JPH07100031B2 - Ｎａｄｈオキシダーゼ及びその製造法 - Google Patents
Ｎａｄｈオキシダーゼ及びその製造法Info
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- JPH07100031B2 JPH07100031B2 JP40788990A JP40788990A JPH07100031B2 JP H07100031 B2 JPH07100031 B2 JP H07100031B2 JP 40788990 A JP40788990 A JP 40788990A JP 40788990 A JP40788990 A JP 40788990A JP H07100031 B2 JPH07100031 B2 JP H07100031B2
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- nadh oxidase
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、還元型ニコチンアミド
アデニンジヌクレオチド(ＮＡＤＨ)オキシダーゼ及びそ
の製造法に関する。より詳しくは本発明は、酸素分子
(Ｏ2)存在下にＮＡＤＨを基質特異的に酸化して過酸化
水素(Ｈ2Ｏ2)を生成し、細菌ストレプトコッカス・ミュ
ータンス(Ｓtreptococcus mutans)から得られるＮＡＤ
Ｈの測定等に有用なＮＡＤＨオキシダーゼ、及びその製
造法に関する。
アデニンジヌクレオチド(ＮＡＤＨ)オキシダーゼ及びそ
の製造法に関する。より詳しくは本発明は、酸素分子
(Ｏ2)存在下にＮＡＤＨを基質特異的に酸化して過酸化
水素(Ｈ2Ｏ2)を生成し、細菌ストレプトコッカス・ミュ
ータンス(Ｓtreptococcus mutans)から得られるＮＡＤ
Ｈの測定等に有用なＮＡＤＨオキシダーゼ、及びその製
造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来、Ｈ2Ｏ2・ジェネレイティング(Ｈ2
Ｏ2 generating)ＮＡＤＨオキシダーゼとしては、ラク
トバチルス・プランタラム(Ｌactobacillus plantaru
m)由来のもの[アグリカルチュラル・アンド・バイオロ
ジカル・ケミストリー(Ａgricultural and Ｂiologic
al Ｃhemistry)、第２５巻、第８７６頁、１９６１
年];アコレプセズマ・ライドラウイ(Ａcholeplasma la
idlawii)由来のもの[ヨーロッピアン・ジャーナル・オ
ブ・バイオケミストリー(Ｅuropean Ｊournal ofＢio
chemistry)、第１２０巻、第３２９頁、１９８１年];ロ
イコノストック・メッセンテロイデス(Ｌeouconostoc
mesenterodes)由来のもの[ジャーナル・オブ・バイオケ
ミストリー(Ｊournal of Ｂiochemistry)、第９７
巻、第１２７頁、１９８５年];バチルス・メガテリウム
(Ｂacillus megaterium)由来のもの[ジャーナル・オブ
・バイオケミストリー(Ｊournal of Ｂiochemistr
y)、第９８巻、第１４３３頁、１９８５年];バチルス・
リケニホルミス(Ｂacillus licheniformis)、バチルス
・ズブチリス(Ｂacillus subtilis)、バチルス・プミ
ルス(Ｂacillus pumilus)、バチルス・アノイリノリテ
ィカス(Ｂacillus aneurinolyticus)、バチルス・スフ
ェリカス(Ｂacillus sphaericus)、バチルス・アミロ
リクエファシエンス(Ｂacillus amyloliquefaciens)、
バチルス・セレウス(Ｂacillus cereus)、バチルス・
テューリンギエンシス(Ｂacillus thuringiensis)由来
のもの[何れも、特開昭６３−２５１０８２号公報];及
びブレビバクテリウム・アンモニアゲネス(Ｂrevibacte
rium ammoniagenes)、コリネバクテリウム・フラカム
ファシエンス(Ｃorynebacterium flaccumfaciens)、ア
リスロバクター・アトロシアネウス(Ａrthrobacter atro
cyaneus)、ミクロコッカス・フラバス(Ｍicrococcus f
ulvus)、シュードモナス・アエルギノザ(Ｐseudomonas
aeruginosa)、アクロモバクター・バルプラス(Ａchro m
obacter pulpulus)、アグロバクテリウム・ラジオバク
ター(Ａgrobacterium radiobacter)、フラボバクテリ
ウム・エステラロマティカム(Ｆlavobacterium este ra
romaticum)、ストレプトマイセス・アウレウス(Ｓtre pt
omyces aureus)由来のもの[特開昭６３−４４８８２号
公報]等が報告されている。
Ｏ2 generating)ＮＡＤＨオキシダーゼとしては、ラク
トバチルス・プランタラム(Ｌactobacillus plantaru
m)由来のもの[アグリカルチュラル・アンド・バイオロ
ジカル・ケミストリー(Ａgricultural and Ｂiologic
al Ｃhemistry)、第２５巻、第８７６頁、１９６１
年];アコレプセズマ・ライドラウイ(Ａcholeplasma la
idlawii)由来のもの[ヨーロッピアン・ジャーナル・オ
ブ・バイオケミストリー(Ｅuropean Ｊournal ofＢio
chemistry)、第１２０巻、第３２９頁、１９８１年];ロ
イコノストック・メッセンテロイデス(Ｌeouconostoc
mesenterodes)由来のもの[ジャーナル・オブ・バイオケ
ミストリー(Ｊournal of Ｂiochemistry)、第９７
巻、第１２７頁、１９８５年];バチルス・メガテリウム
(Ｂacillus megaterium)由来のもの[ジャーナル・オブ
・バイオケミストリー(Ｊournal of Ｂiochemistr
y)、第９８巻、第１４３３頁、１９８５年];バチルス・
リケニホルミス(Ｂacillus licheniformis)、バチルス
・ズブチリス(Ｂacillus subtilis)、バチルス・プミ
ルス(Ｂacillus pumilus)、バチルス・アノイリノリテ
ィカス(Ｂacillus aneurinolyticus)、バチルス・スフ
ェリカス(Ｂacillus sphaericus)、バチルス・アミロ
リクエファシエンス(Ｂacillus amyloliquefaciens)、
バチルス・セレウス(Ｂacillus cereus)、バチルス・
テューリンギエンシス(Ｂacillus thuringiensis)由来
のもの[何れも、特開昭６３−２５１０８２号公報];及
びブレビバクテリウム・アンモニアゲネス(Ｂrevibacte
rium ammoniagenes)、コリネバクテリウム・フラカム
ファシエンス(Ｃorynebacterium flaccumfaciens)、ア
リスロバクター・アトロシアネウス(Ａrthrobacter atro
cyaneus)、ミクロコッカス・フラバス(Ｍicrococcus f
ulvus)、シュードモナス・アエルギノザ(Ｐseudomonas
aeruginosa)、アクロモバクター・バルプラス(Ａchro m
obacter pulpulus)、アグロバクテリウム・ラジオバク
ター(Ａgrobacterium radiobacter)、フラボバクテリ
ウム・エステラロマティカム(Ｆlavobacterium este ra
romaticum)、ストレプトマイセス・アウレウス(Ｓtre pt
omyces aureus)由来のもの[特開昭６３−４４８８２号
公報]等が報告されている。
【０００３】しかしながら、これらの微生物由来のＨ2
Ｏ2・ジェネレイティングＮＡＤＨオキシダーゼは、い
ずれも基質特異性がなく、ＮＡＤＨ以外に還元型ニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(ＮＡＤＰＨ)に
も作用するため、ＮＡＤＨとＮＡＤＰＨが混合した試料
中のＮＡＤＨの定量には使用できない欠点がある。さら
に、これらのＮＡＤＨオキシダーゼは、酵素生産菌の培
養が難しく大量生産が出来ない(アコレプラズマ・ライ
ドラウイ等)、膜結合性酵素であるため酵素の大量精製
が困難である(バチラス・メガテリウム等)、不安定で長
期保存に耐えない(ロイコノストック・メッセンテロイ
デス等)、通常５〜４０時間の酵素生産時間を要する(ブ
レビバクテリウム・アンモニアゲネス、コリネバクテリ
ウム・フラカムフアシエンス、アースロバクター・アト
ロシアネウス、ミクロコッカス・フラバス、シュードモ
ナス・アエルギノーザ、アクロモバクター・パルプラ
ス、アグロバクテリウム・ラジオバクター、フラボバク
テリウム・エステロアロマティカム、ストレプトマイセ
ス・アウレウス、バチルス・リケニホルミス、バチルス
・ズブチリス、バチルス・プルミス、バチルス・アノイ
リノリティカス、バチルス・スフェリカス、バチルス・
アミロリクエファシエンス、バチルス・セレウス、バチ
ルス・チュウリンギエンシス等)などの欠点を有してい
る。
Ｏ2・ジェネレイティングＮＡＤＨオキシダーゼは、い
ずれも基質特異性がなく、ＮＡＤＨ以外に還元型ニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(ＮＡＤＰＨ)に
も作用するため、ＮＡＤＨとＮＡＤＰＨが混合した試料
中のＮＡＤＨの定量には使用できない欠点がある。さら
に、これらのＮＡＤＨオキシダーゼは、酵素生産菌の培
養が難しく大量生産が出来ない(アコレプラズマ・ライ
ドラウイ等)、膜結合性酵素であるため酵素の大量精製
が困難である(バチラス・メガテリウム等)、不安定で長
期保存に耐えない(ロイコノストック・メッセンテロイ
デス等)、通常５〜４０時間の酵素生産時間を要する(ブ
レビバクテリウム・アンモニアゲネス、コリネバクテリ
ウム・フラカムフアシエンス、アースロバクター・アト
ロシアネウス、ミクロコッカス・フラバス、シュードモ
ナス・アエルギノーザ、アクロモバクター・パルプラ
ス、アグロバクテリウム・ラジオバクター、フラボバク
テリウム・エステロアロマティカム、ストレプトマイセ
ス・アウレウス、バチルス・リケニホルミス、バチルス
・ズブチリス、バチルス・プルミス、バチルス・アノイ
リノリティカス、バチルス・スフェリカス、バチルス・
アミロリクエファシエンス、バチルス・セレウス、バチ
ルス・チュウリンギエンシス等)などの欠点を有してい
る。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、ＮＡＤＨに
基質特異性を有し且つ長期保存が可能な、ＮＡＤＨの定
量に有用であるＮＡＤＨオキシダーゼを提供すること
を、目的とする。本発明は又、そのようなＮＡＤＨオキ
シダーゼを、短時間で容易に大量生産・精製出来る製造
方法を提供することも、目的とする。
基質特異性を有し且つ長期保存が可能な、ＮＡＤＨの定
量に有用であるＮＡＤＨオキシダーゼを提供すること
を、目的とする。本発明は又、そのようなＮＡＤＨオキ
シダーゼを、短時間で容易に大量生産・精製出来る製造
方法を提供することも、目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記目的を
達成するため、工業的生産に適したＮＡＤＨオキシダー
ゼについて広く検索した結果、通性嫌気性細菌ストレプ
トコッカス・ミュータンスが、ＮＡＤＨにのみ特異的に
作用するＨ2Ｏ2・ジェネレイティングＮＡＤＨオキシダ
ーゼを生成することを見い出し、また嫌気培養菌を好気
条件下に移し短時間(通常３〜４時間)の通気撹拌培養に
より容易に酵素生産が可能であることを明らかにするこ
とによって、本発明を完成した。
達成するため、工業的生産に適したＮＡＤＨオキシダー
ゼについて広く検索した結果、通性嫌気性細菌ストレプ
トコッカス・ミュータンスが、ＮＡＤＨにのみ特異的に
作用するＨ2Ｏ2・ジェネレイティングＮＡＤＨオキシダ
ーゼを生成することを見い出し、また嫌気培養菌を好気
条件下に移し短時間(通常３〜４時間)の通気撹拌培養に
より容易に酵素生産が可能であることを明らかにするこ
とによって、本発明を完成した。
【０００６】即ち本発明は、酸素分子存在下にＮＡＤＨ
を基質特異的に酸化して過酸化水素を生成し、分子量２
０００００〜２２００００を有するＮＡＤＨオキシダー
ゼを、提供する。更に本発明は、細菌ストレプトコッカ
ス・ミュータンス(Ｓtreptococcus mutans)を培養し、
培養物から上記ＮＡＤＨオキシダーゼを採取することを
特徴とする上記ＮＡＤＨオキシダーゼの製造法も、提供
する。
を基質特異的に酸化して過酸化水素を生成し、分子量２
０００００〜２２００００を有するＮＡＤＨオキシダー
ゼを、提供する。更に本発明は、細菌ストレプトコッカ
ス・ミュータンス(Ｓtreptococcus mutans)を培養し、
培養物から上記ＮＡＤＨオキシダーゼを採取することを
特徴とする上記ＮＡＤＨオキシダーゼの製造法も、提供
する。
【０００７】本発明のＮＡＤＨオキシダーゼは、以下の
酵素化学的諸性質を有する。
酵素化学的諸性質を有する。
【０００８】作用及び基質特異性:本発明のＮＡＤＨ
オキシダーゼは以下の反応式で示す如く、分子状酸素
(Ｏ２）でＮＡＤＨを酸化して、ＮＡＤ＋と過酸化水素
を生成する反応を触媒する。 ＮＡＤＨ ＋ Ｈ+ ＋ Ｏ2 → ＮＡＤ+ ＋ Ｈ2Ｏ2 本酵素は、ＮＡＤＨにのみ作用しＮＡＤＰＨには作用し
ない。ＮＡＤＰＨを酸化できないという本酵素の特性
は、ＮＡＤＨとＮＡＤＰＨが混在する生体試料中のＮＡ
ＤＨ量を選択的に測定できるという利点がある。
オキシダーゼは以下の反応式で示す如く、分子状酸素
(Ｏ２）でＮＡＤＨを酸化して、ＮＡＤ＋と過酸化水素
を生成する反応を触媒する。 ＮＡＤＨ ＋ Ｈ+ ＋ Ｏ2 → ＮＡＤ+ ＋ Ｈ2Ｏ2 本酵素は、ＮＡＤＨにのみ作用しＮＡＤＰＨには作用し
ない。ＮＡＤＰＨを酸化できないという本酵素の特性
は、ＮＡＤＨとＮＡＤＰＨが混在する生体試料中のＮＡ
ＤＨ量を選択的に測定できるという利点がある。
【０００９】分子量:本発明のＮＡＤＨオキシダーゼ
は、標準蛋白としてリボヌクレエースＡ、キモトリプシ
ノーゲンＡ、オバルブミン、牛血清アルブミン、アルド
ラーゼ、カタラーゼ及びフェリチン(ファルマシア高分
子量及び低分子量タンパク質マーカー)等を使用したス
ーパーローズ１２(ＦＰＬＣシステム、ファルマシア)ゲ
ル濾過クロマトグラフィーの結果から、分子量は２０万
〜２２万と推定される。又、標準蛋白としてカルボニッ
ク・アンヒドラーゼ、オバルブミン、牛血清アルブミ
ン、オボトランスフェリン、(ＢＤＨ分子量マーカー)等
を使用したナトリウムドデシルサルフェートを用いたポ
リアクリルアミドゲル電気泳動法の結果から、本酵素は
分子量５．５〜５．６万の同一蛋白から構成されると推
定される。即ち、本酵素は、分子量５．５〜５．６万の
同じサブユニットから成る４量体とみなされる。
は、標準蛋白としてリボヌクレエースＡ、キモトリプシ
ノーゲンＡ、オバルブミン、牛血清アルブミン、アルド
ラーゼ、カタラーゼ及びフェリチン(ファルマシア高分
子量及び低分子量タンパク質マーカー)等を使用したス
ーパーローズ１２(ＦＰＬＣシステム、ファルマシア)ゲ
ル濾過クロマトグラフィーの結果から、分子量は２０万
〜２２万と推定される。又、標準蛋白としてカルボニッ
ク・アンヒドラーゼ、オバルブミン、牛血清アルブミ
ン、オボトランスフェリン、(ＢＤＨ分子量マーカー)等
を使用したナトリウムドデシルサルフェートを用いたポ
リアクリルアミドゲル電気泳動法の結果から、本酵素は
分子量５．５〜５．６万の同一蛋白から構成されると推
定される。即ち、本酵素は、分子量５．５〜５．６万の
同じサブユニットから成る４量体とみなされる。
【００１０】Ｋm値(尚「Ｋm」は、「酵素反応物生成速
度比が最大の速度Ｖの１／２となる基質濃度」と定義さ
れ、数値が小さい程、酵素とＮＡＤＨとの親和性が高
い。):本酵素のＫm値は１０-6Ｍ〜１０-5Ｍの範囲内に
ある。この値は、本酵素のＮＡＤＨに対する親和性が非
常に強いことを示す。尚、生体内のＮＡＤＨの濃度はμ
Ｍレベルであり、１０-5親和性が弱い従来のＮＡＤＨオ
キシダーゼでは生体試料中のＮＡＤＨの定量は不可能で
ある。
度比が最大の速度Ｖの１／２となる基質濃度」と定義さ
れ、数値が小さい程、酵素とＮＡＤＨとの親和性が高
い。):本酵素のＫm値は１０-6Ｍ〜１０-5Ｍの範囲内に
ある。この値は、本酵素のＮＡＤＨに対する親和性が非
常に強いことを示す。尚、生体内のＮＡＤＨの濃度はμ
Ｍレベルであり、１０-5親和性が弱い従来のＮＡＤＨオ
キシダーゼでは生体試料中のＮＡＤＨの定量は不可能で
ある。
【００１１】要求性:本酵素は、フラビンアデニンジ
ヌクレオチド(ＦＡＤ)の添加により活性化される。
ヌクレオチド(ＦＡＤ)の添加により活性化される。
【００１２】至適pＨ及びpＨ安定性:本酵素は、pＨ
５．５〜７．０、特にpＨ６．０付近で最大活性を示す
(図１参照)。本酵素の至適pＨが中性付近にあること
は、生体試料そのものの測定に適する。更に、本酵素の
活性は、pＨ５．０〜８．０、特にpＨ６．０〜８．０に
於いて９０％保持され、pＨ安定性が大きい(図４参
照)。
５．５〜７．０、特にpＨ６．０付近で最大活性を示す
(図１参照)。本酵素の至適pＨが中性付近にあること
は、生体試料そのものの測定に適する。更に、本酵素の
活性は、pＨ５．０〜８．０、特にpＨ６．０〜８．０に
於いて９０％保持され、pＨ安定性が大きい(図４参
照)。
【００１３】作用適温の範囲:リン酸緩衝液(５０m
Ｍ、pＨ７．０)を用いて測定したところ、本酵素は３０
〜５０℃、特に３７℃〜４０℃付近で最大活性を示す
(図２参照)。本酵素の作用至適温度が体温付近にあるこ
とは、生体試料そのものの測定に適する。
Ｍ、pＨ７．０)を用いて測定したところ、本酵素は３０
〜５０℃、特に３７℃〜４０℃付近で最大活性を示す
(図２参照)。本酵素の作用至適温度が体温付近にあるこ
とは、生体試料そのものの測定に適する。
【００１４】耐熱性:本酵素の熱安定性をリン酸緩衝
液(５０mＭ、pＨ７．０)で測定したところ、５０℃で加
熱した時、３０分間で約６０％の活性が保持される(図
３参照)。更にリン酸緩衝液にエチレンジアミン四酢酸
(ＥＤＴＡ)、ＮＡＤＨ、ＦＡＤ、ＤＴＴを添加すること
によって、耐熱性を高めることができる。
液(５０mＭ、pＨ７．０)で測定したところ、５０℃で加
熱した時、３０分間で約６０％の活性が保持される(図
３参照)。更にリン酸緩衝液にエチレンジアミン四酢酸
(ＥＤＴＡ)、ＮＡＤＨ、ＦＡＤ、ＤＴＴを添加すること
によって、耐熱性を高めることができる。
【００１５】上記のように本発明のＨ2Ｏ2・ジェネレイ
ティングＮＡＤＨオキシダーゼは、Ｈ2Ｏ2の定量法と組
み合わせてＮＡＤＨが関与する各種脱水素酵素の活性測
定及びＮＡＤを補酵素とする各種脱水素酵素の基質量の
測定に利用できる有用な酵素である。
ティングＮＡＤＨオキシダーゼは、Ｈ2Ｏ2の定量法と組
み合わせてＮＡＤＨが関与する各種脱水素酵素の活性測
定及びＮＡＤを補酵素とする各種脱水素酵素の基質量の
測定に利用できる有用な酵素である。
【００１６】上記本発明のＮＡＤＨオキシダーゼは、例
えば酵素生産菌ストレプトコッカス・ミュータンスを培
養し、この培養物から採取して製造される。
えば酵素生産菌ストレプトコッカス・ミュータンスを培
養し、この培養物から採取して製造される。
【００１７】本発明のＮＡＤＨオキシダーゼ製造法の一
態様において、Ｈ2Ｏ2・ジエネレイテイングＮＡＤＨオ
キシダーゼの生産菌としてストレプトコッカス・ミュー
タンスを用いる。好ましい菌株としては、例えばストレ
プトコッカス・ミュータンスＮＣＴＣ１０４４９、スト
レプトコッカス・ミュータンス・イングブリッド(Ｉngb
ritt)、ストレプトコッカス・ミュータンスＪＣ２を挙
げることができる。
態様において、Ｈ2Ｏ2・ジエネレイテイングＮＡＤＨオ
キシダーゼの生産菌としてストレプトコッカス・ミュー
タンスを用いる。好ましい菌株としては、例えばストレ
プトコッカス・ミュータンスＮＣＴＣ１０４４９、スト
レプトコッカス・ミュータンス・イングブリッド(Ｉngb
ritt)、ストレプトコッカス・ミュータンスＪＣ２を挙
げることができる。
【００１８】本発明で使用する培地は、使用菌株がＮＡ
ＤＨオキシダーゼを生産するものであれば良いが、生育
に炭酸を必要とするため炭酸塩を培地に添加するのが好
ましい。酵素生産のための炭素源としては、グルコー
ス、マンニトール、ソルビトール等が酵素の高誘導生産
に適しており、窒素源としては、カゼイン、トリプティ
カーゼ、ペプトン、酵母エキス等が使用できる。その他
にリン酸塩、マグネシウム塩、マンガン塩、鉄塩等の無
機塩及び金属塩を加えてもよく、さらにビタミン類、核
酸塩基類を加えてもよい。
ＤＨオキシダーゼを生産するものであれば良いが、生育
に炭酸を必要とするため炭酸塩を培地に添加するのが好
ましい。酵素生産のための炭素源としては、グルコー
ス、マンニトール、ソルビトール等が酵素の高誘導生産
に適しており、窒素源としては、カゼイン、トリプティ
カーゼ、ペプトン、酵母エキス等が使用できる。その他
にリン酸塩、マグネシウム塩、マンガン塩、鉄塩等の無
機塩及び金属塩を加えてもよく、さらにビタミン類、核
酸塩基類を加えてもよい。
【００１９】ＮＡＤＨオキシダーゼ生産菌を培養するに
あたり、培養温度は通常３０℃−４０℃の範囲内で、好
適には３７℃付近でおこなわれる。本発明で使用される
菌株は乳酸菌であるため、生育にともなって培地中に酸
を蓄積しpＨ値が低下する。したがって、培地のリン酸
塩をリン酸カリウム緩衝液(例えば０．１Ｍ〜０．２Ｍ
程度)のかたちで使用すると、酵素の生産性を高めるこ
とができる。又、本発明で使用される菌株は通性嫌気性
菌である。即ち無酸素状態でよく生育できるが、肝心の
ＮＡＤＨオキシダーゼは生産できない。一方好気条件で
は、ＮＡＤＨオキシダーゼの生産はできるが、生育が非
常に遅い。従ってストレプトコッカス・ミュータンスを
ある程度嫌気的条件下で培養した後、好気条件下に移
し、２〜８時間、好ましくは３〜４時間の通気撹拌培養
を行うことによって、ＮＡＤＨオキシダーゼを誘導させ
ることができる。この際、通気撹拌条件、集菌の時期等
の最適化によってＮＡＤＨオキシダーゼの生産量が最大
になるように設定し得る。
あたり、培養温度は通常３０℃−４０℃の範囲内で、好
適には３７℃付近でおこなわれる。本発明で使用される
菌株は乳酸菌であるため、生育にともなって培地中に酸
を蓄積しpＨ値が低下する。したがって、培地のリン酸
塩をリン酸カリウム緩衝液(例えば０．１Ｍ〜０．２Ｍ
程度)のかたちで使用すると、酵素の生産性を高めるこ
とができる。又、本発明で使用される菌株は通性嫌気性
菌である。即ち無酸素状態でよく生育できるが、肝心の
ＮＡＤＨオキシダーゼは生産できない。一方好気条件で
は、ＮＡＤＨオキシダーゼの生産はできるが、生育が非
常に遅い。従ってストレプトコッカス・ミュータンスを
ある程度嫌気的条件下で培養した後、好気条件下に移
し、２〜８時間、好ましくは３〜４時間の通気撹拌培養
を行うことによって、ＮＡＤＨオキシダーゼを誘導させ
ることができる。この際、通気撹拌条件、集菌の時期等
の最適化によってＮＡＤＨオキシダーゼの生産量が最大
になるように設定し得る。
【００２０】ここで生産されるＮＡＤＨオキシダーゼ
は、大部分が菌体内に存在するので、培養菌を集菌洗浄
後通常用いられる方法で細胞を破壊し、無細胞抽出液を
得る。次いで通常用いられている精製手段により、精製
酵素を得ることができる。例えば、塩析濃縮、イオン交
換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、ゲル
濾過クロマトグラフィー等により精製を行い、ポリアク
リルアミドゲル電気泳動的に均一なＮＡＤＨオキシダー
ゼの標品を得ることができる。
は、大部分が菌体内に存在するので、培養菌を集菌洗浄
後通常用いられる方法で細胞を破壊し、無細胞抽出液を
得る。次いで通常用いられている精製手段により、精製
酵素を得ることができる。例えば、塩析濃縮、イオン交
換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、ゲル
濾過クロマトグラフィー等により精製を行い、ポリアク
リルアミドゲル電気泳動的に均一なＮＡＤＨオキシダー
ゼの標品を得ることができる。
【００２１】上記のようにして製造される本発明のＮＡ
ＤＨオキシダーゼの酵素活性力価の測定は、例えば以下
のようにして行うことが出来る。即ち、紫外光吸収測定
用石英ブラックセルに、ＮＡＤＨを含むリン酸緩衝液及
びＥＤＴＡを調製する。この反応液に適当量のＮＡＤＨ
オキシダーゼを加えることによりＮＡＤＨは溶液中の酸
素により酸化されてＮＡＤ+を生成する。ＮＡＤＨに特
異的な３４０nmの吸収度の減少の時間変化により力価を
測定する。尚酵素活性の力価は、１分間に１マイクロモ
ルのＮＡＤＨを酸化するに要する酵素量を１単位として
表す。ＦＡＤ添加時の力価は、反応液にＦＡＤを添加し
て反応させて求める。
ＤＨオキシダーゼの酵素活性力価の測定は、例えば以下
のようにして行うことが出来る。即ち、紫外光吸収測定
用石英ブラックセルに、ＮＡＤＨを含むリン酸緩衝液及
びＥＤＴＡを調製する。この反応液に適当量のＮＡＤＨ
オキシダーゼを加えることによりＮＡＤＨは溶液中の酸
素により酸化されてＮＡＤ+を生成する。ＮＡＤＨに特
異的な３４０nmの吸収度の減少の時間変化により力価を
測定する。尚酵素活性の力価は、１分間に１マイクロモ
ルのＮＡＤＨを酸化するに要する酵素量を１単位として
表す。ＦＡＤ添加時の力価は、反応液にＦＡＤを添加し
て反応させて求める。
【００２２】
【実施例】以下本発明を、実施例でより具体的に説明す
る。
る。
【００２３】(実施例)重炭酸アンモニウム０．２％、グ
ルタミン酸ナトリウム０．１％、酵母エキス０．１％、
ブドウ糖１％、０．１Ｍリン酸緩衝液(pＨ７．０)、無
機塩類溶液(硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、硫酸第
一鉄、塩化ナトリウム等)及び還元剤として０．０１％
のシステインから成る培地３Ｌを含む５Ｌミニジャー・
ファーメンターに嫌気的に１２〜１５時間前培養したス
トレプトコッカスミュータンスを３００ｍｌ接種し、３
７℃で静置培養した。菌の生育度が６６０ｎｍの吸光度
で０．２〜０．３に達した時、通気撹拌培養を開始し
た。（通気量：３ｌ／分、撹拌速度：３００回転／
分）。約３時間の通気撹拌でＮＡＤＨオキシダーゼの誘
導生産は最高に達した。得られた菌体量は５g／Ｌであ
った。菌体を０．２mＭ ＥＤＴＡを含む５０mＭリン酸
緩衝液(pＨ７．０)に懸濁後、菌体を破砕し、超遠心分
画によって粗酵素液を得た。粗酵素液を予め同緩衝液で
平衡化したＤＥＡＥセファロースカラムクロマトにか
け、ＫＣlの直線濃度勾配により溶出した。Ｈ2Ｏ2・ジ
エネレイテイングＮＡＤＨオキシダーゼ活性画分は、
０．２Ｍ〜０．３ＭＫＣl濃度で溶出された。活性画分
を集め、濃縮後、１．２Ｍ 硫酸アンモニウムを含む５
０mＭリン酸緩衝液(pＨ７．０)で平衡化したブチルセフ
ァロースカラムクロマトにかけ、１．２Ｍ〜０Ｍの硫酸
アンモニウムの直線濃度勾配により溶出し、活性画分は
０．５Ｍ〜０．２Ｍ濃度で溶出された。活性画分を回収
したモノＱカラムクロマト(ＦＰＬＣシステム・ファル
マシア)で分画後、再クロマトにより、ＳＤＳゲル電気
泳動的に均一な酵素として分離精製した。この比活性は
１２７単位／mgであり、粗酵素からの収率は約５％であ
った。
ルタミン酸ナトリウム０．１％、酵母エキス０．１％、
ブドウ糖１％、０．１Ｍリン酸緩衝液(pＨ７．０)、無
機塩類溶液(硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、硫酸第
一鉄、塩化ナトリウム等)及び還元剤として０．０１％
のシステインから成る培地３Ｌを含む５Ｌミニジャー・
ファーメンターに嫌気的に１２〜１５時間前培養したス
トレプトコッカスミュータンスを３００ｍｌ接種し、３
７℃で静置培養した。菌の生育度が６６０ｎｍの吸光度
で０．２〜０．３に達した時、通気撹拌培養を開始し
た。（通気量：３ｌ／分、撹拌速度：３００回転／
分）。約３時間の通気撹拌でＮＡＤＨオキシダーゼの誘
導生産は最高に達した。得られた菌体量は５g／Ｌであ
った。菌体を０．２mＭ ＥＤＴＡを含む５０mＭリン酸
緩衝液(pＨ７．０)に懸濁後、菌体を破砕し、超遠心分
画によって粗酵素液を得た。粗酵素液を予め同緩衝液で
平衡化したＤＥＡＥセファロースカラムクロマトにか
け、ＫＣlの直線濃度勾配により溶出した。Ｈ2Ｏ2・ジ
エネレイテイングＮＡＤＨオキシダーゼ活性画分は、
０．２Ｍ〜０．３ＭＫＣl濃度で溶出された。活性画分
を集め、濃縮後、１．２Ｍ 硫酸アンモニウムを含む５
０mＭリン酸緩衝液(pＨ７．０)で平衡化したブチルセフ
ァロースカラムクロマトにかけ、１．２Ｍ〜０Ｍの硫酸
アンモニウムの直線濃度勾配により溶出し、活性画分は
０．５Ｍ〜０．２Ｍ濃度で溶出された。活性画分を回収
したモノＱカラムクロマト(ＦＰＬＣシステム・ファル
マシア)で分画後、再クロマトにより、ＳＤＳゲル電気
泳動的に均一な酵素として分離精製した。この比活性は
１２７単位／mgであり、粗酵素からの収率は約５％であ
った。
【００２４】
【発明の効果】本発明により、ＮＡＤＨの測定に有用な
ＮＡＤＨオキシダーゼの工業的生産に有利な製造法が提
供された。
ＮＡＤＨオキシダーゼの工業的生産に有利な製造法が提
供された。
【図１】ＮＡＤＨオキシダーゼ活性−pＨ相関関係図で
ある。
ある。
【図２】ＮＡＤＨオキシダーゼ活性−温度相関関係図で
ある。
ある。
【図３】ＮＡＤＨオキシダーゼ活性の温度安定性を示す
図である。
図である。
【図４】ＮＡＤＨオキシダーゼ活性のpＨ安定性を示す
図である。
図である。
Claims (2)
- 【請求項１】 酵素生産菌ストレプトコッカス(Strepto
coccusmutance)の培養物から採取された、至適ｐＨ5.5
〜７、作用適温30〜50℃、分子量200,000〜220,000を有
する酸素分子存在下にNADHを基質特異的に酸化して過酸
化水素を生成するNADHオキシダーゼ。 - 【請求項２】酵素生産菌ストレプトコッカス・ミュータ
ンス(Ｓtreptococcusmutans)を培養し、培養物から該Ｎ
ＡＤＨオキシダーゼを採取することを特徴とする請求項
１記載のＮＡＤＨオキシダーゼの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP40788990A JPH07100031B2 (ja) | 1990-12-27 | 1990-12-27 | Ｎａｄｈオキシダーゼ及びその製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP40788990A JPH07100031B2 (ja) | 1990-12-27 | 1990-12-27 | Ｎａｄｈオキシダーゼ及びその製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04365478A JPH04365478A (ja) | 1992-12-17 |
| JPH07100031B2 true JPH07100031B2 (ja) | 1995-11-01 |
Family
ID=18517416
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP40788990A Expired - Lifetime JPH07100031B2 (ja) | 1990-12-27 | 1990-12-27 | Ｎａｄｈオキシダーゼ及びその製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07100031B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0623677A1 (en) * | 1993-03-31 | 1994-11-09 | Nippon Paint Co., Ltd. | A DNA fragment encoding a hydrogen peroxide-generating NADH oxidase |
| JP5115708B2 (ja) | 2008-01-17 | 2013-01-09 | 学校法人慶應義塾 | 新規過酸化水素生成型ｎａｄｈオキシダーゼ及びそれをコードするｄｎａ |
-
1990
- 1990-12-27 JP JP40788990A patent/JPH07100031B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH04365478A (ja) | 1992-12-17 |
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