JPH07100719B2 - コロニ−刺激因子及びその製造法 - Google Patents
コロニ−刺激因子及びその製造法Info
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- JPH07100719B2 JPH07100719B2 JP61291294A JP29129486A JPH07100719B2 JP H07100719 B2 JPH07100719 B2 JP H07100719B2 JP 61291294 A JP61291294 A JP 61291294A JP 29129486 A JP29129486 A JP 29129486A JP H07100719 B2 JPH07100719 B2 JP H07100719B2
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Description
【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は人尿から分離され、哺乳動物の単球−マクロフ
アージ系細胞のコロニー形成を刺激する新規なコロニー
刺激因子とその製造法に関するものである。
アージ系細胞のコロニー形成を刺激する新規なコロニー
刺激因子とその製造法に関するものである。
［従来の技術］ コロニー刺激因子（以下CSFと略記する）は、哺乳動物
の造血組織、例えば骨髄などに存在する造血幹細胞の分
化・増殖を刺激する造血因子であり、多くのCSFは糖蛋
白質から成つている。これまで、単球−マクロフアージ
系幹細胞に作用する因子（Ｍ−CSF又はCSF−１）、顆粒
球−単球系幹細胞に作用する因子（GM−CSF）、顆粒球
系幹細胞に作用する因子（Ｇ−CSF）、更に顆粒球、単
球、赤血球及び巨核球に共通な多能性幹細胞に作用する
因子（Multi−CSF、インターロイキン−３又はIL−３）
の４種が知られている。
の造血組織、例えば骨髄などに存在する造血幹細胞の分
化・増殖を刺激する造血因子であり、多くのCSFは糖蛋
白質から成つている。これまで、単球−マクロフアージ
系幹細胞に作用する因子（Ｍ−CSF又はCSF−１）、顆粒
球−単球系幹細胞に作用する因子（GM−CSF）、顆粒球
系幹細胞に作用する因子（Ｇ−CSF）、更に顆粒球、単
球、赤血球及び巨核球に共通な多能性幹細胞に作用する
因子（Multi−CSF、インターロイキン−３又はIL−３）
の４種が知られている。
Multi−CSFを除く上記３種の人由来CSFは、それぞれの
アミノ酸配列をコードする遺伝子cDNAがクローニングさ
れており、蛋白質構造が明らかにされている［G.G.Wong
ら,Science,228巻,810〜815頁,1985年;E.S.Kawasaki
ら、Science,230巻,291−296頁、1985年;S.Nagataら,Na
ture,319巻,415−418頁,1986年］。
アミノ酸配列をコードする遺伝子cDNAがクローニングさ
れており、蛋白質構造が明らかにされている［G.G.Wong
ら,Science,228巻,810〜815頁,1985年;E.S.Kawasaki
ら、Science,230巻,291−296頁、1985年;S.Nagataら,Na
ture,319巻,415−418頁,1986年］。
人尿中に存在するCSFとしては、単球−マクロフアージ
系細胞に作用する因子（CSF−１又はＭ−CSF）［S.K.Da
s ＆ E.R.Stanley,Journal of Biological Chemistry,2
57巻,13679〜13684頁,1982年］、顆粒球コロニーを刺激
するHGI−糖蛋白質［特公昭60−30291号公報］及びCSF
−HU［K.Motoyoshiら,Blood,52巻,1012〜1020頁,1978年
及びBlood,60巻,1378〜1386頁,1982年］が報告されてい
る。
系細胞に作用する因子（CSF−１又はＭ−CSF）［S.K.Da
s ＆ E.R.Stanley,Journal of Biological Chemistry,2
57巻,13679〜13684頁,1982年］、顆粒球コロニーを刺激
するHGI−糖蛋白質［特公昭60−30291号公報］及びCSF
−HU［K.Motoyoshiら,Blood,52巻,1012〜1020頁,1978年
及びBlood,60巻,1378〜1386頁,1982年］が報告されてい
る。
それらのうち、単球−マクロフアージ系細胞に作用する
上記CSF−１は完全に鈍化され、またその蛋白質をコー
ドするcDNAがクローニングされている（上記、E.S.Kawa
sakiら）。
上記CSF−１は完全に鈍化され、またその蛋白質をコー
ドするcDNAがクローニングされている（上記、E.S.Kawa
sakiら）。
鈍化CSF−１の構造は、糖鎖を含む二本のポリペプチド
がジスルフイド結合により、生物学的に活性なホモ２量
体を形成している。この２量体はジスルフイド結合を還
元剤により切断することにより同一の２個のサブユニツ
トを生成する。この生物学的活性を有する糖蛋白質の、
ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミド電気泳動
法により測定した分子量は、45,000〜60,000ダルトンで
ある。また２量体を形成するポリペプチドサブユニツト
の糖鎖を除いた分子量は14,000〜17,000ダルトンであ
る。このCSF−１サブユニツトのアミノ酸配列をコード
していると考えられるcDNAから推定されたアミノ酸数は
224個、分子量26,000ダルトンのポリペプチドである。
がジスルフイド結合により、生物学的に活性なホモ２量
体を形成している。この２量体はジスルフイド結合を還
元剤により切断することにより同一の２個のサブユニツ
トを生成する。この生物学的活性を有する糖蛋白質の、
ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミド電気泳動
法により測定した分子量は、45,000〜60,000ダルトンで
ある。また２量体を形成するポリペプチドサブユニツト
の糖鎖を除いた分子量は14,000〜17,000ダルトンであ
る。このCSF−１サブユニツトのアミノ酸配列をコード
していると考えられるcDNAから推定されたアミノ酸数は
224個、分子量26,000ダルトンのポリペプチドである。
［発明が解決しようとする問題点］ 本発明者らは人尿中に、CSF−１と同様に作用するが、
理化学的にCSF−１とは区別される従来知られていなか
つた新規な糖蛋白CSFが存在することを見い出してこれ
を単離し、その理化学的及び生物学的性質を明らかにす
ることにより本発明を完成した。
理化学的にCSF−１とは区別される従来知られていなか
つた新規な糖蛋白CSFが存在することを見い出してこれ
を単離し、その理化学的及び生物学的性質を明らかにす
ることにより本発明を完成した。
本発明の目的は、抗ガン剤化学療法による白血球減少
症、免疫不全及び骨髄移植等に治療効果がある新規なCS
Fとその製造法を提供することにある。
症、免疫不全及び骨髄移植等に治療効果がある新規なCS
Fとその製造法を提供することにある。
即ち、本発明は、下記の理化学的性質を有し、且つ哺乳
動物の単球−マクロフアージ系細胞のコロニー形成刺激
作用を有する糖蛋白よりなる新規なCSFを提供する。
動物の単球−マクロフアージ系細胞のコロニー形成刺激
作用を有する糖蛋白よりなる新規なCSFを提供する。
ａ）分子量 CSF−１と同様に還元剤により同一のサブユニツト２個
に解離されるホモ２量体であり、ドデシル硫酸ナトリウ
ム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定した分子量
が70,000〜90,000ダルトンであつて、還元剤で解離さ
せ、生物活性を消失させたサブユニツトについてドデシ
ル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動で
測定した分子量は35,000〜45,000ダルトンである。
に解離されるホモ２量体であり、ドデシル硫酸ナトリウ
ム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定した分子量
が70,000〜90,000ダルトンであつて、還元剤で解離さ
せ、生物活性を消失させたサブユニツトについてドデシ
ル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動で
測定した分子量は35,000〜45,000ダルトンである。
（ｂ）サブユニツトのアミノ酸配列 ホモ２量体を構成するサブユニツト蛋白質は、次に示す
少なくとも189個のアミノ酸配列から成り、 122番目及び140番目のアスパラギン（Asn）はそれぞれ
アスパラギン（Asn）−Ｘ−スレオニン（Thr）又はセリ
ン（Ser）で表わされる典型的なＮ−グリコシド結合部
位を有する。ただしＸは任意のアミノ酸を表わす。
少なくとも189個のアミノ酸配列から成り、 122番目及び140番目のアスパラギン（Asn）はそれぞれ
アスパラギン（Asn）−Ｘ−スレオニン（Thr）又はセリ
ン（Ser）で表わされる典型的なＮ−グリコシド結合部
位を有する。ただしＸは任意のアミノ酸を表わす。
ｃ）等電点 ポリアクリルアミドゲル等電点電気泳動法及びシユクロ
ース密度勾配等電点電気泳動法で測定した等電点（pI）
は3.1〜3.7である。
ース密度勾配等電点電気泳動法で測定した等電点（pI）
は3.1〜3.7である。
ｄ）糖鎖の構成単糖 加水分解後高速液体クロマトグラフイーで分析し、糖鎖
の構成単糖として、マンノース、ガラクトース、Ｎ−ア
セチルグルコサミン及びＮ−アセチルノイラミン酸が同
定された。
の構成単糖として、マンノース、ガラクトース、Ｎ−ア
セチルグルコサミン及びＮ−アセチルノイラミン酸が同
定された。
ｅ）円二色性スペクトル 円二色性分散計による遠紫外部CDスペクトルは波長208n
m及び222nmにそれぞれ極少ピークがあり、α−ヘリツク
ス構造を含んでいる。
m及び222nmにそれぞれ極少ピークがあり、α−ヘリツク
ス構造を含んでいる。
ｆ）熱安定性 60±0.5℃で60分間加熱しても生物活性は失なわれな
い； ｇ）赤外線吸収スペクトル 第３図に示す赤外線吸収スペクトルを有する。
い； ｇ）赤外線吸収スペクトル 第３図に示す赤外線吸収スペクトルを有する。
以上の理化学的性質を有することを特徴とするコロニー
刺激因子を含む人尿をpH8〜９に調整し、不溶物を沈澱
せしめ、その上澄を限外濾過膜で脱塩し、少なくとも20
0倍以上に濃縮した後、pHを6.5〜7.5に調整し、60℃で1
0時間加熱処理し、生ずる沈澱物を遠心除去後、陰イオ
ン交換体に吸着させ、0.2〜0.4M緩衝液で溶出させ、次
いで１〜4M緩衝液中でゲル濾過して分子量70,000ダルト
ン以上の画分を回収し、該画分を疎水性親和体に吸着さ
せて0.5〜1M緩衝液で溶出させ、該溶出物を高速液体ゲ
ル濾過にかけ、分子量70,000〜150,000ダルトンの画分
を回収し、該画分をpH1〜２に調整して逆相高速液体ク
ロマトグラフイーにかけ、有効成分を溶出せしめること
を特徴とするコロニー刺激因子の製造法である。
刺激因子を含む人尿をpH8〜９に調整し、不溶物を沈澱
せしめ、その上澄を限外濾過膜で脱塩し、少なくとも20
0倍以上に濃縮した後、pHを6.5〜7.5に調整し、60℃で1
0時間加熱処理し、生ずる沈澱物を遠心除去後、陰イオ
ン交換体に吸着させ、0.2〜0.4M緩衝液で溶出させ、次
いで１〜4M緩衝液中でゲル濾過して分子量70,000ダルト
ン以上の画分を回収し、該画分を疎水性親和体に吸着さ
せて0.5〜1M緩衝液で溶出させ、該溶出物を高速液体ゲ
ル濾過にかけ、分子量70,000〜150,000ダルトンの画分
を回収し、該画分をpH1〜２に調整して逆相高速液体ク
ロマトグラフイーにかけ、有効成分を溶出せしめること
を特徴とするコロニー刺激因子の製造法である。
［発明の具体的な説明］ （１）CSFの製造 本発明のCSFは次のようにして製造される。
健康人の尿をpH8.0〜9.0に調整し、尿中の粘性物質を沈
澱・除去し、その上澄を分子量10,000〜50,000ダルトン
を通過させる限外濾過膜を用いて濃縮と脱塩を行う。
澱・除去し、その上澄を分子量10,000〜50,000ダルトン
を通過させる限外濾過膜を用いて濃縮と脱塩を行う。
少なくとも200倍以上に濃縮（蛋白質濃度として１％（w
/v）以上）した後pHを6.5〜7.5に調整し、60℃で10時間
加熱処理（ウイルス等の不活化）する。形成された沈澱
物を遠心除去し、陰イオン交換体、例えばDEAE−セルロ
ース等、に有効成分を吸着させる。
/v）以上）した後pHを6.5〜7.5に調整し、60℃で10時間
加熱処理（ウイルス等の不活化）する。形成された沈澱
物を遠心除去し、陰イオン交換体、例えばDEAE−セルロ
ース等、に有効成分を吸着させる。
次に0.05〜0.1Mの緩衝液（pH6.5〜7.5）で該イオン交換
体を洗浄した後0.2〜0.4Mの緩衝液（pH6.5〜7.5）で有
効成分を溶出する。該溶出液を必要ならば限外濾過膜で
濃縮し、1M〜4Mの塩類、例えば硫安、食塩等を含有する
緩衝液（pH6.5〜7.5）で平衡化させたゲル濾過剤、例え
ばSephacryl Ｓ−300（Pharmacia社製）でゲル濾過
し、分子量範囲が70,000〜150,000ダルトンの画分を回
収する。次に該画分を上記1M〜4Mの塩含有緩衝液で平衡
化させた疎水性親和体、例えばPhenyl−Sepharose （P
harmacia社製）に吸着させ、0.5〜1.0Mの塩含有緩衝液
（pH6.5〜7.5）で溶出する。該溶出液を限外濾過膜で濃
縮し、高速液体ゲル濾過カラム、例えばTSKG−3000SW
（東洋曹達製）でゲル濾過し、分子量範囲が70,000〜15
0,000ダルトンの画分を回収する。該画分を再度、濃縮
し、0.1％トリフルオロ酢酸（TFA）溶液（pH1〜２）で
平衡化した高速液体逆相カラム、例えば、Hi−Pore RP
−304（バイオラド社製）に吸着させ、0.1％TFAを含む
溶剤、例えばアセトニトリル又はイソプロパノールの直
線濃度勾配溶出法により溶出する。このようにして得ら
れたCSFは、比活性１×108単位/mg・蛋白質以上を有す
る純粋な物質である。
体を洗浄した後0.2〜0.4Mの緩衝液（pH6.5〜7.5）で有
効成分を溶出する。該溶出液を必要ならば限外濾過膜で
濃縮し、1M〜4Mの塩類、例えば硫安、食塩等を含有する
緩衝液（pH6.5〜7.5）で平衡化させたゲル濾過剤、例え
ばSephacryl Ｓ−300（Pharmacia社製）でゲル濾過
し、分子量範囲が70,000〜150,000ダルトンの画分を回
収する。次に該画分を上記1M〜4Mの塩含有緩衝液で平衡
化させた疎水性親和体、例えばPhenyl−Sepharose （P
harmacia社製）に吸着させ、0.5〜1.0Mの塩含有緩衝液
（pH6.5〜7.5）で溶出する。該溶出液を限外濾過膜で濃
縮し、高速液体ゲル濾過カラム、例えばTSKG−3000SW
（東洋曹達製）でゲル濾過し、分子量範囲が70,000〜15
0,000ダルトンの画分を回収する。該画分を再度、濃縮
し、0.1％トリフルオロ酢酸（TFA）溶液（pH1〜２）で
平衡化した高速液体逆相カラム、例えば、Hi−Pore RP
−304（バイオラド社製）に吸着させ、0.1％TFAを含む
溶剤、例えばアセトニトリル又はイソプロパノールの直
線濃度勾配溶出法により溶出する。このようにして得ら
れたCSFは、比活性１×108単位/mg・蛋白質以上を有す
る純粋な物質である。
（２）CSFの理化学的性状 以上のようにして製造された本発明のCSFは次のような
理化学的性状を有している。尚、この理化学的性状の試
験には、実施例１の方法により純化したCSFを用いた。
理化学的性状を有している。尚、この理化学的性状の試
験には、実施例１の方法により純化したCSFを用いた。
（ａ）分子量 還元剤の非存在下に、Laemmli（Nature,227巻,680−685
頁,1970年）の方法によるドデシル硫酸ナトリウム・ポ
リアクリルアミド電気泳動で分子量を測定すると、70,0
00〜90,000ダルトンであつた。
頁,1970年）の方法によるドデシル硫酸ナトリウム・ポ
リアクリルアミド電気泳動で分子量を測定すると、70,0
00〜90,000ダルトンであつた。
次に、0.2Mメルカプトエタノールで還元し、同様の方法
で測定すると、分子量35,000〜45,000ダルトンのサブユ
ニツトに解離した（第１図）。
で測定すると、分子量35,000〜45,000ダルトンのサブユ
ニツトに解離した（第１図）。
第１図は、本発明のCSFのドデシル硫酸ナトリウム・ポ
リアクリルアミド電気泳動の泳動図であり、Ａ〜Ｅは非
還元（２量体）、F,Gは分子量マーカー蛋白質、Ｈ〜Ｌ
は還元（サブユニツト）を示し、縦軸の数字は分子量
（×103ダルトン）を示す。
リアクリルアミド電気泳動の泳動図であり、Ａ〜Ｅは非
還元（２量体）、F,Gは分子量マーカー蛋白質、Ｈ〜Ｌ
は還元（サブユニツト）を示し、縦軸の数字は分子量
（×103ダルトン）を示す。
（ｂ）サブユニツト蛋白質のアミノ酸配列 NH2−末端アミノ酸配列は、純化CSFを気相アミノ酸シー
ケンサーで常法により分析した。次に純化CSFを6Mグア
ニジンで変性させ、モノヨード酢酸でアルキル化した
後、脱塩し、トリプシン消化を行なつた。トリプシン処
理ペプチドをVydac C−18逆相高速液体クロマトグラフ
イーで分画し、23のペプチド画分を得、各画分をそれぞ
れ気相アミノ酸シーケンサーで分析し、ペプチド断片の
アミノ酸配列を分析した。トリプシン消化ペプチド断片
のアミノ酸配列と本発明者らがクローニングしたmRNAの
塩基配列から、サブユニツト蛋白質のアミノ酸一次構造
を決定した。その結果は表１に示すとおりである。
ケンサーで常法により分析した。次に純化CSFを6Mグア
ニジンで変性させ、モノヨード酢酸でアルキル化した
後、脱塩し、トリプシン消化を行なつた。トリプシン処
理ペプチドをVydac C−18逆相高速液体クロマトグラフ
イーで分画し、23のペプチド画分を得、各画分をそれぞ
れ気相アミノ酸シーケンサーで分析し、ペプチド断片の
アミノ酸配列を分析した。トリプシン消化ペプチド断片
のアミノ酸配列と本発明者らがクローニングしたmRNAの
塩基配列から、サブユニツト蛋白質のアミノ酸一次構造
を決定した。その結果は表１に示すとおりである。
NH2−末端のアミノ酸であるグルタミン酸から149番目の
グルタミンまでは、公知のCSF−１と同一であるが、150
番目から189番目までの40個のアミノ酸は、公知のそれ
と全く異なつていた。またCOOH−末端アミノ酸であるロ
イシンの次に、少なくとも α，β，γの三個のアミノ酸の存在が定性され、αはス
レオニン、βはトリプトフアン、γはグルタミン酸であ
ることが予測された。122番目と140番目のアスパラギン
は、Asn−Ｘ−Ser/Thrの典型的なＮ−グリコシド結合構
造を有し、この部位で糖鎖を結合しているものと推定さ
れた。ここにＸは任意のアミノ酸を示す。
グルタミンまでは、公知のCSF−１と同一であるが、150
番目から189番目までの40個のアミノ酸は、公知のそれ
と全く異なつていた。またCOOH−末端アミノ酸であるロ
イシンの次に、少なくとも α，β，γの三個のアミノ酸の存在が定性され、αはス
レオニン、βはトリプトフアン、γはグルタミン酸であ
ることが予測された。122番目と140番目のアスパラギン
は、Asn−Ｘ−Ser/Thrの典型的なＮ−グリコシド結合構
造を有し、この部位で糖鎖を結合しているものと推定さ
れた。ここにＸは任意のアミノ酸を示す。
（ｃ）糖鎖の構成単糖 ポリペプチドと結合している糖鎖の構成単糖は、加水分
解して遊離させた後、高速液体クロマトグラフイーで分
析した。アルドース、シアル酸は陰イオン交換カラム、
ヘキソサミンは陽イオン交換カラムでホウ酸緩衝液濃度
勾配溶出法で分画し、シアノアセタミド又はアルギニン
によるポストカラム標識した後、ケイ光法により同定し
た。本CSF分子に含有される糖鎖は不均一であり、定量
することは困難であつたが、構成単糖としてマンノー
ス、ガラクトース、Ｎ−アセチルグリコサミン及びＮ−
アセチルノイラミン酸が同定された。そのモル比はおよ
そ2.5:1.4:2.5:2.1であつた。
解して遊離させた後、高速液体クロマトグラフイーで分
析した。アルドース、シアル酸は陰イオン交換カラム、
ヘキソサミンは陽イオン交換カラムでホウ酸緩衝液濃度
勾配溶出法で分画し、シアノアセタミド又はアルギニン
によるポストカラム標識した後、ケイ光法により同定し
た。本CSF分子に含有される糖鎖は不均一であり、定量
することは困難であつたが、構成単糖としてマンノー
ス、ガラクトース、Ｎ−アセチルグリコサミン及びＮ−
アセチルノイラミン酸が同定された。そのモル比はおよ
そ2.5:1.4:2.5:2.1であつた。
（ｄ）等電点 ポリアクリルアミドゲル等電点電気泳動法及びシユクロ
ース密度勾配等電点電気泳動法により、等電点を測定し
た結果、pIは3.1〜3.7であつた。
ース密度勾配等電点電気泳動法により、等電点を測定し
た結果、pIは3.1〜3.7であつた。
（ｅ）円二色性（CD）スペクトル 円二色性分散計（JASCO社製Ｊ−600）で遠紫外部に於け
るCDスペクトルを測定した（第２図）。
るCDスペクトルを測定した（第２図）。
図２は本発明のCSFのCDスペクトルを示し、横軸は波長
（nm）、縦軸は楕円率（mdeg）を示す。波長208nm及び2
22nmにおいて極少ピークがみとめられ、本CSFの二次構
造にα−ヘリツクス構造が含まれているものと推定され
た。
（nm）、縦軸は楕円率（mdeg）を示す。波長208nm及び2
22nmにおいて極少ピークがみとめられ、本CSFの二次構
造にα−ヘリツクス構造が含まれているものと推定され
た。
（ｆ）熱安定性 本CSFを１μg/mlの濃度で、希薄緩衝液（pH7.0）に溶解
し、60±0.5℃で60分間加熱し、そのコロニー刺激活性
（後述）を測定したが、活性の低下はほとんど認められ
なかつた。
し、60±0.5℃で60分間加熱し、そのコロニー刺激活性
（後述）を測定したが、活性の低下はほとんど認められ
なかつた。
（ｇ）赤外線吸収スペクトル 本CSFの凍結乾燥粉末について透過測定法（KBr窓）によ
りフーリエ変換赤外分光装置（Nicolet社製5D×Ｃ）を
用いて測定した赤外線吸収スペクトルはに示すとおりで
あつた。第３図の横軸は波数（cm-1）を縦軸は透過率を
示す。
りフーリエ変換赤外分光装置（Nicolet社製5D×Ｃ）を
用いて測定した赤外線吸収スペクトルはに示すとおりで
あつた。第３図の横軸は波数（cm-1）を縦軸は透過率を
示す。
本CSFは1650cm-1、1201cm-1及び1133cm-1に強い吸収、1
537cm-1、1432cm-1及び1068cm-1に中程度の吸収を示し
た。
537cm-1、1432cm-1及び1068cm-1に中程度の吸収を示し
た。
（３）CSFの生物学的活性 前記（２）項と同様に、このコロニー刺激活性及び比活
性の試験には、実施例１の方法により純化したCSFを用
いた。
性の試験には、実施例１の方法により純化したCSFを用
いた。
（ａ）コロニー刺激活性及び比活性 本発明のCSFのコロニー刺激活性は、マウス骨髄細胞に
よる単層軟寒天ゲルでのコロニー形成試験法で測定し
た。CSF試料を0.3％寒天、20％牛胎児血清（FCS）及び
マウス骨髄細胞１×105個を含むMcCoy′s5A培地1mlと混
合し、7.5％CO2通気下、37℃で７日間培養した。培養
後、50個以上の細胞集塊をコロニーと判定し、形成され
たコロニー数を計測した。コロニー刺激活性は単位で表
現し、１単位は１コロニーを形成させるに必要なCSF量
と規定した。また比活性は、CSF蛋白質1mg当り形成され
るコロニー数（単位）で表わした。その結果、本発明の
CSFは、1.4×108単位/mg・蛋白質の比活性を有してい
た。また形成されたコロニーをヘマトキシリン−エオジ
ン染色して形態学的に分類したところ、95％以上のコロ
ニーが単球−マクロフアージから形成されていた。
よる単層軟寒天ゲルでのコロニー形成試験法で測定し
た。CSF試料を0.3％寒天、20％牛胎児血清（FCS）及び
マウス骨髄細胞１×105個を含むMcCoy′s5A培地1mlと混
合し、7.5％CO2通気下、37℃で７日間培養した。培養
後、50個以上の細胞集塊をコロニーと判定し、形成され
たコロニー数を計測した。コロニー刺激活性は単位で表
現し、１単位は１コロニーを形成させるに必要なCSF量
と規定した。また比活性は、CSF蛋白質1mg当り形成され
るコロニー数（単位）で表わした。その結果、本発明の
CSFは、1.4×108単位/mg・蛋白質の比活性を有してい
た。また形成されたコロニーをヘマトキシリン−エオジ
ン染色して形態学的に分類したところ、95％以上のコロ
ニーが単球−マクロフアージから形成されていた。
（ｂ）in vitro及びin vivoでのマウス骨髄単球−マク
ロフアージ系幹細胞（CFU−Ｍ）の増殖に及ぼす促進作
用 ｂ−１）in vitro試験 C57BLマウスの骨髄細胞を平板吸着法にて、非吸着骨髄
細胞とし、20％FCSを含むMcCoy′s5A培地へ１×106個/m
lの濃度に添加し、本発明のCSFを０（対照）、100単位/
ml、500単位/ml、1,000単位/ml及び2,000単位/mlの割合
でそれぞれ加え、7.5％CO2通気下、24時間、37℃で培養
した。培養後、各骨髄細胞を遠心法で洗浄した後、同じ
培地で５倍に希釈し、各群４枚のシヤーレに、それぞれ
CSF1,000単位、0.3％寒天及び20％FCSを含むMcCoy′s5A
培地1mlに対して0.1ml添加し、7.5％CO2通気下、37℃で
７日間培養した。培養後、50個以上の細胞集塊を単球−
マクロフアージ系幹細胞（CFU−Ｍ）と判定し、形成さ
れたCFU−Ｍ数を計測した。その結果は表２に示すとお
りであつた。
ロフアージ系幹細胞（CFU−Ｍ）の増殖に及ぼす促進作
用 ｂ−１）in vitro試験 C57BLマウスの骨髄細胞を平板吸着法にて、非吸着骨髄
細胞とし、20％FCSを含むMcCoy′s5A培地へ１×106個/m
lの濃度に添加し、本発明のCSFを０（対照）、100単位/
ml、500単位/ml、1,000単位/ml及び2,000単位/mlの割合
でそれぞれ加え、7.5％CO2通気下、24時間、37℃で培養
した。培養後、各骨髄細胞を遠心法で洗浄した後、同じ
培地で５倍に希釈し、各群４枚のシヤーレに、それぞれ
CSF1,000単位、0.3％寒天及び20％FCSを含むMcCoy′s5A
培地1mlに対して0.1ml添加し、7.5％CO2通気下、37℃で
７日間培養した。培養後、50個以上の細胞集塊を単球−
マクロフアージ系幹細胞（CFU−Ｍ）と判定し、形成さ
れたCFU−Ｍ数を計測した。その結果は表２に示すとお
りであつた。
表２に示すようにCSFの添加濃度に依存して、マウス骨
髄細胞中のCFU−Ｍ数は増加した。
髄細胞中のCFU−Ｍ数は増加した。
ｂ−２）in vivo試験 C57BLマウス（５匹／群）に対して体重1kg当り０（生理
食塩液）、80×104単位、160×104単位及び320×104単
位CSFを１日１回、連続３日間腹腔内に投与した。投与
終了の翌日に、各マウスにより大腿骨骨髄及び脾臓を摘
出し、骨髄及び脾臓中の単球−マクロフアージ系幹細胞
（CFU−Ｍ）数を、1,000単位のCSFを刺激因子とする前
記軟寒天平板法によるコロニー形成試験で測定した。そ
の結果は表３及び表４に示すとおりであつた。
食塩液）、80×104単位、160×104単位及び320×104単
位CSFを１日１回、連続３日間腹腔内に投与した。投与
終了の翌日に、各マウスにより大腿骨骨髄及び脾臓を摘
出し、骨髄及び脾臓中の単球−マクロフアージ系幹細胞
（CFU−Ｍ）数を、1,000単位のCSFを刺激因子とする前
記軟寒天平板法によるコロニー形成試験で測定した。そ
の結果は表３及び表４に示すとおりであつた。
表３及び表４に示す如く、80×104単位/kg体重のCSF投
与により、骨髄及び脾臓でのCFU−Ｍの増加が認めら
れ、160×104単位/kg体重以上の投与では顕著な増加が
認められた。
与により、骨髄及び脾臓でのCFU−Ｍの増加が認めら
れ、160×104単位/kg体重以上の投与では顕著な増加が
認められた。
以上のような理化学的性質及び生物学的活性を有する本
発明のCSFを公知の類似した物質と比較すると次のとお
りである。
発明のCSFを公知の類似した物質と比較すると次のとお
りである。
本発明のCSFは、CSF−１と同様に糖鎖を含む二本のポリ
ペプチドがジスルフイド結合し、生物学的に活性なホモ
２量体から構成されていて分子量は、70,000〜90,000ダ
ルトンであり、CSF−１のそれよりも大きい。更に、本
発明のCSFを構成しているサブユニツトのポリペプチド
は、少なくとも189個のアミノ酸から成り、分子量35,00
0〜45,000ダルトンであり、CSF−１のそれの14,000〜1
7,000ダルトンよりも大きい。また、サブユニツトのア
ミノ酸配列をCSF−１と比較すると、NH2−末端の１番か
ら149番目までのアミノ酸配列は同じであつたが、150番
から189番目までのアミノ酸配列はCSF−１のcDNAから推
定されるものと異なつており、CSF−１遺伝子上にコー
ドされていなかつた。従つて、本発明のCSFは、一部CSF
−１と共通性を有するが、遺伝子的にも、構造的にも、
公知のCSF−１とは別個な因子であることが判明した。
ペプチドがジスルフイド結合し、生物学的に活性なホモ
２量体から構成されていて分子量は、70,000〜90,000ダ
ルトンであり、CSF−１のそれよりも大きい。更に、本
発明のCSFを構成しているサブユニツトのポリペプチド
は、少なくとも189個のアミノ酸から成り、分子量35,00
0〜45,000ダルトンであり、CSF−１のそれの14,000〜1
7,000ダルトンよりも大きい。また、サブユニツトのア
ミノ酸配列をCSF−１と比較すると、NH2−末端の１番か
ら149番目までのアミノ酸配列は同じであつたが、150番
から189番目までのアミノ酸配列はCSF−１のcDNAから推
定されるものと異なつており、CSF−１遺伝子上にコー
ドされていなかつた。従つて、本発明のCSFは、一部CSF
−１と共通性を有するが、遺伝子的にも、構造的にも、
公知のCSF−１とは別個な因子であることが判明した。
次に本発明の実施例を示す。
実施例１ 健常人の尿200lをpH8.5に調整し、沈澱物を濾過除去
し、分画分子量50,000ダルトンの限外濾過膜（アミコン
社、H10×50）で濃縮と脱塩を行つた。次に、濃縮液をp
H7.0に調整し、密封容器中で60℃、10時間加熱殺菌し
た。殺菌後、遠心分離（5,000×g 30分間）して沈澱物
を除去した後、0.02Mリン酸緩衝液（pH7.2）で平衡化し
たDEAE−セルロースと混合し、吸着させた。DEAE−セル
ロースを0.02Mリン酸緩衝液、0.05M食塩添加0.02Mリン
酸緩衝液（pH7.2）で洗浄した後、0.25M食塩添加緩衝液
（pH7.2）で溶出させた。溶出液を限外濾過膜（アミコ
ン社H1P10）で濃縮して、Sephacryl S−300（フアルマ
シア社、φ４×80cm）を用い、1M硫安添加緩衝液（pH7.
2）でゲル濾過した。ゲル濾過での分子量範囲70,000〜1
50,000ダルトンの画分を上記1M硫安添加緩衝液で平衡化
したphenyl−Sepharose4Bカラム（フアルマシア社製、
φ２×20cm）に吸着させ、次いで0.5M硫安添加緩衝液
（pH7.2）で溶出させた。溶出液を限外濾過膜（旭化成
製、NM−３）で濃縮して、TSKG−3,000SWカラム（東洋
曹達製、φ４×600mm×２）で高速液体クロマトグラフ
イーにかけ、分子量範囲70,000〜150,000ダルトンの画
分を得た。この画分を再度濃縮し、Hi−Pore RP−304
（バイオラド社製、φ４×150mm）の逆相カラムで0.1％
トリフルオロ酢酸を含む、アセトニトリル０−100％（p
H2.0）の直線濃度勾配による高速液体クロマトグラフイ
ーにかけ、CSFを溶出し、精製された比活性1.4×108単
位/mg・蛋白質のCSFを得た。上記製造工程の各ステツプ
におけるCSFの精製度は表５に示すとおりであつた。
し、分画分子量50,000ダルトンの限外濾過膜（アミコン
社、H10×50）で濃縮と脱塩を行つた。次に、濃縮液をp
H7.0に調整し、密封容器中で60℃、10時間加熱殺菌し
た。殺菌後、遠心分離（5,000×g 30分間）して沈澱物
を除去した後、0.02Mリン酸緩衝液（pH7.2）で平衡化し
たDEAE−セルロースと混合し、吸着させた。DEAE−セル
ロースを0.02Mリン酸緩衝液、0.05M食塩添加0.02Mリン
酸緩衝液（pH7.2）で洗浄した後、0.25M食塩添加緩衝液
（pH7.2）で溶出させた。溶出液を限外濾過膜（アミコ
ン社H1P10）で濃縮して、Sephacryl S−300（フアルマ
シア社、φ４×80cm）を用い、1M硫安添加緩衝液（pH7.
2）でゲル濾過した。ゲル濾過での分子量範囲70,000〜1
50,000ダルトンの画分を上記1M硫安添加緩衝液で平衡化
したphenyl−Sepharose4Bカラム（フアルマシア社製、
φ２×20cm）に吸着させ、次いで0.5M硫安添加緩衝液
（pH7.2）で溶出させた。溶出液を限外濾過膜（旭化成
製、NM−３）で濃縮して、TSKG−3,000SWカラム（東洋
曹達製、φ４×600mm×２）で高速液体クロマトグラフ
イーにかけ、分子量範囲70,000〜150,000ダルトンの画
分を得た。この画分を再度濃縮し、Hi−Pore RP−304
（バイオラド社製、φ４×150mm）の逆相カラムで0.1％
トリフルオロ酢酸を含む、アセトニトリル０−100％（p
H2.0）の直線濃度勾配による高速液体クロマトグラフイ
ーにかけ、CSFを溶出し、精製された比活性1.4×108単
位/mg・蛋白質のCSFを得た。上記製造工程の各ステツプ
におけるCSFの精製度は表５に示すとおりであつた。
実施例２ 実施例１の方法でSephacryl S−300をTSKG−3,000SW
（東洋曹達、HLC−837）、phenyl−Sepharose4BをTSKph
enyl−5pw（東洋曹達）にかえて、全く高速液体クロマ
トグラフイーにより精製した。得られたCSFは、比活性
1.5×108単位/mgであり、回収率も実施例１と同等であ
つた。
（東洋曹達、HLC−837）、phenyl−Sepharose4BをTSKph
enyl−5pw（東洋曹達）にかえて、全く高速液体クロマ
トグラフイーにより精製した。得られたCSFは、比活性
1.5×108単位/mgであり、回収率も実施例１と同等であ
つた。
第１図は本発明のCSFのドデシル硫酸ナトリウム・ポリ
アクリルアミド電気泳動（SDS−PAGE）の泳動図であ
り、第２図及び第３図はそれぞれ本発明CSFの遠紫外部C
Dスペクトル及び赤外線吸収スペクトルを示す。 第１図において、 Ａ〜Ｅ……非還元物（２量体） F,G……分子量マーカ蛋白質 Ｈ〜Ｌ……還元物（サブユニツト）
アクリルアミド電気泳動（SDS−PAGE）の泳動図であ
り、第２図及び第３図はそれぞれ本発明CSFの遠紫外部C
Dスペクトル及び赤外線吸収スペクトルを示す。 第１図において、 Ａ〜Ｅ……非還元物（２量体） F,G……分子量マーカ蛋白質 Ｈ〜Ｌ……還元物（サブユニツト）
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 柳内 延也 東京都中野区南台５−21−10 森永乳業株 式会社中野社宅401 (72)発明者 山田 宗夫 神奈川県川崎市高津区久地752 栄テラス 205号 (72)発明者 横田 肇 東京都港区白金２−５−１−406 (56)参考文献 国際公開87／6954（ＷＯ，Ａ)
Claims (2)
- 【請求項１】哺乳動物の単球−マクロファージ系細胞の
コロニー形成刺激作用を有し、次の理化学的性質を有す
ることを特徴とするコロニー刺激糖蛋白質： ａ）分子量 同一のサブユニット２個から成るホモ２量体であって、
ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気
泳動で測定した分子量が70,000〜90,000ダルトンであ
り、還元剤で解離させて生物活性を消失させたサブユニ
ットについてドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動で測定した分子量は、35,000〜45,000
ダルトンである； ｂ）サブユニットのアミノ酸配列 ホモ２量体を構成するサブユニット蛋白質は、以下に示
す少なくとも189個のアミノ酸配列から成り、122番目及
び140番目のアスパラギン（Asn）はそれぞれアスパラギ
ン（Asn）−Ｘ−スレオニン（Thr）／セリン（Ser）で
表わされるＮ−グリコシド結合部位を有し、ここでＸは
任意のアミノ酸を示す； ｃ）等電点 ポリアクリルアミドゲル等電点電気泳動法及びシュクロ
ース密度勾配等電点電気泳動法で測定した等電点（pI）
は3.1〜3.7である； ｄ）糖鎖の構成単糖 加水分解後、高速液体クロマトグラフィーで分析により
同定された糖鎖の構成単糖は、マンノース、ガラクトー
ス、Ｎ−アセチルグルコサミン及びＮ−アセチルノイラ
ミン酸である； ｅ）円二色性スペクトル 円二色性分散計による遠紫外部CDスペクトルは波長208n
m及び222nmにそれぞれ極少ピークがあり、α−ヘリック
ス構造を含んでいる； ｆ）熱安定性 60±0.5℃で60分間加熱しても生物活性は失なわれな
い； ｇ）赤外線吸収スペクトル 赤外線吸収スペクトルにおいて、1650cm-1、1201cm-1及
び1133cm-1に強い吸収、1537cm-1、1432cm-1及び1068cm
-1に中程度の吸収を示す； ｈ）比活性 1.4×108単位/mg・蛋白質以上の比活性を示す。 - 【請求項２】人尿をpH8〜９に調整し、不溶物を沈殿せ
しめ、その上澄を限外濾過膜で脱塩し、少なくとも200
倍以上に濃縮した後、pHを6.5〜7.5に調整し、60℃で10
時間加熱処理し、沈殿物を遠心除去後、陰イオン交換体
に吸着させ、0.2〜0.4M緩衝液で溶出させ、次いで１〜4
M緩衝液中でゲル濾過して分子量70,000ダルトン以上の
画分を回収し、該画分を疎水性親和体に吸着させ、0.5
〜1Mの緩衝液で溶出させ、該溶出物を高速液体ゲル濾過
にかけ、分子量70,000〜150,000ダルトンの画分を回収
し、該画分をpH1〜２に調整して逆相高速液体クロマト
グラフィーにかけ、有効成分を溶出せしめることを特徴
とする、哺乳動物の単球−マクロファージ系細胞のコロ
ニー形成刺激作用を有し次の理化学的性質を有するコロ
ニー刺激糖蛋白質の製造法： ａ）分子量 同一のサブユニット２個から成るホモ２量体であって、
ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気
泳動で測定した分子量が70,000〜90,000ダルトンであ
り、還元剤で解離させて生物活性を消失させたサブユニ
ットについてドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動で測定した分子量は、35,000〜45,000
ダルトンである； ｂ）サブユニットのアミノ酸配列 ホモ２量体を構成するサブユニット蛋白質は、以下に示
す少なくとも189個のアミノ酸配列から成り、122番目及
び140番目のアスパラギン（Asn）はそれぞれアスパラギ
ン（Asn）−Ｘ−スレオニン（Thr）／セリン（Ser）で
表わされるＮ−グリコシド結合部位を有し、ここでＸは
任意のアミノ酸を示す； ｃ）等電点 ポリアクリルアミドゲル等電点電気泳動法及びシュクロ
ース密度勾配等電点電気泳動法で測定した等電点（pI）
は3.1〜3.7である； ｄ）糖鎖の構成単糖 加水分解後、高速液体クロマトグラフィーで分析により
同定された糖鎖の構成単糖は、マンノース、ガラクトー
ス、Ｎ−アセチルグルコサミン及びＮ−アセチルノイラ
ミン酸である； ｅ）円二色性スペクトル 円二色性分散計による遠紫外部CDスペクトルは波長208n
m及び222nmにそれぞれ極少ピークがあり、α−ヘリック
ス構造を含んでいる； ｆ）熱安定性 60±0.5℃で60分間加熱しても生物活性は失なわれな
い； ｇ）赤外線吸収スペクトル 赤外線吸収スペクトルにおいて、1650cm-1、1201cm-1及
び1133cm-1に強い吸収、1537cm-1、1432cm-1及び1068cm
-1に中程度の吸収を示す； ｈ）比活性 1.4×108単位/mg・蛋白質以上の比活性を示す。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61291294A JPH07100719B2 (ja) | 1986-12-07 | 1986-12-07 | コロニ−刺激因子及びその製造法 |
| AU82181/87A AU606099B2 (en) | 1986-12-07 | 1987-12-07 | Colony-stimulating factor and method for preparation thereof |
| AT87310739T ATE73825T1 (de) | 1986-12-07 | 1987-12-07 | Kolonie-stimulierender faktor und verfahren zu seiner herstellung. |
| EP87310739A EP0276551B1 (en) | 1986-12-07 | 1987-12-07 | Colony-stimulating factor and method for preparation thereof |
| DE8787310739T DE3777623D1 (de) | 1986-12-07 | 1987-12-07 | Kolonie-stimulierender faktor und verfahren zu seiner herstellung. |
| KR1019880003849A KR960005731B1 (ko) | 1986-12-07 | 1988-04-06 | 군락-자극 인자 및 그의 제조방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61291294A JPH07100719B2 (ja) | 1986-12-07 | 1986-12-07 | コロニ−刺激因子及びその製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63198700A JPS63198700A (ja) | 1988-08-17 |
| JPH07100719B2 true JPH07100719B2 (ja) | 1995-11-01 |
Family
ID=17767023
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61291294A Expired - Fee Related JPH07100719B2 (ja) | 1986-12-07 | 1986-12-07 | コロニ−刺激因子及びその製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07100719B2 (ja) |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3023248B2 (ja) * | 1992-09-10 | 2000-03-21 | キヤノン株式会社 | 位置検出装置 |
-
1986
- 1986-12-07 JP JP61291294A patent/JPH07100719B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS63198700A (ja) | 1988-08-17 |
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