JPH07108220B2 - サーモトガ・マリチマ由来の熱安定性核酸ポリメラーゼ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、超好熱性ユーバクテリア（eu bacteria）サ
ーモタガ・マリチマ（Thermotoga maritima）から精製
された、熱安定性DNAポリメラーゼおよび前記酵素を単
離および生産する手段に関する。熱安定性DNAポリメラ
ーゼは、多数の組換えDAN技術、ことにポリメラーゼ連
鎖反応（PCR）による核酸の増幅において有用である。

背景の技術 バクテリアであるサーモタガ・マリチマ（Thermotoga
maritima）の分離はHuberら、1986,Arch.Microbiol.，1
44:324−333に記載されてる。サーモトガ・マリチマ（T
hermotoga maritima）は、偏性嫌気性、桿形、発酵
性、超好熱性であり、そして55℃〜90℃において増殖
し、至適な増殖温度は約80℃である。このユーバクテリ
ウムは、イタリーおよびアゾレスにおける地熱で加熱さ
れた海底から単離された。サーモタガ・マリチマ（Ther
motoga maritima）細胞は鞘様構造および単毛の鞭毛を
有する。サーモトガ・マリチマ（Thermotoga maritim
a）はムレインおよび脂肪酸含有脂質、ジフテリア毒素
抵抗性延長因子２、RNAポリメラーゼサブユニットのパ
ターン、および抗生物質に対する感受性によりユーバク
テリア界に分類される。

広範な研究が中温性微生物、例えば、大腸菌（E. col
i）からのDNAポリメラーゼの単離について実施されてき
ている。例えば、Bessmanら、1957,J.Biol.Chem.，223:
171−177、およびButtinおよびKornberg,1996,J.Biol.C
hem.，241:5419−5427を参照のこと。好熱性細菌、例え
ば、サーモタガ・マリチマ（Thermotoga maritima）か
らのDNAポリメラーゼの単離および精製についてなされ
ている研究は非常に少ない。サームス・アクアチクス
（Thermus aquaticus）YT−１菌株の細胞からのDNAポ
リメラーゼ活性についての６工程の単離および濃縮が、
Kaledinら、1987,Biokhymiya，45:644−651に開示され
ている。これらの工程は、精製の抽出物の単離、DEAE−
セルロースのクロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイ
トによる分別、DEAE−セルロースによる分別、および一
本鎖DNA−セルロースのクロマトグラフィーを包含す
る。精製された酵素の分子量は、Kaledinらにより62,00
0ダルトン／モノマー単位として報告された。

サームス・アクアチクス（Thermus aquaticus）からの
ポリメラーゼの第２の濃縮のスキームは、Chienら、197
6,J.Bacteriol.，127:1550−1557に記載されてる。この
方法においては、精製の抽出物をDEAE−セファデックス
（Sephadex）カラムに適用する。次いで、プールし透析
した分画をホスホセルロースのカラムで処理する。プー
ルした分画を透析し、そしてウシ血清アルブミン（BS
A）を添加してポリメラーゼ活性の損失を防止する。生
ずる混合物をDNA−セルロースカラムに負荷する。カラ
ムからプールした物質を透析する。精製されたタンパク
質の分子量は約63,000〜68,000であると報告されてい
る。

熱安定性酵素、例えば、ChienらおよびKaledinらにより
記載されている酵素を使用して、現存する核酸配列を最
初に存在する量と比較して大量に増幅することは、米国
特許第4,683,195号；米国特許第4,683,202号および米国
特許第4,965,188号に記載されており、これらはPCR法を
記載しており、それら開示の各々を引用によってここに
加える。プライマー、鋳型、ヌクレオシド三リン酸、適
当な緩衝液および反応条件、およびポリメラーゼをPCR
法において使用し、この方法は標的DNAの変性、プライ
マーのハイブリダイゼーション、および相補的鎖の合成
を包含する。各プライマーの伸長生成物は、所望の核酸
配列の生成のための鋳型となる。これらの特許が開示す
るように、使用するポリメラーゼが熱安定性酵素である
場合、ポリメラーゼは各変性工程後に添加することは必
要ではない。なぜなら、熱はポリメラーゼ活性を破壊し
ないからである。

米国特許第4,889,818号、欧州特許公開第258,017号、お
よびPCT公開No.83/06691号（それらの開示をここに引用
によって加える）は、サームス・アクアチクス（Thermu
s aquaticus）からの約94kDaの熱安定性DNAポリメラー
ゼの単離および組み換え発現およびPCRにおけるそのポ
リメラーゼの使用を記載している。サームス・アクアチ
クス（T. aquaticus）のDNAポリメラーゼはPCRおよび
他の組み換えDNA技術における使用のためにことに好ま
しいが、他の熱安定性ポリメラーゼが要求されている。

したがって、前述のPCR法を改良し、そして他の組換え
技術、例えば、DNAの配列決定、ニック翻訳、およびな
お逆転写において熱安定性DNAポリメラーゼを使用する
とき、得られる結果を改良するために使用することがで
きる、精製された、熱安定性DNAポリメラーゼ生産する
ことはこの分野において望まれている。本発明は、サー
モタガ・マリチマ（Thermotoga maritima）のDNAポリ
メラーゼのための組み換え発現ベクターおよび精製のプ
ロトコルを提供することによって、その要求を満足する
ことを促進する。

発明の開示 本発明は、ヌクレオシド三リン酸の組合による、核酸鋳
型鎖に対して相補的である核酸鎖の形成を触媒する、精
製された熱安定性DNAポリメラーゼＩ酵素を提供する。
精製された酵素はサーモタガ・マリチマ（Thermotoga
maritima）（Tma）からのDNAポリメラーゼＩであり、そ
してSDS−PAGEにより測定して約97キロダルトン（kDa）
の分子量および、102kDaの、Tma DNAポリメラーゼ遺伝
子のヌクレオチド配列から推定される分子量有する。こ
の精製された物質はPCRにおいて使用して、最初に存在
する量と比較して大きい量の所定の核酸配列を生産する
ことができるので、これらの配列を容易に操作および／
または分析することができる。

本発明によれば、次の性質： （１）ヌクレオシドトリホスフェートから核酸鋳型鎖に
相補的な核酸鎖を形成する反応（ポリメラーゼ反応）を
触媒する； （２）３′→５′エキソヌクレアーゼ活性を有する； （３）サーモトガ・マリチマ（Thermotoga maritima）
に由来する； （４）SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測
定した場合におそよ70kDa〜97kDaの範囲内に分子量を有
する； （５）ポリメラーゼ反応のための至適温度は約75℃〜80
℃である；及び （６）ポリメラーゼ反応のための好ましいpHは約７〜９
である； を有する熱安定性DANポリメラーゼが提供される。ここ
で、「サーモトガ・マリチマ（Thermotoga maritima）
に由来する」とは、サーモトガ・マリチマの培養物から
得られる酵素のみならず、サーモトガ・マリチマからの
熱安定性DNAポリメラーゼコード遺伝子を遺伝子組換え
操作した後の遺伝子の発現により得られる酵素をも、本
発明に含まれることを意味する。

サーモタガ・マリチマ（Thermotoga maritima）からの
Tma DNAポリメラーゼ酵素をコードする遺伝子も同定さ
れ、クローニングされ、配列決定され、そして高いレベ
ルで発現され、そしてなお本発明の熱安定性酵素を調製
するための他の手段を提供する。完全な遺伝子およびTm
a酵素のためのコード配列に加えて、Tma DNAポリメラー
ゼのためのコード配列の誘導体もまた提供される。

本発明はまた、１種または２種以上の非イオン性ポリマ
ーの洗剤を含有する緩衝液中の前述の精製された熱安定
性Tma酵素を含んでなる安定な酵素組成物を包含する。

最後に、本発明は本発明の熱安定性ポリメラーゼを精製
する方法を提供する。この方法は、サーモタガ・マリチ
マ（Thermotoga maritima）の細胞から粗抽出物を調製
し、DNAポリメラーゼが抽出物中のすべての核酸から解
離するように、粗抽出物のイオン強度を調節し、該抽出
物を疎水性相互作用クロマトグラフィーにかけ、該抽出
物をDNA結合性タンパク質アフィニティークロマトグラ
フィーにかけ、該抽出物をアニオン交換クロマトグラフ
ィーまたはカチオン交換クロマトグラフィーまたはヒド
ロキシアパタイトクロマトグラフィーにかけることを包
含する。好ましい実施態様において、これらの工程は順
次に前述の順序で実施される。ヌクレオチド結合性タン
パク質アフィニティークロマトグラフィーの工程は、DN
Aポリメラーゼをエンドヌクレアーゼのタンパク質から
単離するために好ましい。

発明を実施するための態様 本発明は、Tma DNAポリメラーゼをコードするDNA配列お
よび発現ベクター、Tma DNAポリメラーゼの精製のプロ
トコル、精製されたTma DNAポリメラーゼの調製、およ
びTma DNAポリメラーゼを使用する方法を提供する。本
発明の理解を促進するために、多数の用語を下に定義す
る。

用語「細胞」または「細胞系」は互換的に使用し、そし
てすべてのこのような表示は子孫を包含する。こうし
て、語「形質転換体」または「形質転換された細胞」
は、転移の数に無関係に、一次形質転換細胞、およびそ
の細胞から誘導された培養物を包含する。すべての子孫
は、意図的のまたは偶発的突然変異のために、DNA含有
が正確に同一でないことがある。もとの形質転換された
細胞についてスクリーニングしたとき同一の機能有する
突然変異子孫は、形質転換体の定義の中に含められる。

用語「コントロール」は、特定の宿主生物体における作
用可能に連鎖したコード配列の発現に必要なDNA配列を
呼ぶ。例えば、原核生物に適当なコントロール配列はプ
ロモーター、必要に応じて、オペレーター配列、リボソ
ーム結合部位、および可能ならば他の配列、例えば、転
写停止配列を包含する。

用語「発現系」は、所望のコード配列およびコントロー
ル配列を作用可能な連鎖で含有するDNA配列を呼び、こ
うしてこれらの配列で形質転換された宿主はコードされ
たタンパク質を生産することができる。形質転換を実施
するために、発現系をベクター上に含めることができ
る；関係するDNAはまた、宿主の染色体の中に組み込む
ことができる。

用語「遺伝子」は、回収可能な生物活性ポリペプチドま
たは前駆体の発現をコードするDNA配列を呼ぶ。こうし
て、Tma DNAポリメラーゼ遺伝子はポリメラーゼおよびT
ma DNAポリメラーゼのコード配列を含む。ポリペプチド
は、全長のコード配列によるか、あるいは所望の酵素活
性が保持されるかぎりコード配列の一部分によりコード
されることができる。

用語「作用可能に連鎖した」は、コンロール配列がコー
ドされたタンパク質の発現を推進するために機能するよ
うに、コード配列の位置を決定することに関する。こう
して、コントロール配列に「作用可能に連鎖した」コー
ド配列は、コード配列がコントロール配列の指令下に発
現されることができるようなコンフィグレーションに関
する。

用語「混合物」は、それがTmaポリメラーゼを含有する
混合物に関係するとき、Tmaポリメラーゼを含むが、さ
らに他のタンパク質を含むことができる、物質の集まり
を呼ぶ。Tmaポリメラーゼが組換え宿主細胞に由来する
場合、他のタンパク質は通常宿主細胞に関連するであろ
う。宿主が細菌である場合、汚染するタンパク質は細菌
のタンパク質であろう。

用語「非イオン性ポリマー洗剤」は、イオンの電荷もせ
ず、そして、本発明の目的のために、約3.5〜約9.5のpH
範囲でTma酵素を可溶化する能力により特徴づけられる
表面活性剤を意味する。適当な非イオン性ポリマー洗剤
の多数の例は、米国特許同時継続出願第387,003号、198
9年７月28日提出（その開示をここに引用によって加え
る）に記載されている。

用語「オリゴヌクレオチド」は、ここで使用するとき、
２またはそれより多く、好ましくは３またはそれより多
くの、通常10より多いデオキシリボヌレオチドまたはリ
ボヌクレオチドから構成された分子として定義される。
正確な大きさは多数の因子に依存し、次いでこれらの因
子はオリゴヌクレオチドの究極の機能またはその使用に
依存する。オリゴヌクレオチドは合成的にまたはクロー
ニングにより誘導することができる。

用語「プライマー」は、ここで使用するとき、プライマ
ーの発現が開始される条件下に配置されたとき、合成の
開始点として作用することができるオリゴヌクレオチド
を呼ぶ。オリゴヌクレオチドの「プライマー」は、精製
された制限消化物におけるように、天然に存在すること
ができるか、あるいは合成的に生成することができる。
核酸鎖に対して相補的であるプライマーの発現生成物の
合成は、４つの異なるヌクレオチド三リン酸およびTma
熱安定性酵素の存在下に適当な緩衝液の中で適当な温度
において開始される。「緩衝液」は、所望のpHに調節さ
れた、コファクター（例えば、２価の金属イオン）およ
び塩（適当なイオン強度を与えるために）を含む。Tma
ポリメラーゼについて、緩衝液は好ましくは１〜3mMの
マグネシウム塩、好ましくはMgCl₂、50〜200μＭの各ヌ
クレオシド三リン酸、および0.2〜１μＭの各プライマ
ー、ならびに50mMのKCl、10mMのトリス緩衝液（pH8.0〜
8.4）、および100μg/mlのゼラチン（しかしゼラチンは
要求されず、そしてある応用において、例えば、DNAの
配列決定において回避すべきである）を含有する。

プライマーは増幅における効率を最大とするためには一
本鎖であるが、二本鎖であることができる。二本鎖であ
る場合、プライマーをまず処理してその鎖を単離した
後、発現生成物の調製のために使用する。プライマーは
通常オリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマ
ーは、ポリメラーゼ酵素の存在下に伸長生成物の合成を
プライミングするために十分に長くなくてはならない。
プライマーの正確の長さは多数の因子、例えば、プライ
マー源および所望の結果に依存し、そして反応温度は鋳
型へのプライマーの適切なアニーリングを保証するため
のプライマーの長さに依存して調節しなくてはならな
い。標的配列の複雑さに依存して、オリゴヌクレオチド
プライマーは典型的には15〜35ヌクレオチドを含有す
る。短いプライマー分子は、一般に、十分に安定な鋳型
との複合体を形成するために、より下い温度を必要とす
るであろう。

プライマーは、鋳型の特定の配列の鎖に対して「実質的
に」相補的であるように選択すべきである。プライマー
は、十分に相補的であって、プライマーの延長が起こる
ように鋳型の鎖とハイブリダイゼーションしなくてはな
らない。プライマーの配列は、鋳型の正確な配列を反映
することは必要ではない。例えば、非相補的ヌクレオチ
ドの断片は、プライマーの５′末端に結合することがで
き、プライマーの配列の残部はその鎖に対して実質的の
相補的である。非相補的塩基またはより長い配列をプラ
イマーの中に介在させることができるが、ただしプライ
マーは鋳型の配列と十分に相補的であって、ハイブリダ
イゼーションし、これによりプライマーの伸長生成物の
合成のための鋳型／プライマー複合体を形成することを
条件とする。

用語「制限エンドヌクレアーゼ」および「制限酵素」
は、二本鎖DNAを特定のヌクレオチド配列でまたはその
付近で切断する細菌酵素を呼ぶ。

用語「熱安定性酵素」は、加熱に対して安定でありかつ
耐熱性であり、そしてヌクレオチドの結合を適切な方法
で触媒（促進）して、核酸鎖に対して相補的である伸長
生成物を形成する酵素を意味する。一般に、プライマー
伸長生成物の合成は、プライマーの３′末端において開
始し、そして合成が停止するまで鋳型の配列の５′末端
に向かって進行する。熱安定性酵素は、80℃〜105℃の
温度に短時間（すなわち、５〜30秒）暴露した後、復元
しかつ活性を再び獲得しなくてはならず、そして60℃以
上の至適温度をもたなくてはならない。

本発明のTmaの熱安定性DANポリメラーゼ酵素は、ポリメ
ラーゼ連鎖反応またはPCRとして知られている増幅反応
における有効な使用のための要件を満足する。Tma DNA
ポリメラーゼ酵素は、PCR法において主要な工程であ
る、二本鎖の核酸の変性を実施するために必要な時間の
間、高温に暴露したとき、不可逆的に変性（不活性化）
しない。ここにおける目的のため、酵素の不可逆的変性
は、酵素的活性の永久的かつ完全な損失を意味する。

核酸の変性を実施するために必要な加熱条件は、例え
ば、緩衝液の塩濃度および組成、変性される核酸の長さ
および量に依存するが、典型的には変性温度は数秒〜数
分間で約80℃〜約105℃である。緩衝液の塩濃度および
／または核酸のGC組成が増加するにつれて、より高い温
度を必要とすることがある。Tma酵素は約80℃〜105℃の
温度に比較的短い暴露で不可逆的に変性しない。

Tmaの熱安定性酵素は、約60℃より高い、それが機能す
る至適温度有する。60℃より低い温度はプライマーの鋳
型へのハイブリダイゼーションを促進するが、塩の組成
および濃度およびプライマーの組成および長さに依存し
て、鋳型へのハイブリダイゼーションはより高い温度
（例えば、60℃〜80℃）において起こることができ、こ
れはプライマー延長反応の特異性を促進することができ
る。酵素のための至適温度が高くなればなるほど、プラ
イマー指令の伸長反応の特異性および／または選択性は
より大きくなるであろう。Tma酵素は約45℃〜90℃の広
い温度範囲にわたって活性を示す；好ましい至適温度は
75℃〜80℃である。

本発明はまた、サーモタガ・マリチマ（Thermotoga ma
ritima）の熱安定性DNAポリメラーゼＩ活性をコードす
るDNA配列を提供する。この配列によりコードされるア
ミノ酸配列は、サームス・アクアチクス（Thermus aqu
aticus）およびサームス・サーモフィルス（Thermus t
hermohpilus）の熱安定性DNAポリメラーゼの部分に対す
る相同性有する。Tma DNAポリメラーゼ遺伝子の５′−A
TG開始コドンからTGA−３′停止コドンへの完全なコー
ド配列は下に記載されており、そして配列を列挙する節
において配列番号:1として列挙されている。この配列に
参照のために番号を付してある。

Tma DNAポリメラーゼ遺伝子の完全なコード配列、およ
びコードされた３文字の略号で表されるアミノ酸配列の
両者は、配列番号:1として配列表の節に記載されてい
る。便宜上、Tma DNAポリメラーゼ遺伝子配列によりコ
ードされたアミノ酸配列をまた、１文字の略号でアミノ
末端からカルボキシ末端に、下記に示す。この配列に参
照のための番号が付されている。

アミノサンのための１文字の略号を便宜上下に示す。

Ｆ＝フェニルアラニン Ｈ＝ヒスチジン Ｌ＝ロイシン Ｑ＝グルタミン Ｉ＝イソロイシン Ｎ＝アスパラギン Ｍ＝メチオニン Ｋ＝リジン Ｖ＝バリン Ｄ＝アスパラギン酸 Ｓ＝セリン Ｅ＝グルタミン酸 Ｐ＝プロリン Ｃ＝システイン Ｔ＝スレオニン Ｗ＝トリプトファン Ａ＝アラニン Ｒ＝アルギニン Ｙ＝チロシン Ｇ＝グリシン Tma DNAポリメラーゼＩのためのコード配列は、「縮重
（degenerate）プライマー」法により同定され、この方
法は広い実用性を有し、そして本発明の重要な面であ
る。縮重プライマー法において、既知の熱安定性DNAポ
リメラーゼの保存されたドメインに対応する任意の熱安
定性ポリメラーゼのモード配列のDNA断片を同定するこ
とができる。

縮重プライマー法の１つの態様において、対応する保存
されたドメインは、Taq,TmaおよびTthの熱安定性DNAポ
リメラーゼのアミノ酸配列のためのコード配列からのも
のである。縮重プライマー法は、Taq,Tth,Tおよび種々
の保存された領域が同定されたE.coliからのDNAポリメ
ラーゼＩのタンパク質のアミノ酸配列を比較することに
よって開発された。次いで、これらの保存された領域に
相当するプライマーが設計された。本発明のTma配列を
使用して他の縮重プライマーを設計することができる。
縮重プライマー法の一般的実用性を、ここで、Tma遺伝
子のクローニングに適用された方法を特別に参照して例
示する。

Tma DNAポリメラーゼＩ遺伝子をクローニングするため
に、保存されたアミノ酸配列をアミノ酸の各々のための
可能なコドンのすべてに転換した。遺伝コードの縮重性
のために、所定のアミノ酸はいくつかの異なるコドンに
より表示することができる。所定のアミノ酸のためのコ
ドンの中に複数の塩基が存在できる場合、その配列は縮
重性をもつと言われる。

次いで、所定のアミノ酸配列をコードすることができ
る、すべての可能なDNA配列のプールとして、プライマ
ーを合成した。所定のプライマーのプールについての縮
重の量は、各位置における可能なヌクレオチドの数を掛
けることによって決定することができる。

プライマーのプールがより縮重性をもつようになるほど
（すなわち、プール内の個々のユニークプライマーDNA
配列の数がより大きくなるほど）、ユニークプライマー
配列の１つが所望のもの以外の標的染色体DNAの領域に
結合する確率はより大きくなり−それゆえ、生ずる増幅
の特異性はより少なくなる。縮重プライマーを使用して
増幅の特異性を増加するために、プールをサブセットと
して合成し、こうしてサブセットの全体の群が所定のア
ミノ酸配列をコードするすべての可能なDNA配列を含む
が、各個々のサブセットは一部分のみを含むようにす
る：例えば、１つのプールはＧまたはＣを特定の位置に
含有することができるが、他のものは同一位置にＡまた
はＴを含有する。これらのサブプールの各々はDG番号で
表示される。

前方プライマー（非コード鎖に対して相補的である、遺
伝子の５′−領域から３′−領域に向う方向）および逆
プライマー（コード鎖に対して相補的である、遺伝子の
３′−領域から５′−領域に向う方向）の両者を、これ
らの保存された領域の大部分について設計してTmaポリ
メラーゼをクローニングした。５′−末端に制限部位を
もつプライマーを設計して、クローニングを促進した。
前方プライマーはBalII制限部位（AGATCT）を含有した
が、逆プライマーはEcoRI制限部位（GAATTC）を含有し
た。さらに、プライマーは５′−末端に２ヌクレオチド
を含有して、その制限部位における切断効率を増加し
た。

次いで、縮重プライマーをPCR法において使用し、ここ
で標的核酸はサーモタガ・マリチマ（Thermotoga mari
tima）からの染色体DNAであった。１系列の温度プロフ
ィルと組み合わせて、前方プライマーおよび逆プライマ
ーのプールの組み合わせを使用するPCR法の生成物を比
較した。Taq染色体DNAを使用して発生させた生成物に対
して特異的な同一の大きさの生成物を生成したとき、PC
R断片をゲル精製し、再増幅し、そしてベクターBSM13H:
BalIIの中にクローニングした（ストラタジーン（Strat
agenc）のベクターpBSM＋の誘導体、ここでpBSM＋のHin
dIII部位はBalII部位に転換されている）。配列がポリ
メラーゼタンパク質とくにTaqポリメラーゼおよびTthポ
リメラーゼの中の他の既知のアミノ酸配列に対して相同
性であるアミノ酸配列をコードすることが見出された場
合、その配列は可能性ある熱安定性DNAポリメラーゼコ
ード配列として同定された。

次いで、Tma DNAポリメラーゼ酵素の部分が、サザン−
ブロット分析により、サーモタガ・マリチマ（Thermoto
ga maritima）の染色体DNA中に同定された。Tma染色体
DNAを種々の酵素で消化し、そしてニトロセルロースの
フィルターに移した。³²Pまたはビオチン−dUTPで標識
したプローブを、クローニングしたPCR生成物からの遺
伝子の種々の領域について発生させた。プローブをニト
ロセルロースに結合したゲノムDNAにハイブリダイゼー
ションさせ、プローブにハイブリダイゼーションする染
色体DNA断片の大きさの同定を可能とした。遺伝子の
５′および３′領域をカバーするプローブの使用によ
り、１または２以上のDNA断片がポリメラーゼのための
構造遺伝子の全部でないにしても大部分を含有すること
が保証される。クローニングを促進するために、単一の
DNA断片またはいくつかのDNA断片中に構造遺伝子を含有
する断片を生成するために使用することができる制限酵
素を同定することができる。

いったん同定した後、Tma DNAポリメラーゼ遺伝子をコ
ードする染色体のDNA断片をクローニングした。染色体D
NAを同定された制限酵素で消化し、そして大きさで分別
した。所望の大きさの領域を含有する分画を濃縮し、脱
塩し、そしてBSM13H:BalIIのクローニングベクター中に
クローニングした。前にクローニングしたPCR生成物か
ら発生した標識したプローブを使用するハイブリダイゼ
ーションによりクローンを同定した。次いで、PCR生成
物をポリアクリルアミドゲル上で分析した。

上に示したDNA配列およびアミノ酸配列並びにそれらの
配列をコードするDNA化合物を使用して、組み換えDNA発
現ベクターを設計および構成して、広範な種類の宿主細
胞中でのTma DNAポリメラーゼ活性の発現を推進するこ
とができる。上に示したDNA配列のすべてまたは一部分
をコードするDNA化合物もまた、プローブとして使用し
て、他の生物体からの熱安定性ポリメラーゼをコードす
るDNAを同定することができ、そして上に示したアミノ
酸配列を使用して、熱安定性ポリメラーゼの同定および
精製に使用できる抗体の調製における免疫原として使用
するためのペプチドを設計することができる。

しかしながら、上のアミノ酸配列をコードする組み換え
ベクターによるか、あるいは天然サーモトガ・マリチマ
（Thermotoga maritima）細胞により生産されたかどう
かにかかわらず、Tma DNAポリメラーゼは、典型的に
は、精製した後、組み換えDNA技術において使用する。
本発明はこのような精製法を提供する。

天然タンパク質を回収するために、細胞を任意の適当な
技術を使用して増殖させる。簡単に述べると、細胞は次
の成分を含有する「MMS」培地の中で増殖させる（１リ
ットル当たり）:NaCl（6.93g）;MgSO₄・7H₂O（1.75g）;
MgCl₂・6H₂O（1.38g）;KCl（0.16g）:NaBr（25mg）;H₃B
O₃（7.5mg）;SrCl₂・6H₂O（3.8mg）;KI（0.025mg）;CaC
l₂（0.38g）;KH₂PO₄（0.5g）;Na₂S（0.5G）；（NH₄）₂N
i（SO₄）_２（2mg）；微量のミレラル（Balchら、Microb
iol.Rev.，43260−296（15ml）；レサズリン（1mg）；
および澱粉（5g）、pH6.5（H₂SO₄で調節した）。固体培
地上での増殖のために、0.8％の寒天（Oxoid）を培地に
添加することができる。細胞の合理的増殖はまた、0.5
％の酵母エキスを補充した「SME」培地（Stetterら、19
83,Syst.Appl.Microbiol.，４:535−551）中で、あるい
はマリンブロス（marine broth）（Difco2216）の中で
起こる。

細胞の増殖後、酵素の単離および精製を６段階で実施
し、それらの各々は、特記しない限り、室温以下の温
度、好ましくは約０℃〜約４℃において実施する。第１
段階または工程において、細胞を、それが凍結されてい
る場合は、融解し、アミンコ・フレッシュ・プレッシュ
アー・セル（Aminco fresh pressure cell（８〜20,000
psi）の中で溶解し、緩衝液（約pH7.5）中に懸濁させ、
そして超音波処理して粘度を減少させる。

第２段階において、硫酸アンモニウムをリゼイトに添加
して、Tma DNAポリメラーゼがDNAまたは細胞リゼイトの
タンパク質に結合するのを防止する。また、第２段階に
おいて、ポリミン（Polymin）Ｐ（ポリエチレンイミ
ン、PEI）をリゼイトに添加して、核酸を沈澱させ、そ
してリゼイトを遠心する。

第３工程において、硫酸アンモニウムを上澄み液に添加
し、そして上澄み液を0.3Mの硫酸アンモニウムおよび0.
5mMのDTT（ジチオスレイトール）を含有するTE（50mMの
トリス−Cl、pH7.5）により平衡化したフェニルセルフ
ァローズ（Sepharose）カラム上に負荷する。次いでこ
のカラムを同一の緩衝液で、第２にTE−DTT（硫酸アン
モニウムを含まない）で、第３にエチレングリコール−
TE−DTTで、そして最後にエチレングリコールを含有す
るTE−DTT中2Mの尿素で洗浄する。フェニルセファロー
ズの容量を越える（すなわち、約20〜30mgのタンパク質
/mlの樹脂より多くを負荷することによって）ことがな
いかぎり、Tmaポリメラーゼ活性のすべてはカラムによ
り保持され、そしてエチレングリコールを含有するTE−
DTT中の2Mの尿素で溶出される。

第４段階において、尿素の溶離液を、0.08MのKCl、50mM
のトリス−Cl（pH7.5）、0.1mMのEDTA、0.2％のツイー
ン20および0.5mMのDTTにより平衡化したヘパリンセファ
ローズカラムに適用する。次いで、カラムを同一の緩衝
液で洗浄し、そして酵素を0.08M〜0.5MのKClの直線の勾
配で溶出する。ピーク活性分画は0.225M〜0.275MのKCl
において見いだされた。

第５段階において、第４段階において集められた分画を
KClを含まないアフィゲル（affigel）−ブルー緩衝液で
希釈し、そして25mMのトリス−Cl（pH7.5）、0.1mMのED
TA、0.2％のツイーン20、0.5mMのDTT、および0.15MのKC
lの中で平衡化したアフィゲル−ブルーカラムに適用す
る。このカラムを同一の緩衝液で洗浄し、そして同一の
緩衝液中の0.15M〜0.7MのKClの直線勾配で溶出する。ピ
ーク活性分画は勾配の0.3M〜0.55MのKClにおいて見いだ
された。次いでピーク活性のこれらの分画を、任意の適
当な手順を使用して汚染デオキシリボヌクレアーゼ（エ
ンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼ）について
試験する。１例として、エンドヌクレアーゼ活性は、過
剰のDNAポリメラーゼとのインキュベーション後、ファ
ージλ DNAまたはスーパーコイルドのプラスミドDNAの
分子量の変化から電気泳動的に決定することができる。
同様に、エキソヌクレアーゼ活性は、過剰のDNAポリメ
ラーゼとのインシュベーション後、制限酵素で消化した
DNAの分子量の変化から電気泳動的に決定することがで
きる。デオキシリボヌクレアーゼ活性をもとない分画を
プールし、そして50mMのKClを含有するホスホセルロー
スの緩衝液の中に透析濾過する。

最後に、第６段階において、第５段階からの透析濾過し
たプールを、25mMのトリス−Cl（pH7.5）、50mMのKCl、
0.1mMのEDTA、0.2％のツイーン20および0.5mMのDTTの正
しいpHおよびイオン強度に平衡化した、ホスホセルロー
スのカラム上に負荷する。次いで、このカラムを同一の
緩衝液で洗浄し、そして0.05M〜0.5MのKClの直線勾配で
溶出する。ピーク分画は0.215M〜0.31MのKClにおいて溶
出された。これらの分画からの、分解していない精製さ
れたDNAポリメラーゼは、イン−シチユ活性ゲルにおけ
る変化しない移動パターンにより証明される。

サーモタガ・マリチマ（Thermotoga maritima）から精
製されたDNAポリメラーゼの分子量は、任意の技術によ
り、例えば、タンパク質の分子量マーカーを使用するSD
S−PAGEによるか、あるいはコード配列の計算により決
定することができる。サーモタガ・マリチマ（Thermoto
ga maritima）の精製されたDNAポリメラーゼの分子量
は、SDS−PAGEにより、約97kDaであると決定される。予
測されたアミノ酸配列に基づいて、分子量は約102kDaで
推定される。天然Tma DNAポリメラーゼの精製のプロト
コルは、実施例１により詳細に記載されている。本発明
の組換えTmaポリメラーゼの精製は、同様な方法により
実施することができる。

種々の分子量の生物学的に活性な組換えTmaポリメラー
ゼは、本発明の方法およびベクターにより調製すること
ができる。Tma DNAポリメラーゼ遺伝子の完全なコード
配列が大腸菌（E. coli）中の発現ベクターの中に存在
するときでさえ、細胞は、位置140におけるメチオニン
のコドンで開始する翻訳により形成された切頭されたポ
リメラーゼを生産する。また、Tmaのコード配列の位置2
84におけるメチオニンのコドンにおいて翻訳を開始する
ことによって生産されるタンパク質に相当する切頭ポリ
メラーゼの生産のために、組み換え手段を使用すること
ができる。アミノ酸１〜139（約86kDa）を欠如するポリ
メラーゼおよび野生型Tmaポリメラーゼのアミノ酸１〜2
83（約70kDa）を欠如するポリメラーゼは、ポリメラー
ゼ活性を保持するが、弱化した５′→３′エキソヌクレ
アーゼ活性を有する。さらに、70kDaのポリメラーゼは
天然Tmaポリメラーゼより有意にいっそう熱安定性であ
る。

こうして、安全なTma DNAポリメラーゼＩ酵素の全体の
配列は活性のために要求されない。組換えDNA技術にお
いて、Tma DNAポリメラーゼＩのコード配列の部分を使
用して、DNAポリメラーゼ活性をもつ生物学的に活性な
遺伝子生産物を生産することができる。Tma DNAポリメ
ラーゼの配列をコードするDNAの入手可能性はまた、DNA
ポリメラーゼ活性を有するムテイン（突然変異タンパク
質）の形態を発生させるためにコード配列を修飾する機
会を提供する。Tmaポリメラーゼのアミノ（Ｎ）−末端
部分はポリメラーゼ活性に不必要であり、むしろタンパ
ク質の５′→３′エキソヌクレアーゼ活性をコードす
る。組換えDNA法を使用して、Tma遺伝子のＮ−末端のコ
ード配列のほぼ1/3を欠失し、クローニングし、そして
ポリメラーゼのアッセイにおいて非常に活性である遺伝
子生産物を発現することができるが、欠失の程度に依存
して、５′→３′エキソヌクレアーゼ活性を有する。ポ
リメラーゼのある種のＮ−末端の短縮された形態は活性
であるので、これらのポリメラーゼの発現のために使用
する遺伝子構成体はコード配列の対応する短縮された形
態を含むことができる。

Ｎ−末端の除去に加えて、Tmaポリメラーゼのペプチド
鎖中の個々のアミノ酸残基は、酸化、還元、または他の
誘導体化により修飾することができ、そしてタンパク質
を切断して活性を保持する断片を得ることができる。活
性を破壊しないこのような変更は、そのタンパク質をTm
aポリメラーゼ活性をもつタンパク質の定義から除外せ
ず、それゆえ本発明の範囲内に包含される。

Tma DNAポリメラーゼのコード配列の一次構造を欠失、
付加または変更して、そのコード配列から生成されたmR
NAの翻訳の間にTma DNAポリメラーゼの中の組み込まれ
るアミノ酸配列を変化させることは、タンパク質の高温
のDNAポリメラーゼ活性を破壊しないで、実施すること
ができる。このような置換または他の変更は、本発明の
考えられる範囲内に入るDNAによりコードされるアミノ
酸配列を有するタンパク質を生成する。同様に、Tma DN
Aポリメラーゼ遺伝子のクローニングされたゲノム配列
または相同の合成配列を使用して、Tma DNAポリメラー
ゼ活性をもつ融合ポリペプチドを発現すること、あるい
は天然Tma DNAポリメラーゼのアミノ酸配列と同一のア
ミノ酸配列をもつタンパク質を発現することができる。
さらに、このような発現は、Tma DNAポリメラーゼ遺伝
子のコントロール配列によるか、あるいはTma DNAポリ
メラーゼを発現するために選択された宿主中で（その宿
主がなにであろうと）機能するコード配列により、指令
されることができる。

こうして、本発明は、種々の宿主系に適用可能な発現ベ
クターを構成することができるTma DNAポリメラーゼの
ためのコード配列および発現されるコード配列を提供す
る。Tmaポリメラーゼをコードする配列の部分はまた、
種々の種における他の熱安定性ポリメラーゼをコードす
る配列を回復するプローブとして有用である。したがっ
て、少なくとも４〜６つのアミノ酸をエンコードするオ
リゴヌクレオチドのプローブを合成し、そして熱安定性
ポリメラーゼをエンコードする追加のDNAを探索するた
めに使用することができる。サーモタガ・マリチマ（Th
ermotoga maritima）の熱安定性DNAポリメラーゼの遺
伝子のヌクレオチド配列と他の種の対応する遺伝子との
間に正確な合致は存在しないであろうから、誤った陽性
を排除するために十分なストリンジェンシーの条件下に
ハイブリダイゼーションを得るために、ほぼ12〜18ヌク
レオチドを含有するオリゴマー（４〜６アミノ配列をコ
ードする）が通常必要である。６アミノ酸をコードする
配列は、このようなプローブのために十分な情報を供給
する。このようなオリゴヌクレオチドのプローブを、本
発明の縮重プライマー法においてプライマーとして使用
して、熱安定性ポリメラーゼをコードする解読配列を得
ることができる。

したがって、本発明は、Tma DNAポリメラーゼのための
コード配列およびアミノ酸配列を提供することによっ
て、他の熱安定性ポリメラーゼ酵素およびそれらの酵素
のためのコード配列の単離を可能とする。Tma DNAポリ
メラーゼＩタンパク質のアミノ酸配列は、TaqおよびTth
の熱安定性DNAポリメラーゼのアミノ酸配列に非常に類
似する。これらの類似性は、Tma DNAポリメラーゼのコ
ード配列の同定および単離を促進した。これらの３つの
熱安定性DNAポリメラーゼのコード配列における類似領
域は、配列を整列させることによって容易に観察するこ
とができる。

しかしながら、３つの熱安定性DNAポリメラーゼのコー
ド配列の間の不一致の領域をプローブとして使用して
も、熱安定性ポリメラーゼの酵素をコードする他の熱安
定性ポリメラーゼのコード配列を同定することができ
る。例えば、Taqのいくつかの性質およびTmaの他の多様
な性質を有する熱安定性ポリメラーゼのコード配列を、
TaqとTmaとの間の非類似性の領域をコードする配列に向
けられたプローブを使用することによって同定すること
ができる。詳しくは、このような領域は、アミノ酸配列
コーデネートにより同定される、次の任意の１または２
以上領域からの４またはそれ以上の隣接するアミノ酸の
ストレッチを包含する（番号を包含する）:5−10,73−7
9,113−119,134−145,191−196,328−340,348−352,382
−387,405−414,467−470,495−499,506−512,555−55
9,579−584,595−599,650−655,732−742,820−825,850
−856。

これらの領域は「ホールマークのモチーフ（hallmark m
otifs）」として考えられ、そして熱安定性DNAポリメラ
ーゼの機能（例えば、５′→３′エキソヌクレアーゼ活
性、３′→５′エキソヌクレアーゼ活性、およびDNAポ
リメラーゼ活性）のために重要なアミノ酸のシグネチュ
アー（signature）配列の追加の領域を定める。

Tma DNAポリメラーゼの中に見いだされるが、天然Taq D
NAポリメラーゼおよび天然Tth DNAポリメラーゼにおい
て欠如する１つの性質は、３′→５′エキソヌクレアー
ゼ活性である。この３′→５′エキソヌクレアーゼ活性
は、一般に望ましいと考えられる。なぜなら、合成され
た核酸配列の誤って組み込まれたまたは不一致の塩基が
この活性により排除されるからである。したがって、
３′→５′エキソヌクレアーゼ活性をもつポリメラーゼ
（例えば、Tma DNAポリメラーゼ）を利用するPCRの信頼
性は増加する。Tma DNAポリメラーゼの中に見いだされ
る３′→５′エキソヌクレアーゼ活性はまた、PCRにお
けるプライマー/2量体複合体の形成の確率を減少する。
３′→５′エキソヌクレアーゼ活性は、事実、非鋳型依
存性の方式で結合されたヌクレオチドを除去することに
よって、非鋳型依存性の方式でのプライマーの３′末端
への余分のdNTPの結合を防止する。３′→５′エキソヌ
クレアーゼ活性は、一本鎖のDNA、例えば、プライマー
または一本鎖の鋳型を排除することができる。本質的
に、一本鎖のプライマーまたは鋳型の各ヌクレオチドは
不一致として酵素により処理され、したがって分解され
る。PCRにおけるプライマーの分解を回避するために、
ホスホロチオエートをプライマーの３′末端に付加する
ことができる。ホスホロチオエートで修飾されたヌクレ
オチドは３′→５′エキソヌクレアーゼによる除去に対
していっそう抵抗性である。

熱安定性DNAポリメラーゼにおける３′→５′エキソヌ
クレアーゼ活性のために重量なアミノ酸の「モチーフ」
または特徴ある「シグネチュア配列」は、３つの短いド
メインからなるとして定義することができる。下におい
て、これらのドメインはA,BおよびＣとして定義され、
重要なアミノ酸塩基は１文字の略号で示されておりそし
て重要でない残留は「ｘ」として識別されている。ドメイン 配 列 代表的なTmaコーディネート Ａ DxExxxL 323−329 Ｂ NxxxDxxxL 385−393 Ｃ YxxxD 464−468 領域Ａと領域Ｂとの間の距離は55−65アミノ酸である。
領域Ｂと領域Ｃとの間の距離は67−75アミノ酸、好まし
くは約70アミノ酸である。Tma DNAポリメラーゼにおい
て、重要なモチーフのシグネチュア配列を定めないアミ
ノ酸配列は、ドメインＡにおいて、それぞれ、Ｌおよび
TSS;ドメインＢにおいて、それぞれ、LKFおよびYKV;お
よびドメインＣにおいてSCEである。したがって、Tma D
NAポリメラーゼＩにおいて、ドメインＡはDLETSSLであ
り；ドメインＢはNLKFDYKVLであり；そしてドメインＣ
はYSCEDである。こうして、本発明は、ドメインA,Bおよ
びＣを含んでなり、そして、さらに具体的には、Ｄ−Ｘ
−Ｅ−X³−Ｌ−X^55-65−Ｎ−X⁸−Ｄ−X³−Ｌ−X^85-76−
Ｙ−X³−Ｄを含んでなる３′→５′エキソヌクレアーゼ
活性を有する熱安定性DNAポリメラーゼを提供し、ここ
で１文字の略号を使用し、そしてX^Nは特定したアミノ酸
の間の重要でないアミノ酸の番号（Ｎ）を表す。

熱安定性３′→５′エキソヌクレアーゼのドメインは、
Tma DNAポリメラーゼのアミノ酸291−484により表され
る。したがって、「ドメインのシャフリング（domain s
huffling）」または「熱安定性キメラDNAポリメラー
ゼ」の構成を使用して、新規な性質を有する熱安定性DN
Aポリメラーゼを得ることができる。例えば、コドン約2
91−約484を含んでなるTma DNAポリメラーゼのコード配
列によりサーマス・アクアチクス（Thermus aquaticu
s）DNAポリメラーゼのコドン289−422を置換すると、Ta
q DNAポリメラーゼの５′→３′エキソヌクレアーゼの
ドメイン（１−289）、Tma DNAポリメラーゼの３′→
５′エキソヌクレアーゼのドメイン（291−481）、およ
びTaq DNAポリメラーゼ（423−832）のDNAポリメラーゼ
のドメイン（423−832）を含有する新規な熱安定性DNA
ポリメラーゼが生成するであろう。あるいは、Tma DNA
ポリメラーゼの５′→３′エキソヌクレアーゼのドメイ
ンおよび３′→５′エキソヌクレアーゼのドメイン（約
コドン１−484）を、Taq DNAポリメラーゼのDNAポリメ
ラーゼの（dNTP結合性およびプライマー／鋳型結合性ド
メイン）部分（約423〜832コドン）に融合することがで
きる。ドナーおよびレシピエントはTaqおよびTma DNAポ
リメラーゼに限定することは必要ではない。Tth DNAポ
リメラーゼはTaq DNAポリメラーゼと類似するドメイン
を提供する。さらに、Tth DANポリメラーゼの増強した
／好ましい逆転写酵素の性質は、上に例示した３′→
５′エキソヌクレアーゼのドメインを付加することによ
ってさらに増強することができる。

種々の手段の任意のものを使用してキメラDNAポリメラ
ーゼのコード配列（新規な性質を有する）を発生するこ
とができるが、好ましい方法は「オーバーラップ」PCR
を使用する。この方法においては、意図する連結部配列
をPCRプライマー（それらの５′−末端）にデザインし
て入れる。個々のドメインの最初の増幅の後、種々の生
成物を希釈し（約100〜1000倍）そして組み合わせ、変
性し、アニーリングし、伸長し、次いで最終の前方プラ
イマーのおよび逆プライマーをそれ以外は標準のPCRの
ために添加する。

こうして、Tma DNAポリメラーゼの３′→５′エキソヌ
クレアーゼをコードする配列をTma DNAポリメラーゼか
ら除去するか、あるいは組換えDNA法によりこの活性を
欠如する他のポリメラーゼに付加することができる。非
熱安定性DNAポリメラーゼにおいて、３′→５′エキソ
ヌクレアーゼ活性のドメインをTmaポリメラーゼの熱安
定性３′→５′エキソヌクレアーゼのドメインで置換す
ることさえ可能である。同様に、非熱安定性、DNAポリ
メラーゼの３′→５′エキソヌクレアーゼ活性のドメイ
ンを使用して、Tmaポリメラーゼ（または任意の他のポ
リメラーゼ）の３′→５′エキソヌクレアーゼのドメイ
ンを置換して本発明の有用なポリメラーゼをつくること
ができる。当業者が認識するように、上記のキメラポリ
メラーゼは組換えDNA技術により最も容易に構成され
る。同様なキメラポリメラーゼは１つのDNAポリメラー
ゼの５′→３′エキソヌクレアーゼのドメインを他のDN
Aポリメラーゼに移動させることによって構成すること
ができる。

天然Tma DNAポリメラーゼと同一の酵素またはその酵素
の誘導体または相同体を生産しようとするかどうかにか
かわらず、Tmaポリメラーゼの組換え形の生産は、典型
的には、発現ベクターの構成、そのベクターによる宿主
細胞の形質転換、および発現が起こる条件下での形質転
換された宿主細胞の培養を包含する。

発現ベクターを構成するために、成熟（ここで、すべて
のキメラまたは変異タンパク質を包含するように使用す
る）酵素あるいは活性を破壊しない追加の配列への、ま
たは活性タンパク質を生成するコントロールされた条件
（例えば、ペプチダーゼによる処理）下に切断可能な追
加の配列へのTmaポリメラーゼの融合体をコードするDNA
を得る。次いで、コード配列を発現ベクターの中の適当
なコントロール配列と作用可能な連鎖で配置する。ベク
ターは宿主細胞の中で自律的に複製するように、あるい
は宿主細胞の染色体DNAの中に組み込むように設計する
ことができる。このベクターを使用して適当な宿主を形
質転換し、そして形質転換された宿主を組換えTmaポリ
メラーゼの発現のために適当な条件下で培養する。この
Tmaポリメラーゼを培地または細胞から単離するが、タ
ンパク質の回収および精製はある場合において必要でな
いことがある。

前記の工程の各々は種々の方法で実施することができ
る。例えば、所望のコード配列をゲノムの断片から獲得
し、そして適当な宿主において直接使用することができ
る。種々の宿主において作用可能な発現ベクターの構成
は、一般に後述するように、適当なレプリコンおよびコ
ントロール配列を使用して実施する。所望のコード配列
およびコントロール配列を含有する適当なベクターの構
成は、この分野においてよく理解されている標準的連結
および制限技法を使用する。単離されたプラスミド、DN
A配列または合成されたオリゴヌクレオチドを切断し、
修飾し、そして所望の形態に再連結する。適当な制限部
位を、通常存在しない場合、下に例示するように、コー
ド配列の末端に付加して発現ベクターの構成を促進する
ことができる。

部位特異的なDNAの切断は、一般にこの分野において理
解されておりかつ商業的に入手可能な酵素の製造業者に
より特定されている条件下に、適当な１種または２種以
上の制限酵素で処理することによって実施する。例え
ば、ニュー・イングランド・バイオラブス（New Englan
d Biolabs）の製品カタログを参照のこと。一般に、約
１μｇのプラスミドまたは他のDNAを約20μｌの緩衝液
の中で１単位の酵素により切断する；下記の実施例にお
いて、過剰の制限酵素を一般に使用してDNAの完全な消
化を保証する。約37℃において約１〜２時間のインキュ
ベーション時間が適当であるが、変更も許容されうる。
各インキュベーション後、タンパク質をフェノールまた
はクロロホルムを使用する抽出により取り除く；この抽
出に引き続いて、エーテルの抽出およびエタノール沈澱
により水性分画からのDNAの回収を実施することができ
る。必要に応じて、切断された断片のサイズ分離を、標
準的技術を使用して、ポリアクリルアミドゲルまたはア
ガロースゲルの電気泳動により実施することができる。
例えば、Methods in Enzymology,1980,65:499−560を参
照のこと。

一本鎖の「オーバーラッピング」末端のもつ制限切断さ
れた断片は、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸
（dNTP）の存在下に約15〜25分のインキュベーション時
間を使用して20℃〜25℃において、50mMのトリスpH7.
6、50mMのNaCl、10mMのMgCl₂、10mMのDTTおよび５〜10
μＭのdNTPの中で、大腸菌（E. coli）DNABポリメラー
ゼＩ（クレノー）の大断片で処理することによって平滑
末端化（二本鎖の末端）することができる。必要に応じ
て、突出する末端の性質により決定される制限内で１の
みのまたは選択されたdNTPを供給することによって、選
択的修復を実施することができる。クレノーによる処理
後、この混合物をフェノール／クロロホルムで抽出し、
そしてエタノール沈澱させる。同様な結果はS1ヌクレア
ーゼを使用して達成することができる。なぜなら、適当
な条件下のS1ヌクレアーゼによる処理は核酸の一本鎖部
分の加水分解を生ずるからである。

合成のオリゴヌクレオチドは、Matteucciら、J.Am.Che
m.Soc.，103:3185−3191のトリエステル法、または自動
化された合成法を使用して調製することができる。アニ
ーリングの前のまたは標識化のための一本鎖のキナーゼ
処理は、50mMのトリス（pH7.6）、10mMのMgCl₂、5mMの
ジチオスレイトール（DTT）および１〜２μＭのATPの存
在下に0.5μＭの基質に対して過剰の、例えば、ほぼ10
単位のポリヌクレオチドキナーゼを使用して達成され
る。キナーゼ処理がプライマーの標識化のためである場
合、ATPは高い比活性のγ−³²Pを含有するであろう。

連結は15〜30μｌの体積で次の標準的条件および温度で
実施される::20mlのトリス−Cl（pH7.5）、10mMのMgC
l₂、10mMのDTT、33μg/mlのESA、10mM〜50mMのNaCl、お
よび０℃において40mMのATPおよび0.01〜0.02（Weiss）
単位のT4DNAリガーゼ（相補的一本鎖の末端をもつ断片
の結合のため）あるいは14℃において1mMのATPおよび0.
3〜0.6単位のT4DNAリガーゼ（「平滑末端」の結合のた
め）。相補的末端をもつ断片の分子相互の結合は、通
常、33〜100μg/mlの合計DNA濃度（５〜100nMの合計末
端濃度）で実施する。分子相互の平滑末端の結合（必要
に応じて、20〜30倍のモル過剰のリンカーを使用する）
は１μＭの合計末端濃度において実施する。

ベクターの構成において、ベクターの断片を細菌のまた
は仔ウシ腸アルカリ性ホスファターゼ（BAPまたはCIA
P）で処理して５′のホスフェートを除去し、そしてベ
クターの再結合および再構成を防止する。BAPおよびCIA
Pの消化条件はこの分野においてよく知られており、そ
して発表されたプロトコルは通常商業的に入手可能なBA
PおよびCIAP酵素に伴う。核酸断片を回収するために、
調製物をフェノール−クロロホルムで抽出し、そしてエ
タノール沈澱させてAPを除去し、そしてDNAを精製す
る。あるいは、再結合は、所望のベクターとの結合の前
後に、不必要なベクターの制限酵素消化により防止する
ことができる。

配列の修飾を必要とするベクターまたはコード配列の部
分のために、種々の部位特異的プライマー指令変異誘発
法を利用することができる。ポリメラーゼ連鎖反応（PC
R）を使用して部位特異的変異誘発を実施することがで
きる。現在この分野において標準的である他の技術にお
いて、所望の突然変異をコードする合成オリゴヌクレオ
チドをプライマーとして使用して、変異原プライマーの
伸長生産物の構成のための鋳型として働く一本鎖ベクタ
ー、例えば、pBS13＋の相補的核酸配列の合成を指令す
る。変異原されたDNAを宿主細菌中に形質転換し、そし
て形質転換された細菌の培養物をプレートし、そして同
定する。修飾されたベクターの同定は、ニトロセルロー
スのフィルターまたは他の膜への選択された形質転換体
の移転、および修飾された配列への正確な合致を許す
が、もとの鎖へのハイブリダイゼーションを防止する温
度においてキナーゼ処理した合成プライマーとハイブリ
ダイズした「リフト（lifts）」を包含する。次いで、
プローブとハイブリダイゼーションする。DNAを含有す
る形質転換体を培養し、そして修飾されたDNAの溜めと
して使用する。

下に記載する構成において、プラスミドの構成のために
正しい連結は、大腸菌（E. coli）DG101株または他の
適当な宿主をまず連結混合物で形質転換することによっ
て確認される。適当な形質転換体を、この分野において
理解されているように、プラスミドの構成のモードに依
存して、アンピシリン、テトラサイクリンまたは他の抗
生物質耐性によるか、あるいは他のマーカーを使用する
ことによって選択する。次いで、形質転換体からのプラ
スミドを、Clewellら、1969,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,6
2:1159、の方法に従い、必要に応じてクロランフェニコ
ール増幅（Clewell,1972,J.Bacteriol.，110:667）後に
調製する。プラスミドDNAを得る他の方法は、ベセスダ
・リサーチ・ラボラトリーズ（Bethesda Research Labo
ratoies）の刊行物のFocus,Vol.5,No.2、のベージ11に
「Base−Acid」として記載されており、そして非常に純
粋なプラスミドDNAはそのプロトコルの工程12〜17をDNA
のCsCl/臭化エチジウムの超遠心で置き換えることによ
って得ることができる。単離されたDNAは、制限酵素の
消化により分析し、そして／またはSangerら、1977,Pro
c. Natl.Acad.Sci.USA,74:5463、さらにMessingら、19
81,Nucl.Acids Res.,9:309、に記載されているジデオキ
シ法によるか、またはMaxamら、1980,Methods in Enzym
ology, 65:499の方法により配列決定する。

コントロール配列、発現ベクターおよび形質転換法は、
遺伝子の発現に使用する宿主細胞のタイプに依存する。
一般に、原核生物、酵母菌、昆虫、または哺乳動物の細
胞を宿主として使用する。原核生物の宿主は、一般に、
組換えタンパク質の生産に最も効率よくかつ便利であ
り、したがってTmaポリメラーゼの発現のために好まし
い。

組換えタンパク質の発現のために最も頻繁に使用されて
いる原核生物は大腸菌（E. coli）である。クローニン
グおよび配列のために、および大部分の細菌プロモータ
ーのコントロール下の構成体の発現のために、大腸菌
（E. coli）ジェネティック・ストック・センター（Ge
netic Stock Center）からGCSC＃6135のもとに入手可能
な、大腸菌（E. coli）K12 MM294株を宿主として使用
することができる。P_LN_RHSコントロール配列をもつ発現
ベクターのために、大腸菌（E. coli）K12菌株MC1000
ラムダ溶系株、N₇N_53CI₈₅₇SusP₈₀,ATCC39531を使用する
ことができる。1987年４月７日にATCCに（ATCC53606）
として受託された大腸菌（E. coli）DG116および1985
年３月29日にATCCに（ATCC53075）として受託された大
腸菌（E. coli）KB2もまた、有用な宿主である。M13フ
ァージ組換え体のために、ファージに感染されやすい大
腸菌（E. coli）菌株、例えば大腸菌（E. coli）K12
菌株DG98を使用する。DG98菌株は1984年７月13日にATCC
に（ATCC39768）として受託された。

しかしながら、Tma DNAポリメラーゼの組換え発現のた
めに、大腸菌（E. coli）以外の微生物の菌株、例え
ば、バチルス、例えば、枯草菌（Bacillus subtili
s）、シュードモナス属（Pseudomonas）の種々の菌株、
および他の細菌の菌株をまた使用することができる。こ
のような原核生物系において、典型的には、宿主または
宿主と適合性の種から誘導された複製起点およびコント
ロール配列を含有するプラスミドのベクターを使用す
る。

例えば、大腸菌（E. coli）は、典型的には、Bolivar
ら、1977、Gene，２:95に記載されているpBR322の誘導
体を使用して形質転換される。プラスミドpBR322はアン
ピリシン耐性およびテトラサイクリン耐性のための遺伝
子を含有する。これらの薬物耐性のマーカーは、所望の
ベクターを構成するとき、保持または破壊することがで
き、それゆえ所望の組換え体の存在の検出を促進するこ
とができる。普通に使用される原核生物のコントロール
配列、すなわち、リボソーム結合部位の配列と共に、必
要に応じてオペレーターを伴う、転写開始のためのプロ
モーターは次のものを包含する：β−ラクタマーゼ（ペ
ニシリナーゼ）およびラクトース（lac）プロモーター
系（Changら、1977,Nature，198:1056）、トリプトファ
ン（trp）プロモーター系（Goeddelら、1980,Nucl.Acid
s Res.，８:4057）およびラムダ由来P_Lプロモーター（S
himatakeら、1981,Nature，292:128）およびＮ−遺伝子
リボソーム結合部位（N_RBS）。ポータブルのコントロー
ルシステムのカセットは、米国特許第4,711,845号（198
7年12月８日発行）に記載されている。このカセット
は、N_RBS配列の6bpの３′内で切断可能とする少なくと
も１つの制限部位を有する第3DNA配列より上流に位置す
るN_RBSに作用可能に連鎖したP_Lプロモーターを含む。ま
た、Cheageら、欧州特許公開第196,864号（1986年10月
８日発行）に記載されてるホスファターゼＡ（phoA）は
有用である。しかしながら、原核生物と適合性の任意の
入手可能なプロモーター系を使用して、本発明のTma発
現ベクターを構成することができる。

Tmaインサートのヌクレオチド配列は、上流のリボソー
ム結合部位の効率にマイナスに影響を与え、低いレベル
の翻訳されたポリメラーゼを生ずることができる。Tma
遺伝子の翻訳は、発現ベクターの「翻訳的にカップリン
グされた」誘導体の構成により増強することができる。
短いコード配列のための停止コドンがTma遺伝子コード
配列のためのATG開始コドンと「カップリング」するよ
うに、Tma遺伝子のコード配列からちょうど上流に第２
翻訳開始シグナルおよび短いコード配列をもつ発現ベク
ターを構成することができる。翻訳を効率よく開始する
第２の翻訳開始シグナルを、Tma遺伝子の開始コドンの
上流に挿入することができる。例えば、１つの発現系
は、TrpEの最後の６コドンにイン−フレームで融合され
たT7バクテリオファージの主要キャプシドタンパク質
（遺伝子10）の最初の10コドンおよび翻訳開始シグナル
を利用することができる。TrpEのためのTGA（停止）コ
ドンを、Tma遺伝子のコード配列のためのATG（開始）コ
ドンと「カップリング」させて、TGATGを形成する。短
いコード配列の翻訳とTmaのコード配列の翻訳との間
に、１塩基のフレーム−シフトが要求される。これらの
誘導体の発現ベクターは組換えDNA法により構成するこ
とができる。

遺伝コードの重複もまた、低い翻訳効率に関係づけるこ
とができる。典型的には、同一のアミノ酸をコードする
多数のコドンが存在するとき、可能なコドンの１つが生
物体において優先的に使用される。しばしば生物体は稀
に使用されるコドンに相当するものより高いレベルで好
ましいコドンに相当するtRAN種を蓄積する。コドン使用
のパターンがサーモタガ・マリチマ（Thermotoga mari
tima）と宿主細胞との間で異る場合、Tmaポリメラーゼ
の遺伝子の翻訳に必要なtRNA種は豊富でない場合があ
る。Tmaのコード配列において、アルギニンは「AGA」コ
ドンにより最も頻繁にコードされるが、このコドンは大
腸菌（E. coli）の遺伝子において低頻度で使用され、
そして対応するtRNAは大腸菌（E. coli）宿主細胞にお
いて低い濃度で存在する。結局、「AGA」コドンのため
の「ArgU」tRNAの大腸菌（E. coli）宿主細胞における
低い濃度は、大腸菌（E. coli）宿主細胞におけるTma
ポリメラーゼ遺伝子のRNAの翻訳効率を制限することが
ある。大腸菌（E. coli）宿主細胞内のTmaのコード配
列の翻訳効率は、このtRNA遺伝子の多数のコピーを宿主
細胞の中で発現させることによって、このArgtRNAの濃
度を増加することによって改良することができる。

細菌に加えて、真核性微生物、例えば、酵母菌もまた組
換え宿主細胞として使用することができる。サッカロミ
セス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）の
実験室株のパン酵母は最も頻繁に使用されるが、他の多
くの菌株が普通に入手可能である。２ミクロン複製起点
を使用するベクターが普通である（Broach,1983,Method
s Enzymol.，101:307）が、酵母菌の発現に適当な他の
プラスミドベクターが既知である（参照、Stinchcomb
ら、1979,Nature，282:39;Tchempeら、1980,Gene,10:15
7;およびClarkcら、1983,Methods Enzymol.，101:30
0）。酵母ベクターのためのコントロール配列は、解糖
系酵素の合成のためのプロモーターを包含する（Hess
ら、1968,J.Adv.Enzyme Reg.，７:149;Hollandら、197
8,Biotechnology，17:4900;およびHollandら、1981,J.B
iol.Chem.,256:1385）。この分野において知られている
追加のプロモーターは、次のものを包含する:3−ホスホ
グリセレートキナーゼのためのプロモーター（Htzcman
ら、1980,J.Biol.Chem.，255:2073）および他解糖系酵
素、例えば、グリセルアルデヒド３−ホスフェートデヒ
ドロゲナーゼ、ヘキドキナーゼ、ピルベートデカルボキ
シラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−
ホスフェートイソメラーゼ、３−ホスホグリセレートム
ターゼ、ピルベートキナーゼ、トリセホスフェートイソ
メラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグル
コキナーゼのためのプロモーター。増殖条件によりコン
トロールされる転写の追加の利点を有する他のプローモ
ーターは、アルコールデヒドロケナーゼ２、イソサイト
クロムＣ、酸性ホスフェターゼ、窒素の代謝に関連する
分解系酵素、並びにマルトースおよびガラクトースの利
用に関係する酵素のためのプロモーターである。

コード配列の３′末端に配置するとき、ターミネーター
配列もまた使用して発現を増大することができる。この
ようなターミネーターは、酵母誘導遺伝子の中でコード
配列の後の３′非翻訳領域において見いだされる。酵母
と適合性のプロモーター、複製起点、および他の調節配
列を含有する任意のベクターは、酵母菌のTmaの発現ベ
クターを構成するときの使用に適する。

Tma遺伝子はまた、多細胞の生物体から誘導された真核
生物の宿主細胞の培養物の中で発現させることができ
る。例えば、Tissure Culture,Academic Press,Cruzお
よびPatterson編（1973）参照のこと。通常な宿主細胞
系は、COS−7,COS−A2,CV−１、ネズミの細胞、例え
ば、ネズミの骨髄腫N51およびVERO,Hela細胞、およびチ
ャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞を包含する。こ
のような細胞のための発現ベクターは通常、次のものを
包含する：哺乳動物細胞と適合するプロモーターおよび
コントロール配列、例えば、シミアンウイルス40（SV4
0）からの普通に使用される前期および後期プロモータ
ー（Fiersら、1978,Nature，273:133）、また他のウイ
ルスのプロモーター、例えば、ポリオーマ、アデノウイ
ルス２、ウシ乳頭腫ウイルス（BPV）、または鳥類の肉
腫ウイルスから誘導されたプロモーター、または免疫グ
ロブリンのプローモーターおよびヒートショックプロモ
ーター。哺乳動物の系においてBPVベクター系を使用し
てDNAを発現するための系は、米国特許第4,419,446号に
開示されている。この系の変更は米国特許第4,601,978
号に記載されている。哺乳動物細胞の一般的面は、Axe
l、米国特許第4,399,216号に記載されている。「エンハ
ンサー」領域もまた、発現を最適化するために重要であ
る；これらは、一般に、プローモーター領域の上流に見
いだされる配列である。複製起点は、必要に応じて、ウ
イルス源から得ることができる。しかしながら、染色体
の中への組み込みは真核生物におけるDNAの複製のため
の普通のメカニズムである。

植物の細胞もまた宿主として使用することができ、そし
て植物の細胞と適合するコントロール配列、例えば、ノ
パリンシンサーゼプロモーターおよびポリアデニル化シ
グナル配列、（Depickerら、1982,J.Mol.Appl.Genet.，
１:561）が入手可能である。バキュロウイルスベクター
のより提供される制御系を利用する昆虫を使用する発源
系もまた、記載されている（Millerら、1986,Genetic
Engeneering（Setlowら、編、Plenum Publishing）８:2
77−297）。昆虫に基づく発源はスポドプテラ・フルギ
ペイダ（Spodoptera frugipeida）において達成するこ
とができる。これらの系を使用しても組み換えTmaポリ
メラーゼを生産することができる。

宿主細胞に依存して、形質転換はこのような細胞に適当
な標準的技術を使用して実施される。Cohen,1972,Proc.
Natl.Acad.Sci.USA，69:2110に記載されているような、
塩化カルシウムを使用するカルシウム処理は原核生物ま
たは実質的な細胞壁のバリヤーを含有する他の細胞のた
めに使用される。アグロバクテリウム・ツムファシエン
ス（Agrobacterium tumfaciens）による感染（Shaw
ら、1983,Gene，23:315）は、ある種の植物細胞につい
て使用される。哺乳動物細胞について、Grahamおよびva
n der Eb,1978,Virology，52:546のリン酸カルシウム沈
澱方法が好ましい。酵母の中への形質転換は、Van Soli
ngenら、1977,J.Bacteriol.，130:946およびHasioら、1
979,Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76:3829の方法に従い実
施される。

一旦Tma DNAポリメラーゼが組み換え宿主細胞の中で発
現されると、タンパク質の精製が望ましいことがある。
種々の精製手順を使用して本発明の組み換え熱安定性ポ
リメラーゼを精製することができるが、より少ない工程
を使用して等しい純度の発現調製物を製造する必要があ
ろう。大腸菌（E. coli）宿主のタンパク質は感熱性で
あるので、組換え熱安定性Tma DNAポリメラーゼを粗製
のリゼイトを加熱不活性化することによって実質的に濃
縮することができる。この工程は、宿主DNAからのTma D
NAポリメラーゼの解離を確実にしかつTma DNAポリメラ
ーゼと他の細胞リゼイトのタンパク質とのイオンの相互
作用を減少するために十分な量の塩（典型的には0.03M
の硫酸アンモニウム）の存在下に実施する。さらに、0.
3Mの硫酸アンモニウムの存在はフェニルセファローズカ
ラムとの疎水性相互作用を促進する。疎水性相互作用の
クロマトグラフィーは分離技術であり、ここで物質は疎
水性基を含有する非帯電ベッド材料との疎水性相互作用
の異なる強さに基づいて分離される。典型的には、カラ
ムをまず疎水性結合に好適な条件、例えば、高イオン強
度の下で平衡化する。その時、下降する塩の勾配を使用
して試料を溶出することができる。

本発明によれば、水性混合物（組み換えTma DNAポリメ
ラーゼを含有する）を、比較的強い疎水性ゲル、例え
ば、フェニルセファローズ（Pharmacia製）またはフェ
ニル（Phenyl）TSK（東洋ソーダ製）を含有するカラム
に負荷する。フェニルセファローズのカラムとの相互作
用を促進するために、例えば、0.3Mより高いか、あるい
は低い、好ましい0.3Mの硫酸アンモニウム、あるいは0.
5Mの高いか、あるいは低いNaClを含有する溶媒を使用す
る。カラムおよび試料を、また、0.5mMのDTTを含有する
50mMのトリス（pH7.5）および1.0mMのEDTA（「TE」）緩
衝液中の0.3M硫酸アンモニウムに調節し、そして試料を
カラムに適用する。このカラムを0.3Mの硫酸アンモニウ
ム緩衝液で洗浄する。次いで、酵素を疎水性相互作用を
弱くする溶媒、例えば、減少する塩の勾配、エチレンま
たはプロピレングリコール、または尿素で溶離すること
ができる。天然Tma DNAポリメラーゼについて、好まし
い態様はTE−DTT中の2Mの尿素および20％のエチレング
リコールでカラムを洗浄することを包含する。

長期間の安定性のために、Tma DNAポリメラーゼ酵素を
１種または２種以上の非イオン性ポリマー洗剤を含有す
る緩衝液の中に貯蔵することができる。このような洗
は、一般に、ほぼ100〜250,000ダルトン、好ましくは約
4,000〜200,000ダルトンの範囲の分子量を有し、そして
酵素を約3.5〜約9.5、好ましくは約４〜8.5のpHにおい
て安定化するものである。このような洗剤の例は、次の
文献に特定されているものを包含する:McCutchconのEmu
lsifiers ＆ Detergents,North American編:1983）、MC
Publishing Co.のMcCutcheon Divison発行、米国ニュ
ージャージイ州グレンロック、ロックロード175、の295
〜298ページおよび同時継続出願第387,003号、1989年７
月28日提出、その開示をここに引用によって加える。

好ましくは、洗剤はエトキシル化脂肪酸アルコールエー
テルおよびラウリルエーテル、エトキシル化アルキルフ
ェノール、オクチルフェノキシポリエトキシエタノール
化合物、変性オキシエトキシル化および／またはオキシ
プロピル化直鎖状アルコール、ポリエチレングリコール
モノオレエート化合物、ポリソルベート化合物、および
フェノール系脂肪族アルコールエーテルから成る群より
選択される。ツイーン20、ポリオキシエチル化（20）ソ
ルビタンモノラウレート（ICI Americas Inc.、デラウ
ェア州ウィルミントン）およびIconol NP−40、エトキ
シル化アルキルフェノール（ノニル）（BASF Wyandotte
Corp.、ニュージャージイ州パルシパニイ製）は、さら
に一層好ましい。

本発明の熱安定性酵素は、このような酵素が必要である
か、あるいは望ましい、任意の目的に使用することがで
きる。とくに好ましい態様において、酵素はPCRとして
知られている核酸増幅反応を触媒する。この核酸配列を
増幅する方法は、米国特許第4,683,202号および米国特
許第4,865,188号（それらの各々をここに引用によって
加える）に開示および特許請求されている。PCR核酸増
幅法は、核酸または核酸の混合物の中に含有されている
少なくとも１つの特定の核酸配列を増幅することを包含
し、そして最も普通の態様において、二本鎖DNAを生成
する。

説明を容易とするために、下に記載するプロトコルは増
幅すべき特定の配列が二本鎖の核酸の中に含有されてい
ると仮定する。しかしながら、この方法は一本鎖の核
酸、例えば、mRNAの増幅においても同様に有用である
が、好ましい実施態様において究極の生成物はなお二本
鎖DNAである。一本鎖の核酸の増幅において、第１工程
は相補的鎖の合成（２つの増幅プライマーの１つをこの
目的に使用することができる）を包含し、そして連続す
る工程は下に記載する二本鎖の増幅法におけるように進
行する。

増幅は、工程： （ａ）隠核酸鎖を、４つの異なるヌクレオシド三リン酸
および増幅されるべき各特定の配列のための２つのオリ
ゴヌクレオチドのプライマーと接触させ、ここで各プラ
イマーを、特定の配列の異なる鎖に対して相補的であり
１つのプライマーから合成された伸長生成物がその相補
的体から分離されたとき、他のプライマーの伸長生成物
の合成のための鋳型として働くように選択し、前記接触
を各プライマーが相補的核酸鎖に対してハイブリダイゼ
ーションすることができるような温度において実施し、 （ｂ）各核酸鎖を、工程（ａ）と同時にまたはその後
に、サーモタガ・マリチマ（Thermotoga maritima）か
らのDNAポリメラーゼと接触させ、前記DNAポリメラーゼ
はヌクレオシド三リン酸を結合させて特定の核酸配列の
各鎖に対して相補的であるプライマー伸長生成物を形成
することができるものであり、 （ｃ）工程（ｂ）からの混合物を、酸素の活性を促進し
つつ、増幅される各異なる配列について、各核酸鎖の鋳
型に対して相補的である各プライマーの伸長生成物を合
成するために有用であるが、各伸長生成物を相補的鎖の
鋳型から分離するほど高くない温度において有効な時間
の間維持し、 （ｄ）工程（ｃ）からの混合物を、プライマー伸長生成
物をそれらがその上で合成されて一本鎖の分子を生成す
る鋳型から分離するために有効であるが、酸素を不可逆
的に変性するほど高くない温度に有効な時間の間加熱
し、 （ｅ）工程（ｄ）からの混合物を、工程（ｄ）において
生成された一本鎖の分子の各へのプライマーのハイブリ
ダイゼーションを促進するために有効な温度に有効な時
間の間冷却し、そして （ｆ）工程（ｅ）からの混合物を、酵素の活性を促進し
かつ、増幅される各異なる配列について、工程（ｄ）に
おいて生成された各核酸鎖の鋳型に対して相補的である
各プライマーの伸長生成物を合成するために有効である
が、各伸長生成物を相補的鎖の鋳型から分離するほど高
くない温度に有効な時間の間維持する、 ことを含んでなる。工程（ｅ）および（ｆ）における有
効な時間および温度を一致させて、工程（ｅ）および
（ｆ）を同時に実施できるようにすることができる。工
程（ｄ）〜（ｆ）は、所望のレベルの増幅が得られるま
で、反復する。

この増幅方法は既知配列の特定の核酸配列を大量に生産
するために有用であるばかりでなく、かつまた存在する
ことが知られているが、完全には特定されていない核酸
配列を生産するために有用である。配列の両端における
十分な数の塩基を十分に詳細に知り、こうして配列に沿
った相対的位置における所望の配列の異なる鎖にハイブ
リダイゼーションする２つのオリゴヌクレオチドのプラ
イマーを調製できるようにし、こうして一方のプライマ
ーから合成された伸長生成物が、鋳型（相補的）から分
離されたとき、定義された長さの核酸配列への他方のプ
ライマーの伸長のための鋳型として働くことができるよ
うにする。配列の両端における塩基についての知識が深
くなればなるほど、標的核酸配列に対するプライマーの
特異性およびこの方法の効率をより大きくすることがで
きる。

いずれの場合においても、増幅すべき配列の初期のコピ
ーは入手可能でなくてはならないが、配列は純粋である
必要はなく、あるいは個別の分子である必要はない。一
般に、増幅方法は連鎖反応を包含し、この連鎖反応は、
（ａ）要求される配列の末端が十分に詳細に知られてい
て、それらにハイブリダイゼーションするオリゴヌクレ
オチドを合成することができ、且つ（ｂ）連鎖反応を開
始するために少量の配列が入手可能であると、関係する
反応工程の数に関して指数的な量で、少なくとも１つの
特定の核酸配列を生産する。連鎖反応の生産物は、使用
された特定のプライマーの５′末端に対応する末端をも
個別の核酸二重鎖であろう。

任意の核酸配列を、精製されたまたは精製されない形態
で出発核酸として利用することができるが、ただしそれ
は増幅しようとする特定の核酸配列を含有するか、ある
いは含有すると思われるものであることを条件とする。
増幅すべき核酸は、任意の源、例えば、プラスミド、例
えば、pBR322から、クローニングしたDNAまたはRNAか
ら、あるいは、細菌、酵母菌、ウイルス、細胞小器官、
および高等生物、例えば、植物および動物を包含する任
意の源からの天然DNAまたはRNAから得ることができる。
DNAまたはRNAは、血液、組織材料、例えば、絨毛膜の絨
毛、または羊膜細胞から種々の技術により抽出すること
ができる。例えば、Maniatisら、前掲、pp.280−281を
参照のこと。この方法は、例えば、メッセンジャーRNA
を包含するDNAまたはRNAを使用することができ、前記DN
AまたはRNAほ一本鎖または二本鎖であることができる。
さらに、各々の１つの鎖を含有するDNA−RNAハイブリッ
ドを利用することができる。これらの核酸の任意の混合
物もまた、使用することができ、また前の増幅反応から
核酸を生成することができる（同一であるか、あるいは
異なるプライマーを使用する）。増幅すべき特定の核酸
配列は大きい分子の一部分のみであるか、あるいは特定
の配列が全体の核酸を構成するように、個別の分子とし
て最初から存在することができる。

増幅すべき配列は最初に純粋な形態で存在することは必
要ではない；配列は複雑な混合物の小さい部分、例え
ば、全ヒトDNAの中に含有されるβ−グロブリン遺伝子
の一部分（Saikiら、1985,Science, 230:1530−1534にお
いて例示されているように）または特定の微生物のため
に核酸配列の一部分（この生物体は特定の生物学的試料
の非常に小さい部分のみを構成するであろう）であるこ
とができる。細胞の溶解および細胞内の成分の分散が起
こるまで（一般に１〜15分）低張緩衝液の中の懸濁およ
び約90℃〜100℃の熱処理後、細胞を増幅法において直
接使用することができる。加熱工程後、増幅試薬を溶解
した細胞に直接添加することができる。出発核酸配列は
１より多い所望の核酸配列を含有することができる。増
幅方法は大量の１つの特定の核酸配列の生産のためにば
かりでなく、かつまた同一であるか、あるいは異なる核
酸分子上に位置する１より多い異なる特定の核酸配列を
同時に増幅するために有用である。

プライマーはPCR法において主要な役割を演ずる。語
「プライマー」は、増幅法の説明において使用すると
き、ときに増幅すべき断片の末端の１または２以上の配
列に関する情報が多少不明瞭である場合、あるいは本発
明の縮重プライマー法を使用する場合、１より多いプラ
イマーを意味する。例えば、核酸配列をタンパク質配列
の情報から推理される場合、遺伝コードの縮重性に基づ
いてすべての可能なコドンの多様性を表す配列を含有す
る１集団のプライマーを各鎖のために使用する。この集
団からの１つのポリメラーゼは、増幅すべき所望の配列
の末端と十分に相同性であって、増幅のために有用であ
ろう。

さらに、適当な数のオリゴヌクレオチドプライマーを利
用するかぎり、１より多い特定の核酸配列を最初の核酸
または核酸の混合物から増幅することができる。例え
ば、２つの異なる特定の核酸配列を生成しようとすると
き、４つのプライマーを利用する。プライマーのうちの
２つの特定の核酸配列の１つに対して特異的であり、そ
して他の２つのプライマーは第２の特定の核酸配列に対
して特異的である。このようにして、２つの異なる特定
の配列の各々を本発明の方法により指数的に生産するこ
とができる。

所定の配列内の配列は、反応においてより大きい特異性
をえるための所定の増幅サイクル後、少なくとも１つの
増幅サイクル後、増幅すべき配列の内部の配列（すなわ
ち、末端上に存在しない配列）に対して相補的であるプ
ライマーの組を添加することにより増幅することができ
る。このようなプライマーは任意の段階において添加す
ることができ、そしてより短い増幅された断片を与える
であろう。あるいは、より長い断片は、非相補性の末端
をもつが増幅において前に利用したプライマーと多生の
オーバーラップを有するプライマーを使用することによ
って調製することができる。

プライマーはまた、増幅法をni vitroの突然変異誘発の
ために使用するとき、主要な役割を演ずる。使用するプ
ライマーがもとの鋳型に正確に相補的でない、増幅反応
の生産物は、鋳型よりむしろプライマーの配列を含有
し、それゆえin vitroの突然変異を導入するであろう。
それ以上のサイクルにおいて、それ以上の誤対合のプラ
イミングが要求されないので、突然変異は減少しない効
率で増幅されるであろう。前述したように変更されたDN
A配列をつくる方法を、異なるプライマーを使用して、
変更されたDNAについて反復して、それ以上の配列の変
化を導入することができるであろう。このようにして、
１系列の突然変異した配列を徐々に生成することがで
き、ここでその系列への各新しい付加は最後のものと小
さい程度に異なるが、もとのDNA源の配列と非常に大き
く異なる。

プライマーはその配列の一部分として非相補的配列を含
有できるので、プライマーの十分な量が増幅すべき鎖に
対して相補的である配列を含有するかぎり、多数の他の
利点を実現することができる。例えば、鋳型の配列に対
して相補的でないヌクレオチド配列（例えば、プライマ
ー、リンカー、コード配列など）をプライマーの１つま
たは両方の５′末端に取り付けることができ、それゆえ
増幅法の生成物に付加することができる。伸長プライマ
ーを添加した後、十分なサイクルを実施して、非相補的
ヌクレオチドのインサートを含有する所望の量の新しい
鋳型を得る。これにより、簡単な技術を使用して比較的
短い時間（例えば、２時間以内に）で、大量の組み合わ
された断片を生産することができる。

オリゴヌクレオチドのプライマーは、任意の適当な方
法、例えば、前述のホスホトリエステルまたはホスホジ
エステルの方法、またはそれらの自動化された態様を使
用して調製することができる。１つのこのような自動化
された態様において、ジエチルホスホルアミダイトを出
発物質として使用し、そしてBeaucageら、1981,Tctrahe
dron Letters，22:1859−1862、に記載されているよう
にして合成することができる。固体支持体上でオリゴヌ
クレオチドを合成する１つの方法は、米国特許第4,458,
066号に記載されている。また、生物学的源（例えば、
制限エンドヌレアーゼ消化物）から単離されたプライマ
ーを使用することができる。

しかしながら、どのプライマーを使用しても、反応混合
物はPCRが起こすための鋳型を含有しなくてはならな
い。なぜなら、特定の核酸配列は鋳型としてその配列を
含有する核酸を使用して生成されるからである。第１工
程は、増幅または検出されるべき各特定の核酸配列につ
いて、各核酸鎖を４つの異なるヌクレオシド三リン酸お
よび２つのオリゴヌクレオチドのプライマーと接触する
ことを包含する。増幅または検出すべき核酸がDNAであ
る場合、ヌクレオシド三リン酸は通常dATP,dCTP,dGTPお
よびdTTPであるが、種々のヌクレオチドの誘導体もまた
この方法において使用することができる。ヌクレオシド
三リン酸の濃度は広く変化することができる。典型的に
は、濃度は増幅のための緩衝液の中で各dNTPにおいて50
〜200μＭであり、そしてMgCl₂は緩衝液の中に１〜3mM
の量で存在して、ポリメラーゼを活性化しかつこの反応
の特異性を増加する。しかしながら、１〜20μＭのdNTP
の濃度がいくつかの応用、例えば、DNAの配列決定また
は高い比活性の放射線標識したプローブの発生のために
好ましいことがある。

標的核酸の核酸鎖は、プライマーの伸長生成物である追
加の核酸鎖の合成のための鋳型として働く。この合成は
任意の適当な方法を使用して実施できるが、一般に緩衝
化された溶液の中で、好ましくはpH7〜９において、最
も好ましくはpH約８において起こる。合成を促進するた
めに、モル過剰の２つのオリゴヌクレオチドプライマー
を鋳型鎖を含有する緩衝液に添加する。実際には、増幅
すべき配列は複雑な長鎖核酸鎖の混合物の中に含有され
る場合、プライマーの添加量は相補的鎖（鋳型）の量を
越えたモル過剰である。大モル過剰がこの方法の効率を
改良するために好ましい。したがって、少なくとも100:
1またはそれ以上のプライマー：鋳型の比を一般にクロ
ーニングされたDNAの鋳型について使用し、そして約1
0⁸:1またはそれ以上のプライマー：鋳型の比を一般に複
雑なゲノムの混合物について使用する。

次いで、鋳型、プライマーおよびヌクレオシド三リン酸
の混合物を、増幅または検出されるべき核酸が一本鎖ま
たは二本鎖であるかどうかに従い、処理する。核酸が一
本鎖である場合、第１伸長サイクルの前に変性工程は不
必要であり、そして反応混合物をプライマーのその相補
的標的（鋳型）配列へのハイブリダイゼーションを促進
する温度に保持する。このような温度は、一般に、有効
な時間、一般に数秒〜５分、好ましくは30秒〜１分につ
いて、約35℃〜65℃またはそれ以上、好ましくは約37℃
〜60℃である。35℃〜70℃のハイブリダイゼーション温
度をTma DNAポリメラーゼについて使用することができ
る。長さが15ヌクレオチドまたはそれより長いプライマ
ーを使用して、プライマーのハイブリダイゼーションの
特異性を増加する。より短いプライマーはより低いハイ
ブリダイゼーション温度を必要とする。

もとの一本鎖核酸に対する相補対は、適当な緩衝液、dN
TPおよび１または２以上のオリゴヌクレオチドのプライ
マーの存在下にTma DNAポリメラーゼを添加することに
よって合成することができる。適当な単一のプライマー
を添加する場合、プライマー伸長生成物は一本鎖核酸に
対して相補的であり、そして等しいか、あるいは等しく
ない長さ（プライマーが鋳型にハイブリダイゼーション
するかどうかに依存する）の鎖の二重鎖となって核酸と
ハイブリダイゼーションし、次いでこれを前述したよう
に一本鎖に分離して、２つの単一の、分離された、相補
的な鎖を生産することができる。次いで第２プライマー
を添加し、こうしてプライマーの伸長の引き続くサイク
ルを鋳型としてもとの一本鎖の核酸および第１プライマ
ーの伸長生成物の両者を使用して実施する。あるいは、
２またはそれ以上の適当なプライマー（それらの１つは
他の伸長生成物を鋳型として使用して合成をプライミン
グするのであろう）を一本鎖の核酸に添加し、そして反
応を実施することができる。

二本鎖の増幅または一本鎖標的の第２サイクルの増幅の
場合におけるように、核酸が２つの鎖を含有する場合、
プライマーのハイブリダイゼーションの前に、核酸の鎖
を分離しなくてはならない。この鎖の分離は、物理的、
化学的または酵素的手段を包含する、任意の適当な変性
法により達成することができる。核酸の鎖を分離する１
つの好ましい物理的方法は、核酸を完全な（＞99％）変
性が起こるまで加熱することを包含する。典型的な加熱
変性は、核酸の組成および大きさに依存して、一般に約
数秒〜数分の範囲の時間の間、約80℃〜105℃の温度を
用いる。好ましくは、有効な変性温度は数秒〜１分間に
ついて90℃〜100℃である。鎖の分離はまた、ヘリカー
ゼ（Helicases）として知られている酵素または酵素Rcc
A（これらはヘリカーゼの活性を有しそしてriboATPの存
在下にDNAを変性することが知られている）のクラスか
らの酵素により誘発することができる。ヘリカーゼによ
り核酸鎖を分子するために適当な反応条件はKuhn Hoffm
ann−Berling,1978,CSH−Qunatitative Biology，43:63
に記載されており、そしてRecAを使用する技術はRaddin
g,1982,Annu.Rev.Genet.，16:405−437において概観さ
れている。この変性は等しいか、あるいは等しくない長
さの２つの分離された鎖を生成する。

二本鎖の核酸を熱により変性する場合、反応混合物を各
プライマーの相補的標的（鋳型）配列へのハイブリダイ
ゼーションを促進する温度に冷却する。この温度は、試
薬に依存して、通常約25℃〜65℃、好ましくは37℃〜60
℃である。ハイブリダイゼーション温度は有効な時間、
一般に数秒〜数分、好ましくは10秒〜１分の間維持され
る。実際には、温度は単に約95℃から37℃程度に低く低
下させ、そしてハイブリダイゼーションはこの範囲内の
温度において起こる。

核酸が一本鎖または二本鎖であるかどうかにかかわら
ず、サーモタガ・マリチマ（Thermotoga maritima）か
らのDNAポリメラーゼを、変性の前にまたはその間に、
あるいは温度がハイブリダイゼーションを促進する範囲
に低下しつつあるとき、あるいはその範囲にあるとき、
添加することができる。Tmaポリメラーゼの熱安定性は
任意の時間におけるTmaポリメラーゼの反応混合物への
添加を可能とするが、混合物がストリンジェントのハイ
ブリダイゼーション温度以下に冷却されない時点におい
て、ポリメラーゼを反応混合物に添加することによっ
て、非特異的増幅を実質的に阻止することができる。ハ
イブリダイゼーション後、酵素の活性が促進されたまた
は最適化される温度、すなわち、ハイブリダイズしたプ
ライマーおよび鋳型からのプライマー伸長生成物の合成
を促進するにあたり酵素の活性を増加するために十分な
温度に、反応混合物を加熱するか、あるいは維持する。
温度は、実際に、各核酸の鋳型に対して相補的である各
プライマーの伸長生成物を合成するために十分である
が、その相補的鋳型からの各伸長生成物を変性するほど
高くあってはならない（すなわち、温度は一般に約80℃
〜90℃以下である）。

使用する１または２以上の核酸に依存して、この合成反
応に有効な典型的な温度は一般に約40℃〜80℃、好まし
くは50℃〜75℃の範囲である。サーモタガ・マリチマ
（Thermotoga maritima）のDNAポリメラーゼについ
て、温度はより好ましくは約65℃〜75℃の範囲である。
この合成に要求される時間は、温度、核酸の長さ、酵
素、および核酸混合物の複雑さに依存して、約10秒〜数
分またはそれ以上の範囲であることができる。伸長時間
は、通常、約30秒〜数分である。核酸がより大きい場
合、より長い時間が相補的鎖の合成に要求される。

新しく合成された鎖および相補的核酸鎖は、増幅法の次
の工程において使用される二本鎖の分子を形成する。次
の工程において、二本鎖の分子の鎖は加熱変性により分
離され、この加熱変性はその分子を変性するために有効
な温度および時間の間実施されるが、熱安定性酵素が完
全にかつ不可逆的に変性または不活性化される温度では
なくかつそれほど時間は長くてはならない。この鋳型の
変性後、温度は、前述したように、前の工程から生成し
た相補的一本鎖の核酸（鋳型）へのプライマーのハイブ
リダイゼーションを促進するレベルに低下させる。

このハイブリダイゼーション工程後、あるいはハイブリ
ダイゼーション工程と同時に、温度は、熱安定性酵素の
活性を促進して、新しく合成された鎖およびもとの鎖の
両者を鋳型として使用するプライマー伸長生成物の合成
を可能とするために有効な温度に調節される。温度はや
はり前述したように、伸長生成物をその鋳型から分離
（変性）するほど高くあってはならない。ハイブリダイ
ゼーションはこの工程において起こることができるの
で、変性後の冷却の前の工程は不必要である。このよう
な場合において、同時の工程を使用して、好ましい温度
範囲は50℃〜70℃である。

鎖の分離、ハイブリダイゼーション、および伸長生成物
の合成の１サイクルに関係する加熱および冷却の工程
を、所望の量の特定の核酸配列を生成するために必要な
回数だけ反復することができる。唯一の制限は存在する
プライマー、熱安定性酵素およびヌクレオシド三リン酸
の量である。通常、15〜30サイクルが完了する。増幅さ
れたDNAの診断的検出について、サイクルの数は試料の
性質および試料の中標的の濃度に依存するであろう。例
えば、増幅される試料が純粋である場合、より少ないサ
イクルが要求される。試料が核酸の複雑な混合物である
場合、より多いサイクルが検出のために十分なシグナル
を増幅するために要求されるであろう。一般の増幅およ
び検出のために、この方法は約15回反復される。増幅を
使用して、標識された配列特異的プローブで検出すべき
配列を発生するとき、およびヒトゲノムDNAが増幅の標
的であるとき、明瞭に検出可能なシグナルを生成するた
めに、すなわち、バックグラウンドのノイズが検出を妨
害しないようにするために十分に配列を増幅するために
は、この方法を15〜30回反復する。

主要な試薬が使い尽くされず、そして酵素が変性される
かあるいは不可逆的に不活性化されないことを条件し
て、追加のヌクレオシド、プライマー、または熱安定性
酵素は初期の添加後に不必要であるが、そのようになっ
た場合において、追加のポリメラーゼまたは他の試薬を
反応を続けるために添加しなくてはならないであろう。
しかしながら、各工程におけるこのような物質の添加は
反応に悪影響を及ぼさないであろう。適当な数のサイク
ルを完結して、所望の量の特定の核酸配列を生成した
後、通常の方法で、例えば、EDTA、フェノール、SDS、
またはCHCl₃を添加して酵素を不活性化するか、あるい
は反応の成分を分離することによって、反応を停止させ
ることができる。

増幅の方法は連続的に実施することができる。自動化さ
れた方法の１つの態様において、温度がある時間の間あ
るレベルでコントロールされるように、反応混合物を温
度サイクルすることができる。この目的のための１つの
このような機器は、パーキン−エルマー・セツス・イン
スツルメンツ（Perkin−Elmer Cetus Instruments）に
より開発されかつ市販されている、増幅反応を取り扱う
ための自動化された機械である。この計器を使用してPC
Rを実施するための詳細なインストラクションは、この
機器の購入するとき入手可能である。

Tma DNAポリメラーゼは、ポリメラーゼ連鎖反応による
核酸配列の増幅が有用である多様な方法において非常に
有用である。増幅方法を米国特許第4,800,159号に記載
するように利用して、適当な発現ベクター中への挿入の
ための特定の核酸配列をクローニングすることができ
る。このベクターを使用して、組み換えDNA技術の標準
的方法により、適当な宿主生物体を形質転換して遺伝子
生産物を生成することができる。このようなクローニン
グは、平滑末端の結合を使用するベクターの中への直接
の結合、または制限酵素を使用するプライマー内に含有
された部位における切断を包含することができる。Tma
ポリメラーゼに適当な他の方法は、米国特許第4,683,19
5号および米国特許第4,683,202号並びに欧州特許公開第
229,701号；欧州特許公開第237,362号；および欧州特許
公開第258,017号（これらの開示をここに引用によって
加える）に記載されているものを包含する。さらに、本
発明の酵素は非対称のPCR（参照、GyllenstenおよびErl
ich,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85:7652−7656、そ
の開示をここに引用によって加える）：逆PCR（Ochmen
ら、1988,Gentics，120:621、その開示をここに引用に
よって加える）において；およびDNAの配列決定（参
照、Innisら、1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85:9436
−9440、およびMcConlogueら、1988,Nuc.Acids Res.，1
6（20）:9869）のために有用である。Tmaポリメラーゼ
はまた、逆転写酵素活性を有すると信じられる;PCT特許
公開第91/09944号、1991年７月11日公開を参照のこと、
その開示をここに引用によって加える。

Tma DNAポリメラーゼの逆転写酵素活性は、RNAを転写お
よび増幅する方法におけるこの酵素の使用を可能とす
る。このような方法の改良は単一の酵素の使用にある
が、従来の方法は１より多い酵素を必要とした。

改良された方法は、工程：（ａ）RNA鋳型と適当なプラ
イマーとを、該プライマーが対応するRNA鋳型にアニー
リングする条件下に組み合わせ；そして（ｂ）アニーリ
ングされたプライマー−RNA鋳型の混合物をTma DNAポリ
メラーゼと、そのDNAポリメラーゼがデオキシヌクレオ
シド三リン酸の重合を触媒してRNA鋳型の配列に対して
相補的なDNA配列を形成するために十分な条件下に、イ
ンキュベーションすることによって、RNAを逆転写す
る、ことを含んでなる。

上記の方法の他の面において、RNA鋳型にアニーリング
するプライマーはまた、PCRによる増幅のために適当で
あることがある。PCRにおいて、逆転写されたcDNA鎖に
対して相補的である第２プライマーは伸長生成物の合成
の開始部位を提供する。既に述べたように、Tma DNAポ
リメラーゼはcDNA鋳型上のこの伸長反応を触媒すること
ができる。

Tma DNAポリメラーゼによるRNA分子の増幅において、第
１伸長反応は逆転写であり、ここでDNA鎖はRNA/cDNAハ
リブリッドの分子の形態で生成される。DNA鎖を鋳型と
して使用する第２伸長反応は、二本鎖DNA分子を生成す
る。こうして、Tma DNAポリメラーゼを使用するRNA鋳型
からの相補的DNA鎖の合成は、PCRによる増幅のための出
発物質を提供する。

Tma DNAポリメラーゼをRNA鋳型からの核酸の転写に使用
するとき、Mg²⁺を含有する緩衝液の使用は、従来使用さ
れたMg²⁺を含有する逆転写緩衝液と比較して、Tma逆転
写酵素活性の改良された刺激を提供する。結局、増加し
たcDNAの収量またはこれらの方法から生ずる。

前述したように、Tma DNAポリメラーゼによるRNA転写の
生成物はRNA/cDNAハイブリッドの分子である。このRNA
を加熱変性あるいはアルカリ、熱、または酵素処理を包
含する任意の他の既知の方法により除去する。次いで残
留するcDNA鎖は自己相補的鎖の重合のための鋳型として
働き、これにより増幅または他の取り扱いに適当二本鎖
cDNA分子を提供する。第２鎖の合成は配列特異的プライ
マーおよびTma DNAポリメラーゼを必要とする。

第2cDNA鎖の合成後、生ずる二本鎖cDNA分子は、DNA配列
決定、PCRによる増幅または特定の核酸配列の検出を包
含する、ある数の目的に役立つことができる。cDNAのセ
グメントの増幅に有用な特定のプライマーを、逆転写後
に、添加することができる。また、第１組のプライマー
を使用して特定のcDNAを合成し、そして第２の入れ子の
組のプライマーを使用して所望のcDNAセグメントを増幅
することができる。これらの反応のすべてはTma DNAポ
リメラーゼにより触媒される。

Tma DNAポリメラーゼはまた、試料の中のRNA標的分子を
検出する方法を簡素化および改良するために使用でき
る。これらの方法において、Tma DNAポリメラーゼは次
の反応を触媒する：（ａ）逆転写；（ｂ）第２鎖cDNAの
合成；および必要に応じて（ｃ）PCRによる増幅。単一
の酵素のみを必要とする改良に加えて、記載する方法に
おけるTma DNAポリメラーゼの使用は、各手順の工程の
ために異なる酵素の使用のために必要であった、２組の
インキュベーション条件の従来の要件を排除する。Tma
DNAポリメラーゼの使用は、RNAの転写および相補的DNA
の増幅を増強された特異性をもって、従来のRNAのクロ
ーニングおよび診断的方法より工程の数を少なくして提
供する。これらの方法は実験室および臨床的分析のため
のキットにおける使用に適合可能である。

上の方法において転写されそして増幅されたRNAは、多
数の源に由来することができる。RNA鋳型は、任意の生
物体からの核酸の調製物、例えば、ウイルスまたはバク
テリアの核酸の調製物の中に含有されていることができ
る。この調製物は細胞の破片および他の成分、精製され
たRNA、または精製されたmRNAを含有することができ
る。RNA鋳型はまた試料の中の不均一なRNA分子の集団で
あることができる。さらに、標的RNAは生物学的試料の
中に含有されることがあり、そして試料はRNAがほんの
小さい部分である、異種の試料であることができる。こ
のような生物学的試料の例は、血液の試料およびバイオ
プシーの組織試料を包含する。

上の方法の逆転写工程における使用するプライマーはRN
A鋳型に対して一般に完全に相補的であるが、プライマ
ーは完全に相補的である必要はない。PCRにおけるよう
に、逆転写が起こるためにはプライマーのすべてが鋳型
にアニーリングしなくてもよい。例えば、非相補的snは
プライマーの５′末端に存在することができ、プライマ
ーの残部はRNAに対して相補的である。あるいは、非相
補的塩基がプライマーの中に介在することができるが、
ただしプライマーの配列はハイブリダイゼーションが起
こりかつ相補的DNA鎖の合成を可能とするために十分なR
NA鋳型と相補性をもつことを条件とする。

以下の実施例は例示のみに提供され、そして特許請求さ
れる本発明の範囲をいかなる方法においても限定するこ
とを意図しない。これらの実施例において、特記しない
限り、すべての百分率は固体について重量により、そし
て液体について容量により、そしてすべての温度は０℃
である。

実施例１ サーモトガ・マリチマ（Theromotoga maritima）のDNA
ポリメラーゼの精製 この実施例は、サーモタガ・マリチマ（Thermotoga ma
ritima）からのTma DNAポリメラーゼの単離を記載す
る。DNAポリメラーゼは、Lawyerら、1989,J.Biol.Che
m.,264（11）:6427−6437（その開示をここに引用によ
って加える）の中にTaq DNAポリメラーゼについて記載
されている１つの変更（1mMのMgCl₂）を有する方法に従
い精製の間に、種々の時点で測定した。

典型的には、この測定は25mMのTAPS−HCl,pH9.5（20
℃）;50mMのKCl;1mMのMgCl₂;1mMのβ−メルカプトエタ
ノール;20μＭの各々のdATP,dCTP,dGTPおよびTTP;10mM
のα−³²P−cCTP（0.03〜0.07μCi/nM）;12.5μｇの活
性化サケ精子DNA;並びにポリメラーゼから構成された反
応混合物の50μｌの合計体積で実施する。反応を、希釈
物（希釈物は10mMのトリス−HCl,pH8.0,50mMのKCl,0.1m
MのEDTA,1mg/mlのオートクレーブ処理したゼラチン、0.
5％のNp40,0.5％のツイーン20および1mMのβ−メルカプ
トエタノールから構成されている）中のポリメラーゼの
添加により開始し、そして反応を75℃において実施す
る。下に示す計算のために、添加したポリメラーゼ（お
よび希釈物）の体積を５μｌであり、そして合計反応体
積を50μｌであると仮定する。10分間のインキュベーシ
ョン後、10μｌの60mMのEDTAの添加により反応を停止さ
せる。反応混合物を遠心し、そして50μｌの反応混合物
を10mlの2mMのEDTA中50μg/mlのキャリヤーDNA（０℃）
に移す。等しい体積（1ml）の20％のTCA,2％のピロリン
酸ナトリウムを添加し、そして混合する。この混合物を
０℃において15〜20分間インキュベーションし、次いで
ワットマン（Whatman）GF/Cフィルターで濾過し、そし
て５％のTCAおよび１％のピロリン酸ナトリウムを含有
する混合物（６×5ml）でよく洗浄し、次いで冷95％の
エタノールで洗浄する。次いでフィルターを乾燥し、そ
して放射能を計数する。バックグラウンド（酵素なし）
は通常インプットcpmの0.001％〜0.01％である。約50〜
250ピコモルの³²P−dCTP標準を単位の計算のためにスポ
ッティングする。１単位は75℃において30分間で組込ま
れた10nMのdNTPに等しい。単位は次のようにして計算す
る； 4.167の計数は、停止溶液の添加後の反応体積（60μ
ｌ）の5/6（50μｌ）のみを計数することから生ずる。

すべての操作は、特記しない限り、０℃〜４℃において
実施した。すべてのガラス器は使用前にベーキングし、
そして精製に使用した溶液は、可能ならば、使用前にオ
ートクレーブ処理した。

約50gの凍結したサーモタガ・マリチマ（Thermotoga m
aritima）菌株MSB8の細胞（教授K.O.Stettcr博士、ドイ
ツ国レゲンスバーグ、により提供された）を、2.4mMのP
MSF（DMF中144mMのストックから）を含有する25mlの３
×TE−DTT緩衝液（150mMのトリス−Cl（pH7.5）,3mMのE
DTA、および3mMのジチオスレイトール）の中で融解し、
そして磁気攪拌機により低速で均質化した。融解した細
胞をアミンコ（Aminco）フレンチ圧力セル（８〜20,000
psi）の中で溶解した。リゼイトを追加の2.4mMのPMSFを
含有する１×TE−DTT緩衝液で最終5.5×細胞湿潤重量に
希釈し、そして超音波処理して粘度を減少させた（40〜
100％のアウトプット、９分、50％の使用サイクル）。

生ずる分画、分画Ｉ（275ml）は5.31gのタンパク質およ
び15.5×10⁴単位の活性を含有した。硫酸アンモニウム
を0.2M（7.25g）に添加し、そしてリゼイトを氷上で15
分間攪拌した。硫酸アンモニウムはTma DNAポリメラー
ゼが粗製のリゼイトの中のDNAに結合するのを防止し、
そしてDNAポリメラーゼと他の細胞リゼイトのタンパク
質とのイオン性相互作用を減少する。

実験的試験は、0.2％のポリミン（Polymin）Ｐ（ポリエ
チレンイミン、PEI）が全核酸の≧92％を沈澱させるこ
とを示した。ポリミンＰ（pH7.5）を0.2％（5.49mlの10
％のPEI）にゆっくり添加し、そしてこのスラリーを氷
上で30分間攪拌し、次いで30,000×ｇで４℃において30
分間遠心した。上澄み液を分画II（246ml）と表示し、
そして3.05gのタンパク質および12.5×10⁵単位の活性を
含有した。

分画IIを3.24gの固体硫酸アンモニウムの添加により0.3
M硫酸アンモニウムに調製し、DNAポリメラーゼのフェニ
ルセファローズへの完全な結合を保証した。次いで分画
IIを2.2×6.6cm（25ml）のフェニルセファローズCL−4B
（ロット0M08012,Pharmacia−LKBから購入した）カラム
（0.3Mの硫酸アンモニウムおよび0.5mMのDTTを含有する
TEの中で平衡化したもの）上に38ml/時（10ml/cm²/時）
で負荷した。すべての樹脂は製造業者のインストラクシ
ョンに従い平衡化しそして再循環した。カラムを150ml
の同一の緩衝液で洗浄し（基線に対してA₂₈₀）、次いで
0.6mMのDTTを含有する（硫酸アンモニウムを含まない）
90mlのTEで洗浄し、次いで0.5mMのDTTを含有するTE中20
％のエチレングリコール95mlで洗浄し、そして最後に20
％のエチレングリコールおよび0.5mMのDTTを含有するTE
中2Mの尿素で溶出した。カラムの分画を測定するとき、
活性の大きい比率が流過分画および洗浄分画の中に見い
だされ、カラムの容量を越えたことを示した。この最初
のフェニルセファローズのカラムに結合したDNAポリメ
ラーゼのほぼ70％は低い塩において溶出され（TE−DTT
洗浄液で）、そして結合した物質の残部は2MのTE−DTT
洗浄液中20％のエチレングリコール中2Mの尿素で溶離さ
れた。

第１フェニルセファローズのカラムからの流過液の活性
はPSII負荷と表示し（226ml）、そして1.76gのタンパク
質を含有した。分画PSII負荷を第２フェニルセファロー
ズカラム（同一のロットおよび寸法）に適用し、そして
実験を同一の方法で反復した。再び、カラムの容量を越
え、そして活性は低い塩および2Mの尿素の洗浄液の両者
で溶出されることがわかった。結合したDNAポリメラー
ゼのわずかに10％にTE−DTT洗浄液で溶離された；主要
な部分（約90％）はTE−DTT洗浄液中20％のエチレング
リコール中2Mの尿素で溶出された。

第２フェニルセファローズカラムからの流過液の活性を
第１および第２のフェニルセファローズのカラムからの
TE−DTT溶出液と一緒にし、そして0.3Mの硫酸アンモニ
ウムに調節した。この分画（PSIII負荷、259.4ml）は83
1mgのタンパク質を含有し、そして50mlのベッド体積の
第３フェニルセファローズカラムに10ml/cm²/時で適用
した。この時、適用した活性のすべてはこのカラムによ
り保持され、そしてTE−DTT洗浄液中20％のエチレング
リコール中の2Mの尿素でのみ溶出された。

３つのすべての尿素溶出液を別々にアミコン（Amicon）
YM30上で約３〜４倍に濃縮し、そして溶出後短時間でヘ
パリンセファローズ負荷緩衝液の中に透析して、尿素へ
の延長された暴露を回避した（カルバミル化を回避する
ために）。透析しかつ濃縮した尿素溶出液をタンパク質
濃度について測定し、そしてそれらの比活性が大きく変
化することが発見された。第２フェニルセファローズカ
ラムからの尿素溶出液は他の２つの溶出液に比べて、有
意に高い比活性（約100単位/mgのタンパク質において約
８×10⁴単位の活性）で活性の大部分を含有したので、
これをそれらと別に処理した。

透析しそして濃縮したフェニセファローズII尿素溶出液
を、0.08MのKCl,50mMのトリス−Cl,pH7.5,0.1mMのEDTA,
0.2％のツイーン20および0.5mMのDTTにより平衡化した5
mlのベッド体積のヘパリンセファローズCL6B（Pharmaci
a−LKBから購入した）カラムに適用した。このカラムお
よびすべての引き続くカラムを１ベッド体積／時で展開
した。適用したDNAポリメラーゼ活性のすべてはこのカ
ラムにより保持された。このカラムを17mlを同一緩衝液
で洗浄し（基線に対してA₂₈₀）そして60mlの同一緩衝液
中80〜500mMのKClの直線勾配で溶出した。

0.21〜0.315MのKClで溶出する分画（0.53ml）をSDS−PA
GEにより分析した。0.25〜0.275MのKClで溶出するピー
ク分画を別々に進めた。前後の分画を後に他の分画と一
緒にするために保持した。ピーク分画（アフィゲルＩ負
荷）のプールをKClを含まないアフィゲル−ブルー緩衝
液で希釈して、そのイオン強度を0.15MのKClに減少し
た。

アフィゲルＩ負荷の分画は3.4mgのタンパク質を含有し
そして、25mlのトリス−Cl,pH7.5,0.1MのEDTA,0.2％の
ツイーン20,0.5mlのDTTおよび0.15MのKClの中で平衡化
した。4.3mlのアフィゲル−ブルーカラム（BioRadから
購入した）に適用した。適用したTma DNAポリメラーゼ
のすべては保持された。このカラムを15mlの同一緩衝液
で洗浄し、そして66mlの同一緩衝液中0.15〜0.7MのKCl
の直線勾配で溶出した。

0.35〜0.55MのKClで溶出する分画（0.58ml）をSDS−PAG
Eにより分析し、そして＞90％の純度であるように思わ
れる。ポリメラーゼのピーク分画は部位特異的エンドヌ
クレアーゼで汚染されていなかった（65℃において２単
位のTmaポリメラーゼと600ngのプラスミドpLSG1（ccc−
DNA）を使用して１または２時間インキュベーションし
た後、低分子量の特定のDNA断片の不存在により示され
た）。0.3〜0.5Mで溶出するポリメラーゼのピークをプ
ールし、そしてアミコンYM30膜上で約20倍に濃縮した。
次いでこの分画を2.5×貯蔵緩衝液（50mMのトリス−Cl,
pH7.5,250mMのKCl,0.25mMのEDTA,2.5mMのDTTおよび0.5
％のツイーン20［Pierce,Surfact−Amps］）中で透析濾
過し、そして４℃において貯蔵した。

第１および第３のフェニルセファローズのカラムからの
尿素溶出液を、第１ヘパリンセファローズカラムからの
前後分画と一緒にした。このオプール（HSII負荷）は約
200mgのタンパン質を含有し、そしてKClを含まないヘパ
リンセファローズ緩衝液で80mMのKClにそのイオン強度
を長した。HSII負荷を16mlのベッド体積のヘパリンセフ
ァローズカラム（80mMのKCl,50mMのトリス−Cl,pH7.5,
0.1mMのEDTA,0.2％のツイーン20および0.5mMのDTTの中
で平衡化したもの）に適用した。検出可能な活性は流過
分画の中に現れなかった。

このカラムを80mlの同一緩衝液で洗浄し、そして200ml
の同一緩衝液中80〜750mMのKCl勾配で溶出した。0.225
〜0.335MのKClで溶出する分画（2ml）を一緒にし、そし
てアミコンYM30膜上で約５倍に濃縮し、そしてヒドロキ
シアパタイト緩衝液の中に透析した。この分画（HA負
荷）は9.3mgのタンパク質を含有し、そして4mlのベッド
体積のヒドロキシアパタイト（高い分離能のHPT,Calbio
chemから購入した）カラム（10mMのリン酸カリウム緩衝
液,pH7.5,0.5mMのDTT,0.1mMのEDTAおよび0.2％のツイー
ン20の中で平衡化したもの）上に負荷した。

このカラムを12mlの同一緩衝液で洗浄し、そして60mlの
10〜500mMリン酸カリウム（pH7.5）の直線勾配で溶出し
た。0.105〜0.230Mのリン酸カリウムで溶出する分画
（0.8ml）をSDS−PAGEにより分析した。アフィゲルカラ
ムＩの分画（これはSDS−PAGEにより約10〜20％の純度
であると思われた）と比較して、これらの分画は約５倍
純度が低かった。0.105〜0.255Mのリン酸カリウムで溶
出するDNAポリメラーゼのピーク分画を一緒にし、アミ
コンYM30膜上で３倍に濃縮し、そしてアフィゲル−ブル
ー緩衝液中で透析濾過した。

アフィゲルII負荷分画を、アフィゲル−ブルー緩衝液中
で平衡化した3mlのベッド体積のアフィゲル−ブルーカ
ラムに適用した。検出可能なDNAポリメラーゼの活性は
流過分画中に現れなかった。このカラムを9mlの同一緩
衝液で洗浄し、そして50mlの同一緩衝液中の0.2〜0.7M
のKCl直線勾配で溶離した。0.33〜0.505MのKClで溶出す
る分画（0.58ml）をSDS−PAGEにより分析した。早期に
溶出する分画はそれらの銀染色パターンによりわずかに
一層きれいに見えたので、２つのプールをつくった。0.
31〜0.4MのKClで溶出する分画をプールＩの中に一緒に
した;0.4〜0.515MのKClで溶出する分画をプールIIの中
に一緒にした。２つのプールの各々を別々にアミコンYM
30膜上で約７倍に濃縮した。

３つのすべてのアフィゲル−ブルーのプールはなお高い
レベルの汚染非特異的ヌクレアーゼを含有した。70℃に
おいて1.5単位のDNAポリメラーゼと共にインキュベーシ
ョンすることにより、一本鎖M13のDNA鋳型およびプラス
ミドの多断片の制限消化物の両者は数時間以内に分解し
た。イン−シチュ活性ゲルを展開し、そしてDNAポリメ
ラーゼの分画がタンパク質分解的分解を受けなかったこ
とを示した。

第２アフィゲル−ブルーカラムからの２つのプールを一
緒にし、そしてホスホセルロースカラム緩衝液の中に透
析した。透析した分画（P11 Ｉ負荷）を3mlのホスホセ
ルロースカラム（25mMのトリス−CI,pH7.5,50mMのKCl,
0.1mMのEDTA,0.2％のツイーン20および0.5mMのDTTで一
夜洗浄したもの）上に負荷した。この洗浄は後にホスホ
セルロース樹脂のpHの平衡化のために不十分であったこ
とが証明された。不都合なことには、これは試料がカラ
ム上に負荷された後に見出された。適用した活性はすべ
てのカラムに結合した。

このカラムを9mlの負荷緩衝液で洗浄し、そして45mlの5
0〜700mMのKClの直線勾配で溶出した。0.46〜0.575mMの
KClで溶出するDNAポリメラーゼのピーク分画（0.58ml）
をSDS−PAGEにより分析した。

汚染タンパク質の分離はピークを通して観察された：約
45kDaの汚染バンドは0.53Mで溶出する；約85kDaの汚染
バンドは0.54MのKClにおける溶出ピークを有する。した
がって、このカラムを反復した（ポリメラーゼの溶出の
プロフィルを考慮して、多少高いイオン強度で負荷す
る）。第１ホスホセルロースのカラムから0.475〜0.56M
のKClで溶出するピーク分画を第１アフィゲルカラムか
らのプールと一緒にした。一緒にした分画（P11 II負
荷）は今や、精製されたポリメラーゼのすべて（約7.5
×10⁴）を含有した。

分画P11 II負荷をホスホセルロース緩衝液で希釈して、
イオン強度を0.5MのKClに調節した。P11 II負荷を9mlの
ベッド体積のホスホセルロースカラム（この場合、25mM
のトリス−Cl,pH7.5,200mMのKCl,0.1mMのEDTA,0.2％の
ツイーン20および0.5mMのEDTAの正しいpHおよびイオン
強度に平衡化された）上に負荷した。このカラムを27ml
の同一緩衝液で洗浄し、そして140mlの0.2〜0.8MのKCl
の直線勾配で溶出することを意図した。しかしながら、
0.8MのKClの上限緩衝液の代わりに、緩衝液は52mMのKCl
の濃度を有し、これは塩の減少勾配を生じた。次いでこ
のカラムを32mlの0.2MのKCl−ホスホセルロース緩衝液
により再び平衡化し、そして140mlの0.2〜0.8MのKClの
直線勾配を再び適用した。

流過液、洗浄液、および勾配分画の日常的アッセイによ
り、このより高いpH（pH7.5）において、DNAポリメラー
ゼはホスホセルロース樹脂に0.2MにKClにおいて結合し
ないことが示された。流過液、洗浄液、および塩減少勾
配の分画からのDNAポリメラーゼ活性を含有する分画を
一緒にした。生ずるプールをアミコンYM30膜上で濃縮し
た。しかしながら、濃縮装置の故障はDNAポリメラーゼ
活性のそれ以上の損失に導いた。回収された活性を50mM
のKClのホスホセルロース緩衝液の中に透析し、そしてP
11 III負荷と表示した。

この分画を50mMのKClを含むホスホセルロース緩衝液に
より平衡化した5mlのベッド体積のホスホセルロースの
カラム上に負荷した。適用した活性のすべてはこのカラ
ムにより保持された。このカラムを15mlの同一緩衝液で
洗浄し、そして50mlの同一緩衝液中の50〜500mMのKClの
直線勾配で溶出した。0.16〜0.33MのKClで溶出する分画
（0.87ml）をSDS−PAGEおよびイン−シチュ活性ゲルに
より分析した。

銀染色パターンに基づいて、２つのプールを作った。0.
215〜0.31MのKClで溶出するピーク分画を、先行する分
画および後の分画から別々に保持し、これらを一緒にし
て副分画プールにした。両者のプールをセントリコン
（centricon）30膜上で濃縮し、そして2.5×貯蔵緩衝液
（50mMのトリス−Cl,pH7.5,250mMのKCl,2.5mMのEDTA,2.
5mMのDTTおよび0.2％のツイーン20」Pierce,Surfact−A
mps］）中で透析濾過し、引き続いて1.5体積の80％のグ
リセロールと混合した。

約3.1×10⁴単位がピーク分画において回収され；副プー
ルは追加の１×10³の単位の活性をもたらす。精製され
たDNAポリメラーゼは、イン−シチュ活性ゲルの中の不
変化の移動パターンにより証明されるように、分解しな
かった。精製されたDNAポリメラーゼのゲル電気泳動に
より決定された分子量はほぼ97kDaである。Tma DNAポリ
メラーゼは、Taq DNAポリメラーゼのアミノ酸残基5697
−587（DGTP1）および718−732（DGTP3）に相当する、
エピトープ特異的抗体により認識される。

実施例２ Tma DNAポリメラーゼＩ活性をコードするDNAの単離 合成オリゴデオキシリボヌクレオイドDG164〜DG167は、
熱安定性DNAポリメラーゼの鋳型結合ドメイン（最も
３′−側の14ヌクレオチド）におけるモチーフの１つに
対する「前方」プライマーと表示される、４つの異なる
16倍の縮重の（各々）22マーのプールである。このモチ
ーフはアミノ酸配列Gly−Tyr−Val−Glu−Thrであり、
そしてサームス・アクアチクス（Ｔ，aquaticus）（Ta
q）DNAポリメラーゼのアミノ酸718−722に、およびサー
ムス・サーモフィルス（Ｔ．thermophilus）（Tth）DNA
ポリメラーゼのアミノ酸720−724に同一に対応する。こ
のモチーフはすべてのサームス（Thermus）種におけるD
NAポリメラーゼ遺伝子の中に見いだされる。一緒にした
プライマーのプールは64倍の縮重性であり、そしてプラ
イマーはそれらの５′末端においてBglII認識部位をコ
ードする。

前方プライマーDG164〜DG167を下に示す： DG164 配列番号:2 ５′CGAGATCTGGNTAYGTWGAAAC DG165 配列番号:3 ５′CGAGATCTGGNTAYGTWGAGAC DG166 配列番号:4 ５′CGAGATCTGGNTAYGTSGAAAC DG167 配列番号:5 ５′CGAGATCTGGNTAYGTSGAGAC これらの前のプライマーにおいて:Aはアデニンであり;C
はシチジンであり;Gはグアニジンであり;Tはチミンであ
り;YはＣ＋Ｔ（pYrimidine）であり;SはＧ＋Ｃ（Strong
相互作用;3H−結合）であり;WはＡ＋Ｔ（Week相互作用;
2H−結合）であり；そしてＮはＡ＋Ｃ＋Ｇ＋Ｔ（aNy）
である。

合成オリゴデオキシリボヌクレオチドDG160〜DG163は、
熱安定性DNAポリメラーゼの鋳型結合ドメイン（最も
３′−側の14ヌクレオチド）におけるモチーフの１つに
対する「逆」プライマーと表示される、４つの異なる８
倍の縮重の（各々）20マーのプールである。これらのプ
ライマーは相補的（＋）鎖DNA配列に帰属され、そして
モチーフGln−Val−His−Asp−Gluをコードし、そしてT
aq DNAポリメラーゼのアミノ酸782−786およびTth DNA
ポリメラーゼのアミノ酸784−788に同一に対応する。こ
のモチーフはすべてのサームス（Thermus）種におけるD
NAポリメラーゼ遺伝子中に見いだされる。一緒にしたプ
ライマーのプールは32倍の縮重性であり、そしてプライ
マーはそれらの５′未満においてEcoRI認識部位をコー
ドする。

逆プライマーDG160〜DG163を下に示す； DG160 配列番号:6 ５′CGGAATTCRTCRTGWACCTG DG161 配列番号:7 ５′CGGAATTCRTCRTGWACTTG DG162 配列番号:8 ５′CGGAATTCRTCRTGSACCTG DG163 配列番号:9 ５′CGGAATTCRTCRTGSACTTG これらの逆プライマーにおいて、A,C,G,T,SおよびＷは
上に定義した通りであり、そしてＲはＧ＋Ａ（puRine）
である。

Tma DNAポリメラーゼ遺伝子の約230bpの断片を増幅する
ために、MgCl₂を使用しないで80μｌの中に次の成分を
含有するPCR増幅管を調製した：（１）5ngの変性したTm
aゲノムDNA;（２）50ピコモル（合計）の一緒にした前
方プライマーの組DG164−DG167;（３）50ピコモル（合
計）の一緒にした逆プライマーの組DG160−DG163;
（４）２単位のTaq DNAポリメラーゼ；（５）50μＭ
（最終）の各dNTP;（６）0.05％のラウレス（Laureth）
−12;および（７）標準的PCR緩衝液、塩化マグネシウム
を含まない。

試料を−70℃でフラッシュ凍結し、そして−20℃におい
て貯蔵した。凍結した試料を20μｌの10mMのMgCl₂（最
終濃度2mM）で層状にし、直ちに50mlの鉱油をオーバー
レイし、そしてパーキン・エルマー・セツス・サイクラ
ー（Perkin Elmer Cetus Cycler）で次のファイルに従
いサイクリングした：（１）98℃への段階−50秒の保
持；（２）50℃への段階−10秒の保持；（３）４分かけ
て75℃への傾斜；および（４）98℃への上昇。このファ
イルを合計30サイクル反復した。増幅生成物の1/5（20
μ）を３％のヌシーブ（Nusieve）/1％のシーケム（Sea
kem）アガロース複合ゲル上で精製し、そしてほぼ230bp
の断片を溶出し、濃縮し、そしてBglIIおよびEcoRIで消
化した。

合成オリゴデオキシリボヌクレオチドDG154およびDG155
は、熱安定性DNAポリメラーゼのプライマー：鋳型結合
ドメイン（最も３′−側11ヌクレオチド）におけるモチ
ーフの１つに対する「前方」プライマーと表示される２
つの異なる32倍の縮重の（各々）19マーのプールであ
る。このモチーフはテトラペプチドの酸配列Thr−Ala−
Thr−Glyであり、そしてTaq DNAポリメラーゼのアミノ
酸569−572およびTth DNAポリメラーゼのアミノ酸571−
574に同一に対応する。このモチーフはすべてのサーム
ス（Thermus）種におけるDNAポリメラーゼ遺伝子の中に
見いだされる。一緒にしたプライマーのプールは64倍の
縮重性であり、そしてプライマーはそれらの５′末端に
おいてBglII認識部位をコードする。

前のプライマーDG154およびDG155を下に示す： DG154 配列番号:10 CGAGATCTACNGCNACWGG DG155 配列番号:11 CGAGATCTACNGCNACSGG これらの前方プライマーにおいて、A,C,G,T,S,Wおよび
ｎは上に定義した通りである。

Tma DNAポリメラーゼ遺伝子のほぼ約667bpの断片の増幅
するために、MgCl₂を使用しないで80μｌの中に次の成
分を含有するPCR増幅管を調製した：（１）5ngの変性し
たTmaゲノムDNA;（２）50ピコモル（合計）の一緒にし
た前方プライマーの組DG154−DG155;（３）50ピコモル
（合計）の一緒にした逆プライマーの組DG160−DG163;
（４）２単位のTaq DNAポリメラーゼ；（５）50μＭ
（最終）の各dNTP;（６）0.05％のラウレス（Laureth）
−12;および（７）標準のPCR緩衝液、塩化マグネシウム
を含まない。

試料を−70℃でフラッシュ凍結し、そして−20℃におい
て貯蔵した。凍結した試料を20μｌの10mMのMgCl₂（最
終濃度2mM）で層状にし、直ちに50mlの鉱油をオーバー
レイし、そしてパーキン・エルマー・セツス・サイクラ
ー（Perkin Elmer Cetus Cycler）で次のファイルに従
いサイクリングした：（１）98℃への段階−50秒の保
持；（２）50℃への段階−10秒の保持；（３）４分かけ
て75℃への傾斜；および（４）98℃への上昇。このファ
イルを合計30サイクル反復した。

増幅生成物の1/5（20μ）を1.5％のアガロースゲル上で
精製し、そしてほぼ670bpの断片を溶出し、濃縮し、そ
してBglIIおよびEcoRIで上のようにして消化した。

これらの増幅反応は、667bpの断片、および667bpの断片
の下位断片である230bpの断片を生じた。これらの断片
は、以下の実施例に記載するように、Tma DNAポリメラ
ーゼＩ遺伝子のための完全なコード配列を得るとき有用
であることが証明された。

実施例３ サーモトガ・マリチマ（Theromotoga maritima）（Tm
a）DNAポリメラーゼＩ遺伝子のクローニング この実施例は、サーモタガ・マリチマ（Theromotoga m
aritima）のTma DNAポリメラーゼＩ遺伝子（Tma PolI）
をクローニングする戦略および方法を記載する。

プライマーDG164−167およびDG160−163（230bp）およ
びDG154,155およびDG160−163（667bp）により発生した
PCR生成物のDNA配列は、XmaI制限部位の認識配列５′CC
CGGGを含有する。オリゴヌクレオチドを、XmaI部位の上
流および下流の配列にハイブリダイゼーションするよう
に設計した。DG224は21マーであり、XmaI部位に対して5
9−79bpだけ３′−末梢のPCR生成物に対して相同性であ
る。DG225は22マーであり、XmaI部位からXmaI部位より2
1bp上流（５′）までのPCR生成物に対して相同性であ
る。DG224およびDG225の配列を下に示す（ＫはＧまたは
Ｔである）。

DG224 配列番号:12 ５′ACAGCAGCKGATATAATAAAG DG225 配列番号:13 ５′GCCATGAGCTGTGGTATGTCTC DG224およびDG225を、ほぼ８ビチオン−dUMP残基をオリ
ゴヌクレオチドの３′末端に付加するように設計した反
応において、ビオチン−dUTPおよびトランスフェラーゼ
でテイリングすることによって標識した。これらの標識
したオリゴヌクレオチドをゲノムのTma DNAの制限消化
のサザンブロット分析においてプローブとして使用し
た。サザン分析の結果、および実施例２に記載するよう
に生産したPCR生成物のDNA配列に基づいて、予備的制限
地図を作成した。

予備的地図は、全体のTma DNAポリメラーゼ遺伝子が２
つのXmaI制限断片を含有することを示した。５′末端を
包含する、遺伝子の大部分はほぼ2.6kbのXmaI断片上に
位置する。この遺伝子の残部（および３′末端）はほぼ
4.2kbのXmaI断片上に位置する。全体のTma DNAポリメラ
ーゼ遺伝子を含有する２つのXmaI断片を、後述するよう
に、プラスミドpBS13＋（また、pBSM13＋呼ぶ）の中に
クローニングした。

約40μｇのTmaゲノムDNAをXmaIで完全に消化した。XmaI
消化物を電気溶出によりサイズ分画した。γ−³²P−ATP
−キナーゼ処理したDG224およびDG225プローブを使用す
る、各分画の小部分のスロットブロット分析は、4.2kb
の３′−断片（DG224とハイブリダイゼーションする）
および2.6kbの５′−断片（DG225とハイブリダイゼーシ
ョンする）を含有する分画を同定した。分画をエタノー
ル沈澱により濃縮し、次いでXmaI消化したpBS13＋（Str
atagene）と連結した。アンピシリン耐性の形質転換体
をニトロセルロースのフィルター上で選抜し、そしてフ
ィルターを適当ならばγ−³²P−ATP−キナーゼ処理した
DG224およびDG225のプローブでプロービングした。プラ
スミドDNAをプローブとハイブリダイゼーションしたコ
ロニーから単離した。制限分析を実施して、断片が期待
したものであることを確証し、そしてpBS13＋ベクター
に関する断片の向きを決定した。クローニングした断片
のDNA配列の分析を、「ユニバーサル」および「逆」配
列決定プライマー（これらはベクター中で、制限部位の
ポリリンカー領域の外側でプライミングする）を使用し
て実施した。さらに、５′−クローンについて、DG154
−155/DG160−163の667bpのクローンのDNA配列の決定に
使用したプライマーを用いた。予備的DNA配列の分析に
より、Tma DNAポリメラーゼ遺伝子を含有する所望のDNA
断片がクローニングされたことが確証された。

予備的DNA配列から、断片のより内部の領域のDNA配列を
得るように、それ以上の配列決定プライマーを設計し
た。さらに、DNA配列の分析を促進するために、２つのX
maI断片のいくつかの欠失を作った。2.6kbの５′−断片
の両者の向きについて、EcoRI,SacI、およびXbaIの消化
物の各々を欠失し、そして分子内の結合に好適な条件下
に結合し、こうしてベクターEcoRI,SacI、およびXbaI部
位とTma XmaI断片の対応する部位との間のDNAを欠失し
た。このような内部の欠失は、「ユニバーサル」または
「逆の」配列決定プライマーを使用する容易なDNA配列
の分析を可能とする。

同様に、ベグターのBamHI部位を、そのクローン中のTma
PolIの内部のXmaI部位からほぼ650bpのBglII部位と融
合して、4.2kbの３′−断片の欠失を作った（BamHIおよ
びBglIIは互いに容易に結合する同一のGATC粘着末端を
有する）。この欠失はTma PolI遺伝子の３′末端のDNA
配列の分析を可能とする。

制限部位分析において、2.6kgの５′−断片および4.2kb
の３′−断片の両者はNcoI,NdeIおよびAseI制限部位を
欠如することが明らかにされる。Tma PolI遺伝子のATG
開始およびコード配列を知ると、DNA配列をATG開始部位
において変更して、オリゴヌクレオチドの部位特異的突
然変異によりNcoI,NdeIおよびAseI制限部位を含めるよ
うなオリゴヌクレオチドを設計することができる。さら
に、pBSM＋ベクターのプロモーターとTma PolI遺伝子の
開始部位との間の配列の欠失が、ATG開始部位におけるN
deIまたはAseI認識部位の包含と同時になされるよう
に、突然変異のオリゴヌクレオチドを設計することがで
きる。

ベクターの中のlacプロモーターとTma PolI遺伝子の開
始部位との間の配列の欠失はまた、欠失された領域にお
けるXmaI制限部位を排除し、こうしてこの分野において
普通の技術を使用する発現プラスミド中への全体コード
配列のアセンブリングを便利にする（例えば、同時継続
出願第455,967号、1989年12月22日提出、その開示をこ
こに引用によって加える、の中のpDG174−pDG181につい
ての合成のプロトコルを参照のこと）。

実施例４ Tma DNAポリメラーゼを使用するPCR 約1.25単位の実施例１において精製したTma DNAポリメ
ラーゼを使用して、TthゲノムDNAからのrRNA配列を増幅
する。反応体積は50μｌであり、そして反応混合物は50
ピコモルのプライマーDG73,10⁵〜10⁶のTthのコピー（約
２×10⁵コピーのゲノム/ngのDNA）,50ピコモルのプライ
マーDG74,200μＭの各dNTP,2mMのMgCl₂,10mMのトリス−
HCl,pH8.3,50mMのKCl、および100μg/mlのゼラチン（必
要に応じて、ゼラチンを省略することができる）を含有
する。

反応はパーキン−エルマー・セツス・インスツルメンツ
（Perkin−Elmer Cetus Insruments）のDNAサーマルサ
イクラー（Thermal Cycler）で実施する。20〜30サイク
ルの96℃で15秒;50℃で30秒、および75℃で30秒を実施
する。20サイクルにおいて、増幅生成物（160bpの大き
さ）が臭化エチジウム染色したゲル上にかすかに見るこ
とができ、そして30サイクルにおいて、生成物は臭化エ
チジウム染色したゲム上で容易に見ることができる（紫
外線下）。

より少ない単位のTma DNAポリメラーゼ使用する場合
（すなわち、0.31単位/50μｌの反応）、PCRはより少な
い非特異的生成物を生ずるであろう。さらに、非イオン
性洗剤、例えば、ラウレス−12を反応混合物に約0.5％
〜１％の最終濃度に添加すると、PCR生成物の収量を改
良することができる。

プライマーDG73およびDG74を下に示す： DG73 配列番号:14 ５′TACGTTCCCGGGCCTTGTAC DG74 配列番号:15 ５′AGGAGGTGATCCAACCGCA 実施例５ Tma DNAポリメラーゼの組換えベクター A.Tma PolI遺伝子の５′および３′末端の変異誘発 ベクターpBS:Tma7−１（ATCC No.68471、後で改名pTma0
1）中のTma遺伝子の５′末端を、オリゴヌクレオチドDG
240およびDG244でオリゴヌクレオチドの部位特異的変異
により変異誘発した。プラスミドpBS:Tma7−１は、ベク
ターpBS＋の中にクローニングされた2.6kbの５′XmaI断
片を含んで成る。両者の変異誘発から生ずる変異体は、
pBS＋ベクター中のβ−ガラクトシダーゼのATGとTma Po
lIのATGとの間に欠失を有するので、Tmaコード配列はベ
クターlacプロモーター、オペレーターおよびリボソー
ム結合部位（RBS）を利用する発現のために配置され
た。両者の組の変異体はまた、Tma PolIのための第２お
よび第６のコドン中に変更を有して、コードされたタン
パク質のアミノ酸配列を変化させないで、大腸菌（Ｅ．
coli）のコドンの使用といっそう適合性となった。さら
に、DG240はNdeI制限部位をコード配列のATG開始部に配
置し（５′CATATG）、そしてDG244はNcoI制限部位をコ
ード配列のATG開始部に配置させた（５′CCATGＧ）。DG
240変異の候補コロニーを［γ³²P］標識したオリゴヌク
レオチドDG241でスクリーニングし、そしてDG244変異の
候補コロニーを［γ³²P］標識したオリゴヌクレオチドD
G245でスクリーニングした。プラスミドDNAを適当なプ
ローブとハイブリダイゼーションしたコロニーから単離
し、そして変異は制限分析およびDNA配列の分析により
確証された。DG240の変異体をpTma5′Nde＃９と命名
し、そして後にpTma07と改名された）。

Tma PolI遺伝子の３′末端を、pBSTma3′11−1Bam/Bgl
（ATCC No.68472、後の改名pTma04）中で変異誘発オリ
ゴヌクレオチドDG238で変異誘発した。プラスミドpBSTm
a3′11−1Bam/Bglは、実施例３に記載するように、4.2k
bの３′XmaI断片をpBS＋中にクローニングし、生ずるプ
ラスミドをBamHIおよびBglIIで消化し、そして消化から
の大きい断片を結合することによって環化して構成され
た。DG238はEcoRVおよびBamHII部位をTGA停止コドンの
直ぐ下流に挿入する。変異コロニーの候補を［γ³²P］
標識したオリゴヌクレオチドDG239で同定した。陽性の
コロニーから単離したプラスミドDNAを適当な制限消化
のパターンについてスクリーニングし、そしてDNA配列
を確認した。得られた１つの正しいプラスミドをpTma
3′mut＃１として表示し、そして後にpTma05と改名し
た。

B.lacプロモーターのベクター中の全長遺伝子のアセン
ブリング 大腸菌（Ｅ．coli）中のTma PolIの低いレベルの発現お
よびTma PolIによる大腸菌（Ｅ．coli）ポリメラーゼ変
異体の可能な相補性（ここで高いレベルの発現は細胞を
殺すことがあるが、低いレベルは救済または補完するこ
とができる）を研究する目的で、Tma PolI遺伝子をpBS1
3＋クローニングベクターの中でアセンブリングした。p
Tma3′mut＃１からの約300bpのXmaI−EcoRV断片を、ア
ガロースゲルの電気泳動および臭化エチジウムの染色
後、約300bpの断片を含有するアガロースゲルのスライ
スを切除しそしてコスター（Costar）スピネックスのフ
ィルターユニット中で凍結することによって、単離およ
び精製した。融解すると、このユニットをマイクロフー
ジ（microfuge）で回転し、そしてDNA断片を含有する液
体を集めた。エタノール沈澱後、断片を２つの５′ベク
ター、pTma5′Nde＃３およびpTma5′Nco＃９の各々と連
結し、これらの各々をAsp718で消化し、クレノーおよび
すべてのdNTPで修復し（反応条件は次の通りである:56m
Mのトリス−Cl,pH8.0,56mMのNaCl,6mMのMgCl₂,6mMのDT
T,5μＭのdNTPおよび11単位のクレノー、37℃,15分；次
いで75℃において10分間不活性化する）、次いでXmaIで
さらに消化した。

連結は２工程で実施した。XmaI粘着末端を連結するため
に条件は次の通りであった:20μg/mlの合計のDNA,20mM
のトリス−Cl,pH7.4,50mMのNaCl,10mMのMgCl₂,40μｍの
ATP、および0.2Weiss単位のT4DNAリガーゼ/20μｌの反
応、０℃、一夜。Asp718消化しそしてクレノー修復した
平滑末端をEcoRV消化した平滑末端と連結するために、
第１の連結物を、同一の結合緩衝液の中で４〜５倍に希
釈しそして15℃においてインキュベーションした。但
し、1mMのATPおよび10Wciss単位のT4DNAリガーゼを20μ
ｌの反応について使用した。連結物をDG101宿主細胞に
形質転換した。候補を適当な制限部位についてスクリー
ニングし、そしてクローニング部位付近のDNA配列を確
認した。所望のプラスミドをpTma08（ATGにおいてNdeI
部位）およびpTma09（ATG部位においてNcoI部位）と表
示した。

C.P_L発現ベクター中の全長遺伝子のアセンブリング λP_Lプロモーターのコントロール下に全長のTma PolIを
アセンブリングしかつ発現するために使用したP_Lプロモ
ーターの発現ベクターを下表に記載する。

表の中の５つのベクターは、アンピリシン耐性の場合、
プラスミドpDG160の誘導体であるか、あるいはテトラサ
イクリン耐性の場合、pDG161である。プラスミドpDG160
およびpDG161並びに表に示すpDGベクターに類似するベ
クターを構成するスキームは、米国特許出願第455,967
号、1989年12月22日提出（その開示をここに引用によっ
て加える）に記載されている。ベクターはアンピシリン
またはテトラサイクリン耐性を与え、そしてすべてはサ
ーモタガ・マリチマ（Thermotoga maritima）からのδ
−トキシン陽性のレトロレギュレーターおよび同一の点
突然変異をRNAII遺伝子の中に含有し、これらはプラス
ミドをコピー数について温度感受性とする。

表に記載されているプライマーおよびオリゴヌクレオチ
ドを下に示す。

３つの断片の結合を使用して、ベクター中でTma PolI遺
伝子をアセンブリングした。ベクターをSmaIおよびNdeI
（pDG174,pDG178）またはNcoI（pDG182,pDG184,pDG18
5）で消化する。Tma PolI遺伝子の５′末端のNdeIおよ
びXmaIで消化したpTma5′Nde＃３からのものであるか、
あるいはNcoIおよびXmaIで消化したpTma5′Nco＃９から
のものである。遺伝子の３′末端はXmaIおよびEcoRVで
消化したpTma3′mut＃１からのものでありそして約300b
pの断片を前述したように精製した。

表に示すプラスミドpDG182および上のスキームを使用し
て、発現ベクターpTma13を構成した。プラスミドpDG184
および上のスキームを使用して、ベクターpTma12−１お
よびpTma2−３を構成した。プラスミドpTma12−３はpTm
a12−１と異なり、pTma12−３は同一の連結／形質転換
のプロトコルの間に生成したPctma12−１の２量体であ
る。プラスミドpDG185および上のスキームを使用して、
発現ベクターpTMa11を構成した。

ベクターはポリメラーゼ全コード配列を含有することが
できるが、この酵素の短縮された形態を独占的にあるい
は全長のプラスミドとの組み合わせで発現することがで
きる。Tma DNAポリメラーゼのこれらの短縮された形態
は、５′−ATG以外のコード配列中のメチオニン（ATG）
コドンの１つにおいて起こる翻訳開始から生ずる。モノ
マーのpTma12−１のプラスミドは、加熱誘導すると、天
然Tma DNAポリメラーゼのアミノ酸−138を欠如する生物
学的に活性な熱安定性DNAポリメラーゼを主として生成
する。約86kDaのタンパク質は、Tmaコード配列の位置14
0におけるメチオニンのコドンにおける翻訳開始の結果
であり、そしてMET140と呼ばれる。

適当な条件（38℃ではなく、34℃または36℃における加
熱誘導）下の震盪フラスコの研究において、マルチマー
のpTma12−３の発現ベクターは、有意なレベルの「全長
の」Tma DNAポリメラーゼ（SDS−PAGEによりほぼ97kD
a）およびより少量のMet140における翻訳開始から生ず
る短縮された（ほぼ86kDa）の形態を生じた。全長のTma
DNAポリメラーゼのアミノ酸配列決定は、アミノ末端の
メチオニンが除去され、そして第２位置のAlaがＮ−末
端に存在することを示した。

組換えTma DNAポリメラーゼを、プラスミドpTma12−３
を含有する大腸菌（Ｅ，coli）菌株DG116から精製し
た。10リットルの発酵用種母フラスコは、トリプトン
（20g/l）、酵母エキス（10g/l）、NaCl（10g/l）、ア
ンピシリン（100mg/l）およびチアミン（10mg/l）を含
有した。種母フラスコに寒天プレート（凍結グリセロー
ル培養物を使用することもできる）からのコロニーを接
種した。種母フラスコを30℃において0.5〜2.0光学密度
（A₆₈₀）に増殖させた。発酵槽の中に接種した種母培養
物の体積を計算して、細菌の濃度が0.5mgの乾燥重量／
リットルであるようにする。12.5リットルの増殖培地
は、60mMのKH₂PO₄,16mMのNaNH₄HPO₄,10mMのクエン酸お
よび1mMのMgSO₄を含有した。次の無菌の成分を添加し
た:2g/lのグルコース、10mg/lのチアミン、2.5g/lのカ
ザミノ酸、100mg/lのアンピシリン、および100mg/lのメ
チシリン。必要に応じて、消泡剤としてプロピレングリ
コールの添加により、発泡を抑制した。空気の流れを２
リットル／分に維持した。発酵槽に前述したように接種
し、そして培養物を30℃において4.5時間0.7の細胞密度
（A₆₈₀）に成長させた。増殖温度を35℃にシフトして、
組換えTma DNAポリメラーゼの合成を誘導した。温度の
シフトはpTma12−３プラスミドのコピーの数を増加し、
そして同時に宿主の中に欠陥のあるプロファージのリソ
ゲンによりコードされる温度感受性cIリプレッサーの不
活性化により、修飾されたTma DNAポリメラーゼ遺伝子
のラムダP_Lプロモーターがコントロールする転写を抑制
解除する。細胞を21時間の間４の光学密度（A₆₈₀）に増
殖させ、そして遠心により収穫した。生ずる細胞のペー
ストを−70℃で貯蔵した。

組換えTma DNAポリメラーゼを下の実施例６におけるよ
うに精製した。簡単に述べると、細胞を１体積のTE緩衝
液（50mMのトリス−Cl,pH7.5および10mMのEDTAおよび1m
MのDTT）の中で融解し、そしてプロテアーゼ阻害剤を添
加する（PMSFを2.4mMに、ロイペプチンを１μg/mlに、
そしてTLCKを0.2mMに）。細胞をアミコ（Amico）フレン
チ圧力セル中で20,000psiにおいて溶解し、そして超音
波処理して粘度を低下させた。超音波処理物をTE緩衝液
およびプロテアーゼ阻害剤を5.5×潤滑量の細胞塊（分
画Ｉ）に希釈し、0.3Mの硫酸アンモニウムに調節し、そ
して急速に75℃にし、そして75℃に15分間維持した。熱
処理した上澄み液を０℃に急速に冷却し、そして大腸菌
（Ｅ，coli）細胞の膜および変性されたタンパク質を2
0,000×ｇの30分間の遠心後に除去した。Tma DNAポリメ
ラーゼ（分画II）を含有する上澄み液を取って置く。核
酸の＞95％を沈澱させるために必要なポリミン（Polymi
n）Ｐのレベルを試験沈殿により決定する（通常0.6〜１
％w/vの範囲）。所定量のポリミン（Polymin）Ｐを０℃
において30分間急速に攪拌しながらゆっくり添加し、そ
してこの懸濁液を20,000×ｇで30分間遠心して、沈澱し
た核酸を除去する。Tma DNAポリメラーゼを含有する上
澄み液（分画III）を取って置く。

分画IIIを50mMのトリス−Cl,pH7.5,0.3Mの硫酸アンモニ
ウム、10mMのEDTAおよび1mMのDTTの中で平衡化したフェ
ニルセファローズのカラムに適用する。カラムを２〜４
体積の同一緩衝液で洗浄し（基線に対してA₂₈₀）、次い
で１〜２カラム体積の100mMのKClを含有するTE緩衝液で
洗浄して大部分の汚染するE.coliタンパク質を除去す
る。次いでTma DNAポリメラーゼをカラムから50mMのト
リス−Cl,pH7.5,2Mの尿素、20％（w/v）のエチレングリ
コール、10mMのEDTAおよび1mMのDTTを含有する緩衝液で
溶出し、そしてDNAポリメラーゼ活性を含有する遊離を
プールする（分画IV）。

組換えTma DNAポリメラーゼの最後の精製を、ヘパリン
セファローズのクロマトグラフィー（天然またはMET284
組換えDNAポリメラーゼについて）、アニオン交換クロ
マトグラフィー、またはアフィゲルブルーのクロマトグ
ラフィーを使用して達成する。組換えTma DNAポリメラ
ーゼを2.5×貯蔵緩衝液の中に透析濾過し、1.5体積の無
菌の80％（w/v）のグリセロールと一緒にし、そして−2
0℃において貯蔵する。

実施例６ 切頭TmaポリメラーゼMET284の発現 上に記載したように、完全なTma遺伝子のコード配列を
含有する発現プラスミドは、開始コドンにおける翻訳の
開始から生ずる全長のポリメラーゼ、あるいは位置140
におけるメチオニンのコドンに存在する翻訳開始部から
生ずる短縮されたポリメラーゼを発現した。翻訳開始部
位として作用することができる第３メチオニンコドン
は、Tma遺伝子のコード配列の位置284に存在する。天然
Tma DNAポリメラーゼのアミノ酸１−283を欠如するDNA
ポリメラーゼを発現するプラスミドを、Tmaのコード配
列の対応する領域を欠失することによって構成した。

プラスミドpTma12−１をBspH1（ヌクレオチド位置848）
およびHindIII（ヌクレオチド位置2629）で消化した。1
781bpの断片をアガロースゲル精製により単離した。DNA
からアガロースを分離するために、所望の断片を含有す
るゲルのスライスをコスター（Costar）スピンネックス
フィルターユニットの中で−20℃において凍結した。室
温において融解後、ユニットをマイクロフージ（microf
uge）の中で回転した。DNAを含有するフィルターをスピ
ード・バク（Spood Vac）濃縮装置で濃縮し、そしてDNA
をエタノールで沈澱させた。

単離した断片をNcoIおよびHindIIIで消化したpTma12−
１の中にクローニングした。NcoIの消化物はBspH1によ
る消化物と同一の粘着末端の配列を残すので、1781塩基
対の断片はNcoIおよびHindIIIで消化することによって
プラスミドpTma12−１から切除した全長の断片と同一の
粘着末端を有する。単離した断片と消化したプラスミド
との結合は断片のスイットを生じ、そしてpTma14と表示
するプラスミドをつくるために使用した。

プラスミドpTma15は同一の単離した断片をpTma13の中に
クローニングすることによって構成した。pTma14と同様
に、pTma15は天然Tma DNAポリメラーゼのアミノ酸１−2
83を欠如するポリメラーゼの発現を推進する；翻訳は天
然コード配列の位置284のメチオニンのコドンにおいて
開始する。

pTma14およびpTma15の両者の発現プラスミドは、約70kD
aの分子量の生物学的に活性な熱安定性DNAポリメラーゼ
を高いレベルで発現した；プラスミドpTma15はT4DNAリ
ガーゼより高いレベルでポリメラーゼを発現した。大腸
菌（Ｅ．coli）PolIのクレノー断片との類似性、例え
ば、３′−５′エキソヌクレアーゼ活性のために必須の
３つのすべてのドメインにおけるアミノ酸配列のモチー
フの保存性、アミノ末端からエキソヌクレアーゼ活性の
ために必須の第１ドメインまでの距離、および発現され
たタンパク質の長さ、に基づいて、Tmaポリメラーゼの
短縮された形態（MET284）は３′−５′エキソヌクレア
ーゼおよびプルーフ−リーディング（proof−reading）
活性を有するが、５′−３′エキソヌクレアーゼ活性を
欠如する。しかしながら３′−５′エキソヌクレアーゼ
活性についての初期のSDS活性のゲルアッセイおよび溶
液アッセイは、プラスミドpTma15を収容する大腸菌
（Ｅ．coli）宿主細胞により発現されたポリメラーゼの
プルーフーリーディング活性の有意の弱化を示唆した。

MET284Tma DNAポリメラーゼを、プラスミドpTma15を含
有する大腸菌（Ｅ．coli）菌株DG116から精製した。10
リットルの発酵の種母フラスコは、トリプトン（20g/
l）、酵母エキス（10g/l）、グルコース（10g/l）、ア
ンピシリン（50mg/l）およびチアミン（10mg/l）を含有
した。種母フラスコに寒天プレート（凍結グリセロール
培養物を使用することができる）からのコロニーを接種
した。種母フラスコを30℃において0.5〜2.0光学密度
（A₆₈₀）に増殖させた。発酵槽中に接種した種母培養物
の体積を計算して、細菌濃度が0.5mg乾燥重量／リット
ルであるようにする。10リットルの増殖培地は、25mMの
KH₂PO₄,10mMのNaNH₄HPO₄,4mMのクエン酸ナトリウム、0.
3mMのFeCl₃,0.04mMのZnCl₂,0.03mMのCoCl₂,0.03mMのCuC
l₂および1mMのH₃BO₃を含有した。次の無菌の成分を添加
した:4mMのMgSO₄,20g/lのグルコース、20mg/lのチアミ
ン、および50mg/lのアンピシリン。pHをNaOHで6.8に調
節し、そして発酵の間NH₄OHの添加によりコントロール
した。グルコースをNH₄OHの添加と組み合わせて連続的
に添加した。必要に応じて、消泡剤としてプロピレング
リコールの添加により、発泡を抑制した。溶解した酵素
の濃度を40％に維持した。

発酵槽に前述したように接種し、そして培養物を30℃に
おいて0.5〜1.0×10¹⁰の細胞密度（15の光度密度
［A₆₈₀］）に増殖させた。増殖温度を38℃にシフトし
て、MET284のTma DNAポリメラーゼの合成を誘導した。
温度のシフトはpTma15のプラスミドのコピーの数を増加
し、そして同時に宿主中の欠陥のあるプロファージのリ
ソゲンによりコードされる温度感受性cIリプレッサーの
不活性化により、修飾されたTma DNAポリメラーゼ遺伝
子のラムダP_Lプロモーターがコントロールする転写を抑
制解除する。

細胞を６時間の間37（A₆₈₀）に増殖させ、そして遠心に
より収穫した。細胞塊（約95g/l）を50mMのトリス−Cl,
pH7.6,20mMのEDTAおよび20％（w/v）のグリセロールを
含有する等しい体積の緩衝液の中に再懸濁させた。この
懸濁液を液体窒素の中にゆっくり滴下して懸濁液を「ビ
ース」または小さいペレットとして凍結した。凍結した
細胞を−70℃で貯蔵した。

200gの凍結したビーズ（100gの湿潤重量の細胞を含有す
る）に、100mlの１×TE（50mMのトリス−Cl,pH7.5,10mM
のEDTA）を添加し、そしてDTTを0.3mMに、PMSFを2.4mM
に、ロイペプチンを１μg/mlに、そしてTLCK（プロテア
ーゼ阻害剤）を0.2mMに添加した。試料を氷上で融解
し、そして低速のブレンダーの中で均一に再懸濁した。
細胞懸濁液を細胞をアミンコ（Aminco）フレンチ圧力セ
ルの中で20,000psiにおいて溶解した。粘度を減少する
ために、溶解した細胞の試料を各３分間50％の使用サイ
クルおよび70％のアウトプットで４回超音波処理した。
超音波処理物を1mMのDTT,2.4mMのPMSF,1μg/mlのロイペ
プチンおよび0.2mMのTLCK（分画Ｉ）を含有する１×TE
で550mlに調節した。硫酸アンモニウムを0.3Mに添加し
た後、粗製のリゼイトを沸騰する水の中で急速に75℃に
し、そして75℃の水に15分間移して大腸菌（Ｅ．coli）
宿主のタンパク質を変性および不活性化した。熱処理し
た試料を急速に０℃にし、そして氷上で20分間インキュ
ベーションした。５℃において20,000×Ｇで遠心するこ
とによって沈澱したタンパク質および細胞膜を除去し、
そして上澄み液（分画II）を取って置いた。

熱処理した上澄み液（分画II）をポリエチレンイミン
（PEI）で処理して、DNAおよびRNAの除去した。ポリミ
ン（Polymin）Ｐ（34.96mlの10％［w/v］,pH7.5）を急
速に攪拌しながら、437mlの分画IIに０℃において添加
した。０℃において30分後、試料を20,000×Ｇで30分間
遠心した。上澄み液（分画III）を、50mMのトリス−Cl,
pH7.5,0.3Mの硫酸アンモニウム、10mMのEDTAおよび1mM
のDTTの中で平衡化した。100mlのフェニルセファローズ
のカラム（3.2×12.5cm）に、800ml/時で適用した。こ
のカラムを約200mlの同一緩衝液で洗浄し（基線に対し
てA₂₈₀）、次いで150mlの50mMのトリス−Cl,pH7.5,100m
MのKCl,10mMのEDTAおよび1mMのDTTで洗浄した。次いでM
ET284のTma DNAポリメラーゼをカラムから50mMのトリス
−Cl,pH7.5,2Mの尿素、20％（w/v）のエチレングリコー
ル、10mMのEDTAおよび1mMのDTTを含有する緩衝液で溶離
し、そしてDNAポリメラーゼ活性を含有する分画をプー
ルした（分画IV）。

分画VIを50mMのトリス−Cl,pH7.5,1mMのEDTAおよび1mM
のDTTの中で50mMのKClに等しい導電性に調節した。この
試料を、同一緩衝液の中で平衡化した15mlのヘパリン−
セファローズのカラムに適用（9ml/時で）した。このカ
ラムを同一緩衝液で約14ml/時（3.5カラム体積）で洗浄
し、そして同一緩衝液中の150mlの0.05〜0.5MのKClで溶
離した。DNAポリメラーゼ活性は0.11〜0.22MのKClの間
で溶離された。pTma15でエンコードされた修飾Tma DNA
ポリメラーゼを含有する分画をプールし、濃縮し、そし
て2.5×貯蔵緩衝液（50mMのトリス−Cl,pH8.0,250mMのK
Cl,0.25mMのEDTA,2.5mMのDTTおよび0.5％のツイーン2
0）に対して透析濾過し、引き続いて1.5体積の無菌の80
％（w/v）のグリセロールを混合し、そして−20℃にお
いて貯蔵した。必要に応じて、ヘパリンセファローズ溶
出のDNAポリメラーゼまたはフェニルセファローズ溶出
のDNAポリメラーゼを透析するか、あるいは50mMのトリ
ス−Cl,pH7.5,1mMのDTT,1mMのEDTAおよび0.2％のツイー
ン20の中で50mMのKClに等しい導電性に調節し、そして
同一の緩衝液の中で平衡化したアフィゲルブルーカラム
に適用（1mgのタンパク質/mlの樹脂）することができ
る。このカラムを３〜５カラム体積の同一緩衝液で洗浄
し、そして10カラム体積の同一緩衝液中のKClの勾配
（0.05〜0.8M）で溶出した。DNAポリメラーゼ活性（0.2
5〜0.4MのKClの間で溶出する）を含有する分画をプール
し、濃縮し、透析濾過し、そして上のように貯蔵した。

種々のDNAポリメラーゼの相対的耐熱性を比較した。97.
5℃において、天然DNA Tmaポリメラーゼの半減期は天然
または組換えTaq DNA（すなわち、Amplitaq^R）ポリメラ
ーゼの半減期の２倍より大きい。驚くべきことには、ME
T284Tma DNAポリメラーゼの97.5℃における半減期は天
然Tma DNAポリメラーゼの半減期より３倍長い。

10mMのトリス−Cl,pH8.3および1.5mMのMgCl₂（Taqまた
は天然Tma DNAポリメラーゼについて）または3mMのMgCl
₂（MET284Tma DNAポリメラーゼについて）、50mMのKCl
（Taq、天然TmaおよびMET284Tma DNAポリメラーゼにつ
いて）またはKCl不含（MET284Tma DNAポリメラーゼ）、
0.5μＭの各プリマーPCR01およびPCR02,1ngのラムダ鋳
型DNA,200μＭの各dNTP（dCTPを除外する）、および４
単位の各酵素を含有するPCR管を97.5℃において大きい
水浴中で０〜60分間インキュベーションした。試料を経
時的に抜き出し、０℃において貯蔵し、そして５μｌを
残留活性についての標準の活性のアッセイにおいて75℃
において10分間測定した。

Taq DNAポリメラーゼは97.5℃において約10分の半減期
を有したが、天然Tma DNAポリメラーゼは97.5℃におい
て約21〜22分間の半減期を有した。驚くべきことには、
Tma DNAポリメラーゼのMET284の形態は、Taqまたは天然
Tma DNAポリメラーゼのいずれより有意に長い半減期（5
0〜55分）を有した。MET284Tma DNAポリメラーゼの改良
された耐熱性は、PCRにおける、とくにＧ＋Ｃに富んだ
標的が増幅困難である場合に用途を見いだすであろう。
なぜなら、標的およびPCR生成物の配列の完全な変性に
要求される鎖単離の温度は酵素の不活性化に導くからで
ある。

50μｌの10mMのトリス−Cl,pH8.3,3mMのMgCl₂,20μＭの
各dNTP,0.5ngのバクテリオファージラムダのDNA,0.5μ
ＭのプライマーPCR01,4単位のMET284Tma DNAポリメラー
ゼおよび0.5mMのプライマーPCR02またはPL10を含有する
PCR管を、１分間の96℃のＴ（変性）および２分間の60
℃のＴ（アニーリング−伸長）を使用して25サイクルを
サイクルした。ラムダDNA鋳型、デオキシヌクレオチド
のストック溶液、並びにプライマーPCR01およびPCR02
は、PECI Gene Amp^Rキットの一部であった。プライマー
PL10は配列：（配列番号:45）５′−GGCGTACCTTTGTCTCA
CGGGCAAC−３′を有し、そしてバクテリオファージラム
ダのヌクレオチド8106−8130に対して相補的である。

プライマーPCR01およびPCR02は、ラムダからの500bpの
生成物を増幅する。プライマー対PCR01およびPL10はラ
ムダからの1kbの生成物を増幅する。それぞれのプライ
マーの組を使用して増幅した後、５μｌのアリコートを
アガロースゲルの電気泳動にかけ、そして特定の意図す
る生成物のバンドを臭化エチジウムの染色で可視化し
た。豊富なレベルの生成物が両者のプライマーの組で発
生し、MET284Tma DNAポリメラーゼは意図する標的配列
を首尾よく増幅したことを示す。

実施例７ 切頭Tmaポリメラーゼの発現 上に記載したように、完全なTma DNAポリメラーゼ遺伝
子のコード配列を含有するプラスミドで形質転換された
宿主細胞は、短縮された形態（MET140）のTmaポリメラ
ーゼを単独または全長のポリメラーゼと一緒に発現す
る。変異を行って、発現されるポリメラーゼの形態をコ
ンロールすることができる。ポリメラーゼのMET140の独
占的な発現を増強するために、139までのアミノ酸に相
当するコード領域を発現ベクターから欠失した。このよ
うに欠失を構成するプロトコルは実施例６に記載されて
いる構成に類似する：短縮された遺伝子断片を切り出
し、次いで全長の断片が切除されているベクターの中に
挿入する。しかしながら、短縮された断片は、制限消化
物から精製するよりむしろPCR増幅生成物として得られ
る。この方法は有用な場合に新しい上流制限部位（また
は他の配列）の組込みを可能とする。

位置140におけるメチオニンのコドンまでの領域を欠失
するために、SphI部位をpTma12−１およびpTma13中にPC
Rを使用して導入した。位置140のメチオニンのコドンの
ちょうど上流にSphI部位を導入するように、前方プライ
マー（FL63）を設計した。位置624にXbaIを含むよう
に、逆プライマー（FL69）を選択した。SmaIで線状化し
たプラスミドpTma12−１をPCR鋳型として使用して、225
bpのPCR生成物を生成した。

消化の前に、PCR生成物をPCR反応混合物の50μg/mlのプ
ロテイナーゼＫ＋0.5％のSDSおよび5mMのEDTAで処理し
た。37℃において30分間インキュベーションした後、プ
ロテイナーゼＫを68℃で10分間加熱不活性化した。この
手順は、引き続く制限消化を阻害しうる生成物に結合し
たTaqポリメラーゼを排除した。緩衝液をTE緩衝液に交
換し、そして過剰のPCRプライマーをセントリコン（Cen
tricon）100マイクロコンセントレーターで除去した。

増幅された断片をSphIで消化し、次いでクレノールで処
理して、SphI切断した末端に平滑末端をつくり、そして
最後にXbaIで消化した。生ずる断片を、NcoIで消化した
プラスミドpTma13（pTma12−１が適当であったであろ
う）と結合し、クレノーで修復し、次いでXbaIで消化し
た。この連結は、最初のNcoI部位（コード配列の第１メ
チオニンから上流）と導入されたSphI部位（位置140に
おけるメチオニンコード配列から上流）との間の領域が
除去されたインフレームのコード配列を生じた。生ずる
発現ベクターをpTma16と表示した。

この実施例において使用したプライマーを下および配列
のリストの節に記載する。

実施例８ MET140発現ベクター中の望ましくないRBSの排除 Tma DNAポリメラーゼのMET140の形態の少い発現は、位
置140のメチオニンのコドンから上流のリボソーム結合
部位（RBS）を排除することによって達成することがで
きる。オリゴヌクレオチド部位特異的変異誘発により排
除した。遺伝コードの冗長性の利点を利用して、コドン
の第３位置を変化して核酸配列を変更し、これにより、
コードされたタンパク質のアミノ酸配列を変化しない
で、RBSを排除することができる。

修飾された配列を含有する変異原プライマー（FL64）を
合成し、そしてリン酸化した。一本鎖pTma09（NcoI部位
を有する全長クローン）を、ストラタジーン（Stratage
ne）から商業的に入手可能な、ヘルパーファージR480で
同時感染することによって調製した。一本鎖pTma09およ
びpBS13＋のPvuII消化からの大きい断片の「ギャップド
二重鎖（gapped duplex）」を、２つのプラスミドを混
合し、２分間沸騰加熱しそして65℃に５分間冷却するこ
とによって作った。次いで、リン酸化したプライマーと
「ギャップド二重鎖」とを、混合、２分間の80℃への加
熱および引き続く室温へゆっくりした冷却によりアニー
リングした。残留するギャップをクレノーを使用する伸
長により満たし、そして断片をT4DNAリガーゼにより連
結した。両反応を標準的塩類中200mMの各dNTPおよび40m
MのATPの中で37℃において30分間実施した。

生ずる環状断片をDG101に、ニトロセルロースフィルタ
ー上でプレート形質転換により形質転換した。二重反復
実験のファルターをつくり、そして正しいプラスミドの
存在をγ³²P−リン酸化プローブ（FL65）でプロービン
グすることによって検出した。生ずるベクターをpTma19
と表示した。

pTma19からのPBSを含まない部分を、NcoI/XbaI断片のス
イッチによりpTma12−１中にクローニングした。プラス
ミド19をNcoIおよびXbaIで消化し、そして620bpの断片
を、上の実施例７におけるように、電気泳動により精製
した。pTma12−１をNcoI,XbaIおよびXcmIで消化した。X
cmIによる切断は、引き続く連結工程のためにPBS＋断片
を不活性化し、これは「粘着」末端の連結に適当な条件
下に実施される（希いリガーゼおよび40mMのATP）。最
後に、発現のために、連結生成物をDG116宿主細胞の中
に形質転換し、そしてpTma19−PBSと表示する。

この実施例において使用したオリゴヌクレオチド配列を
下記および配列表の節に記載する。

実施例９ 切頭Tma DNAポリメラーゼMET ASP21の発現 Tma DNAポリメラーゼ遺伝子のコード配列の位置21にお
けるアスパラギン酸のコドン付近において翻訳を開始す
るために、このコドンの前にメチオニンのコドンを導入
し、そして最初のNcoI部位からこの導入されたメチオニ
ンのコドンまでの領域を欠失させる。欠失の方法は、前
述の同一の下流プライマー（FL69）、および570bpの生
成物を生ずるためにNcoI部位およびメチオニンのコドン
組込むように設計した上流プライマー（FL66）を使用す
る手順を包含する。

増幅された生成物をセントリコン（Centricon）−100マ
イクロコンセントレーターで濃縮して、過剰のプライマ
ーおよび緩衝液を排除した。生成物をスピード・バク
（Speed Vac）濃縮装置で濃縮し、次いで消化混合物の
中に再懸濁させる。増幅した生成物をNcoIおよびXbaIで
消化する。同様に、pTma12−1,pTma13またはpTma19−RB
Sを同じ２つの制限酵素で消化し、そして増幅断片の消
化物と消化した発現ベクターとを連結した。生ずる構成
体は、天然Tmaコード配列の開始コドンから上流のNcoI
部位から、天然Tmaコード配列の位置21のアスパラギン
酸のコドンから上流に導入された新しいメチオニンのコ
ドンまでの欠失を有する。

同様に、翻訳の開始が天然Tmaコード配列の位置74のグ
ルタミンのコドンGlu74において開始するように、欠失
の変異体をつくることができる。メチオニンのコドンお
よびNcoI部位をClu74の前に導入するように上流プライ
マー（FL67）を説明する。使用する下流プライマーおよ
びクローニングのプロトコルは、MET ASP21構成体につ
いて前述した通りである。

この実施例において使用した上流プライマーの配列を下
記および配列表の節に記載する。

実施例10 T7プロモーターをもつ発現ベクター 発現の効率は、発現ベクター中のプロモーターおよび／
またはリボソーム結合部位（RBS）を変化することによ
って変更することができる。T7遺伝子10のプロモーター
およびRBSを使用して、発現ベクターpTma17からのTma D
NAポリメラーゼの発現を推進し、そしてT7遺伝子10のプ
ロモーターおよび遺伝子ＮのRBSを使用して、発現ベク
ターpTma18からのTma DNAポリメラーゼの発現を推進し
た。これらのベクターの構成は、pTma12−１中に存在す
るユニーク制限部位：プロモーターから上流のAflII部
位、RBSから下流のNcoI部位、およびプライマーとRBSと
の間のBspE1部位を利用した。存在するプロモーター
を、前の実施例に記載する技術に類似する技術を使用し
て、pTma12−１から切除しそして合成T7遺伝子10プロモ
ーターと置換した。

２つのオーバーラッピングする合成オリゴヌクレオチド
から合成インサートをつくった。pTma7（T7遺伝子10のR
BSをもつ）をつくるために、等しい比率のFR414およびF
R416を混合し、加熱沸騰させ、そして室温にゆっくり冷
却した。ハイブリダイゼーションしたオリゴヌクレオチ
ドをクレノーで伸長して、全長の二本鎖のインサートを
つくった。次いで伸長した断片をAflIIおよびNcoIで消
化し、適当な「粘着」末端を残した。インサートをAflI
IおよびNcoIで消化したプラスミドpTma12−１中にクロ
ーニングした。DG116宿主細胞を生ずるプラスミドによ
り形質転換し、そして形質転換体を所望のプラスミドに
ついてスクリーニングした。

同一手順をpTma18（遺伝子ＮのRBSをもつ）の作製にお
いて使用したが、ただし、FR414およびFR418を使用し、
そして伸長した断片をAflIIおよびBspE1で消化した。こ
のDNA断片を、AplIIおよびBspE1で消化したプラスミドp
Tma12−１中のP_Lプロモーターと置換した。

プラスミドpTma17およびpTma18を使用して、誘発可能な
T7DNAポリメラーゼ遺伝子を含有するように修飾された
大腸菌（Ｅ．coli）宿主細胞を形質転換する。

これらのベクターの構成において使用したオリゴヌクレ
オチドを下記および配列表の節に記載する。

実施例11 翻訳カップリング 前述したように、タンパク質のためのコード配列の開始
部位のちょうど上流に短いコード配列をカップリングす
ることによって、翻訳カップリングはタンパク質の発現
の効率を増加することができる。上流のコード配列の翻
訳の停止は、下流のコード配列のための開始部位に密接
に近接してリボソームの残す。上流のコード配列は、所
望のタンパク質のためのコード配列の開始に対して下流
にリボソームを動かす機能のみをする。

翻訳的にカップリングしたTmaの発現ベクターを構成
し、そしてこの発現ベクターはTmaコード領域の上流に
位置する大腸菌（Ｅ．coli）のTrpEの最後の６コドンに
対してインフレームで融合したT7バクテリオファージの
主要キャプシドタンパク質（遺伝子10）の最初の10コド
ンおよび翻訳開始シグナルを有した。TrpEのためのTGA
（停止）コドンとTma遺伝子のためのATG（開始）コドン
とを「カップリング」して、配列TGATGを形成する。短
いコード配列の翻訳とTmaコード配列の翻訳との間に、
１塩基のフレーム−シフトが要求される。

下記の実施例において、T7遺伝子10−大腸菌（Ｅ．col
i）TrpE/TrpD融合生成物を含有する断片（TrpEからの最
後の６コドンおよびTGA停止コドンならびにTrpDからの
オーバーラップするATG開始コドン）は、前以て存在す
るプラスミドから転移された。当業者は認識するよう
に、翻訳的にカップリングした発現ベクターの構成にお
いて使用したT7遺伝子10−大腸菌（Ｅ．coli）TrpE/Trp
D融合生成物は合成オリゴヌクレオチドとして構成する
ことができる。挿入された断片のための配列を下記およ
び配列表の節に記載する。

T7遺伝子10−大腸菌（Ｅ．coli）TrpE/TrpD融合生成物
を、プラスミドpSYC1868からプライマーFL48およびFL49
を使用して増幅した。プライマーFL51およびFL53では、
pTma08（NdeI部位を含有する全長クローン）中のTma Po
lI遺伝子の５′末端を、ATG開始コドンからATG開始コド
ンの下流のMroI部位まで増幅した。オーバーラッピング
領域を残し、こうして本質的に実施例10に記載するよう
にして２つの増幅された生成物をアニーリングしそして
伸長することができるようにプライマーFL51およびFL49
を設計した。２つの増幅生成物を混合し、95℃に加熱
し、室温にゆっくり冷却し、そしてTaqポリメラーゼで
伸長した。

伸長されたインサートをプライマーFL48およびFL53で増
幅し、次いでXmaIおよびMroIで消化した。プラスミドpT
ma12−１をMroIで消化し、そして仔ウシ腸アルカリ性ホ
スファターゼで処理して再連結を防止した。消化したpT
ma12−１をインサートと連結した。生ずる構成体でDG11
6宿主細胞を形質転換し、そして形質転換体を所望のプ
ラスミドDNAについてスクリーニングした。生ずるベク
ターをpTma20と表示した。

オリゴヌクレオチドプライマーおよびT7遺伝子10−大腸
菌（Ｅ．coli）TrpE/TrpD融合生成物（遺伝子10のイン
サート）の配列を下記および配列表の節に記載する。

実施例12 ArgUtRNAの発現 コドンの使用のパターンは、サーモタガ・マリチマ（Th
ermotoga maritima）と大腸菌（Ｅ．coli）との間で異
なる。Tmaコード配列において、アルギニンは「AGA」コ
ドンにより最も頻繁にコードされるが、このコドンは大
腸菌（Ｅ．coli）宿主細胞の中で低い頻度で使用され
る。対応する「ArgU」tRNAは大腸菌（Ｅ．coli）におい
て低い濃度で現れる。宿主細胞中のArgtRNAの低い濃度
はTmaポリメラーゼ遺伝子の翻訳効率を制限することが
ある。大腸菌（Ｅ．coli）宿主内のTmaコード配列の翻
訳効率は、「ArgU」tRNAのための遺伝子を含有する第２
発現ベクターを使用して、tRNA遺伝子の多数のコピーを
宿主細胞中にクローニングすることによって、このtRNA
種の濃度を増加することにより改良することができる。

ArgtRNA遺伝子を、プライマーDG248およびDG285を使用
して、大腸菌（Ｅ．coli）ゲノムDNAからPCR増幅した。
増幅生成物をSalIおよびBspH1で消化し、そして次にArg
U断片を消化したベクターと連結した。DG101細胞を形質
転換し、そして連結したベクターをpARG01と表示した。
最後に、DG116宿主細胞をpARG01およびpTma12−１によ
り同時形質転換した。

この実施例において使用したオリゴヌクレオチドのプラ
イマーを下記および配列表の節に記載する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 ストッフェル，スザンヌ アメリカ合衆国，カリフォルニア 94530, エル セリット，ガルビン ドライブ 935

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】次の性質を有する熱安定性DNAポリメラー
   ゼ： （１）ヌクレオシドトリホスフェートから核酸鋳型鎖に
   相補的な核酸鎖を形成する反応（ポリメラーゼ反応）を
   触媒する； （２）３′→５′エキソヌクレアーゼ活性を有する； （３）サーモトガ・マリチマ（Thermotoga maritima）
   に由来する； （４）SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測
   定した場合におそよ70kDa〜97kDaの範囲内に分子量を有
   する； （５）ポリメラーゼ反応のための至適温度は約75℃〜80
   ℃である；及び （６）ポリメラーゼ反応のための好ましいpHは約７〜９
   である。
2. 【請求項２】およそ97kDaの分子量を有し、５′→３′
   エキソヌクレアーゼ活性を有し、そして97.5℃において
   約21〜22間の半減期を有する、請求項１に記載の熱安定
   性DNAポリメラーゼ。
3. 【請求項３】次のアミノ酸配列（Ｉ）： から実質上成る請求項２に記載の熱安定性DNAポリメラ
   ーゼ。
4. 【請求項４】約86kDaの分子量を有する請求項１に記載
   の熱安定性DNAポリメラーゼ。
5. 【請求項５】次のアミノ酸配列（II）： から実質上成る、請求項４に記載の熱安定性DANポリメ
   ラーゼ。
6. 【請求項６】約70kDaの分子量を有し、５′→３′エキ
   ソヌクレアーゼ活性を実質的に有さず、97.5℃において
   50〜55分間の半減期を有する、請求項１に記載の熱安定
   性DNAポリメラーゼ。
7. 【請求項７】次のアミノ酸配列（III）： から実質上成る請求項６に記載の熱安定性DNAポリメラ
   ーゼ。
8. 【請求項８】サーモトガ・マリチマの培養により得られ
   る、請求項１〜３のいずれか１項に記載の熱安定性DNA
   ポリメラーゼ。
9. 【請求項９】遺伝子組換え法により得られる請求項項１
   〜７のいずれか１項に記載の熱安定性DNAポリメラー
   ゼ。
10. 【請求項１０】請求項１〜３のいずれか１項に記載の熱
    安定性DNAポリメラーゼの製造方法であって、該酵素を
    生産することができるサーモトガ・マリチマを培養し、
    培養物から該酵素を採取することを特徴とする方法。
11. 【請求項１１】請求項１〜８のいずれか１項に記載の熱
    安定性DNAポリメラーゼの製造方法であって、該酵素を
    コードするDNAを含んで成る発現ベクターにより形質転
    換された細菌宿主を培養し、該培養物から前記酵素を採
    取することを特徴とする方法。
12. 【請求項１２】１又は複数の非イオン性ポリマー洗剤を
    含んで成る緩衝剤中に請求項１〜８のいずれか１項に記
    載の熱安定性DNAポリメラーゼを含んで成る安定な酵素
    組成物。
13. 【請求項１３】請求項１〜８のいずれか１項に記載の熱
    安定性DNAポリメラーゼ又は請求項12に記載の熱安定性
    酵素組成物を使用することを特徴とする、核酸の増幅方
    法。
14. 【請求項１４】請求項１〜８のいずれか１項に記載の熱
    安定性DNAポリメラーゼ、又は請求項12に記載の熱安定
    性酵素組成物を含んで成る核酸増幅用キット。