JPH07108917B2 - 組換え肺胞表面活性物質蛋白 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の技術分野 本発明は，組換え蛋白質の産生の分野に関する。特に，
ある呼吸疾患の管理に有効な肺胞表面活性物質蛋白（AS
P）の産生に関する。

背景技術 人間の肺は，ガスを血液と肺の空積で交換する多数の小
さな気嚢或いは肺胞から成る。健康な個体では，この交
換はII型の肺胞細胞のミクロソーム膜で合成される表面
活性物質複合体を含む蛋白の存在により媒介される。こ
の複合体が適当なレベルで存在していないと，肺は正常
に機能できない，即ち肺胞は呼吸時につぶれ，吸入して
も続いて膨張できない。このように，この複合体の合成
不能性が治療されなければ死か或いは厳しい肉体的損傷
に至るかもしれない。

不十分な表面活性物質複合体レベルについて最もよく証
明されている例は，未熟児や複雑な妊娠後に生まれた新
生児で起こり，呼吸困難症候群（RDS）として広く知ら
れている。この症候群の広く公表されている種類は硝子
膜症，或いは特発RDSと呼ばれている。RDSは目下，合衆
国内，及び他の先進国内で新生児の死亡率および罹患率
を率いている原因であり，実質的な努力が診断及び治療
に向けられている。現行の治療は機械的に（圧力をか
け）新鮮な空気で浄化することに向けられており，これ
はせいぜい侵略的な穴埋め法であって，しばしば肺に対
する損傷や，気管支肺異形成，間質性気腫，及び気胸の
ような併発症を含む他の有害な副作用を生じる。精神的
な障害も，この治療を用いた際に生じる（Hallman,M.,e
t al.,Pediatric Clinics of North America（1982）2
9:1057-1075）。

表面活性物質を置換することによりこの症候群を治療し
ようとする限られた試みが成されている。これは，一般
的にはほんの一回だけの投与が必要であり，損傷の可能
性が減ずるという選ばれた方法であろう。例えば,Fujiw
ara,et al.,Lancet（1980）1:55−は，ウシ肺由来の蛋
白を抜いた表面活性物質調整物を用いた。調整物は効果
的ではあるが，免疫原である。Hallman,M.,et al,Pedia
trics（1983）71:473-482は，ヒト羊水より単離した表
面活性物質を用いて限られた数の新生児を治療するのに
ある程度成功した。ClementsのU.S.Patent 4,312,860
は，データは示していないがこのアプローチでは有効で
あると言われている，蛋白を含まない人為的な表面活性
物質を開示している。短的には，表面活性物質の置換は
医療で広くは使われていない。

好ましい表面活性物質置換体は，肺の表面活性物質複合
体それ自身であろう。この複合体は，アポ蛋白，多量に
ある２種のホスホリピド（ジパルミトイルホスホコリン
（DPPC）及びホスファチジルグリセロール（PG）），非
常に少量しかない数種の脂質成分，及びカルシウムイオ
ンから成る。アポ蛋白は,32,000ダルトンの桁の分子量
の蛋白と約10,000ダルトンの桁の非常に疎水性蛋白を含
む（King,R.J.et al.,Am J Physiol（1973）224:788-79
5）。32,000ダルトンの蛋白は糖化されており，ハイド
キシプロリンを含む。

表面活性物質の置き換え療法の発展が限定されている大
きな理由は，複合体の蛋白部分を利用することを欠いて
いたことである。置き換え治療は脂肪成分だけの使用の
試みに向けられており，そのような治療の功績はアポ蛋
白を加えることにより飛躍的に向上し得るようである
（Hallman,M.,et al.,Pediatric Clinics of North Ame
rica（1982）（前出））。しかし，現在，これらの蛋白
は正常な成人の肺，及び羊水からのみ入手できる。効果
的な分離手順によっても十分な供給物が提供されること
はなかろう。このように，単独で或いは複合体の飽和ホ
スホリピド部分と結合して使用するために，実用的な量
のアポ蛋白を生産する方法を可能にすることが望まし
い。

発明の開示 本発明は，多量に，しかもその特徴を最も効果的にする
条件で，肺の表面活性物質複合体のアポ蛋白部分を得る
手段を提供する。カルシウムイオンとともに，ジパルミ
トイルホスホコリン及びホスファチジルグリセロールと
いう複合体の残りの部分はすべてに容易に入手可能であ
る。操作可能なアポ蛋白が要求された量利用できること
になり，治療で使用し得る複合体を最も効果的にするた
めの研究努力が可能となり，呼吸困難症候群の型にはま
った置換治療の可能性が開かれる。

このようにある見地では，本発明は組換えて産生した哺
乳類の肺胞表面活性物質蛋白（ASP）に関する。これら
の蛋白は，比較的高分子，約32Kd（32K ASP）の比較的
水溶性の蛋白と，低分子で，約10〜20Kd（10K ASP）の
疎水性の蛋白との混合物である。カルシウムイオン存在
下でホスホリピドと複合体をつくると，両方の蛋白は，
被膜を抑える表面張力の形成を助長する。本発明はさら
に，ヒトとイヌの32Kと10KのASPを含む哺乳類のASPをコ
ードしているDNA配列，これらの蛋白を産生するのに適
した発現ベクター，これらのベクターで形質転換された
組換え宿主細胞，及び組換えATPとその前躯体を産生す
る方法に関する。他の見地では，本発明は，ヒトASPを
含む製薬成分及び，それらを使ってのRDSの治療の方法
に関係する。

図面の簡単な説明 第１図は，イヌ32K ASPをコードしているDNA配列を，推
定されたアミノ酸配列とともに示している。

第２図は，推定アミノ酸配列とともに，イヌ10K ASPを
コードしているcDNAに対して決定したDNA配列を示して
いる。

第３図は，ヒト32K ASP遺伝子のヌクレオチド配列と推
定アミノ酸配列を示している。

第４図は，λ:gHS-15でトランスフェクションしたCHO細
胞由来の³⁵S-Met標識分泌蛋白のオートラジオグラフィ
ーである。

第５図は,pHS-6に含まれるヒトASP cDNAの３′未端側の
配列を示している。

第６図は，推定アミノ酸配列とともに，ヒト10K ASPを
コードしているcDNAに対して決定したDNA配列を示して
いる。

第７図は，発現ベクターpASPc-SV（10）の関連した連結
部とコード配列を示している。

第８図は，発現ベクターpASPcg-SV（10）の関連した連
結部とコード配列を示している。

第９図は，発現ベクターpMT-Apo:gHS（HinfI/EcoRI）の
関連した連結部とコード配列を示している。

第10図は,pMT-Apo:gHS（HinfI/EcoRI）でトランスフェ
クションしたCHO細胞により分泌され,endoF.で処理した
或いは処理していない，³⁵S標識上清蛋白で行ったSDS P
AGEの結果を示している。

第11図は,pMT-Apo:gHS（HinfI/EcoRI）でトランスフェ
クションしたCHO細胞により分泌され,endoF.で処理した
或いは処理していない，上清蛋白で行った，ヒト標識抗
ASPによりイムノブロットしたSDS PAGEの結果を示して
いる。

第12図は，ホスホリピドで抑えた表面張力を高めるため
にASPの能力をin vitroで決定した結果である。

第13図は、ヒト32K成熟ASPの推定アミノ酸配列を示して
いる。

本発明の実施態様 A.定義 ここで用いているように，“肺胞表面活性物質蛋白質
（ASP）”は，肺の表面活性物質複合体に関連し，以下
で定義するようなASP活性を待つ，アポ蛋白を指す。調
べた全種のASPは，ここで“32K ASP"と表している比較
的高分子量（32Kdという桁）の１つ以上の成分と，ここ
で“10K ASP"と表している比較的低分子量（10〜20Kdと
いう桁）の１つ以上の全く疎水的な成分とを含む（Kin
g,R.J.,et al,J Appl Physiol(1977)42:483-491;Phizac
kerley,P.J.R.Biochem J（1979）183:731-736）。この
用語は，天然の配列及びそれと等価な修飾物を指す。例
えば，ヒト32K ASPは，第３図で示したアミノ酸配列を
有する。イヌ，サル，あるいは他の哺乳動物のような他
の種に由来する約32KdのASP蛋白は，この配列と実質的
な程度の相同性を持つ（イヌのASPと関連して第１図を
見よ）。他の特別な32K ASP（イヌ）および10K ASP（ヒ
トおよびイヌ）の追加の配列を以下に開示する。

本発明の組換えASP蛋白は，本来の蛋白に対応するアミ
ノ酸配列を持つ。しかしながら，限定された修飾は活性
を破壊することなしに行われ得ること，および完全な１
次構造の一部分だけが，必要であり得ること，が理解さ
れている。例えば，本発明のヒトASP32K組換え蛋白は，
第３図で示したのと実質的に同様のアミノ酸配列を有す
るが，活性を破壊しないこの配列の軽い修飾も,32Kヒト
ASPの定義内に，さらに以下で示すような特許請求した
蛋白の定義内にある。活性を有する第３図の完全な配列
を持つ断片も定義内に含まれる。

全ての蛋白の場合と同様に,ASP蛋白は調製様式或いはも
し溶液状態ならばその環境により，中性の形態，或いは
塩基性或いは酸性の付加した塩の形態，で存在できる。
一般的には蛋白，およびそれ故に特にどのASPでも，遊
離のアミノ基を含む酸性塩，或いは遊離のカルボキシル
基で形成される塩基性塩の形態で見出され得る。薬学的
に受け入れ可能な塩は，蛋白の機能性を確かに高め得
る。適当な薬学的に受け入れ可能な酸性塩は，例えば，
塩酸或いは硫酸のような無機酸により，或いは酢酸ある
いはグリコール酸のような有機酸により，形成されたも
のを含む。薬学的に受け入れ可能な塩基は，水酸化カリ
ウム或いは水酸化ナトリウムのようなアルカリ水酸化
物，或いはピペリジン，グルコサミン，トリエチルアミ
ン，コリン或いはカフェインのような有機塩基，を含
む。加えて蛋白は，脂質や糖のような他の生物学的物質
との組み合わせにより，或いはアミノ基のアセチル化，
水酸基側鎖のリン酸化或いはスルフヒドリル基の酸化の
ような側鎖の修飾，或いはコードされている一次配列の
他の修飾により，修飾される。確かに，その本来の形態
では32K ASPは糖化された蛋白であり，コードされてい
るあるプロリン残基はヒドロキシプロリンに変換されて
いる。それはまた，ホスホリピドDPPCとPGに関連して見
出されている。糖化あるいは非糖化の形態，ヒドロキシ
ル化或いは非ヒドロキシル化された形態，アポ蛋白のみ
のもの，或いは脂質で関連したもの，要するに，血液と
肺の空積間でガスの交換を促し肺胞を再膨張させること
のできる能力を保持している本来の配列と実質的に同様
なアミノ酸配列を有するあらゆる組成物が，ここではあ
らゆるASPの定義内に含まれる。

一次アミノ酸配列の小さな修飾により，本来の配列に比
べて実質的に同等の或いは高められた活性を待つ蛋白に
なり得る。これらの修飾は，部位指定変異により生ずる
故意的なものであるが，或いは,ASPを産生する生物宿主
の変異のような偶然的なものかもしれない。これらの修
飾の全ては,ASP活性が保持されている限り，含まれる。

蛋白の“ASP活性”は，単独或いは他の蛋白と組合せて
脂質を組合せたとき,Robertson,B.Lung（1980）158:57-
68のin vivo検定において活性を示す能力として定義さ
れる。この検定では，調べる試料は，帝王切開により早
産させたウサギ或いは子羊に気管を通じて投与する。
（これらの“未熟児”は自身のASPを欠いており，通風
装置上で維持している。）肺の受け入れ，血液中のガス
および通風装置の圧力の測定は，活性の指標を供する。
活性の予備的な査定は,in vitroの検定，例えば,King,
R.J.,et al.Am J Physiol（1972）223:715-726のもの，
或いは蛋白をホスホリピド小胞調製物と混ぜたときの空
気−水面界での表面張力の明瞭な測定を利用する,Hawgo
od,et al.の下に示すようなもの，を用いても行える。

“作動可能なように連関している”は，成分をその有効
な機能を果たせるように形造った連けいを指す。このよ
うに，コード配列に作動可能なように連関している制御
配列は，コード配列の発現を行うことができる。

“制御配列”は，所望のコード配列に正しく連結した場
合，そのような配列と和合可能な宿主でその発現を行う
ことのできるDNA配列のことを指す。そのような制御配
列は，原核生物および真核生物の宿主のいずれのプロモ
ーターも含み，原核生物ではリボゾーム結合部位配列，
また真核生物では終止シグナルも含む。発現を行うのに
必須な或いは約に立つ付加的な因子は，続いて確認し得
る。ここで用いたように，“制御配列”は単に，用いた
特別な宿主で発現を行うのに必要であるDNA配列になら
どのようなものをも指す。

“細胞",“組換え宿主細胞”或いは“宿主細胞”は，前
後関係で明瞭ならば，しばしば互換性をもって使用す
る。これらの用語は直接被験細胞，およびもちろんその
子孫を含む。全ての子孫は，偶然的な変異あるいは環境
による違いのため，その親細胞と正確に同じであるとは
限らないことが理解されている。しかし，そのような変
化した子孫も，上記の用語が用いられる場合，含まれ
る。

B.一般的記述 ASPをコードしているDNA配列を得るために下に説明した
方法は単に説明のためであり，また，使用される方法の
代表的なものである。しかしながら，当該分野で理解さ
れているような他の方法もまた用いられている。

B.1.表面活性物質複合体の性質 肺の肺胞表面は，多くの技術を用い多数のグループによ
り広く研究されている。肺胞の基礎膜はＩ型およびII型
の肺胞細胞から成り,II型細胞は表面のおよそ３％を占
めていると考えられている。II型細胞は基礎膜を覆う内
面液層の物質の外分泌をつかさどっており，この物質は
内面の液層と含有容量中の気層との間の表面張力を減少
させている。そこで，液層は，肺胞の毛細血管の血漿か
ら由来している水，およびII型細胞の表面活性物質の分
泌物とから成っている。

II型細胞は，それ自体,1細胞あたり60〜100pgの蛋白お
よび約1pgのリン脂質を含んでおり,II型細胞のDPPCとリ
ン含有PGの割合は約８対１である。アポ蛋白成分の研究
は様々な肺洗浄物に基づいており，上に述べたように，
分子量が約10〜20Kdおよび32Kdの主に２つの蛋白を含む
ことが示されている（Kikkawa,Y.,et al.Laboratory In
vestigation（1983）49:122-139）。アポ蛋白がホスホ
リピド成分と結合しているか（King,R.J.,et al.Am Rev
Respir Dis（1974）110:273），していないか（Shell
y,S.A.,et al.J Lipid Res（1975）16:224）ははっきり
していない。

イヌの肺洗浄物から得られゲル電気泳動で分離された分
子量の大きい方の蛋白は，分子量が29,000,32,000およ
び36,000ダルトンの３つの主な成分から成ることがわか
った（1984年10月26日に提出され，本出願人に譲渡さ
れ，参考文献としてこの中に編入されている米国出願番
号665,018を参照）。32,000ダルトンの蛋白は，下に述
べるように，シークエンスデータを得るために用いられ
た。しかしながら，これら３つの蛋白は全て，同一のＮ
末端配列を持っており，それらは糖付加程度だけにより
異なっていることが確かめられている。36Kdと32Kdのバ
ンドを，炭水化物側鎖を除去するエンドグリコシダーゼ
F.で分解すると,29Kdの成分と同じ移動度を持つ産物を
得た。29Kd成分の移動度は，この処理によっても影響は
なかった。32Kdの断片は,2量体および３量体になるこも
わかっている。

分子量の小さい方の蛋白は，より困難はあるが，抽出さ
れており，これらもまた混合物のようである（Phizacke
rley,et al（前出）；以下に記述）。

B.2.イヌおよびヒトASP蛋白のコード配列のクローニン
グ イヌおよびヒトのASP32K蛋白をコードしている配列全体
をクローニングし，以下のＣ節に示すように，これらは
種々の宿主細胞における発現に対して有効である。加え
て，ヒトおよびイヌの両方の供給源から，いくつかの低
分子量蛋白をコードしているDNA配列も得られた。

イヌの32K配列は，成犬の肺から分離されたmRNAから調
製されたcDNAライブラリーから,2組の合成オリゴヌクレ
オチドをプローブとして得られた。１つはＮ末端配列の
１から５番目のアミノ酸をコードする可能性がある配列
全てに合わせるように調製し，もう１つはその配列の７
から11番目のアミノ酸をコードするように調製した。同
様に，哺乳動物のコドン選択性を基にして選択した,1か
ら５番目のアミノ酸をコードする単一の15マーも調製し
た。エセリシア・コリー（E.coli）中で構築されたライ
ブラリーからの固定化cDNAをこれらのオリゴヌクレオチ
ドのセットを用いて検索した。偽陽性のものは,1組より
多いセットに対し，ハイブリダイゼーションを行うこと
によって最小となるようにした。うまくハイブリダイズ
するクローンは配列決定を行い,1つは正しいＮ末端配列
を含むことがわかった。

成功したクローンからPstIで分解して得られたcDNA挿入
物は，次いで，もとのイヌcDNAライブラリーのプローブ
として用い，結果として,ASPの他の領域をコードしてい
る挿入物を含む２つのクローンがさらに得られ，それら
はこのプローブと合わせてイヌ32K ASPの完全なコード
配列を含む844ヌクレオチドにわたっていた。３つの適
当な挿入物の全体のヌクレオチド配列，およびそれから
推定される256アミノ酸配列を第１図に示した。

上記で使われた，この同じ起源から得られたＮ末端コー
ド断片を，再びプローブとして用いて，λファージシャ
ロン28中でヒトゲノムライブラリー由来の断片を得た。
ヒトASP 32K蛋白の全体をコードしている配列が単一の
ファージプラーク中に含まれ,2つの隣接したBamHI断片,
5′側の1.2Kb断片と３′側の3.5Kb断片，の中に含まれ
ることがわかった。ヒトASPをコードし,3つのイントロ
ンを含むこれらの断片の適当な領域を第３図に示す。そ
れから推定されるヒトASPのアミノ酸配列は228アミノ酸
を含み，先頭に少なくとも25アミノ酸のシグナル配列が
あった。蛋白の全長に対応するヒト32K ASPのcDNAもま
た，ヒト胎児と成人の肺のmRNAに由来するヒトcDNAライ
ブラリーを検索することによって得られた。

広範囲での相同性がイヌとヒトの32Kアミノ酸配列の間
で存在した。

同様の方法が，続いて，ヒトおよびイヌの10KASPをコー
ドするcDNAを得るために用いられた。上記のイヌの肺・
cDNAライブラリーを16.5Kd（還元していないゲル上で）
のイヌ蛋白のＮ末端アミノ酸配列と一致するように作ら
れた２つの合成オリゴマーの混合物を用いて検索し，両
方のプローブに対してハイブリダイズするクローンを回
収し，配列決定した。これらのクローンのうち１つは，
イヌASPをコードしている配列を含んでいるが，これを
成人の肺から分離したmRNAからバクテリオファージgt10
中で調製されたcDNAライブラリーを検索するために用い
たところ，ヒト10KASPをコードするクローンが得られ
た。

B.3.ASPの発現 種々のヒト及びイヌのASPをコードしているヌクレオチ
ド配列が，今有効であることがわかったので，これらを
Ｃ節に記載の種々の系で発現させた。もし原核生物の系
を用いる場合，イントロンのないコード配列が適当な制
御配列とともに用いられる。上記ASP蛋白のいずれに対
するcDNAクローンも適当な制限酵素で切り，このような
発現のための原核生物ベクターに連結した。ASPのゲノ
ムDNAの原核生物での発現では,DNAは，イントロンを除
くために，部位指定変異によって，或いはcDNA領域を取
ってきてイントロンを含むゲノム配列の代わりにそれら
を用いることによって，修飾を加える必要がある。その
イントロンのないコードDNAを，次に，原核生物での発
現のための発現ベクターに連結した。

以下に例示するように,ASPをコードしている配列はま
た，イントロンをプロセッシングできるような発現系，
普通は，哺乳動物宿主細胞培養で直接使われる。このよ
うな発現を行うため，ゲノム配列を,CHO細胞中でこれら
の配列の発現を調節する制御可能な哺乳動物プロモータ
ーの下流に連結することができる。

B.4.蛋白の回収 ASP蛋白は，成熟蛋白又は，融合蛋白として生産された
り，あるいは分泌のためにシグナル配列をプロセッシン
グできるような細胞中でこの配列を持った蛋白として生
産される。蛋白の分泌を獲得することは有効なことで，
それは精製時の困難を最小にするからである。従って，
適当なプロセッシングができるような細胞で，本来のシ
グナル配列のコドンを含むヒトASP遺伝子を発現させる
ことが好ましい。培養哺乳動物細胞は，シグナル配列を
含む異種の哺乳動物蛋白を切断，プロセッシングし，そ
れらを培地中に分泌できることが示されている。（McCo
rmick,F.,et al,Mol Cell Biol（1984）4:166） 培地中に分泌されると,ASP蛋白は，一般的な蛋白精製技
術を用い回収される。精製過程は簡単で，なぜなら培地
中には比較的わずかな蛋白しか分泌されないし，分泌さ
れた蛋白の大部分は，それゆえ，すでにASPであるから
である。しかしながら，方法はもっと苦労するが，この
蛋白を細胞内で融合又は成熟な形で産生した細胞の超音
波破砕物又は溶解物から精製することも当該分野で既知
の方法である。

B.5.ASP活性の測定 in vitroでの方法が，表面張力を減少させる（表面圧力
の増加と同じ意味）ことによる機能について，また水／
気体界面の膜形成について,ASP蛋白の能力を評価するた
めに，考え出された。これらの方法を用いた研究は分離
された天然の10KイヌASPに関して行われてきた。（Bens
on,B.J.,et al Prog Resp Res（1984）18:83-92;Hagwoo
d,S.,et al,Biochestry（1985）24:184-190） Tanaka,Y.et al,Chem Pharm Bull（1983）31:4100-4109
において，ウシ肺から得られた35Kd蛋白がDPPCの表面核
散を強めることを開示している。Suzuki,Y.,J Lipid Re
s（1982）23:62-69;Suzuki,Y.,et al,Prog Resp Res（1
984）18:93-100は，ブタ肺からとれた15Kd蛋白が同じ供
給源由来の脂質−蛋白複合体の拡散を強めることを示し
た。

in vivoでの表面活性物質複合体の機能は表面張力を減
少させるために気体／水界面で膜を形成することである
から,in vitroモデルにおける，このような表面での脂
質，あるいはリポ蛋白の拡散により生じる膜形成を高め
るASP蛋白の能力は明らかにその有効性と関連してい
る。

B.6.投与及び利用 精製蛋白は，幼児や成人の呼吸困難症の治療のために，
単独で，また投与に適当な製薬組成物と結合させて使用
することができる。本発明の組成物および蛋白産物は，
肺炎や気管支炎のような関連した呼吸疾患を治療する際
にもまた有効である。このような治療において使用する
ために，成分のどちらか，好ましくは32K成分を，単独
で或いはさらに好ましくはヒトのASPの10K成分と結合さ
せて，天然または合成の脂質と結合させて，表面活性物
質複合体を再構成した。その複合体は，約50％からほぼ
100％（wt/wt）の脂質および50％から１％以下のASPを
含んでいる。ただしASPは好ましくは複合体の５％から2
0％である。脂質部分は好ましくは,80％から90％（wt/w
t）がDPPCで，残りの部分は非飽和ホスファチジルコリ
ン，ホスファチジルグロセロール，トリアシルグリセロ
ール，パルミチン酸またはそれらの混合物である。複合
体は,ASP溶液と脂質リボゾーム懸濁液との混合により，
或いは脂質，蛋白質の溶液を界面活性剤または有機溶媒
存在下で混合することにより，再集合させる。界面活性
剤または溶媒は，その後，透析により除く。

複合体を再構成する際，肺洗浄物の天然の脂質成分を利
用し，脂質を適切な量のASP蛋白に添加することは可能
であるが，合成脂質の利用の方が明らかに好ましい。第
一に，十分な供給物があるということで，これは明白な
ことである。第二に，調製品の純品さ，および伝染性蛋
白を含む外来蛋白，これは天然の脂質を分離してくる肺
に存在するものであるが，による汚染がないこと，は合
成品に関してのみ確かなことである。もちろん，有効な
複合体の再構成は，合成成分を用いるとより難しくな
る。

32KヒトASPを組成物の蛋白成分として単独で用いるより
も,32Kと10Kの蛋白と組合せた方が好ましい。蛋白の割
合は，典型的には,32K:10Kでは80:20の範囲内である。3
2K蛋白は，水溶液中のホスホリピド水胞水性懸濁液に直
接加える；何故なら10K蛋白は非常に疎水性であるの
で，この蛋白がクロロホルムのような有機溶媒中の脂質
に加えられ，溶媒を蒸発させ，そして小胞が水和により
再形成される。

複合体を含む組成物は，好ましくは，気管内投与に適す
るものである。すなわち，概して，液状懸濁液，乾燥粉
末“ちり”あるいはエアロゾルのようなものである。直
接的気管内投与として，複合体を，例えば水，生理食塩
水，デキストロース或いはグリセロールなどの適当な賦
形剤とともに液中に懸濁する。組成物は,pH緩衝剤のよ
うな無毒の補助物質，例えば酢酸ナトリウムやリン酸ナ
トリウムなどを少量含んでもよい。“ちり”を調製する
ために，上記のように随意混合した複合体を凍結乾燥
し，乾燥粉末として回収する。

エアロゾル投与で使用する場合には，複合体を付加的な
界面活性剤や推進剤とともに細かく分離した形で供給す
る。投与される一般的な界面活性剤は，脂肪酸やエステ
ルであるが，しかしながら，今回の場合は，表面活性物
質複合体の他の成分であるDPPCやPGを利用することが好
ましい。有効な推進剤としては，一般的に，密閉した条
件での気体で，圧縮下で凝縮させる。低級アルカンや，
フレオンのようなフッ化アルカンが使われる。エアロゾ
ルは，成分が放出されるまで圧縮下で維持できるよう
に，適当な弁を備えた容器の内に詰めておく。

表面活性物質複合体は，投薬の形に合うように，気管チ
ューブ，エアロゾル投与，吸入気体中への懸濁物また
は，“ちり”の霧状化により，投与する。複合体は約0.
1mgと10mgの間の量が一回の投与量となるよう投与す
る。新生児に使用する場合は一般的に１回の投与で十分
である。成人では，十分量の再構成複合体を投与して，
示された欠陥レベルを置き換える（Hallman,M.,et al.J
Clinical Investigation（1982）70:673-682）。

C.標準的な方法 細胞を形質転換するため，ベクターを構築するため，メ
ッセンジャーRNAを抽出するため,cDNAのライブラリーを
調製するために用いられるほとんどの技術およびその他
同種のものは，当該分野で広く行われており，ほとんど
の当業者は，特別な状件と操作を記述する標準的な手段
の資料をよく知っている。しかしながら便宜上，次の節
を指針として示す。

C.1.宿主と制御配列 原核生物系と真核生物系の両方を,ASPのコード配列を発
現するために用いている；原核生物宿主はクローニング
操作において最も好都合である。原核生物は，E.coliの
様々な株によって最もよく代表される；しかしながら，
他の微生物株もまた用いられる。複製部位と制御配列と
を含むプラスミドベクターは，用いられる宿主と和合性
の種から得られた；例えば，E.coliはpBR322,Bolivar,e
t al.Gene（1977）3:95によってE.coli種から得られた
プラスミド，の誘導体を用いて典型的に形質転換され
る。pBR322はアンピシリンとテトラサイクリン耐性のた
めの遺伝子を含んでおり，従って，所望のベクターを構
築する際に残しておくかあるいは壊すかすることのでき
る付加的なマーカーを供する。オペレーターを随意に有
し，加えてリボゾーム結合部位配列を伴う転写開始のた
めのプロモーターを含むとここで定義されている制御配
列は，ベーターラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）とラク
トース（lac）のプロモーター系（Chang,et al.Nature
（1977）198:1056），トリプトファン（trp）プロモー
ター系（Goeddel,et al.Nucleic Acids Res（1980）8:4
057）およびラムダ由来のP_LプロモーターとＮ−遺伝子
リボゾーム結合部位（Shimatake,et al.Nature（1981）
292:128）のような，一般に用いられるプロモーターを
含む。

バクテリアに加えて，酵母のような真核微生物もまた宿
主として用いることができる。サッカロマイセス・セレ
ビシェ（Saccharomyces cerevisiae）の研究室株である
Bakerの酵母が，たくさんの他の株が，一般に有用であ
るけれども，もっとも用いられる。例えば,Broach,J.
R.,Meth Enz（1983）101:307の複製の２μオリジン，或
いは他の酵母の和合性復製オリジン（例えばStinchcom
b,et al.Nature（1979）282:39,Tschempe,et al.Gene
（1980）10:157およびClarke,L,et al.Meth Enz（198
3）101:300参照）を使用するベクターが，用いられる。
酵母ベクターの制御配列は，解糖系酵素合成のプロモー
ターを含む（Hess,et al.J Adv Enzyme Reg（1968）7:1
49;Holland,等，Biochemistry（1978）17:4900）。当該
分野で知られている付加的なプロモーターには,3−ホス
ホグリセレート カイネース（Hitzeman,et al.J Biol
Chem（1980）255:2073）のプロモーターおよび他の解糖
系酵素のプロモーターが含まれる。他のプロモーター，
これは生育状況によって転写が制御されるという付加的
な有利点を持つのだが，はアルコール デハイドロゲナ
ーゼ 2,イソチトクローム C,酸ホスファターゼ，窒素
代謝に関与する分解酵素およびマルトースやガラクトー
ス利用に任のある酵素のプロモーター領域である。終止
配列がコード配列の３′末端にあることが望ましいこと
もまた信じられている。このようなターミネーターは，
酵母由来の遺伝子中のコード配列に続く３′非翻訳領域
に見いだされる。

もちろん，多細胞生物から得られた真核生物の宿主細胞
培養物中で，ポリペプチドをコードしている遺伝子を発
現することも，可能である。例えば，Tissue Cultures,
Academic Press,Cruz and Patterson,editors（1973）
を見よ。これらの系は，イントロンをスプライシングで
きるという付加的な利点を持ち，従って，ゲノム断片を
発現するために直接用いることができる。有用宿主細胞
系には,VERO,HeLa細胞およびチャイニーズハムスター卵
巣（CHO）細胞が含まれる。このような細胞のための発
現ベクターは，通常，プロモーターと，例えば一般に用
いられるシミアン ウィルス40（SV40）の早期プロモー
ターおよび後期プロモーター（Fiers,et al.Nature（19
78）273:113），或いはポリオーマ，アデノウィルス
2,ウシ パピローマ ウィルス或いは，鳥肉腫ウィルス
由来のプロモーターのような他のウィルス性プロモータ
ーのような，哺乳動物の細胞と和合性の制御配列を含
む。制御可能なプロモーターであるhMT II（Karin,M.,e
t al.Nature（1982）299:797-802）もまた用いることが
できる。哺乳動物細胞宿主系形質転換の一般的な面は,A
xelの米国特許番号4,399,216（特許日1983年８月16日）
に記載されている。“エンハンサー”領域が，発現を効
果的にするのに重要であることも現在では明らかであ
る。一般的に，これらは非コードDNA領域中のプロモー
ター領域の上流或いは下流に見られる。必要に応じて，
複製起点がウィルス源から得られる。しかしながら，染
色体への組み込みは，真核生物でのDNA複製と同じ機構
である。

C.2.形質転換 用いた宿主細胞に応じて，形質転換はその細胞に適切な
標準手法を用いて行われる。Cohen,S.N.,Proc Natl Aca
d Sci（USA）（1972）69:2110に記載されているような
塩化カルシウムによるカルシウム処理，或いは,Maniati
s,et al.,Molecular Cloning;A Laboratory Manual（19
82）Cold Spring Harbor Press,P254に記載のRbCl₂法
が，原核生物或いは，実質的な細胞壁の障壁を持つ他の
細胞用に用いられる。このような細胞壁のない哺乳動物
細胞には,Graham and van der Eb,Virology（1978）52:
546のリン酸カルシウム沈澱法を，随意に,Wigler,M.,et
al.Cell（1979）16:777-785により手直しされた通り
に，用いることができる。酵母への形質転換は,Van Sol
inger,P.,et al.J Bact（1977）130:946或いは,Hsiao,
C.L.,et al,Proc Natl Acad Sci(USA)（1979）76:3829
の方法に従って，行われる。

C.3.ゲノムライブラリーのcDNAの検索 cDNA或いはゲノムライブラリーは，コロニーハイブリダ
イゼーション操作を用いて選別される。各々のマイクロ
タイタープレートを二重のニトロセルロースフィルター
紙（Ｓ＆ＳタイプBA-85）へ写す。そしてコロニーを,15
μg/mlテトラサイクリンを含むＬ寒天上で,14〜16時間,
37℃で生育させる。コロニーを10％SDSで溶解させ，そ
のDNAを,500mM NaOH/1.5M NaClで５分，次いで,0.5Mト
リス塩酸（pH8.0）/1.5M NaCl,続いて２×標準クエン酸
塩含有食塩水（SSC），の連続処理によってフィルター
に固定する。フィルターは空気中で乾して,80℃で２時
間焼く。

ニックトランスレーションしたプローブの場合は，二重
のフィルターを,1フィルターあたり,DNAハイブリダイゼ
ーション緩衝液10ml（50％ホルムアミド（もし結合が弱
いなら,40％ホルムアミド）,5×SSC,pH7.0,5×デンハー
ト溶液（ポリビニルピロリドン，フィコールおよびウシ
血清アルブミン；各々１×0.02％）pH7.0の50mM,リン酸
ナトリウム緩衝液,0.2％SDS,50μg/ml,酵母tRNA,および
50μg/mlの変性，切断したサケ精子DNA）を用いて,42℃
で,16〜18時間プレハイブリタイブした。サンプルは，
この同じDNAハイブリダイゼーション緩衝液5mlに含まれ
る，ニックトランスレーションしたDNAプローブで，同
種では42℃，異種では37℃で,12〜36時間ハイブリダイ
ズする。フィルターは，同種のハイブリダイゼーション
では,0.2×SSC,0.1％SDSの中で50℃で，異種のハイブリ
ダイゼーションでは,3×SSC,0.1％SDSの中で50℃で,30
分間,2回洗う。フィルターは空気中で乾して，−70℃で
１〜３日オートラジオグラフィーにかける。

合成（15〜30マー）オリゴヌクレオチドプローブの場合
は，二重のフィルターを,1フィルターあたり10mlのオリ
ゴーハイブリダイゼーション緩衝液（６×SSC,0.1％SD
S,1mMEDTA,5×デンハート,0.05％ピロリン酸ナトリウム
および50μg/mlの変性，切断したサケ精子DNA）で,2〜
８時間,42℃でプレハイブリダイズする。

サンプルを，オリゴヌクレオチドの組成物に応じた条件
下で,15〜30ヌクレオチドのリン酸化オリゴヌクレオチ
ドプローブでハイブリダイズする。典型的な条件として
は，プローブを含むこの同じオリゴハイブリダイゼーシ
ョン緩衝液をフィルターあたり5ml,30〜42℃の温度,24
〜36時間，を採用する。フィルターは,6×SSC,0.1％SD
S,pH7の50mMリン酸ナトリウムで,23℃,15分,2回洗う。
その後,6×SSCと0.1％SDSで，計算されたハイブリダイ
ゼーション温度で２分,1回洗い，空気中で乾かし，−70
℃で２〜３日オートラジオグラフィーにかける。

C.4.cDNAライブラリーの産生 二本鎖のcDNAは，プタスミドベクターpBR322への挿入用
にウシ胸腺ターミナルトランスフェラーゼによって仲介
されるホモポリメリック テーリングを用いて合成され
調製される（Sutcliffe.J.G.,Nucleic Acid Res（197
8）5:2721-2732。第一鎖のcDNAは,5μｇのmRNAに，オリ
ゴ（dT）12〜18をプライマーとして，鳥骨髄芽球症ウィ
ルス由来のRNA−依存性DNAポリメラーゼによって，合成
される。RNA鋳型は，次いで,100℃,5分での変性とそれ
に続く氷冷によって，生じたDNA鎖から放す。第二のDNA
鎖は，E.coliのDNAポリメラーゼＩの大きい断片を用い
て，第一鎖分子の３′末端でのそれ自身のプライマーに
よって合成される。このようにして，二本鎖のヘアピン
DNAが，形成される。これらの分子は，開放終結末端で
平滑末端にし，ヘアピンループはアスペルギラス・オリ
ジー（Aspergillus oryzae）のS1ヌクレアーゼで切断し
て開く。二本鎖cDNAのS1ヌクレアーゼ分解は,300mM NaC
l,30mM NaOAc,pH4.5および3mM ZnCl₂中で,600ユニット
の酵素で37℃,30分行われる。cDNAはフェノール：クロ
ロホルムで抽出し，小さなオリゴヌクレオチドは，酢酸
アンモニウム存在下での３回エタノール沈澱によって除
去する。これは次のように行う；半分容量の7.5M酢酸ア
ルミニウムと,2倍容量のエタノールとをcDNA溶液に加
え，−70℃で沈澱させる。平滑末端の二本鎖cDNAを，次
いで，セファロース4B（ファルマシアファインケミカル
ズ，ピスカタウェイ,NJ）のカラム（0.3×14cm）を通し
たゲル濾過により，大きさによって分画する。或いは,5
〜20％のグリセロール勾配中での超遠心分離で，その勾
配を分画する。所望の長さ，例えば300塩基対，より大
まかに大きなcDANを残し,70％エタノールで沈澱させて
回収する。デオキシシトシンの短い（10〜30ヌクレオチ
ド）重合尾部を,0.2Mカコジル酸カリウム,25mMトリス,p
H6.9,2mMジチオスレイトール,0.5mM CoCl₂,200mM cDTP,
400μg/mlBSAおよび40ユニットのウシ胸腺ターミナルデ
オキシヌクレオチド トランスフェラーゼを含む,22℃,
5分の反応により,cDNAの３′末端に加える。反応液は，
フェノール：クロロホルムで抽出して，小さなオルゴヌ
クレオチドは酢酸アンモニウムの存在下で３回のエタノ
ール沈澱により除去する。

dCの尾部のついたcDNAは,PstIで切断してオリゴdGを尾
部につけたpBR322でアニールさせる:2.5μｇのpBR322-d
GDNAは,5μg/mlのベクター濃度でcDNAとアニールさせ，
そしてハイブリッドを,Casabadan,M.,et al.,Mol Biol
（1980）138:179-207に記載のCaCl₂処理によって，E.co
liMC1061に移す。

C.5.ベクター構築 所望のコード配列と制御配列とを含む適切なベクターの
構築には，当該分野でよく理解されている標準的な連結
と制限技術を用いる。単離されたプラスミド,DNA配列あ
るいは合成オリゴヌクレオチドは，切断され，尾部を付
けられ，所望の形に再連結される。

部位特異的DNA切断は，一般に当該分野で知られている
条件下における，市販制限酵素の製造者の指示に基づい
た，適切な制限酵素での処理によって行われる。例え
ば,New England Biolabsでの製品カタログを見よ。一般
的に，約１μｇのプラスミド或いはDNA配列は，約20μ
ｌの緩衝溶液中で１ユニットの酵素によって切断され
る。例えば，ここでは典型的に，過剰の制限酵素を用い
て,DNA基質の完全な切断を確かにする。変動は大目に見
ることができるけれども約37℃で，約１時間から２時間
の保温時間で実行されうる。各々の保温の後，蛋白はフ
ェノール／クロロホルムでの抽出により除去され，続い
てエーテル抽出を行ってもよく核酸をエタノール沈澱に
よって，水層画分から回収した。必要に応じて，切断断
片の大きさによる分離を，標準的な手法によるポリアク
リルアミドゲル或いはアガロースゲル電気泳動によって
行ってもよい。大きさによる分離の一般的な記述は，Me
thods in Enzymology（1980）65:499-560に見られる。
制限酵素で切断した断片は４つのデオキシヌクレオチド
トリフォスフェイト（dNTPs）の存在下で50mMトリスp
H7.6,50mM塩化ナトリウム,6mM塩化マグネシウム,6mMDTT
と５〜10μM dNTPs中で,20℃から25℃で約15分から25分
の保温時間を用いればE.coliDNAポリメラーゼ１の大き
い断片（クレノー）での処理によって，平滑末端にする
ことができる。クレノー断片は，たとえ４つのdNTPがあ
っても,5′の粘着末端を埋めるが突出した３′の一本鎖
も消化する。もし望むなら選択的な修復を粘着末端の性
質によって指示される限定内で,1つだけの或いは選択し
たdNTPsを供給することによって実行することができ
る。クレノーを用いた処理の後，その混合液をフェノー
ル／クロロホルムで抽出しエタノール沈澱を行う。S1ヌ
クレアーゼもしくはBal-31を用いた適切な条件下での処
理は，いかなる一本鎖部分も加水分解する。

合成オリゴヌクレオチドは,Efimov,V.A.,et al.(Nuclei
c Acids Res)（1982）6875-6894）の方法で調製され，
そして商業的に入手可能な自動オリゴヌクレオチド合成
機を用いて，調製することができる。アニ−リングする
前に，或いはラベルするための一本鎖のリン酸化は，過
剰な例えば1n moleの基質に対しておよそ10ユニットの
ポリヌクレオチド キナーゼを,50mMトリス,pH7.6,10mM
塩化マグネシウム,5mMジチオスレイトール,1〜2mMATP,
1.7p moles γ 32P-ATP（2.9mCi/mmole）,0.1mM ス
ペルミジン,0.1mMEDTAの存在下で用いて，達成した。

結合は次の標準的な条件と，温度のもとで15〜50μｌ容
量で行われる:20mMトリス−塩酸pH7.5,10mM塩化マグネ
シウム,10mMDTT,33μg/mlBSA,10mM〜50mM塩化ナトリウ
ム，そして40μM ATP,0.01〜0.02（Weiss）ユニットT4D
NAリガーゼで０℃において（“粘着末端”の結合のため
に）或いは,1mMATP,0.3〜0.6（Weiss）ユニットT4DNAリ
ガーゼで14℃において（“平滑末端”の結合のため
に）。分子間粘着末端結合は通常，総DNA濃度1ml当り33
〜100μｇ（５〜100mM総末端濃度）にて行われる。分子
間の平滑末端結合（普通10〜30倍molar過剰のリンカー
を用いる）は，全体で１μＭの末端濃度で行われる。

“ベクター断片”を用いるベクター構築において，ベク
ター断片を一般的に５′のリン酸を取り除きかつベクタ
ーの再結合を防ぐために，バクテリアのアルカリホスフ
ァターゼ（BAP）か，或いは牛の腸のアルカリホスファ
ターゼ（CIP）で，処理する。分解はおよそ150mMトリス
中pH8にてNa⁺とMg⁺²の存在下で，ベクター１μｇにつき
１ユニットのBAP或いはCIPを用いて，約１時間60℃で処
理される。核酸断片を回収するために，その調製液をフ
ェノール／クロロホルムで抽出し，エタノール沈澱を行
う。もしくは，再結合を必要ではない断片の付加制限酵
素による分解によって，二重に分解されたベクターで
は，防ぐことができる。

cDNAから得られたベクターの部分或いは配列の修飾が必
要なゲノムDNAのために，部位特異的プライマーの直接
的な変異が用いられる。これは，所望の変異を表す限ら
れたミスマッチングを除いては，変異をかけるべき一本
鎖ファージDNAに相補的なプライマー合成オリゴヌクレ
オチドを用いて行う。簡単に言えば，合成オリゴヌクレ
オチドを，プライマーとして，ファージに相補的な鎖
を，直接合成するために用い，そして得られた二本鎖DN
Aをファージを増殖させる宿主バクテリアに形質転換す
る。形質転換したバクテリアの培養液を上層寒天に拡
げ，ファージを持つ単一細胞からのプラーク形成を可能
にする。

理論的には新しいプラークの50％が，一本鎖として変異
のかかった形を持つファージであり,50％が始めの配列
を持っている。得られたプラークはリン酸化した合成プ
ライマー用いて，正しいマッチのハイブリダイゼーショ
ンができうる温度であるが，始めの鎖とのミスマッチ
が，ハイブリダイゼーションを十分防ぐことのできる温
度で，ハイブリダイズさせる。プローブとハイブリダイ
ズしたプラークを次いで釣り上げ，培養し，そしてDNA
を回収する。部位特異的変異操作の詳細は，以下に特別
な例で，記述する。

C.6.構築の確認 下記構築（ベクター）おいて，プラスミド構築のための
正しい結合は初めに,M.Casadaban博士から得られたE.co
li株MC1061（Casadaban.M.,et al.J Mol Biol（1980）1
38:179-207）或いは他の適した宿主を，結合混合物で，
形質転換することによって，確認される。成功した形質
転換株をアンピシリン，テトラサイクリン，或いは他の
抗生物質耐性によってか，或いは，プラスミド構築の様
式による他のマーカーを用いて当該分野で知られている
ように選択する。形質転換株からのプラスミドは，次い
でClewell,D.B.,et al.,Proc Natl Acad Sci（USA）（1
969）62:1159の方法に従って，そして必要なら，クロラ
ムフェニコールによる増幅（Clewell,D.B.,J Bacteriol
（1972）110:667）により，調製される。単離したDNAを
制限酵素により分析され，そして／あるいはSanger,F.,
et al.,Proc Natl Acad Sci （USA）（1977）74:5463。
さらに,Messing et al,Nucleic Acids Res（1981）9:30
9に述べられているように，ジデオキシ法或いはMaxam,e
t al,Methods in Enzymology（1980）65:499の方法によ
り配列決定される。

C.7.例示宿主 ここでクローニングと発現で用いられた宿主株は，次の
ものである： クローニングと配列決定のためと，そしてほとんどのバ
クテリアのプロモーターの制御下での構築の発現のため
にE.coli株Mc1061を用いた。

M13ファージの組み換えのために，E.coli株JM101のよう
なファージに感染しやすいE.coli株を用いた。

発現のために用いた細胞はChinese hamster ovary（CH
O）細胞である。

D.ASPのクローニングおよび発現 イヌとヒトのASP蛋白を精製したかたちで得た。ヒトのA
SPの染色体およびcDNAのライブラリーのためのプローブ
を供給するのに，イヌcDNAを使った。

D.1.イヌのASPの精製 D.1.a.界面活性物質複合体の分離 肺界面活性物質複合体の血を抜いたイヌから得たイヌの
肺から調製した。洗浄を含めたすべての操作は,4℃で行
い，分離した材料は−15℃で貯蔵した。

肺のガスを抜き，洗浄１回あたり１の緩衝液（5mMト
リス塩酸,100mM塩化ナトリウム,pH7.4）で３回洗浄し
た。この緩衝液のCo⁺²濃度は,5×10^-6M以下だった（ラ
ジオメーターF2112Ca;ラジオメーターA/S,コペンハーゲ
ン デンマーク）。洗った肺を集め細胞材料を除くため
150×gavで15分間遠心した。（サッバルRC2-B）それか
ら，上澄液をタイプ15ローター（ベックマン インスト
ラメント）を用い20000×gavで15時間遠心した。得らた
ペレットを,1.64M臭化ナトリウムを含む緩衝液に懸濁し
た。１時間平衡させた後，この懸濁液をSW28ローターで
（ベックマン インストラメント）100000×gav,4時間
遠心した（ベックマンL5-50B）。この薄膜を緩衝液に再
び懸濁し,100000×gav,1時間遠心した（ベックマンL5-5
0B）。複合体を含むこのペレットを２回蒸留水で再懸濁
した。

D.1.b.脂質および10kd蛋白の抽出 10〜15mgリン脂質/mlの濃度で水に再懸濁したペレット
を50倍容過剰のｎ−ブタノールに注入した（シグリス
ト,H.ら，Biochem Biophys Res Commun（1977）74:178-
184）。そして，室温で１時間攪拌した。10000×gavで2
0分間の遠心（サーバルRC2-B）の後，以下の述べるよう
に，さらに精製するため，ペレット（これは32K ASPを
含む）を回収する。上澄液（一層よりなる）は，脂質
と，低分子量の蛋白を含んでいる。脂質を得るため，こ
の上澄液を真空下,40℃で乾燥した。そして脂質を抽出
した。（フォルチ.J.ら，J Biol Chem（1957）226:497-
509）。

疎水性蛋白を得るため，ブタノールを除くべく，上澄液
をロトバップにかけた。ロトバップにかえる前にエタノ
ールを加えさらに乾燥した。この乾燥残留物を0.1N塩酸
を含む，再蒸留したクロロホルムに懸濁した。そして，
不溶性物質を遠心で除去した。

得られた溶液をLH-20カラム（ファマチア）でクロマト
グラフィーにかけクロロホルムで展開した。（LH-20
は，セファデックスG-50のヒドロキシプロピル誘導体で
ある；これは，疎水性のゲルで有機溶媒に対し反応性が
ない。）この蛋白は，除去される。脂質／リン脂質をそ
の含まれている部分から溶出した。

ボイドボリュームの分画から，窒素存在下でクロロホル
ムを蒸発させ，蛋白を得た。そして，ポリアクリルアミ
ドゲルで，そのサイズを調べた。非還元状態で行うと,1
6.5kd,12kdおよび10kdの３つのバンドが得られた。還元
状態では,10kd〜12kdのブロードな単一バンドが見られ
た。

エドマン分解により，非還元のゲルからの16.5kdおよび
12kdのバンドのＮ末端分析を行い，次の配列を得た。

16.5kd:?-Pro-Ile-Pro-Leu-Pro-Tyr-Cys-Trp-Leu-Cys-A
rg-Thr-Leu-Ile-Lys-Arg-Ile-Gle-Ala-Met-Ile-Pro-Lys
-Gly-Val-Lou-Ala-Val-Thr-?-Gly-Gln- 12kd:Ile-Pro-Cys-Phe-Pro-Ser-Leu-Lys-Arg-Leu-Leu-I
le-Ile-Val-Trp D.1.c.蛋白の分画およびASP 32k蛋白であることの確認 上記のｎ−ブタノール抽出から得た沈澱を窒素下で乾燥
し,20mMオクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドを含む緩
衝液20mlで２回洗った。100000×gav,1時間の遠心の
後，（ベックマンL5-50B），このペレットを0.3Mジヨー
ドサリチル酸リチウム,0.05Mピリジン（pH8.4）に氷上
で懸濁し，等量の水で希釈した。そして水層と等量の容
積のｎ−ブタノールを混合した。9n−ブタノール水分配
の全体は，界面活性物質の水層中の濃度を低くするため
なされた。最後の低い，蛋白を含む水層を15時間凍結乾
燥し,2mlの緩衝液に溶解し,100000×gav（ベックマンL5
-50B）で，残っている不溶性の物質を除くため遠心し
た。323nmでの吸光係数４×10³という値（マーチェシ,
V.T.およびアンドリュス,E.P.,サイエンス（1971）174:
1247-1248）から，最終的なサンプルのジョードサルチ
ル酸リチウムの濃度を計算すると,10μＭに達しなかっ
た。

このように精製したイヌASP 32Kアポ蛋白を，上記のよ
うに精製された界面活性脂質で再構成した。再構成され
た物質は，表面圧秤で測定すると表面活性を持ってい
た。そのインビボでの生物学的活性は，換気装置上に保
ったウサギ胎児への吸気によって測定された。

D.1.d.さらなる蛋白精製 前項で得た蛋白分画を50mMDTTを加えた１％SDD,50mMト
リス塩酸,1mMEDTAのpH7.5溶液と,37℃で１時間インキュ
ベートすることにより，還元し,100mMヨードアセトアミ
ド（シグマ）で０℃,30分間アルキル化した。そしてレ
ムリー,U.K.,ネイチャー（1970）277:680-685の方法で
ポリアクリルアミドゲルを電気泳動した。4M酢酸ナトリ
ウム溶液にこのゲルを浸すことによって蛋白は見えた。
そして,32kdのバンドをカミソリの刃で切り出し，ハン
カピラー,M.W.ら，酵素学の方法（1983）91:277-235,ニ
ューヨーク アカデミック プレスの方法でCBSサイエ
ンティフィック（デルマール カリフォルニア州）エレ
クトロリューション装置で電気溶出した。

溶出した蛋白を凍結乾燥し，そのＮ末端のアミノ酸配列
を1n molの蛋白から，アプライド バイオシステム 47
0Aゲール−フェーズ シーケンサー（アプライド バイ
オシステム社，フォスター市,CA）を用い，メーカーの
指示に従って決定した。PTHアミノ酸は,0.46×25cmIBM
CN−カラムを使って，ベックマン334T HPLCで同定し
た。用いた勾配は，ハンカピラー,N.W.,およびフード,
L.E.,酵素学の方法（1983）91:486-492ニューヨーク
アカデミックプレスに示された勾配に次の修整を加え
た。２成分の勾配系に代えて,3成分の勾配系を用いた。
その系では，アセトニトリルとメタノールはセパレート
ポンプで注ぎ込み,2つの比は，勾配のプログラムの適当
な修整を行いながら勾配の過程全体の時間によって変化
させた。パーマフェーズETH^rガードカラムに代えて，
“５×0.46cm IBM CN"アナリティカル“ミニ−カラム”
を用いた。そして，そのカラムは,32℃よりむしろ28℃
に加熱した。

Ｎ末端のアミノ酸配列は， “Hyp"は，修飾されたアミノ酸ヒドロキシプロリンを示
す。

イヌの32K蛋白のアミノ酸組成のデータは,Gly-X-Hypの
コラーゲンに似たパターンで推論された配列（以下を見
よ）中のプロリン残基のヒドロキシ化と矛盾しないとヒ
ドロキシプロリン含有量を示す。このパターンはヒトの
Ｎ末端の配列も示しているので，イヌのデータよりの類
推によって，多分，同様に処置されたヒトの配列中のプ
ロリンは，ヒドロキシ化されている。

コラーケナーゼ処理されたイヌASPの精製および配列決
定により，プロセッシングに関する情報が得られた。

精製したイヌのASPをバクテリアのコラゲナーゼ（ウォ
ーシングトン フリーホールド NJ）で酵素：基質が1:
1の比の5mMトリスpH7.4,5mM CaCl₂中,37℃で分解さし
た。これで,22Kdの限定分解産物の生成物をSDSゲルで分
析した。この22Kdのバンドをゲルから電気溶出し，上記
に述べたのと同様のアミノ酸配列分析にかけた。２つの
アミノ酸が各サイクルで同定され，このことがコラゲナ
ーゼ処理がジスルフィド架橋で連結されたままの２つの
ペプチドを生成することを示している。cDNAのクローン
の配列決定より,2つの配列が完全な分子中の78〜110お
よび203〜231アミノ酸に相当すると示し得る。

得られた配列は， そして，翻訳は完全であり，蛋白のＣ末端が完全である
ことを示す。

D.1.e.ヒトのASPの分離 ヒト32Kおよび，より小さな分子量のASPを以下の，イヌ
の蛋白に対し，上記に記述した方法で，肺胞のプロティ
ノシス（肺に過剰の界面活性物質が存在する結果生じる
症候群）をわずらった患者から，調製した。

32K ASPは，次のＮ末端配列を持つ。

ヒト配列の３〜17のアミノ酸は，イヌの32K蛋白の６〜2
0のアミノ酸と,9の位置のセリンを除いて正確に一致す
る。

分離した低分子量の疎水性蛋白は,16.5Kd,14Kdおよび10
Kdに当たるバンドを，ポリアクリルアミドゲル電気泳動
に，非還元状態でかけたときに示される。還元状態で
は,10〜11Kdに相当するブロードな単一のバンドが得ら
れる。

D.2.イヌの肺のmRNAの分離 全RNAを成犬の肺からチルグウィン J.M.ら，バイオケ
ミストリー（1979）18:5294-5299の方法で分離した。肺
組織を液体窒素の中で，モーターと乳棒を使って粉砕す
ることにより，粉状にした。そして,6Mグアニジンチオ
シアネート,0.05Mトリス塩酸,pH7.0 0.1M−β−メルカ
プトエタノール,0.5％サルコシル溶液中で，ホモジナイ
ズした。このホモジネートに,CsClを2.0M加え,0.01Mエ
チレンジアミンテトラ酢酸（EDTA）,0.05Mトリス塩酸pH
9.0中の5.7M CsClクッションに重層した。このRNAは,11
5000xg,16時間の遠心で，このクッションを通ってペレ
ット化された。それにより，このRNAは，より高い密度
のCsCl溶液を通って沈降しない細胞DNAおよび蛋白から
分離される。次いで，このRNAを0.01Mトリス塩酸pH7.4,
0.005M EDTA,1.0％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）に溶
かし，クロロホルムとフェノールの1:1混合液で抽出し,
70％エタノールで沈澱させた。このポリアデニル化され
たRNA（ポリA⁺RNA）の分画をアビブ,H.,およびレーダ
ー,P.,ブロックノトル アカッド サイ（USA）（197
2）69:1840-1412に記述されたようにオリゴ（dt）セル
ロースを通すアフィニティークロマトグラフィーにより
得た。

D.3.イヌの肺のcDNAライブラリーの作成およびスクリー
ニング D.2.節で調製した成犬の肺のポリA⁺RNAをC.4.節で記述
したようなcDNAライブラリーを作成するのに使った。５
μｇのmRNAから,300bp以上のサイズで選択されたcDNAを
約25ngを得た。このライブラリーは，約200,000の独立
した組み換え体を含んでいた。それらのうちの40,000の
組み換え体をニトロセルロースフィルター上に置いた。

これらのフィルターは，次のレプリカのマスターとして
働く。（ハナハン,D.,およびメセルソン M.,ゲーネ（1
980）10:63-75の方法による。） 32K蛋白をコードするcDNA ３つのプローブを作った：次の配列を持つ１〜５のアミ
ノ酸に相補的な24種の14量体配列の混合物を作った（プ
ローブａ）： 次の配列を持つ７〜11のアミノ酸に相補的な64種の14量
体（プローブｂ）： そして１種の15量体で哺乳類のコドンの好みに基づいて
作ったもの５′ATCGAGAACAACACC3′（プローブｃ）。各
オリゴヌクレオチド混合物および,1つの特有なオリゴヌ
クレオチドをバイオサーチSAMオリゴヌクレオチド シ
ンセサイザー（バイオサーチ社，サン ラファエル C
A）で，エフィモフ,V.A.,3ヌクレイック アシッド レ
ス（1982）10:6875-6894に記述の濃縮剤と同じ濃縮剤と
してＮ−メチルイミダゾールの存在下で，メシチレンス
ルホニルクロライドを使い標準トリホスホエステル法の
修整によって合成した。

ハイブリダイゼーションには,xixレプリカフィルターを
それぞれのマスターフィルターから調製した。それは，
各コロニーを複製中で，おのおの２つのオリゴヌクレオ
チドプローブを用いスクリーニングし得るようにするた
めである。このマスターフィルターを複製した後，回収
したコロニーを170μg/mlのクロラムフェニコールを含
む寒天プレート上に,18時間おいた。次いでこのコロニ
ーをハイブリダイゼーション用にグランスティン,M.,お
よびホゲネス,D.,プロックナトル アカッド サイ（19
75）72:3961-3972の方法に従って調製した。このフィル
ターを真空下にて80℃で２時間焼き，次いで，大量の３
×SSC（１×SSCは,0.15M NaCl,0.015Mクエン酸ナトリウ
ム,pH7.5）,0.1％SDS中で振盪した。このフィルターを
６×SSC,0.1％SDS,1mM EDTA,5×デンハルド溶液（0.1％
フィコル,0.1％ポリビニルピロリドン,0.1％ウシ血清ア
ルブミン）0.05％ピロリン酸ナトリウムおよび50μg/ml
変性させたサケ精子DNA中で,42℃で最近２時間プレハイ
ブリダイズした。

次いで，複製のフィルターをフィルターあたり,5×10⁶c
pmの³²Pでラベルしたオリゴヌクレオチドプローブ（マ
ニアティス,T.ら，モレキュラー クローニング，（198
2）コールド スプリング ハーバー ラボラトリー p
p.122-123に従ってリン酸化した。）の１つで，プレハ
イブリダイゼーショ溶液と同一の成分を含むハイブリダ
イゼーション溶液10ml中において，ハイブリダイズし
た。フィルターをオリゴヌクレオチドプローブa,bおよ
びｃとともにそれぞれ37℃,45℃および41℃でハイブリ
ダイズした。１時間後，プローブａは28℃に，プローブ
ｂは37℃に，サーモスタットの温度を下げ，その後，バ
スを平衡させた。プローブｃとフィルターは低い温度で
ハイブリダイズしなかった。このフィルターを６×SSC,
0.1％SDSによって，室温で15分間かけて２回洗浄した。
それから６×SSC 0.1％SDSによって,37℃,45℃および41
℃でそれぞれプローブa,bおよびｃを２分間洗浄した。
この最後の洗浄温度は，サッグス S.V.ら，精製された
遺伝子を用いる発生生物学（D.D.ブラウンおよびC.F.フ
ォックス著），アカデミックプレス,NY.pp.683-693の経
験式,Td＝４（Ｇ＋Ｃ）＋２（Ａ＋Ｔ）から得た。それ
から，ハイブリダイズフィルターを乾燥し，コダックXA
Rフィルム上に，デュポン クロネックス強化スクリー
ンで，完全な露光が得られるまでオートラジオグラフし
た。

もし，コロニーが複製で,3つのすべてのオリゴヌクレオ
チドプローブと，またはa,b両方のプローブとハイブリ
ダイズすれば，そのコロニーはポジティブと言えた。数
種の潜在的なポジティブクローンのうち,1つは，他と比
べてより強くプローブa,bとハイブリダイズした。この
クローンのシーケンスにより，それが，イヌの32KASPの
配列の一部をコードしていることがわかった。それをDS
-1と名付け,32KイヌASP全体を得るのに使った。

375bpの精製されたDNA挿入を制限酵素PstIでpDS-1から
切り出し，スモールミニプレップ法（マニエーティス
ら，前出P366）を用いて調製し，アガロースゲル上で分
離した。次いで，このDNA挿入全体をバクテリオファー
ジM13にサブクローニングし（メッシング,J.,およびヴ
ィエイラ,J.,遺伝子（1982）19:259-268）。サンガー
F.ら，プロックナトル アカッド サイ（USA）（197
7）74:5463-5469のジデオキシ法でシーケンスした。そ
の配列は，およそ300アミノ酸蛋白のＮ末端部分をコー
ドしていた。すなわち,D.I.節の精製したイヌのASP蛋白
から決定したＮ末端アミノ酸配列32残基，および101の
その下流のアミノ酸をコードしていた。それはまた,50b
pの５′不翻訳領域を含んでいた。

イヌのASP配列全体をコードするのに充分な長さの配列
の存在を決定するため，ノーザンブロットによりmRNAプ
ールの評価を行った。バイレイ,J.M.およびダビッドソ
ン,N.,アナル バイオケム（1976）70:75-85.の方法
で，メチルメルクリックハイドロキシドを含む1.4％ア
ガロースゲルで電気泳動し，分画した後，ニックトラン
スレーションしたDS-1挿入DNAを使って,D.5.節のポリA⁺
RNAをノーザンブロッティングにかけた。プローブにハ
イブリダイズしたmRNAは1800〜2000ヌクレオチドの長さ
で，コーディングシーケンスに必要な約700ヌクレオチ
ドより明らかに大きかった。

それゆえ，このDS-1挿入プローブをオリジナルフィルタ
ーの１つの精製セットの再スクリーニングに用いた。そ
のフィルターは，残存するオリゴヌクレオチドプローブ
を除くため100℃で10分間処理した。0.75M塩化ナトリウ
ム,0.075Mクエン酸ナトリウム,50％ホルムアミド,0.5％
SDS,0.02％ウシ血清アルブミン,0.02％フィコール−40
0,000,0.02％ポリビニルピロリドン,0.1％ピロリン酸ナ
トリウム,50μg/ml酵母tRNA.50μg/ml変性切断サケ精子
DNA中で，フィルターを42℃にて18時間プレハイブリダ
イズさせた。1mlの新鮮なハイブリダイゼーション緩衝
液あたり,5×10⁵cpmの³²P−ラベルをし，煮沸したDS-1c
DNAを加え，その緩衝液中でフィルターを42℃で16時間
インキュベートした。それから，フィルターを0.03M塩
化ナトリウム,0.003Mクエン酸ナトリウムおよび0.1％SD
Sで２回，それぞれ50℃にて30分間洗浄し，一晩オート
ラジオグラフィーのため露光した。さらに,2つのクロー
ン,DS-4およびDS-31が同定され，それは,DS-1同様だい
たい1700bpからなっている（第１図）。

DS-4およびDS-31もまた,Pst Iを使って切り出し,M13mp9
にサブクローニングし，そしてサンガー,F.（前出）の
方法に従ってダイデオキシシーケンスにより配列決定し
た。この生体の配列は,2つの内部Pst1サイトを持ってい
た。正しいシーケンスであることの確認は，第１図に示
した。推論される内部の制限サイトから得たフラグメン
トのダイデオキシシーケンスによって得た。256コドン
のオープンリーディングフレームから推論されるASPの
アミノ酸配列を含む全ヌクレオチド配列を第１図に示
す。

イヌの10K ASPをコードするcDNA 哺乳類のコドンの好ましい表をコドンの選択に用い,16.
5Kd蛋白のＮ末端配列に相当する２つのオリゴプローブ
を作った。プローブ1198は36量体の配列５′−GGTCACAG
CCAGGCCCTTGGGGATCATGGCCTGGAT-3′であり，プローブ11
99は45量体の配列であった。５′−CTTGATCAGGGTTCTGCA
CAGCCAGCAGTAGGGCAGGGGGATGGG-3′両方をカイネシング
によって³²Pラベルした。

ハイブリダイゼーションのため，このフィルターを真空
下で,80℃にて２時間焼き,0.1％SDSを含む大量の３×SS
C中で68℃にて４時間振盪し洗浄した。６×SSC,5×デン
ハード,20％ホルムアミド,0.1％SDS,100μg/mlの切断変
性サケ精子DNA中で,42℃にて数時間，このフィルターを
プレハイブリダイゼーションした。13ng/mlのプローブ1
198または16ng/mlのプローブ1199を含む，上記の緩衝液
中で，複製フィルターを，最初は68℃で，次いで42℃で
一晩ハイブリダイズした。６×SSC,0.1％SDS,0.05％ピ
ロリン酸ナトリウム中で,15分間室温で２回フィルター
を洗浄した。それから65℃で５分間同じ緩衝液で洗浄し
た。その後，乾燥し，オートラジオグラフィーをした。

スクリーニングした40,000クローンのうち,8つが双方の
プローブにハイブリダイズした。そして，それの制限分
析を行った。組み合わせると1520ヌクレオチドになる２
つの重なったクローンをシーケンスした。結果は第２図
に示す。矢印は，成熟した16.5Kd蛋白の開始点を示す。

D.4.ヒト32KASP遺伝子の単離 バクテリオファージシャロン 28（Rimm,D.L.,et al.Ge
ne（1980）12:301-310）は,T.Maniatis博士，ハーバー
ド大学から得た。E.coli K803で約1.5×10⁶のファージ
を増殖させ，溶菌したプラークをBenton,W.D.,et al,Sc
ience（1977）196:180-182に記載のニトロセルロースフ
ィルターに移した。フィルターは,Rigby,P.W.J.,et al,
J Mol Biol（1977）113:237-251のニックトランスレー
ション法によりリン酸化されたDS-1 cDNAでプローブし
た。フィルターを42℃,1時間で，ハイブリダイゼーショ
ン緩衝液（0.75M NaCl,0.75M硝酸ナトリウム,40％ホル
ムアミド,0.05％SDS,0.02％ウシ血清アルブミン,0.02％
フィコール−400,000,0.02％ポリビニルピロリドン,0.1
％ピロリン酸ナトリウム,50μg/ml酵母tRNA,50μg/mlの
変性し切断したサケ精子DNA）で前洗浄した。新しいハ
イブリダイゼーション緩衝液1mlあたり５×10⁵cpmプロ
ーブを加え，フィルターを37℃で16時間，この緩衝液で
保温した。次いで，これを0.45M NaCl,0.045Mクエン酸
ナトリウムおよび0.1％SDSで50℃で２回洗い，一晩オー
トラジオグラフィーにかけた。DS-1cDNAにハイブリダイ
ズする配列を含む可能性のある６つのクローンを得た。
最も強くハイブリダイズするクローン,gHS-15,を調べ
た。

gHS-15の700bp EcoRI断片がDS-1プローブとハイブリダ
イズし，配列分析に選ばれた。このEcoRI断片を精製し,
M13mp9の中に挿入して配列決定したところ，対応するイ
ヌの配列と相同性があることがわかった。全ヒトコード
領域は,5′側の1.2Kb断片と３′側の3.5Kb断片との２つ
の隣接するBamHI断片を含んでいた。両方のBamHI断片を
M13mp8のBamHI部位に各々，サブクローン化し，配列決
定した。付加的な断片は，第３図に示す手順に従って同
様に配列決定された。配列情報は，製造業者の指示に従
って，いろいろな遺伝情報（パロアルト,CA）コンピュ
ータープログラムを使用して分析された。シグナルペプ
チド，前駆体配列および成熟アポ蛋白を含む領域はイヌ
ASPcDNAと比較することで同定した。配列分析から，遺
伝子の５′未満は1.2Kb BamHI断片内にコードされてお
り,3′末端は3.5Kb BamHI断片内にコードされている。
遺伝子は,1.2Kb BamHI断片の最初のbpを１とした時の12
18bp,1651bp,そして2482bpの３つのイントロンによって
さえぎられている。推定されたヒトASP蛋白のアミノ酸
配列を含む全配列を第３図に示す。

D.5.ヒト32KASPの発現 全ヒトASP遺伝子を含む約16Kpの挿入を持っているもの
としてD.5節で同定されたgHS-15単離ファージは,pSV2:N
EOとともに形質転換によって,10％ウシ胎児血清を含む
マッコイ5A培地で増殖させたCHO細胞内に移された（Sou
thern,P.,et alJ Mol Appl Genet（1982）1:327-34
1）。このプラスミドは，哺乳動物細胞に有毒であるネ
オマイシンアナログG148に対する耐性を与える機能遺伝
子を含む。形質転換において，λ:gHS-15 15μｇとpSV
2:NEO 2μｇが,Wigler M.,et al,Cell（1979）16:777-7
85の方法に従って，リン酸カルシウム/DNA共沈澱でCHO
細胞の100mm皿に加えられた。

これには,DNAにさらした４時間後の,2分間の15％グリセ
ロール“ショック”が含まれる。細胞は１μg/ml G418
を含む培地に移し,100mm皿あたり約50個の安定な形質転
換体が得られた。

標識する前に，安定な形質転換体を,0.25mMアスコルビ
ン酸を添加した培地で培養した。安定な形質転換体の２
つのプールとCHO細胞で処理していない１つのプールと
を，通常の1/10のメチオニン濃度を含む培地で１時間培
養し，次いで８〜16時間，³⁵S−メチオニンで標識し，
³⁵S‐metで標識した全分泌蛋白をSDSポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動で分析した。結果を第４図に示す。通常
のCHO分泌蛋白をレーン１に示す。λ:gHS-15分泌蛋白を
レーン２と３に表す。その両方ともが，発現されたASP
蛋白に相当する付加的な30〜36Kdの蛋白を持っている。
30〜36Kd蛋白の同一性をさらに証明するために，イヌAS
P抗体で全分泌蛋白標品を免疫沈降させることができ
る。ベクターλ:gHS-15は1984年12月７日にAmerican Ty
pe Culture Collectionに寄託され,ATCC40146で受理さ
れた。

D.6.32Kおよび10Kの蛋白に対するヒトcDNAクローンの調
製 ヒト32K ASP ヒト肺を22週間目と24週間目の２胎児から得た。最初に
7gの肺組織を液体窒素で凍結させ，モーターですりつぶ
し粉粒にした。そして全ポリＡ′RNAをD.2.節（前出）
の方法で調製した。

cDNAライブラリーをC.4節で述べた方法でmRNAから調製
した。５μｇの肺ポリA⁺RNAから約25ngのcDNAができ,50
0塩基対以上のものが選択され,300,000の個々の組み換
え体ライブラリーを得た。

ヒトcDNAライブラリーの60,000個を，遺伝子ライブラリ
ーのスクリーニングのために上で述べた方法で，イヌDS
-1cDNAでスクリーニングした。組み換え体コロニーは,2
組のレプリカに対してマスターとなるニトロセルロース
フィルターの上に置かれた。コロニーフィルターは，次
いでGrunstein;M.,and Hogness,D.（前出）の方法に従
ってハイブリダイゼーションのために調製された。フィ
ルターは，真空下,80℃で２時間焼き，大量の３×SSCと
0.1％SDSで振盪しながら68℃で４時間洗浄した。次に，
フィルターを0.75M NaCl,0.075M硝酸ナトリウム,40％ホ
ルムアミド,0.5％SDS,0.02％ウシ血清アルブミン,0.02
％フィコール−400,000,0.02ポリビニルピロリドン,50
μg/ml酵母tRNA,50μg/mlの変性，切断したサケ精子DNA
で,18時間37℃でプレハイブリダイゼーションした。新
しいハイブリダイゼーション緩衝液1mlあたり,1×10⁶cp
mの³²P−標識DS-1プローブを加え，次いで37℃で16時間
保温した。次にフィルターを0.45MNaCl,0.045Mクエン酸
ナトリウムおよび0.01％SDSで,2回，各々50℃で30分間
洗い，一晩，オートラジオグラフィーにさらした。

１個の正にハイブリダイゼーションしたクローン,HS-6,
は，さらに塩基配列決定によって分析された。HS-6は,P
st I切断によってベクターから放出され得，また内部Ec
oRI部位を有する,1.2Kb挿入断片を持っている。挿入断
片からの両Pst I-EcoRI断片が,M13mp8とmp9のPst I-Eco
RI部位にサブクローン化され，部分的な配列が得られ
た。配列決定された200bpを越える部分がgHS-15の３′
−末端に完全に対応した。HS-6のヌクレオチド配列を第
５図に示す。

HS-6c DNA挿入断片はASPmRNAの３′−末端領域のみしか
含んでいないので，プローブとしてHS-6を使用して残り
のクローンを表面活性物質の隣接配列を捜すためにスク
リーニングした。ライブラリーの残りにクローンは見つ
からなかった。

ヒト32K ASPをコードしている完全なcDNAを得るため
に，成人の肺から，無秩序に入れたcDNAを調製し,Huyn
h.T.,et al,cDNA Cloning Techniques:A Practical App
roach（Glover,D.,ed）IRL,Oxfordの方法によってEcoRI
リンカーを使用してバクテリオファージベクターgt10に
クローン化した。成人の肺は，胎児の肺細胞に比べてAS
P転写物に富んでいる（私たちの観察による）ので，完
全なASPcDNAを得る頻度を非常に上げる。

ファージプラークは,50％ホルムアミド,5×SSC,0.05％S
DS,5×デンハート,tRNAおよびサケ精子DNA中,16時間,42
℃で，³²Pで標識されたpHS-6挿入断片の５×10^-5cpm/ml
を使い，スクリーニングした。フィルターを0.2×SSC,
0.1％SDSで，各々30分間,50℃で２回洗い，乾燥させ，
オートラジオグラフィーにかけた。

２つの正にハイブリダイズするクローン（pHS-2およびp
HS-5と称する）が単離された。各々は,32K ASPの全コー
ド配列と,5′の非翻訳領域のほとんどを含んでいた。各
々は，ほとんどの３′−非翻訳領域を含むHS-6と重なっ
た。各クローンの３′末端はコード領域内のEcoRI部位
に対応する。

ヒト10K ASP ラムダgt10中の同じcDNAライブラリーを，前述のよう
に,40％ホルムアミド,5×SSC,0.05％SDS,5×デンハー
ト,50μg/ml酵母tRNA,および50μg/mlサケ精子DNA中,37
℃で16時間，先のイヌクローンpD10K-1 1×10⁶cpmを使
用して，ニトロセルロースフィルターでスクリーニング
した。フィルターを,2×SSC,0.1％SDSで30分間,50℃で
２回洗浄し，乾燥させ，オートラジオグラフィーにかけ
た。40,000プラークのうち２つが正のクローンで，その
うちの１つ,1.5Kbの挿入を含むラムダH10K-1と名付けら
れたものを，配列決定のために選択した。仮の部分配列
の結果を第６図に示す。下線部分のアミノ酸残基は，イ
ヌの蛋白と相同性があることを示している。

D.7.発現ベクターの構築 哺乳動物細胞におけるゲノムヒト32K ASPコード配列の
発現に対して安定なベクターを，これはイントロンを含
むDNAをプロセシングできるものであるが，構築した。K
arin,M.,et al,Nature（1982）299:797-802で述べられ
ているように，発現はメタロチオネインII（hMT II）制
御配列によって制御される。

宿主ベクターpMTは，プロモーターをpUC8と連結するこ
とによって得られた。

hMT II遺伝子を運ぶプラスミド84H（Kari,M.,et al,
（前出））をBamHIで完全に切断し，エキソヌクレアー
ゼBal-31で処理して終止ヌクレオチドを取り除き，次い
でHind III切断をおこなって−765から＋70のhMT II遺
伝子ヌクレオチド（転写される最初のヌクレオチドを＋
１とする）を含む840bの断片を遊離した。840bp断片を
単離し,Hind III/Hinc II切断pUC8（Vieira,J.,et al,
Gene（1982）19:259-268）と連結し，この連結混合物を
E.coli Mc1061へ形質転換した。pMTの正しい構築物をジ
デオキシヌクレオチドシークエンスによって確認した。

さらに,C末端制御シグナルを含むpMTの誘導体,pMT-Apo
が調製された。pMT-Apoは,3′末端制御シグナルを含む
ヒト肝臓蛋白ApoA₁遺伝子の一部（Shoulders,C.C.,et a
l Nucleic Acids Res（1983）11:2827-2837）を持って
いる。ApoA₁遺伝子のPst I/Pst I 2.2Kb断片（平滑末
端）をpMTポリリンカー領域のSma I部位にクローン化
し,BamHI切断でApoA₁遺伝子のほとんどの部分を取り除
き，クレノーで平滑末端にし,Stu Iで切断し，再連結し
た。ジデオキシジクエンス分析法によって確かめると，
得られたベクターは,3′末端からざっと500bpのApoA₁遺
伝子を含んでいる。ヒトASP遺伝子,pMTおよびpMT-Apo発
現ベクターの５つの構築物は,gHS-15の1.2Kbと3.5KbのB
amHI断片を使用して調製された。すべての構築物は単離
され制限分析とジデオキシジクエンスとの両方によって
確認された。これらの構築物は，以下のようにして調製
された。

1.1.2Kbと3.5KbのBamHI断片をpMTのBamHI部位にクロー
ン化してpMT:gHSを得た； 2.1.2Kb BamHI断片をHinf I（950位置）で切断すること
によって５′末端で断ち切り，クレノーで埋めた。切断
された断片を3.5Kb断片とともにpMTのBamHI部位へクロ
ーン化して,pMT:gHS（Hinf I）を得た； 3.第２節の断片を代わりにpMT-ApoのBamHI部位にクロー
ン化して,pMT-Apo:gHS（Hinf I）を得た。

4.3.5Kb BamHI断片をEcoRI（3434位置）で切断すること
によって,3′末端を断ち切り，クレノーで埋めた。この
切断された断片を，上記のHinf Iで切断した1.2Kb切断
片とともにpMT-ApoのBamHI部位へクローン化して,pMT-A
po:gHS（Hinf I/EcoRI）を得た。

5.1.2Kb断片を356位置のBstE II部位で切断し,3.5Kb断
片を4024位置のBstE II部位で切断した。これらの断片
をpMT-ApoのBamHI部位にクローン化して,pMT-Apo:gHS
（BstE II）を得た。

得られたpMT:gHS構築物を，³⁵S−メチオニンとともに10
^-4MZnCl₂を加える以外は,D.6節の方法でCHO細胞に移
し，メクロチオネインプロモーターを誘導し，産生され
た蛋白を標識した。

８〜16時間後，イヌのASP抗体で免疫沈降する³⁵S‐met
標識全分泌蛋白を培地中で分析した。非免疫IgGが対照
として使用された。

D.8 発現の最適化 発現の条件を最適化し,SV40のウイルスのエンハンサー
を含む付加的な発現ベクターを,CHO細胞中の発現量の増
加のために，用いた。３つのベクターを用いた：これ
は，上記の，そして以下でさらに特徴を述べるpMT-Apo:
gHS（Hin f/Eco RI），そして下記のように構築したpAS
Pc-SV（10）とpASPcg-SV（10）である。

エンハンサーを含むベクター MT-IIプロモーターに発現可能なように連結したSV40エ
ンハンサーを含む宿主発現ベクターを得るために,1100b
pのSV40DNA断片をpMT中のMT-IIプロモーター配列の上流
のHind III部位に挿入した。このSV40DNA断片はSV40の
複製オリジナルにわたっており，ヌクレオチド5171から
5243まで（オリジナルにおける），つまりヌクレオチド
107-250からの重複した72bpの繰り返しを含んでいる。
これは，オリジン側に後期ウイルスmRNAの５′末端を含
む，ヌクレオチド1046まで続いている。

このHind III 1100bp断片はSV40のDNAのHind III分解か
ら得られ（Buchman,A.R.,et al.DNA Tumor Viruses,2nd
ed（J.Tooze,ed）Cold Spring Harbor Laboratory,New
York（1981）,pp.799-841），増幅のためにpBR322にク
ローン化する。クローニングベクターをHind IIIで分解
し，ゲル電気泳動により1100bpSV40DNA断片を分離し,Hi
nd IIIで分解しCIP処理したpMTに連結した。その結果得
られるベクター,pMT-SV（９）とpMT-SV（10），はMT-II
プロモーターの前に断片を逆方向で含んでいる。pMT-SV
（９）では，エンハンサーは５′側のmRNA開始部位から
約1600bp離れており，逆方向のものでは,5′側のmRNA開
始部位から約980bp離れている。両方向ともに発現可能
であるが，エンハンサー配列が開始部位に近い方の向き
の方がより高い発現量を与える。

pASPc-SV（10）:ASPのコード配列を，宿主ベクターpMT-
SV（10）の上記のように修飾した形のものに挿入した。
最初に500bpのApoAI断片は，この断片の分離により,pMT
-SV（10）に挿入され,pMT-Apo（上記）の分解およびEco
RI/Bam HIで分解したpMT-SV（10）への連結により得ら
れる。修飾したベクターをBam HIで分解し，平滑末端化
し，この平滑末端化したEco RI分解物としてpHS-5から
得られたcDNA配列（White,R.T.,et al,Nature（1985）3
17:361-363）に連結した。このcDNA断片は５′の翻訳さ
れない領域に連結したEco RIリンカーから３′の翻訳さ
れない領域に元から存在するEco RI部位まで及ぶ（900b
p）。この関連したヌクレオチド配列を第７図に示す。
ここで，星印を付けたアミノ酸は，アミノ酸一次配列
と,pMT-Apo:gHS（Hin f/Eco RI）から得られた蛋白の配
列との相違を表す。（この相違はヒトのcDNAとゲノム配
列との間の塩基置換から生じる。）翻訳の開始は，元の
配列と同じく，ヌクレオチド56からである。

pASPCg-SV（10）：付加的な修飾は,pASPc-SV（10）とpM
T-Apo:gHS（HinfI/EcoRI）配列を組込むことにより調整
された。プラスミドpASPc-SV（10）をBam HIとEcoRIで
分解し，分離した大きい方の，断片を,pMT-Apo:gHS（Hi
nfI/EcoRI）のBamHI/EcoRI（部分）分解により得られた
ASP遺伝子の３′部分に連結した。これは，ヌクレオチ
ド1154から始まり，ヌクレオチド3432まで伸びているヒ
トASP遺伝子部分を表し，これを上記のごとくApoAI遺伝
子断片に連結した。この構築によりpMT-Apo:gHS（HinfI
/EcoRI）から得られる蛋白と同一の蛋白が生成する。し
かし，これはアミノ酸部位25,30および34がpASPc-SV（1
0）から得られた蛋白とは異なる。関連する挿入のヌク
レオチド配列を第８図に示す。

pMT-Apo:gHS（HinfI/EcoRI） ゲノムDNAを含むベクター,pMT-Apo:gHS（HinfI/EcoRI）
のために，エキソン2,3および４とエキソン５の一部を
含む，ヌクレオチド950からヌクレオチド3432までの遺
伝子HinfI/EcoRI断片として得られた。White,R.T.らNat
ure（1985）317:361-363も参照せよ。この断片を前述の
ポリアデニレーション・シグナルとポリアデニレーショ
ン配列を含むヒトApoAI遺伝子（Shoulders.C.C.Nucleic
Acids Res（1983）11:2827-2837）の３′末端からの50
0bp断片に連結した。この完全なASPをコードするゲノム
挿入物を,MT-IIプロモーターに連結した形で第９図に示
す。

このベクターからは本来のプレ蛋白（これはシグナル配
列を含む）より23アミノ酸だけ長いタンパクが生成す
る。この構築では，エキソン１を欠き，よって翻訳は，
通常は最初のイントロン中にある，本来のプレ蛋白のmR
NAに相補的なゲノム配列のヌクレオチド987から始まるA
TGから開始するのであろう。本来のプレ蛋白の生成にお
いて，エキソン１がヌクレオチド1022でエキソン２と連
結され，この開始コドンが欠落し，そして翻訳がヌクレ
オチド1046から開始するようになる。しかし，この付加
的な残基は分泌を阻害しないようであり，通常の成熟蛋
白が，この修飾した形の遺伝子を発現する細胞から分泌
される。

形質転換の手段 上述のベクターの各々を用いて，次に述べるようにして
CHO細胞を形質転換した：チャイニーズ・ハムスターの
卵巣（CHO）‐K1細胞を10％ウシ胎児血清を含むCoon's
F12培地およびDME 21培地の1:1の混合物からなる培地で
増殖させた。感受性細胞を，目的のベクターとpSV2:NEO
で共形質転換した（Southern,P.,ら，J Mol Appl Genet
（1982）1:327-341）。pSV2:NEOはネオマイシンのアナ
ログG418に対する耐性を与える機能の遺伝子を含む。典
型的な形質転換では,0.5μｇのpSV2-NEOと５μｇまたは
それ以上の発現ベクターDNAを100mm皿の細胞に加える。
Wigler M.,らCell（1979）16:777-785の方法に従って，
リン酸カルシウム−DNAの共沈澱を,4時間DNAにさらした
後に15％グリセロールを含むPBSにより２分間の“ショ
ック”を与えることを含めて，用いた。

要約すれば，細胞を1/10量で植菌し，一晩培養して２×
PBSで洗浄し，CaPO₄・DNA共沈澱物を含む0.5ml Hepes−
バッファー食塩溶液中に15分間置き，次いで10mlの培地
を加える。この培地を吸引により除き,15％グリセロー
ルを含むPBSに換え,1.5〜３分間置く。このショックを
与えた細胞を洗浄し，培養培地を加える。MT-IIに制御
された発現が誘導されるまで，この培地は,10％FBSを含
むF12/DMEM21の1:1混合液を有している。１日後,G418耐
性コロニーのプールを得るために，細胞に1mg/ml G418
を加える。所望のプラスミドの安定した形質も保持する
好ましい形質転換体を，その後クローン単体の精製のた
めに低濃度でプレートにまく。

ASP産生量の検定 所望蛋白の産生のために，まずプールについて，次いで
単一のクローンについてマルチウェルプレート中で，形
質転換体を検定した。このプレートでの検定量は，ウェ
ルの大きさに多少依存する。例えば,24ウェルのプレー
トの結果は96ウェルのプレートの結果とは直接には比較
できない。プレート検定により十分な量の蛋白を産生す
ることが分かったクローンは，次に回転ビン中での産生
操作で培養できる。典型的には，スケール・アップを行
えば，この産生量は増加する。しかし，プレート検定と
回転ビンの操作との間には絶対的な相関はない。すなわ
ち，プレート検定では一番良い産生を示すものの培養
は，スケール・アップ後では必ずしも一番良いものでは
ない。この理由から，典型的には100〜200またはそれ以
上の個々のクローンをプレート上で種々の選別方法によ
り検定し，最も高い産生を示すものの５から10コを産生
条件下（回転ビン）で検定する。

プレート検定 ASPをコードする種々のプラスミドにより形質転換し
た。細胞のプールをマルチウェルプレートで増殖させ，
次いでASPの産生を誘導するために,5×10^-5〜１×10^-4
濃度の亜鉛イオンにさらした。ASP検定は，ウサギ抗−
ヒトASPポリクローナル抗血清での免疫沈澱，それに続
く¹²⁵IプロティンＡとオートラジオグラフィーを使用す
るウエスタンブロットを用いて行った。

もっと詳しく言えば,10％FBSを含むMcCoyの5A培地で増
殖させた個々の細胞系統の半融合単層をリン酸塩バッフ
ァー食塩水（PBS）で洗浄し,10％FBSを含むMcCoyの培
地,1×10^-4の塩化亜鉛および0.25mMのアスコルビン酸ナ
トリウムを加えた。（アスコルビン酸塩は，プロリン残
基のヒドロキシル化の促進を助けうる。）誘導後24時間
で，細胞をPBSで洗浄し，再び塩化亜鉛とアスコルビン
酸とを含む無血清McCoyの培地を加えた。12時間後，調
節された培地を回収し，トリス中pH8で20mMにして,BRL
ドット・ブロット器具中でニトロセルロースを通して濾
過した。このニトロセルロース・フィルターを５％脱脂
粉乳を含む50mMトリス,pH7.5,150mMNaCl（トリス／食
塩），で封鎖し，次いで封鎖溶液中に,5000倍希釈のウ
サギ抗ヒトASPポリクローナル抗血清を加えてインキュ
ベートし，上記トリス／食塩で数回洗浄し，そして25μ
Ciの¹²⁵IプロティンＡを封鎖溶液に加えてインキュベー
トし，洗浄してオートラジオグラフィーをとった。

ASPをコードするベクターにより形質転換されたものの
プールのほとんどは，この検定において検出可能なASP
を生産しなかった。しかし，明確にASPを分泌する細胞
系統（A-38と称する）をpMT-Apo:gHS（HinfI/EcoRI）形
質転換体から選別した。さらにpASPc-SV（10）で形質転
換された細胞のあるプール（ASP-Iと称する）またはpAS
Pcg-SV（10）で形質転換された細胞のあるプール（ASP-
FおよびASP-Gと称する）は，下記のD-4と称する細胞系
統により生産される量（〜2-5μg/ml）と比較し得るASP
を生産した。

ASP蛋白のキャラクタリゼーション このA-38細胞（上記）を10％FBSを含むMcCoyの5A培地中
で25％集合体となるまで増殖させ，次いで,10％FBSと0.
25mMアスコルビン酸ナトリウムを含むMcCoy培地中の10
^-4M塩化亜鉛で誘導した。（細胞の半分は，10^-6Mのデキ
サメサゾンでも処理した。）24時間後に，この細胞をPB
Sで洗浄し，そして10％透析FBS,1×10^-4M塩化亜鉛,0.25
mMアスコルビン酸ナトリウム，および0.5mCi/mlの³⁵S−
メチオニンを含むRPMI培地を再び加えた。

18時間後に，この細胞上澄液を1mMフェニルメチルスル
ホニルフルオライドとし，ウサギ抗イヌASP抗血清を用
いてプロテインＡを担体として免疫沈澱させた。沈澱し
た蛋白の半分をSDS-PAGE試料バッファー中で沸騰させ，
そして残りの半分を0.75％トリトン×−100,0.075％SD
S,0.75％２−メルカプトエタノール,30mMEDTA,75mMリン
酸ナトリウム,pH1,中に溶出し,0.5単位のエンドグリコ
シダーゼ−Ｆ（エンド−Ｆ）を加えて37℃で１時間イン
キュベートした。エンド−Ｆで処理されたおよび未処理
の蛋白の画分をSDS-PAGEにかけた。この結果を第10図に
示す。このエンド−Ｆ処理された画分は，未処理の画分
の38Kdの蛋白（レーンＥ）に比べて,30Kdの蛋白（レー
ンＦ）を示した。（レーンＭはサイズマーカーを含み，
レーンＡとＢは非形質転換CHO細胞の上澄液，そしてレ
ーンＣとＤは，各々デキサメサゾンで処理されたまたは
未処理のA-38細胞からの上澄液を含む。） D-4調製のための過度のトランスフェクション D-4と名付けた付加的な細胞系統を,pMT-Apo:gHS（HinfI
/EcoRI）（20μｇ）およびpSV2:GPT（１μｇ）の混合物
を用いて,A-38を過度にトランスフェクションすること
により得た。10％FBSを含むF12/DMEM 21中で増殖させた
A-38の半融合単層を，上記のように共にトランスフェク
ションした。48時間後に，この細胞を５分の１ずつに分
けて,10％FBSとHAT選択薬剤とを含むF12/DMEM 21中に加
えた。HAT選択の17日後，生存している耐性コロニーの
プールを,mcCracken A,A.,らBiotechniques（March/Apr
il 1984）82-87の免疫フィルター選択方法により，高レ
ベルのASPを生産する個々のクローンについて選択し
た。簡単に言えば,100mm皿に100個の細胞の割合で，こ
の細胞をF12/DMEM 21,10％FBS中に植菌した。５日後に
おいて，（コロニーに各々50-200個の細胞を含むとき）
この細胞をPBSで洗浄し，無血清F12/DMEM 21を加え，そ
して殺菌テフロン・メッシュを重ねた。メッシュの上
に，ニトロセルロースフィルターを置き,8時間そのまま
にしておいた。このニトロセルロースを取り除き，イミ
ュノブロットとして，初めにウサギ抗イヌASPポリクロ
ーナル抗血清を用い，次いで¹²⁵IプロティンA,それに続
いてオートラジオグラフィーすることにより処理した。
約2000個の選別したコロニーから,2個の検出可能なシグ
ナルが得られ,D-4と名付けたものは,ASP遺伝子をA-38の
10-20倍量，すなわち計算すれば２〜５μg/ml ASPに対
応する量の発現を示した。

キャラクタリゼーション D-4細胞系より分泌されたASPをアフィニティークロマト
グラフィーで無血清培地より単離し，気相ミクロシーク
エンサーでＮ末端の配列を決めた。16アミノ酸の配列の
決定では，肺の洗浄により単離した蛋白のＮ末端部分と
完全に相同性を示した：全体の70％はＮ末端Glu残基を
含んでいた：残りの30％は,N末端Val（Gluに関して２
位）を含むように削られた。これは，単離された洗浄蛋
白と同じ組成である。ヒドロキシプロリンは,10,13およ
び16位に存在し，翻訳後のプロセッシングを表す細胞の
能力を示している。

加えて，プールASP1（上記）由来およびプールASP2（上
記）由来の分泌された蛋白画分とともにD-4により分泌
された蛋白をウエスタンブロットを用いて，ヒトの蛋白
症の肺の洗浄物の蛋白と比較した。誘導された細胞由来
の無血清培地をTCA沈澱させ,Endo.Fで処理し（あるいは
処理せずに），そして12.5％のゲル中でSDS-PAGEにかけ
た。このゲルをエレクトロブロットし，ウサギの抗ヒト
ASPポリクローナル抗血清，続いて¹²⁵I−プロティンＡ
とドットで保温した。この結果を第11図に示す。

レーンＡおよびＦは,Endo.Fに分離する前およびその後
の１μｇの肺胞の蛋白症の蛋白を含む。レーンB,Cおよ
びＤは，それぞれEndo.F未処理のD-4,ASP-Iプール，お
よびASP-Gプール由来の培地を示す。レーンG,HおよびＩ
は,Endo.Fで処理したこれらの上澄液由来の蛋白を示
す。Endo.F処理は全ての蛋白の見かけの分子量を減じて
おり，より分離したバンドを生じることが明らかであ
る。

生産の実施 pMT-Apo:gHS（HinfI/EcoRI）の多コピーを含む過度にト
ランスフェクションした細胞系（細胞系D-4）を，ロー
ラーボトル中で生産レベルの実施において用いた。850c
m四方のローラーボトルに,10％FCS,15mM Hepes,pen/str
ep,およびグルタミン中で,2×10⁶の細胞を含む10cmの皿
で植菌した。この細胞が集密的に達すると（２〜３
日）,PBSで２度洗浄し,FCSのない250mlのF12/DMEM 21,1
0mM Hepesに置き換えた。次の日は，この細胞に250mlの
F12/DMEM 21,10mM Hepes,5×10^-5塩化亜鉛，10^-6Mデキ
サメタゾン，および0.25mMアスコルビン酸，を加えた。
この細胞を２日ごとに取り出し,1000rpmで10分間遠心
し，−20℃で凍結させた。生産は,1〜５μg/ml/dayで，
上記で述べたように,5000培希釈でポリクローナル抗イ
ヌASP抗血清を用いてドットブロットウェスタンで分析
した。生産は約14〜17日後に低下する。

D.9.ASP成分の活性 単離したASP成分の空気／水の界面で脂質膜を形成する
のを高める能力を,Hagwood,S,ら，Biochemistry（198
5）24:184-190に記述の方法を用いて，イン ビトロで
分析した。簡単に言うと，試験蛋白を適当な比率で持つ
リン脂質小胞の調製物を，水成の緩衝液，磁性攪拌器，
およびプラチナ板を含むテフロン皿の底に，微量を，注
意深く加える。このプラチナ板は緩衝液の表面に取り付
けられ，ストレインゲージに付着している。ストレイン
ゲージに表示される表面張力の変化は，攪拌器を始動す
るとすぐに時間の関数として記録される。

10K蛋白を含むクロロホルム溶液と，脂質の2:1 V/Vクロ
ロホルム：メタノール溶液と混ぜることにより,10K蛋白
をリン脂質に加えた。この溶媒を蒸発させ，小胞を得る
ために緩衝液中に固体を水和させた。32K蛋白は，小胞
の懸濁液となるように直接水性溶液に加えられ得る。こ
れは，小胞の会合に関連して，濁度の測定により検出さ
れ得る。

Hawgoodら（上記）が報告したように，リン脂質がイヌ
の肺の表面活性物質の複合体から得られると,32Kイヌの
ASPはリン脂質小胞を会合させ得，リン脂質小胞に含ま
れると膜の形成を高め得る。本発明の蛋白の活性は,Haw
goodが先に述べたのと同じ，会合や膜形成を測定する方
法を用いて評価される。

上記で述べたように調製したイヌの肺由来のリン脂質調
製物（300μｇ）およびリン脂質の合成混合液の両方を
用いた。この合成リン脂質は,240gの市販のDPPCおよび6
0μｇの卵のPGを含んでいた。これは，天然の脂質より
もずっと膜を形成しにくい。しかしながら，この試験リ
ン脂質は，蛋白の活性を最も効果的に表現するように選
択された。

この32K蛋白と10KASPの混合液とは，上記で述べたよう
に，イヌの肺から単離された。この32K蛋白を60μｇ加
えると，肺より得た“天然”のリン脂質による膜の形成
を，複合体それ自体で示されるのとほぼ同レベルにまで
高め得るのに対し，それだけでも適度に合成脂質を用い
ての膜形成が高められる。同じような結果が,13μｇの1
0K蛋白だけを加えて得られた。しかしながら,13μｇの1
0K調製物を,60μｇの32K蛋白を加える前に，合成リン脂
質小胞と保温すると，天然の複合体自体のそれと比較で
きる速さで，および程度で，膜形成が起こった。これら
の結果を第12図に示した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｎ 15/09 (72)発明者 コーデル，バーバラ アメリカ合衆国 カリフオルニア 94109 サンフランシスコ，プリースト ストリ ート 25 (72)発明者 ベンソン，ブラツドレイ ジエイ アメリカ合衆国 カリフオルニア 94117 サンフランシスコ，セブンテイーンス ストリート 4903 (56)参考文献 Ｎａｇｏｙａ Ｍｅｄ Ｊ．，Ｖｏｌ. 27，Ｎｏ．３−４（1982），Ｐ．213−226

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】精製され、単離された形の肺胞表面活性物
   質蛋白（ASP）であって、該ASPが以下のアミノ酸配列を
   有するヒト肺から単離される32K ASP:
2. 【請求項２】精製され、単離された形のヒト肺胞表面活
   性蛋白（ASP）を生産する方法であって、該方法は、 以下のアミノ酸配列を有するヒト肺からの32K ASP: をコードするDNAで、または該DNAが制御配列に作動可能
   に結合された組み換え発現ベクターで形質転換された組
   み換え宿主細胞を培養し、該コード配列を発現させてAS
   Pを生産する工程、 および、該生産されたASPを回収する工程 を包含する、方法。
3. 【請求項３】哺乳動物の呼吸困難症を治療するための薬
   学的組成物であって、該組成物は以下に示されるASPと
   薬学的に受容可能な賦形剤との混合物を有する組成物： ここで、該ASPは、以下の配列を有するヒト肺からの32K
   ASP: である、組成物。
4. 【請求項４】前記賦形剤が、リン脂質の小胞である特許
   請求の範囲第３項に記載の組成物。