素としてカルボキシルエステラ
ーゼ、フォスファターゼ、デアルキラーゼ、グリコシタ
ーゼそしてプロテアーゼが挙げられる。

典型的な例としてコラー（KOLLER）とブォルフバイス
（WOLFBEIS）による「分析化学、143、146」（1984年）
で発表されたフォスファターゼの測定方法によれば、下
記の構造Ａを有する燐酸エステルが酵素「酸性フォスフ
ァターゼ」によって２つの成分に分解し、イオン加水分
解生成物Ｂ及び遊離燐酸イオンが生成する。

このヘノラート−イオンＢは、出発基質Ａと異なり、強
い黄色又は青緑色の蛍光を発する。時間経過に伴う色変
化と蛍光の増加が「酸性フォスファターゼ」の活性の測
定値として用いられる。

この測定方法は感度が高く、ミリリットル試料当たり約
0.001活性単位のフォスファターゼの測光検出、及び蛍
光測定におけるミリリットル当たり約60マイクロ単位の
検出を可能にする。

カルボキシルエステラーゼ、スルファターゼはアミラー
ゼの測定方法も同様に知られている。

プロテアーゼは、上記のコバーン、ライトル、フーバの
論文に記載されているように、合成ペプチド又はアミド
を使って類似の方法で測定することができる。これらの
全ての方法は、酵素反応によって多様な色素又は蛍光生
成物が生じることが共通点である。

〔発明が解決しようとする課題〕

上述した公知の測定方法は、いずれも生きている有機体
すなわち生体に直接適用するには適しておらず、酵素活
性測定は従来、試験管の中でのみ行われていた。しか
し、例えば生体内での測定はリアルタイムで行うことが
できるので、種々の理由から要望されている。逆に、従
来の測定方法では試料採取が必要であり、試料採取や試
料の準備の際に生じる誤差が避けられない。

さらに酵素基質を用いる前述したような測定方法は、光
学的に透明な溶液又は試料が与えられている場合にのみ
適しており、血液等の生体内での測定には適していな
い。

そこで、本発明の目的は、上述のような従来技術の問題
点を解消し、特に酵素活性の生体内での測定を可能とす
る酵素活性測定用センサとそれを用いた測定装置及び測
定方法を提供することにある。

〔課題を解決するための手段〕

上記目的を達成すべく、本発明によれば、酵素基質が光
ファイバの端部に配設された光ファイバセンサである酵
素活性測定用センサが提供され、この酵素基質が試料と
接触し、酵素よる反応により引き起こされる酵素基質又
は酵素基質からの反応生成物の光スペクトル特性の変化
を測定することによって、酵素活性が測定される。酵素
基質を光ファイバの端部に配設する具体的な方法として
は、例えば酵素基質を直接ファイバ端面に固定する方
法、光ファイバ端部の被覆を剥がしてコア外周面に固定
する方法、ポリマー，イオン変換膜，ポリアクリルアミ
ド，セルロース等の担体フィルムに固定してこれを光フ
ァイバ端部に貼り付ける方法、水溶性又は膨潤性のポリ
マー担体に酵素基質を固定含有させたものを酵素透過性
膜によって包み込んで光ファイバ端部に取り付ける方法
等が好ましい。このようにして得られた光ファイバセン
サからの光出力を測定して測定信号を評価装置に与える
光検出器、フィルタやレンズを含む光学系等を備えて酵
素活性測定装置が構成される。

〔作用・効果〕

上記のように、加水分解活性酵素のための酵素基質を光
ファイバの端部に配設した光ファイバセンサを用いるこ
とによって、生体内での測定が可能になる。光ファイバ
端部の酵素基質は生体内の試料と接触し、試料の酵素活
性によって酵素基質のスペクトル特性が変化する。この
変化は光ファイバを介して測定される。これにより初め
て、予め試料を調製することなく、血液や他の透明でな
い液体の酵素活性測定が可能となる。

本発明による測定装置及び測定方法の実施態様におい
て、酵素反応により引き起こされる酵素基質の光吸収特
性の変化が光ファイバを介して得られ、酵素活性の測定
値として用いられる。あるいは、酵素反応により引き起
こされる酵素基質の蛍光ビームのスペクトル変化、例え
ば蛍光強度の変化や蛍光最大値のずれが光ファイバを介
して得られ、酵素活性の測定値として用いられる。前者
の場合は酵素基質や反応生成物によって減衰する励起光
の強度が測定され、その強度は接触反応による酵素活性
によって影響される基質の吸収特性に左右される。後者
の場合は、例えばフィルタ又はエネルギ分散検知システ
ムを使って酵素の接触反応による酵素基質の蛍光強度の
変化が光ファイバを介して測定され、その測定値が評価
される。

本発明による測定方法の別実施態様として、酵素活性に
加えてPH値を公知の方法で測定し、この測定値を先に測
定された酵素活性の補正のために用いることも好まし
い。

良く知られているように、多くの酵素反応の速度は溶液
のPH値によって強く左右される。さらに、加水分解の際
遊離される色素の解離度もPH値に左右される。生理的試
料のPH値はある範囲で変動するので、実際に測定された
酵素活性をPH値に関して補正する必要がある。これは実
験に基づく方法で最もうまくいく。酵素活性のPH依存性
は多くの酵素について既知であるが、固定化された酵素
の場合は新しく測定しなければならない。試料の個々の
PH値の測定は酵素活性の測定と同時に行うことが有益で
ある。真の酵素活性は、実際のPH値の関数として、活性
と相対的な信号変化との実験的に定めた関係を用いるこ
とによって最も正確に求められる。

本発明による測定装置は、酵素基質が光ファイバの端部
に配設されて試料と接触し、出力側に信号評価装置と接
続する光検出器が備えられ、この光検出器が酵素基質の
反応生成物から放出される蛍光又は反射された励起光を
測定するものである。ビーム分配器を使って励起光の一
部分を基準光検出器に送り、この基準光検出器の出力信
号を用いて光検出器の測定出力を較正することにより、
励起光源の変動の影響を取り除くことも可能である。測
定目的や酵素の性質に応じて種々の測定技術上のアレン
ジが可能である。しかしながら、酵素基質が光ファイバ
の端部に配設されていることやスペクトル特性の変化が
光ファイバを用いて測定されることは全ての測定システ
ムに共通である。

光検出器として光電子倍増管、フォトトランジスタ又は
フォトダイオードが適している。フォトダイオードは安
価であるが可視スペクトル領域でのみ感応するので、こ
の場合に使用する酵素基質として、その分解が450nm以
上の波長、理想的には500nm以上の波長で観測されるも
のが好ましい。460nm以上の分析波長であれば、光源と
して経済的な発光ダイオードを使用することができる。

光源として白熱電球、蛍光灯、発光ダイオード又はレー
ザが挙げられる。ビーム分配器の代わりに二色性鏡を用
いて、散乱又は反射した励起光と蛍光とを一層良く分離
することができる。光ファイバは単一のファイバが好ま
しいが、ファイバ束でもよい。

蛍光と反射した励起光との分離にフィルタを用いること
も可能である。

本発明による測定装置において、酵素基質は光ファイバ
端部に化学的又は物理的に固定することによって配設さ
れる。例えば酵素基質は直接光ファイバの研摩された出
口端面に固定される。光ファイバの端部の被覆を剥がし
て、コアの外周面に酵素基質を固定することも可能であ
る。励起光の減衰又は蛍光の発生は、いわゆるエバネッ
セント波によって引き起こされる。これは光ファイバの
境界面で全反射が生じる際に、光ファイバより屈折率が
小さい媒質である酵素基質の内部へ数nmだけ進入して境
界面に沿って進む電磁波であって、急激に減衰する。エ
バネッセント波の到達範囲に色素が存在する場合、励起
光がそこで吸収され、また蛍光を引き起こす。反射光ま
たは放射光は光ファイバを通って戻り、光検出器で測定
される。

酵素基質の固定化は種々の方法で行われる。例えば、ク
マリンから誘導された下記の構造の基質はブチル−コリ
ンエステラーゼの測定に適しており、次の方法によって
光ファイバの端部に固定される。

200μｍの太さの石英光ファイバの端面が精密に研摩さ
れ、20％の硫酸水溶液を用いてイオン的な表面の汚れが
取り除かれ、表面が化学的に活性化される。続いて、ガ
ラス表面がガラス誘導化試薬のアミノプロピルートリエ
トキシシランを用いて公知の方法で処理される。この処
理は、基本的にはガラスの活性表面が、トルエンによる
10％シラン溶液中において、100℃で２時間加熱された
後、アセトンで洗浄され、120℃で乾燥することによっ
て行われる。このようにして端部に遊離アミノ基を持つ
光ファイバが得られる。

このアミノ基に公知の化学的方法によって酵素基質が結
合される。先に述べた基質Ｉはペプチド結合試薬エチル
−Ｎ′−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイ
ミド−塩酸塩を使って固定化される。別の方法として、
基質を対応する塩化カルボン酸に変換したのちガラス表
面のアミノ基と反応させてもよい。

このようにして得られた光ファイバの端部を酵素ブチリ
ルコリンエステラーゼを含む溶液と接触させれば、410
〜430nmの分析波長における光吸収の顕著な増加、及
び、460〜470nmにおける蛍光強度の増加がやがて測定装
置に検出される。

上記の例と同様の方法で、同じ基本分子から導き出され
たスルファターゼ、アミラーゼ、プロテアーゼのための
典型的な基質が固定化される。スルファターゼ、アミラ
ーゼ、プロテアーゼの基質はそれぞれの次の構造II,II
I,IVを有する。

全ての場合において、試料の酵素活性は420nmにおける
吸収の増加と460nmにおける蛍光の増加とをもたらす。

次の構造Ｖは酵素リバーゼのための基質である。

これはVIで示す構造を有するＩ−ヒドロキシピレン−3,
6,8−トリスルフォナートから誘導され、静電的に固定
化される酸素基質の一例である。この固定化は基質の負
に帯電したスルフォン基と、担体として用いられる陰イ
オン交換体の正に帯電した表面アンモニウム基との間の
相互作用による。

本発明によるさらに別な実施態様において、酵素基質を
薄い担体フィルムに固定しておき、これを光ファイバの
端部に取り付けることができる。次に酵素基質を静電的
に固定化した膜の典型的な調製について説明する。

陰イオン交換膜を50mlのメタノールによる1gの１−ヒド
ロキシピレン−3,6,8−トリスルフォナートVIの溶液に
浸す。約２分後に、黄色に変色した緑色の蛍光を発する
膜を溶液から引き上げ、これをまずPH7の約0.06モルの
リン酸塩緩衝液で洗浄し、それから水で洗浄する。これ
を乾燥した後、100mgのラウリン酸無水物のジオキサン
溶液に浸し、これによって膜の表面に結合しているVIが
Ｖに変換される。このラウリン酸無水物の溶液は1mlの
ジオキサンに0.1gのラウリン酸を溶かし、0.1gのＮ、
Ｎ′−ジシクロヘキシルカルボジイミドを添加し、生じ
た沈澱物をろ過することによって作られる。２時間後に
この膜を溶液から取出して乾性アセトンで洗う。この膜
は蛍光や今は青紫色となり、黄色は消えている。

この膜が光ファイバの端部に取り付けられ、酵素リバー
ゼの溶液に接触すると、その基質は酵素によって、鮮明
な緑色の蛍光を発する黄色の加水分解生成物に変化す
る。460nmでの吸収の増加、又は520〜535nmでの緑色蛍
光の増加は光ファイバを介して検出される。これによっ
て試料中の酵素活性が直接測定される。この基質の分解
は酵素リバーゼのみならず、血清アルブミンによっても
生ずる。後者の活性はかなり高いので、このセンサは人
間の例えば血液中の血清アルブミンの測定に用いられ
る。

後者の方法は、ヒドロラーゼのための他の固定化酵素基
質の製造にも適している。これは酵素感応膜を調製する
ための方法としてだけでなく既に使用されたセンサの再
生のためにも用いられる。

種々の加水分解酵素による固定化酵素基質の分解は固体
表面つまり基質の担体上で生ずる。かかる分解は、化学
的に固定された基質の場合、基質が周囲全方向で酵素に
さらされる溶液中に比べてゆっくりと進行する。加水分
解の速度が遅いほど、小規模に起こる非酵素による基質
の加水分解の影響が大きく現れてくる。

本発明に従って、光ファイバの表面又は担体フィルムの
表面と酵素基質との間に長鎖のスペーサーを存在させる
ことにより、固定化された基質の酵素による加水分解の
速度はかなり加速されることがわかった。

適当なスペーサとして、例えばヘキサメチレンジアミン
のような長鎖のジアミンが用いられる。スペーサはシリ
ル化試薬と共に例えば「長鎖アミン」を用いて直接導入
される。

色の濃い試料、例えば血液が光学系に影響を与えること
を防ぐために、光ファイバの端部を保護キャップで覆う
ことが好ましい。この保護キャップは大きい有色粒子、
例えば赤血球の侵入を阻止する一方、酵素の通過は許容
する。この蛋白質透過性の保護キャップのための理想的
な材料はセルロースである。

光ファイバの端部に直接酵素基質を固定化する代わり
に、反応室を形成する酸素透過性膜によって光ファイバ
の端部を包み込む構成も好ましい。この膜は酵素基質を
含み、試料の細胞成分を透過させない。上記反応室は測
定されるべき酵素が透過できなければならないが、同時
に酵素基質が拡散によって出て行くのを防止する必要が
ある。

本発明によれば、酸素基質の拡散は、酵素基質を水溶性
又は膨潤性のポリマに例えば化学固定化によって結合す
ることによって阻止される。反応室における酵素基質の
担体として用いられる水溶性又は膨潤性のポリマとし
て、デキストラン、アガロース、ポリエチレンイミン、
ポリアクリルアミド又はポリアルコールがある。担体ポ
リマは、その分子が保護キャップを通り抜けることがで
きない十分大きなものでなければならない。固定化され
た基質は酵素によって加水分解され、そのスペクトル特
性が変化する。この変化は光ファイバを介して、酵素活
性として測定される。発生した色素の相当量がセルロー
ス膜を通って拡散するので、酵素反応が拡散に比べてか
なり速く行われる必要がある。

上記装置の場合、スペクトル特性が酵素反応により顕著
に変化する酵素基質だけが使われる。これは、光ファイ
バが酵素基質及びその分解生成物の両方信号を伝達する
ことによる。それ故、別の実施態様にあっては、酵素基
質が光ファイバの端部に配設された円柱状の反応室の内
周面に固定化され、反応室の試料側端面には試料の細胞
を透過させない酵素透過性膜が備えられ、かつ酸素反応
によって生じた反応生成物が反応室内へ拡散するように
構成される。酵素基質とその分裂生成物との分離によ
り、分解生成物の生成が顕著に観察される。

励起光の最大出射角αと前記円柱状反応室の直径及び長
さの関係により、光学的な分離が簡単に得られ、これに
よって酵素基質が直接励起されることが回避される。内
周面に酵素基質を備える円柱壁は、最大射出角αで光フ
ァイバから出る励起光の領域外に位置し、酵素反応が生
じない限り酵素基質は信号を生成しない。

測定されるべき酵素が反応室に入ると、色素の放出を伴
う酵素反応が生ずる。その色素は反応室内で分散し、そ
の色又は蛍光が光ファイバを介して検出される。色ある
いは蛍光強度の増加が酵素活性として測定される。

上記の測定装置は以下のような基本的な利点を有する。

（ａ）酵素基質とその分解生成物が空間的に分離してい
るため光スペクトルの重複がなく、高い無効値（blank
values）が避けられる。

（ｂ）合成の酵素基質のみならず、色素で染められた自
然の基質も使用することができる。

次の例は、本発明による測定装置の適用範囲の広さを示
しており、その固定化はほとんどがポリマ担体、スペー
サー、そして本来の色素の化学的結合によって行われ
る。

（１）７−オキシクマリン−３−カルボン酸のスペーサ
（アジピン酸）を介するセルロース膜又は他のOH基を持
つポリマの表面への固定化によって次の構造を有する表
面ができる。

カルボキシスエステラーゼのグループの酵素によるCO−
Ｏ−結合の分解によって色素が発生し、この色素が光フ
ァイバからの励起光の領域内に拡散して測定される。

（２）３−シアノ−７−ヒドロキシクマリンのCH₂−CH₂
−CH₂−CH₂スペーサを介するOHを含むポリマへの固定化
によって次の構造ができる。

このプロセスから生まれる固定化色素はデアルキラーゼ
のための合成基質である。これはエーテル基を分解して
蛍光色素７−ヒドロシクマリン−３−カルボン酸を遊離
し、この色素が光ファイバを介して検出される。

（３）ガラス表面に固定化されたプロテアーゼ基質の構
造を次に示す。

合成基質のみならず、色素で染められた自然の基質、例
えば蛋白質も反応室の内面に固定化される。例えば卵白
リゾチームが壁の内面に固定化され、次に蛍光色素、例
えばフルオレセイン−イソチオシアン酸塩で染められ
る。この基質は酸素トリプシンと接触すると分解する。
フルオレセインとフルオレセインによって染められたリ
ゾチームは、光ファイバから出る励起光の領域内に拡散
して蛍光分析により測定される。

固定化された蛋白質は簡単に調製することができるが、
市販品を入手することもできる。サッカライド、つまり
砂糖状化合物も固定化された形で市販されている。例え
ば固定化Ｎ−アセチルグルコサミン、乳糖、メリビオー
ゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン、フコース、マンノー
ス、セロビオース、ガラクトース、そしてグルコースで
ある。これらを反応室の内壁に付着させて色素で染めれ
ばよい。その色素としては、フルオレセイン−イソチオ
シアン酸塩、ダンシル塩化物、フルオレスカミン、ナフ
チルイソシアン酸塩そしてユーロピウムキレートがあ
る。染色された分子は酵素反応によって遊離して反応室
に拡散し、光ファイバによって検出される。

反応室を囲む壁材料は酵素基質自体であってもよい。例
えばポリグルコシドに属するアミロースを用い、壁材料
の内面が蛍光色素で染められる。ポリペプチドや脂肪酸
エステルを含む他の物質も基質及び壁材料として使用さ
れる。非水溶性物質のみが使用されることはいうまでも
ない。

染色された自然の酵素基質を使用する利点は、自然の基
質に対して酵素が有する高い特異性を有することができ
ることにある。蛍光分析との組み合わせによって、感度
が良く、且つ、特異的な測定方法を見出す目的が達成さ
れた。

多くの酵素は複数の形で生じ、サブグループを形成す
る。典型的な例はフォスファターゼである。これには、
アルカル溶液内で最大活性を呈するアルカリ性フォスフ
ァターゼと酸性溶液内で最大活性を呈する酸性フォスフ
ァターゼとがある。臨床的に重要な酸性フォスファター
ゼは、例えばPH7.4では、アルカリ性フォスファターゼ
の活性を少なくとも部分的に包含していなければ測定す
ることができない。

この問題は、２つの酵素感応性光ファイバカテーテルを
使用することによって回避される。これらのカテーテル
は、それぞれの終端部に備えられた酵素基質が各酵素に
対して異なる親和力を有し、且つ、異なる最大反応速度
を有する点で区別される必要がある。基質に対する酵素
の親和力はミカエリス−メンテン定数によって与えら
れ、最大速度は最大反応速度を示す量によって与えられ
る。

〔実施例〕

次に本発明を第１図から第５図に示した実施例に基づい
て詳しく説明する。第１図において、光源１から発する
光はコリメータレンズ２で集光され、フィルタ３を通っ
たのちフォーカスレンズ４によって光ファイバ６の入力
側端部５に入り込む。その光の波長は、酵素による加水
分解で遊離した色素による吸収が最大になるようにフィ
ルタ３を用いて調整される。光の一部分はビーム分配器
７によって分けられ標準光検出器８に入る。この標準光
検出器８は光源１の強度変動の影響を除去するために用
いられる。

光ファイバ６を介して励起光が入射する酵素基質９は、
光ファイバ６の出口側端部10に固定化されている。酵素
基質９が酵素によって分解されると、入射した光は色素
反応生成物９′の形成によって徐々に吸収されて減衰す
る。一方、その色素が蛍光性であれば、徐々に強くなっ
ていく蛍光強度が観測される。反射励起光及び蛍光は同
じ光ファイバ６により戻され、ビーム分配器７のハーフ
ミラーになっている表面11で反射し、レンズ12、13を通
って光検出器14に達する。蛍光を測定する場合は、ビー
ム分配器７から検出器14までの光路に反射励起光を通さ
ない第２の光学フィルタ15を設置し、これにより選択さ
れた蛍光だけが検出される。

光検出器14の出力である測定信号Ｓならびに標準光検出
器８の出力である標準信号Ｒは増幅され、図示されてい
ない表示装置または評価装置に送られる。

第２図はコア16と被覆（sheathing）17が異なる屈折率
を有する光ファイバ６の端部10を拡大して示している。
酵素基質９は薄い担体フィルム18、例えばセルロース、
イオン交換膜又はポリアクリルアミドでつくられたもの
に固定化され、光ファイバ６の出口側端部10に貼り付け
られる。

第３図に示すように、光ファイバ６の出口側端部10のコ
ア16の外周面19に酵素基質９を付着することもできる。
この場合、光ファイバ６の出口側端部10の被覆17は剥が
される。そして、光ファイバ６の端面には光を反射する
キャップ21が着けられる。

第４図には、例えばセルロースでつくられた蛋白質透過
性膜23によって囲まれた球状の反応室22を出口側端部10
に備えた光ファイバ６が示されている。反応室22には比
較的小さい分子の酵素基質９が含まれ、この酵素基質９
は膜23を通って外部に拡散し得る。この拡散を阻止する
ために酵素基質９は大きな分子の水溶性ポリマに固定化
される。反応室22内の酵素基質のための担体として水溶
性又は膨潤性のポリマが適している。

第５図に示す実施例では反応生成物９′がもとの酵素基
質９から空間的に分離される。光ファイバ６の出口側端
部10に円筒体26で囲まれた反応空間24が設けられ、その
試料側端面は例えばセルロースや多孔性ポリカーボネー
トでつくられた酵素が透過可能な膜23で覆われている。
円筒体26の内壁25は色素即ち蛍光酵素基質９で覆われて
いる。前述の実施例と異なり、酵素基質９は反応空間全
体にに一様に分布しておらず、円筒体26の内壁25にのみ
化学的、静電的又は物理的に固定化されている。

測定されるべき酵素が矢印29に沿って膜23を通って反応
空間24に入ると、酵素反応が起こり反応生成物９′を放
出する。この反応生成物９′は反応空間24内を自由に動
き、励起光の最大出射角αによって決まる領域内に拡散
する。この構成では、光ファイバ６の端面から出る励起
光が円筒体の内壁25に固定化された酵素基質９に当たら
ないように、円筒体26の直径27及び長さ28を決める必要
がある。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の実施例に係る酵素活性の光学的測定装
置の概略構成図、第２図から第５図は第１図の測定装置
に用いる光ファイバセンサの種々の実施例を示す光ファ
イバ端部の拡大断面図である。 ６……光ファイバ、７……ビーム分配器、９……酵素基
質、９′……反応生成物、10……光ファイバの端部、16
……光ファイバのコア、20……光ファイバの端面、14…
…光検出器、18……担体フィルム、23……酵素透過性
膜、24……反応空間、26……円筒体、25……円筒体の内
壁面。

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】酵素基質（９）を光ファイバ（６）の端部
   （10）に試料と接触可能に配設した酵素活性測定用セン
   サ。
2. 【請求項２】酵素基質（９）を光ファイバ（６）の端面
   （20）又はコア（16）の外周面（19）に物理的又は化学
   的に固定した特許請求の範囲第１項記載のセンサ。
3. 【請求項３】酵素基質（９）を担体フィルム（18）に固
   定し、この担体フィルム（18）を光ファイバ（６）の端
   部（10）に貼り付けた特許請求の範囲第１項又は第２項
   記載のセンサ。
4. 【請求項４】光ファイバ（６）の表面又は担体フィルム
   （18）の表面にスペーサーを介して酵素基質（９）を固
   定した特許請求の範囲第１項、第２項、又は第３項記載
   のセンサ。
5. 【請求項５】酵素基質（９）を光ファイバ（６）の端部
   （10）に試料と接触可能に配設した光ファイバセンサ
   と、その光出力を測定して測定信号（Ｓ）を評価装置に
   与える光検出器（14）とが備えられ、この検出器（14）
   が酵素基質（９）又はその反応生成物（９′）によって
   放出される蛍光又は励起光の変化を光ファイバを介して
   測定する酵素活性測定装置。
6. 【請求項６】酵素基質（９）が光ファイバ（６）の端部
   （10）に配設された反応空間（24）を形成する円筒体
   （26）の内壁面（25）に固定され、前記円筒体（26）の
   試料側端面には試料の細胞を透過させない酵素透過性膜
   （23）が備えられ、酵素反応によって生成した反応生成
   物（９′）が前記反応空間（24）に拡散する特許請求の
   範囲第５項記載の測定装置。
7. 【請求項７】光ファイバ（６）の端面（20）から最大出
   射角（α）より小さい角度で出射する励起光が前記円筒
   体の内壁面（25）に固定された酵素基質（９）に当たら
   ないように、前記円筒体（26）の直径及び長さが決めら
   れている特許請求の範囲第６項記載の測定装置。
8. 【請求項８】酵素基質を光ファイバの端部に試料と接触
   可能に配設した光ファイバセンサを用いて、酵素基質又
   はその反応生成物によって放出される蛍光又は励起光の
   変化を前記光ファイバを介して測定する酵素活性測定方
   法。
9. 【請求項９】酵素活性に加えて試料のPH値も測定され、
   このPH測定値が酵素活性の測定値の補正のために用いら
   れる特許請求の範囲第８項記載の測定方法。