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JPH07108920B2 - ハイブリツド粒状免疫原 - Google Patents
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JPH07108920B2 - ハイブリツド粒状免疫原 - Google Patents

ハイブリツド粒状免疫原

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JPH07108920B2
JPH07108920B2 JP60200690A JP20069085A JPH07108920B2 JP H07108920 B2 JPH07108920 B2 JP H07108920B2 JP 60200690 A JP60200690 A JP 60200690A JP 20069085 A JP20069085 A JP 20069085A JP H07108920 B2 JPH07108920 B2 JP H07108920B2
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Description

【発明の詳細な説明】 〔従来の技術および発明が解決しようとする問題点〕 免疫系は、病原体または毒素により引き起こされる病気
に対して脊椎動物を保護するための細胞、分泌因子およ
び応答の非常に複雑な機構である。哺乳動物は病気にか
かるが、ほとんどの場合生き残るという事実は、この系
の誤りやすさとその驚くべき能力の両方を示すものであ
る。免疫系は生体内および生体外の目的の両方について
広い用途が見い出されており、ワクチン注射、受動免
疫、および生体外診断、組織学、細胞学などのための抗
体の生産に用いられる。モノクローナル抗体の出現によ
り、免疫系は、ポリクローナル抗体が不適切であった様
々な目的のためのモノクローナル抗体の生産において、
その利用が非常に拡張した。
免疫系は複雑であり、そして完全には理解されていな
い。免疫系が宿主のペプチドおよび糖類から異種免疫原
を識別する様式はまだ明らかにされておらず、広範な研
究の主題である。哺乳動物宿主が異種タンパク質にさら
された場合、弱いかまたは検出不可能な免疫応答が得ら
れる場合が多数存在する。多くのワクチンは、免疫処置
の際に感染を生じ得る毒性の生物体の可能性を伴う、弱
毒化された生物体の使用に基づく。多くの場合、表面タ
ンパク質またはその免疫原性部分を用いて免疫処置する
ことが望ましいが、これは関連するエピトープ部位に対
する抗体を生産することができないかあるいは弱い応答
のため、不十分であることがしばしば認められる。多く
のタンパク質またはエピトープ部位は弱い免疫原性であ
ることがわかり、そのため異種宿主に注入したとき、着
目の部位に対する中和抗体は得られるとしてもほんのわ
ずかである。
したがって、着目のエピトープ部位に対して高い免疫原
性を示す組成物を調製できることは非常に重要である。
このようにして、ワクチン注射のときに増強された免疫
応答を得ることができ、受動免疫において活性であろう
抗体を提供することができ、そして抗体の生産に用いら
れる従来の宿主中で弱い免疫原性のエピトープ部位であ
るものに対する抗体を生産することができる。さらに、
複数の感染因子からのエピトープ部位を含有する組成物
を製造することが好ましいであろう。これらの組成物は
多価ワクチンとして利用することができ、高価でなく、
より効率的で、より安全な免疫処置体制を可能にするこ
とができるであろう。
Ｂ型肝炎ウイルスの全ゲノムはE. coli中でクローニン
グされ、そしてそのヌクレオチド配列が決定されている
〔Valenzuela等、Nature（1979）280:815-819:Valenzue
la等、Animal Virus Genetics（1980）57-70ページ〕。
Ｂ型肝炎表面抗原粒子は酵母菌S. cerevisiae中で合成
されそして組立てられている〔Valenzuela等、Nature
（1982）298:347-350〕。前表面（presurface）抗原領
域を含有するＢ型肝炎表面抗原粒子の酵母中での合成お
よび組立ては、「肝炎表面抗原粒子ワクチン（Hepatiti
s Surface Antigen Particle Vaccine）」と題する1984
年６月18日提出の米国特許出願第621,756号に記載され
ている。E. coli中の単純疱疹ウイルスの糖タンパク質
Ｄ遺伝子のクローニングおよび該遺伝子のヌクレオチド
配列は報告されている〔Watson等、Science（1982）21
8:381-384〕。クローニングされた糖タンパク質Ｄ遺伝
子は、「単純疱疹ウイルスの糖タンパク質Ｄの改良発現
（Improved Expression of Glycoprotein D of Herpes
Simplex Virus）」と題する1984年７月17日に提出され
た米国特許出願第631,669号において報告されているよ
うに、酵母菌中で発現されている。
ヒトマラリア寄生虫プラスモジウム・ファルシパルム
（Plasmodium falciparum）についてサーカムスポロゾ
イト（circumsporozoite;CS）タンパク質の配列がクロ
ーニングされている〔Dame等、サイエンス science（198
4）225:593およびEnea等、同文献628ページ〕。プラス
モジウム・ファルシパルム（P. falciparum）およびプ
ラスモジウム・ノウレシ（P. Knowlesi）からのCSタン
パク質は、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）
中で〔Youg等、Science（1985）228:958〕および酵母菌
中で〔SharmaおよびGodson,Science（1985）228:879〕
クローニングされている。また、プラスモジウム・ファ
ルシパルム（P. falciparum）のCSタンパク質からの合
成ペプチドは、マウスおよびラットに対して免疫原性で
あることがわかっている〔Ballou等、Science（1985）2
28:996〕。上の関連する開示のすべてを、本明細書の記
載の参考とされたい。
〔問題点を解決するための手段〕
天然のウイルス粒子形成性タンパク質の少なくとも一部
分と１または複数の着目のエピトープ部位を有する１ま
たは複数のオリゴペプチドとのハイブリッドウイルス粒
子形成性タンパク質を含むウイルス粒子を含んで成る新
規免疫原性組成物が提供される。該オリゴペプチドはバ
クテリア寄生体、異なるウイルスまたは他の感染因子か
らの抗原性領域を含むことができる。該粒子は、ハイブ
リッドタンパク質をコードする核酸配列を調製すること
によって形成される。この核酸配列は、単独の粒子形成
性タンパク質としてまたは１もしくは複数の異なる粒子
形成性タンパク質をコードする核酸配列と組合わせて、
発現のため宿主細胞中に導入される。前記核酸配列は宿
主内で発現されてポリペプチドを生産し、粒子に組立て
られる。これらの粒子は、粒子形成性ポリペプチドおよ
び着目のエピトープ部位の両方に対する抗体の生産のた
めの免疫原として使用することができる。
これらの粒子はワクチンとして使用することができ、あ
るいは単離可能なポリクローナルまたはモノクローナル
抗体の生産に使用できる。前記抗体は受動免疫、生体外
診断、細胞学、組織学または他の用途に使用することが
できる。
イントロンの存在下または不在下において、適切な読み
枠において、粒子形成性ポリペプチドの少なくとも一部
分をコードする核酸配列に連結されたエピトープ部位を
有する１もしくは複数のポリペプチドまたはオリゴペプ
チドをコードするポリヌクレオチド断片を用いることに
より、１または複数の前もって決定されたエピトープ部
位の免疫原性が増強された、新規免疫原性組成物が提供
される。ここで得られるハイブリッドタンパク質は、粒
子形成能力を保持している。特に、センス鎖の転写方向
において、１または複数の着目のエピトープ部位をコー
ドするポリヌクレオチド配列の３′末端に同じ方向で
５′末端が連結されたウイルス粒子形成性ポリペプチド
の少なくとも部分をコードする核酸配列が使用される。
着目のエピトープ部位をコードするポリヌクレオチド配
列は、粒子形成性ポリペプチドをコードする配列に接合
されたものは天然に存在しない。ハイブリッドタンパク
質をコードする生じたハイブリッド遺伝子は、転写調節
並びに翻訳開始および停止シグナルに連結され、そして
発現および粒子組立ての条件下で宿主中に導入される。
この組立ては、ハイブリッドタンパク質のみまたはハイ
ブリッドタンパク質と他の粒子形成性タンパク質との組
み合わせの粒子形成の結果であることができる。
パッケージング過程の一部分として、キャプシドタンパ
ク質をコードするウイルス遺伝子が宿主内で発現され、
そして組立てられてキャプシドを形成する。次いで、キ
ャプシドは従来法に従い分離され、そして抗体の形成を
刺激する免疫原として使用され得る。ハイブリッド粒子
形成性タンパク質の調製において使用すべき粒子形成性
ポリペプチドについての必要条件は、該ポリペプチドが
キャプシドの形成をもたらす宿主内で十分に安定である
こと；該ポリペプチドが細胞質内で自動的にキャプシド
に集成すること；粒子形成性タンパク質またはその断片
の末端が１または複数の異なるポリペプチド（例、オリ
ゴペプチド）によって変更され得、これにより前記異種
ポリペプチドが所望の抗原コンホメーションで粒子の表
面に提示されること；および粒子形成性タンパク質が発
現宿主内で細胞毒性ではないことである。
単細胞微生物宿主内で調製され得る粒子形成性タンパク
質の例は、Ｂ型肝炎表面抗原（HBsAg）、とくにＢ型肝
炎表面抗原の前駆物質、preS-B型肝炎表面抗原（preS-H
BsAg）である。
Ｂ型肝炎ウイルス（HBV）の粒子形成性タンパク質は、
その全体を使用することができ、その粒子形成断片とし
て使用することもできる。該断片は通常少なくとも約90
％のアミノ酸配列を有し、特にＮ−末端を保持し、preS
の少なくとも一部分、通常少なくとも５％、好ましくは
少なくとも約25％を含むことが望ましく、ここでpreS部
分の任意の部分、通常Ｎ末端からアミノ酸を除去するこ
とができる。preSポリペプチドは168のアミノ酸を有
し、そして断片が用いられるとき、それは通常約10〜10
0アミノ酸を有するであろう。preS部分は天然に存在す
るpreS部分、特にＣ末端部分の約25〜75アミノ酸、通常
35〜65アミノ酸を含むことができる。
粒子形成性タンパク質のための遺伝子は入手可能である
か、あるいは常用の技術に従って得ることができる。HB
sAgをコードする遺伝子はValenzuela等の前掲の文献（1
982）に記載されており、前駆体preS-HBsAg遺伝子は198
4年６月18日提出の米国特許出願第621,756号に記載され
ており、この関連開示は引用により本明細書に組込まれ
る。
粒子形成性タンパク質をコードする遺伝子が入手可能で
ある場合、このタンパク質を単離し、部分的に配列決定
し、そしてアミノ配列に基づいてDNAプローブを調製す
ることができる。次いでウイルスを単離し、適当ならば
断片にして約５〜20kbの断片を形成し、そしてこれらの
断片を分子量に従い分離し、そして二重型（duplex）の
形成についてプローブを用いてスクリーニングすること
ができる。二重型を形成する断片をクローニングし、精
製し、そしてサブクローニングしてより小さい断片を形
成することができ、そしてこれらをクローニングする。
次いでサブクローニングした断片を分子量に従い分離
し、そして再び二重型形成についてプローブでサブクロ
ーニングする。二重型を形成するこれらの断片は、マン
グビーンヌクレアーゼで開裂されたウイルスのゲノムを
スクリーニングするためのプローブとして使用すること
ができる。この酸素は遺伝子の末端付近で開裂させるこ
とがわかっている。McCutchan等、science（1984）225:
625-628参照。
別法として、クローニングした断片を配列決定し、転写
解読枠（open reading frame）を決定し、そして粒子形
成性タンパク質の既知の配列に一致する配列を単離し、
そしてこれを用いて構造遺伝子を定めることができる。
適当ならば、種々の遺伝子を操作して構造遺伝子の部分
を除去することができ、制限部位の導入または他の操作
上の便宜に備えて、天然アミノ酸の変化または保持をも
たらし得る特定のヌクレオチドを変更することができ
る。
余分のDNAは、制限、エキソヌクレアーゼ消化、例え
ば、Bal31、プライマー修復、試験管内（in vitro）突
然変異誘発、または他の操作技術により除去することが
できる。ハイブリッド配列の形成に使用することになっ
ている断片の各操作後、断片をクローニングし、精製
し、次の操作にかける。特定の粒子形成性ポリペプチド
に依存して、ハイブリッドタンパク質はN-末端領域また
はＣ末端領域に着目のエピトープを有することができ
る。こうして、着目のエピトープ部位をコードするDNA
配列は、粒子形成性タンパク質をコードする断片のセン
ス鎖の５′または３′末端に３′または５′末端がそれ
ぞれ読み枠で連結したセンス鎖を有することができる。
着目のオリゴペプチドをコードする配列は、天然源、合
成源またはそれらの組合わせのいずれからも得ることが
できるが、天然では粒子形成性タンパク質に連結しない
であろう。天然配列は短くすることができ、そうでなけ
れば変更して制限部位を導入することができ、発現宿主
に好ましいコドンを提供することができる。一般に、配
列は粒子形成性ポリペプチドの能力を妨害しないもので
あろう。典型的には、この配列は約50アミノ酸以下、し
ばしば、10〜20アミノ酸をコードするが、５アミノ酸以
下であってもよい。
特に着目されるものは、オリゴペプチドの少なくとも１
つのエピトープ部位をコードする配列であり、前記エピ
トープ部位は毒素上に、あるいは病原体の部分、例え
ば、表面または膜タンパク質、分泌タンパク質、エンベ
ロープタンパク質またはキャプシドタンパク質上に存在
する。ワクチンとしての該粒子の使用は、典型的には感
染因子と関連する着目のポリペプチドまたはオリゴペプ
チドを包含するだろう。このような感染因子としては、
例えば、次のものが挙げられるがこれらに限定されな
い：グラム陰性菌およびグラム陽性菌；ウイルス、とく
にヘルペスウイルス、AIDSに関連するレトロウイルスな
ど；寄生体、例えばヒトマラリア寄生体プラスモジウム
・フルシパルム（Plasmodium fulciparum）など。感染
因子が優性エピトープまたは繰り返し単位から構成され
ているものを有するとき、それらの配列を、本発明の構
成物中に含めるのが好ましい。用いる配列は、制限、ア
ダプターまたはリンカーの連結、試験管内突然変異誘
発、プライマー修復などにより末端を操作して、粒子形
成性タンパク質をコードする配列への結合に備えること
ができる。
DNA断片を結合する種々の技術が存在する。しばしば、
２つの断片の意図する接合部位の近くに制限部位が存在
するだろう。この場合、２つの末端が付着性でありかつ
相補的であり、そして失ったコドンが必要でないとき、
２つの末端を一緒に接合することができ、ここで適切な
読み枠が確立される。別法として、アダプターを使用す
ることができ、ここでアダプターは失ったヌクレオチド
の一部または全部を修復し、２つの断片が適切な読み枠
内に存在するようにするか、あるいは接合部において天
然アミノ酸と異なるアミノ酸をコードする異なるヌクレ
オチドを提供する。便利には、断片の１つをあるベクタ
ー上でクローニングし、適切な部位において制限し、次
いでさらに、例えば、制限、アダプターの挿入などによ
り操作し、他の断片を挿入し、次いでハイブリッド配列
をクローニングする。
ハイブリッド配列が調製されれば、それをさらに発現の
ために変更することができる。これには、ハイブリッド
配列を発現宿主内での発現のために適切な方向で転写調
節および翻訳シグナルへ接合させることが必要である。
単細胞の微生物または哺乳動物細胞の発現宿主として、
真核生物または原核生物を使用できる。いずれの場合に
おいても、ハイブリッド粒子形成性タンパク質の発現の
ために利用可能な広範な発現ベクターが存在する。原核
生物については、E. coli、B. subtilis、B. thermo
philusなどを使用できる。単細胞の真核生物について、
S. cerevisiae、S. kluveromyces、S. pombeなどを
使用できる。より高等の哺乳動物の細胞としてはマウス
細胞、ヒト細胞、サル細胞などが挙げられる。
酵母細胞中のハイブリッドタンパク質の発現が特に着目
される。酵母細胞中での発現のために、種々の発現ベク
ターを使用することができ、通常、構造遺伝子の組み込
み以外を望む時、２μ複製系を使用する。組み込みを望
む時、ベクターは組み込みによる形質転換の効率を高く
するためarsを用いることができる。ベクターは酵母内
での選択のために１または複数のマーカーを通常有する
だろう。マーカーは、栄養素要求性宿主に対する原栄養
性（prototrophy）、生物致死剤、例えば、抗生物質、
例えば、G418、ツニカマイシンに対する耐性または重金
属、例えば、銅または亜鉛に対する耐性、あるいは他の
選択方法を提供することができる。
酵母菌の転写開始調節配列は、種々の遺伝子、特にグリ
コリシス遺伝子、例えば、アルコールデヒドロゲナー
ゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナー
ゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、トリオ
ースリン酸イソメラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、等
の遺伝子、または他の遺伝子、例えば、酸ホスファター
ゼ、β−アクチン、α−アミラーゼ、熱ショックタンパ
ク質、メタロチオネイン等の遺伝子から誘導することが
できる。転写開始配列と一緒に操作可能であるいずれの
便利な転写終結配列を用いることができ、便利には、開
始配列と同じ遺伝子に関連した終結配列を用いることが
できる。さらに、組み込みが関係するとき、ハイブリッ
ド遺伝子は増幅を可能とする他の遺伝子、例えば、メタ
ロチオネイン遺伝子、例えば、銅キレイチン（chelati
n）遺伝子、ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子などと縦
列に配置することができる。
他の配列に加えて、各段階におけるクローニングを可能
にするために、原核生物複製系を含めることもできる。
種々の原核生物複製系、例えば、ColE1、P-1不適合性プ
ラスミド、R6、例えば、ラムダなどが存在する。
本発明の構成物は、次式により概略的に示すことができ
る。
〔Tpi 1−Tli 1−Ｇ−Tlt 1−Tpt 1〕m−En−〔Tpi 2−Tli 2
−Im−Tlt 2−Tpt 2〕ｆ−(Rpe)a−(Rpp)c−(M)d− 式中、 Tpiは転写開始調節シグナルである； Tliは翻訳開始調節シグナルである； Tltは翻訳停止調節シグナルである； Tptは転写停止調節シグナルである； ここで上付きの１および２は種々の調節配列が同一また
は異なることができることを示し、ここで全ての調節配
列は同一宿主により認識されることができ、かつ同一宿
主中での発現のために機能することができる； Ｇは、発現宿主をストレス、例えば、抗生物質または重
金属から保護しそして遺伝子およびフランキング領域を
増幅させ、遺伝子およびフランキング領域の縦列のコピ
ーを形成するような生成物をコードする遺伝子である；
望ましくは、この構成物を構成する遺伝子およびフラン
キング領域は、ゲノム中への組み込みの可能性を増大さ
せるように発現宿主のゲノムと相同性を有する配列を含
むだろう；特に着目される遺伝子としては、ジヒドロ葉
酸レダクターゼをコードする遺伝子、カナマイシン耐性
（G418）をコードする遺伝子、ツニカマイシン耐性をコ
ードする遺伝子および、重金属に対する耐性を与えるた
めのメタロチオネインをコードする遺伝子が挙げられ
る； Ｅは転写速度を増加させるエンハンサーである； Imは式(Agi)k−(prePP)b−Agpを有する免疫原であり、
式中、 Agiは、或るエピトープ部位に特異的な抗体の形成のた
めに免疫応答を誘導することができる、天然にはAgpに
接合しないエピトープ部位を提供する着目の抗原であ
る;prePPは、一般により大きいポリペプチドから開裂さ
れた、通常天然のＮ−末端ポリペプチドの全部または部
分であり、通常Agpを含み、そしてAgiとAgpとの間の結
合として働くことができるポリペプチドである； m,nおよびｂは０または１である； ｋおよびｆは各々１以上、典型的には２または３であ
り、そして典型的には、ｋが１より大であるとき、ｆは
１であり、そしてその逆も同様である； Agpは粒子形成性抗原であり、天然に存在する粒子形成
性抗原またはその部分と実質的に同一であり、前記部分
はAgiと一緒に粒子を形成することができ、そして宿主
内で粒子を形成し且つ抗体の生産のためにAgiの暴露を
備えるいかなるウイルスからも誘導することができ、特
にHBsAg抗原である； RpeおよびRpeは真核生物および原核生物細胞のための複
製系である； ａおよびｃは０または１である； Ｍはクローニングまたは発現宿主の選択のために用意さ
れるマーカーであり、ここで前記マーカーは同一または
異なることができ、そして生物致死剤、例えば、抗生物
質、重金属などに対する耐性；栄養素要求性宿主への原
栄養性の提供：などが挙げられる； ｄは０〜５、通常１〜４である； 角カッコ内の配列はDNA配列の出現の好ましい順序の指
示を与え、一方角カッコの外側の部分はいずれの順序で
あってもよい。
種々の配列は常用の技術に従って連結することができ
る。制限部位が機能性配列、例えば、調節配列、コード
配列など、の外側に存在する場合、制限部位が相補的で
ある２つの配列を連結することができ、あるいは２つの
配列の連結にリンカーを使用できる。通常、クローニン
グベクターを使って、構成物は漸進的に作製されるであ
ろう。この場合、断片をクローニングベクター中に段階
的に挿入し、クローニングし、ベクターを単離しそして
精製する。制限部位が機能性配列の外側に存在しないか
機能性配列に関して不都合に位置している場合、機能性
配列の全部または一部分を再生しかつ２つの機能性配列
を適切な配向で一緒に連結するようなアダプターを使用
することができる。別法として、配列の突然変異誘発に
より便利な制限部位をつくることができ、そしてそのよ
うな部位を連結操作に使用することができる。前記配列
を一緒に接合する効率を改良する種々の技術として、１
つの配列のアルカリホスファターゼ処理、平滑末端連結
に備えた配列のフィルイン、尾（tail）の付加などが挙
げられる。
必要な機能性配列を有する構成物がいったん調製されれ
ば、この発現構成物を、任意の便利な技術により、例え
ば、形質転換、例えばポリエチレングリコール沈澱、接
合、トランスフェクション、形質導入などにより適合性
宿主中に導入することができる。次いで、受容細胞を適
当な栄養培地中で所望密度に増殖させ、細胞を収得し、
溶解産物を便利な手段、例えば、ガラスビーズの存在下
での攪拌により調製し、そして所望のタンパク質を収得
する。
本発明のタンパク質は発現宿主内で自然に凝集して粒子
を形成するだろう。粒子を包んで（envelope）脂質被膜
を有するようにすることができ、この被膜はウイルスに
よりコードされる膜タンパク質を含むかまたは含まない
ことができる。あるいは、粒子は脂質膜を含まなくても
よく、または膜は最初は存在しているか、または全体的
もしくは部分的に除去することができる。
粒子は様々な方法で免疫原として使用できる。粒子は、
存在する抗原のいずれか一方あるいは両方を認識するカ
ラムを用いたアフィニティクロマトグラフィーにより単
離することができ、あるいは別法として、密度勾配、ゲ
ル濾過などを用いて分離を行うことができる。これらの
技術は個々にまたは組み合わせて用いることができる。
死ウイルスワクチンを投与する常法のいずれを適用する
こともできる。固体の生理学的に許容されうる基剤上ま
たは生理学的に許容されうる分散液中で、非経口的な、
注射による適用などが挙げられる。ワクチンの適量は投
与の経路に依存し、そして宿主の大きさに従って変化す
るであろう。ワクチンは、あるとしても、副作用はわず
かであるので、宿主に損傷を与えないで、比較的大きい
投与量を用いることができる。ワクチンの量は、ワクチ
ンによる免疫処置を増強するために適当な担体またはア
ジュバントと混合した後、約１μｇ〜20mg/kg宿主、よ
り通常には約５μｇ〜20μg/kg宿主であり、皮下的にま
たは筋肉内に与えられるであろう。
ワクチン用のアジュバントの作用を達成する種々の方法
としては、リン酸塩緩衝化塩溶液中の0.05〜0.1％溶液
として通常使用されるアルミニウムの水酸化物またはリ
ン酸塩（みょうばん）；C. parvumのような細菌細胞ま
たはグラム陰性菌のエンドトキシンもしくはリポ多糖成
分との0.25％溶液混合物として使用される糖の合成ポリ
マー（Carbopol）との混合物；生理的に許容される油状
賦形剤、例えば、マンニットモノオレエート（Aracel
A）中の乳剤；または代用血液として使用されるペルフ
ルオロカーボン（Fluosol-DA）の20％溶液を有する乳剤
の使用が挙げられる。
アジュバントの使用量は、アジュバントの性質に依存し
て広く変化し、一般に免疫原の重量の0.1〜100倍であ
り、より通常約１〜10倍であろう。
多くの場合、ワクチンの多数回の投与が望ましいであろ
う。通常、接種は６回を越えず、より普通には４回を越
えず、好ましくは１回以上、通常約３回である。接種は
通常２〜12週の間隔、より通常には３〜５週の間隔であ
り、必要に応じて１〜５年の間隔で定期的なブースター
注射を行う。免疫処置の過程は、着目の抗原に対する抗
体の存在についてアッセイすることにより追跡すること
ができる。
本発明の粒子は、また、着目の抗原に対する抗体の存在
を検出するためのアッセイにおいて使用できる。アッセ
イでの使用においては、個々のタンパク質または粒子
は、アッセイに使用される種々の標識のうちの１つで通
常標識されるであろう。これらの標識は特許および技術
文献に広範に報告されており、例えば放射性核種、蛍光
物質、化学発光物質、酵素、酵素基質、小さい分子など
を包含する。
本発明の粒子は、種々の哺乳動物宿主、例えばネズミ、
ウシ、ブタ、ウサギ、ヒトなどにおける抗体の生産に使
用することができる。次いでこの抗体を、着目の抗原の
存在をアッセイするイムノアッセイにおいて使用するこ
とができる。あるいは、抗体を受動免疫に使用すること
ができ、そして常法で哺乳動物宿主に体内投与すること
ができる。
本発明の粒子は常法において抗血清またはモノクローナ
ル抗体の生産に使用することができる〔KohlerおよびMi
lstein,Nature（1975）256:495-497、この開示を引用に
よって本明細書に加える〕。モノクローナル抗体の生産
については、ハイブリドーマを培養して増殖させるか、
腹水の形成のために腹腔内注射するか、あるいは同種累
系の宿主または免疫欠損（immuno-compromised）宿主の
血液中に注射することができる。次いで、抗体を常法で
単離することができる。
〔実施例〕
以下、実施例により、本発明を更に詳細に説明するが、
これは本発明を限定するものではない。
実験 TE 10mM Tris-HCl,pH8.0,1mM EDTA EDTA エチレン−ジアミン−四酢酸 PBS リン酸塩緩衝化塩溶液 SDS ドデシル硫酸ナトリウム BSA ウシ血清アルブミン ADH アルコールデヒドロゲナーゼ GAPDH グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナー
ゼ HSV 単純疱疹ウイルス gD 糖タンパク質Ｄ HBV Ｂ型肝炎ウイルス HBsAg Ｂ型肝炎表面抗原 pre-S 前表面（pre-surface） HRP 西洋ワサビペルオキシダーゼ kbp キロ塩基対 すべてのDNA操作は標準手順に従って実施した。Molecul
ar Cloning,T.Maniatisら、コールド・スプリング・ハ
ーバー・ラボラトリーズ（Cold Spring Harbor La
b.）、ニューヨーク、1982参照。クローニングに使用し
た酵素はNew England BiolabsまたはBethesda Research
Laboratoriesから入手し、そして供給者の指示に従っ
て使用した。酵母を形質転換し、そして種々の培地、例
えば、選択的培地（ロイシンを含まない酵母窒素源）;1
％（W/V）酵母エキス、２％（W/V）ペプトンおよび２％
（W/V）グルコースを含有するYEPD培地、並びに他の適
当なおよび／または下に詳述する培地を用いて増殖させ
た。平板培養の場合には、培地は２％（W/V）寒天、お
よび形質転換のため、３％の上層寒天を含有した。培地
の組成は、Shermanら、1979、Methods in yeast geneti
cs:A Laboratory Manual、コールド・スプリング・ハー
バー・ラボラトリーズ、ニューヨークに記載されてい
る。
1.ハイブリッド抗原（preS-HBsAg-gDおよびpreS-HBsAg-
CS）のための酵母発現ベクターの作製に使用するベクタ
ーの説明 1a.プラスミドpC1/1 欧州特許（EPO）83/306507.1参照。その関連部分を引用
によって本明細書に加える。
1b.プラスミドpYH119 このベクターは、pC1/1（前述）のBamH I部位にクロー
ニングされたグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロ
ゲナーゼ（GAPDH）発現カセット中に部分的gD遺伝子を
含有する。クローニングされた部分的gD遺伝子はそれぞ
れ５′末端および３′末端のコード領域中に600bpおよ
び2400bpの２つの欠失を含有する。これらの欠失はシグ
ナル配列（５′）の大部分とアンカー配列（３′）コー
ド領域の全部を含んで成る。pYHS119を作製するため、
次の２つの断片を得た：（ｉ）pBR322配列、GAPDHプロ
モーター＋GAPDH構造遺伝子の最初の７つのコドンおよ
びGAPDHターミネーターを含んで成る、NcoI-SalＩ消化
ベクター（6.8kbp）。このベクターはpUH28（後述）のN
coＩ消化、次いでSalＩでの部分的消化およびゲル電気
泳動による精製により調製された。
（ii）部分的gD遺伝子を含有するNcoI-（NarＩ）‐Sal
Ｉ断片（873bp）。この断片は次のようにして得た：プ
ラスミドpYHS115（後述）をNcoＩおよびSalＩで消化
し、gD遺伝子を含有する生じた1430bp断片をゲル電気泳
動により精製し、引き続いてNarＩで消化した。873bpの
NcoI-NarＩ断片をゲル電気泳動により単離した。次の配
列の合成アダプター： （これはNarI 5′オーバーハング、リーディングフレー
ム中の３コドン、終止コドンおよびSalＩの５′オーバ
ーハングに対して相補的なヌクレオチドを提供する）を
873bpのNcoI-NarＩ断片に結合し、次いでSalＩで消化し
てNcoI-（NarＩ）SalＩ断片を生成した。
これらの２つの断片を一緒に連結せしめ、pBR322由来の
ベクターを生成した。このベクターは読み枠においてGA
PDH遺伝子の最初の７つのコドンと融合した部分的gD遺
伝子を含有し、GAPDHプロモータがその５′末端に隣接
し、そしてGAPDHターミネーターがその３′末端に隣接
していた。このプラスミドをBamHＩで消化し、そしてゲ
ル電気泳動により3.4kbp断片を精製することによってgD
発現カセットを得た。この断片を、BamH I消化され、ア
ルカリ性ホスファターゼ処理されたpC1/1（前述）に連
結して、pYHS119を得た。
1c.プラスミドpUH28の作製 プラスミドpUH28は、正しくない読み枠においてGAPDH構
造遺伝子の最初の７コドンと融合したＢ型肝炎表面抗原
（HBsAg）遺伝子のコード領域および３′非コード領域
を含有する。この融合物の５′末端にGAPDHプロモータ
ーが隣接し、そして３末端にGAPDHコード領域の部分に
続いてGAPDHターミネーターが隣接する。このプラスミ
ドは、次の配列を有するGAPDH構造遺伝子の最初の７コ
ドンの３′末端にNcoＩ部位を有するように作製した： このNcoＩ末端を部分的gD断片に連結する時、（前述のp
YHS119の作製を参照）、gDタンパク質についての正しい
読み枠が再生される。断片（ｉ）の調製において使用し
たSalＩ部位（前述した）はGAPDHターミネーターの５′
領域に存在する。したがって、HBsAgコード領域＋非コ
ード領域およびGAPDHコード領域を、pUH28をNcoＩで消
化しそしてSalＩで部分消化することにより除去した。
pUH28の作製は、pHBS5-3 Hae2-1（後述）から調製した6
07bpの３′非コード領域およびHBsAgコード領域を含有
する断片をGAPDH含有ベクターpGAP2′（後述する）中に
クローニングすることを含む。前記断片を調製するた
め、pHBS5-3 Hae2-1をPstＩ消化により線状化し、NcoＩ
で部分的に消化し、そしてpBR322配列、HBsAgコード配
列および３′配列を含有する1.9kbpのPstI-NcoＩ断片を
ゲル電気泳動により精製した。この断片を引き続いてEc
oR Iで消化し、そしてHBsAgコード領域および３′非コ
ード領域を含有する1.2kbpのNcoI-EcoRI断片をゲル電気
泳動により精製した。プラスミドpGAP2′をXbaＩで線状
化し、そしてBal31で処理してほぼ100bpを除去した。こ
のプラスミドをNcoＩで引き続いて消化し、そして約9kb
pのベクター断片をゲル電気泳動により精製した。この
ベクターのNcoＩ末端とHBsAgをコードする1.2kbpのNcoI
-EcoRI断片とを連結した。陥凹末端をクレノウでフィル
インし、そして生じた平滑末端を、Bal31消化により得
られたベクターの平滑末端に連結してpUH28を作製し
た。
pHBS5-3 Hae2-1は、HBsAgコード領域および607bpの３′
フランキング配列を含有するプラスミドである。このプ
ラスミドは、同一の挿入断片を含有するが607bpの代わ
りにわずか128bpの３′非翻訳領域を含有するpHBS5-3の
誘導体である。プラスミドpHBS5-3は1984年５月11日提
出の米国特許出願第609,540号（13〜14ページ）に記載
されている。pHBS5-3 Hae2-1は次のようにして作製し
た。pHB-3200〔Valenzuela等、Nature（1979）280:815-
819〕からEcoRIで制限消化することによりHBVゲノム
（3.2kb）を切除した。この3.2kbpの断片をゲル電気泳
動により精製し、そしてEcoR I付着末端の連結により再
環化した。この閉じたHBVゲノムをHaeIIで消化し、３′
非コード領域中を切断する。陥凹末端をクレノウ断片に
よりフィルインし、そしてHind IIIリンカーを連結せし
めた。このDNAをHind IIIで、次にHBsAgコード領域中に
単一部位を有するXbaＩで切断した。586塩基対のHBsAg
のコード配列および607塩基対の３′非コード領域を含
有する1.2kbpのXbaI-Hind III断片を、ゲル電気泳動に
より単離した。この断片を、XbaＩおよびHind IIIで予
め切断しそしてアルカリホスファターゼで処理したpHBS
5-3中にクローニングして、pHBS5-3 Hae2-1を得た。
pGAP-2は、GAPDHコード配列、５′および３′フランキ
ング領域を有するBamH I挿入断片を含有するpBR322由来
のベクターである。このプラスミド中には２つのXbaＩ
部位が存在し、１つはコード領域中に存在し、そして１
つは３′フランキング配列中に存在する。pGAP-2′はpG
AP-2の誘導体であり、３′フランキング領域中に存在す
るXbaＩ部位が削除されている。このために、50μｇのp
GAP-2をXbaＩで部分的に消化し、Bal31で処理して、25
塩基対／端を除去し、そして連結した。このプラスミド
を用いてE. コリHB101を形質転換し、３′フランキン
グ領域中のXbaＩ部位の欠失について形質転換体を選択
した。
1d.pYHS115の構成 プラスミドpYHS115は、pC1/1（前述）のBamH I部位中に
クローニングされたグリセルアルデヒド−３−リン酸デ
ヒドロゲナーゼ（GAPDH）発現カセット中にgD遺伝子を
含有する。
GAPDH発現カセットは次のようにして作製した。３つの
断片を調製した（下に詳述する）： （ａ）346bpのpBR322および1061bpのGAPDHプロモーター
を含有するBamH I-Hind III断片（1407bp）、 （ｂ）gd遺伝子を含有するHind III-SalＩ断片（1430b
p）、および （ｃ）GAPDHターミネーターを含有するSalI-BamH I断片
（900bp）。
これらの断片を一緒に連結し、そしてこの混合物をBamH
Iで消化した。3.7kbpの得られたカセットをゲル電気泳
動により単離し、そしてBamH I切断され、アルカリホス
ファターゼ処理されたpC1/1に連結した。
断片（ａ）は、pGAP347（後述）をBamH Iで完全に消化
し、次いでHind IIIで部分的に消化することにより調製
した。346bpのpBR322および1061bpのGAPDHプロモーター
を含有する生じた1407bp断片を、ゲル電気泳動により単
離した。
pBR322中にクローニングされたGAPDHプロモーター（106
1bp）を含有するプラスミドpGAP347を作製した（1983年
２月22日提出の米国特許出願第468,589号参照）。
PolyA+RNAをS. cerevisiae酵母菌株A364Aから単離し
た。AMV逆転写酵素およびE. coliDNAポリメラーゼＩを
用いて、二本鎖cDNAを合成した。ポリ−dC−尾を、デオ
キシヌクレオチドターミナルトランスフェラーゼを使用
して、二本鎖cDNA分子に付加した。ポリ−dC−尾を有す
るcDNAをポリ−dG−尾を有するpBR322にアニーリング
し、そしてこれを用いてE. coliHB101を形質転換し
た。1000の形質転換体を標識PolyA+RNAへのコロニーハ
イブリダイゼーションによりスクリーニングし、そして
サブセットを制限エンドヌクレアーゼマッピングおよび
DNAシークエンシングにより更に検査した。GAPDH配列を
含有する３つのクローンがプールから単離された。１つ
のクローン（pcGAP-9）は約1200塩基付の挿入断片を含
有し、そしてこれを更なる研究に使用した。
Blattner等、Science（1977）196:161-169に従い、制限
エンドヌクレアーゼSau3Aで全酵母DNAを部分的に消化し
た後に得られる断片をラムダファージCharon28中に挿入
することにより、酵母遺伝子ライブラリーを調製した。
このファージライブラリーをpcGAP-9からの標識DNAでス
クリーニングすることにより、酵母GPDHコード配列を含
有するいくつかの断片を単離した。これらのクローンの
１つの酵母GAPDH遺伝子を、2.1kbpのHind III断片とし
てpBR322中にサブクローニングした（pGAP-1）。
GAPDHプロモーター領域をこれらのクローンから単離し
た。該プロモーターの３′部分を含有する約350bpのHha
I-Hind III断片を、次のようにして得た：（ａ）pGAP-1
をHinf Iで消化して、プロモーターの３′部分およびGA
PDHN−末端アミノ酸をコードする領域を含む約500bpの
セグメントを得る；（ｂ）Bal31で再切除し、GAPDHコー
ド領域を欠く400bpの断片を生成する（ATG開始コドンか
ら１塩基上流の３′末端）；（ｃ）Hind IIIリンカーを
付加する；そして（ｄ）HhaＩで切断して350bpのHhaI-H
ind III断片を生成する。プロモーターの５′部分を含
有する約700bpの第２Hind III-HhaＩ断片をpGAP-1から
単離し、350bpのHhaI-Hind III断片に結合し、そしてHi
nd IIIで処理する。生じた1061bpのHind III断片をゲル
電気泳動により単離し、そしてHind III消化されアルカ
リホスファターゼ処理されたpBR322中にクローニング
し、pGAP347を得た。
断片（ｂ）は次のようにして得た。HSV-1 Pattonライブ
ラリーから単離されたクローンＨをSacＩで消化した。
2.9kbpのSacＩ断片をゲル電気泳動により精製し、続い
てHind IIIおよびNruＩで消化した。gD遺伝子を含有す
る1430bpのHind III-NruＩ断片をゲル電気泳動により精
製し、次の配列 ５′−TGATAAG-3′ ACTATTCAGCT のNruI-SalＩアダプターと連結せしめ、そしてSalＩで
消化した。
断片（ｃ）は次のようにして得た。GAPDHターミネータ
ーを含有する900bp断片を、pUH28（前述）のBamH Iおよ
びSalＩ消化およびゲル電気泳動による精製により得
た。
1e.プラスミドpDC101の作製 このベクターは、pBR322誘導体（pBRΔR1-Sal、後述）
のBamH I部位中にクローニングされたGAPDH発現カセッ
ト中にpreS-HBsAg遺伝子（55コドンのpre-S領域を含
む）を含有する。このプラスミドを作製するため、3.2k
bpのBamH I発現部位をpHBpreSGAP347/19T（後述）からB
amH I消化により切り出した。ゲル電気泳動による精製
後、3.2kbpのBamH I断片を、BamH I消化され、アルカリ
ホスファターゼ処理されたpBRΔR1-Salに連結せしめ、
そしてE. coli中でクローニングしてpDC101を得た。
1f.プラスミドpBRΔR1-Salの作製 このプラスミドは、EcoR I部位とSalＩ部位との間の領
域が除去されそしてBamH I部位が造成されているpBR322
誘導体である。このプラスミドは、pBR322をEcoR Iおよ
びSalＩで消化することにより作製された。クレノウ断
片を用いて突出末端をフィルインした後、BamH Iリンカ
ーを連結せしめ、次いでBamH Iで消化し、ベクターを再
環化し、クローニングし、EcoR I部位を含有しないpBR
ΔR1-Salを得た。
1g.pHBpreSGAP347/19Tの作製 酵母グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ
（GAPDH）プロモーター領域;55アミノ酸をコードする16
5bpからなるpre-S HBV領域；前表面（pre-S）配列と一
緒の読み枠における表面抗原（HBsAg）のコード配列；
およびGAPDHターミネーター、を含有するカセットを、
次の４つの断片を連結することにより調製した：（ａ）
GAPDHプロモーターを含有する1407bpのBamH I-Hind III
断片；（ｂ）pre-S領域の最初の３アミノ酸をコードす
る14bpのHind III-EcoR Iアダプター分子；（ｃ）pre-S
領域のセグメント（52アミノ酸）およびHBsAg N−末端
領域の最初の32アミノ酸をコードする250bpのEcoR I-Xb
aＩ断片、および（ｄ）sAgコード領域およびGAPDHター
ミネーターを含有する約1580bpのXbaI-BamH I断片。
これらの４つの断片を、次のようにして段階的に結合し
た:4ピコモルの断片（ａ）（GAPDHプロモーター）を10
単位のT4 DNAガーゼの存在下260ピコモルのリン酸化さ
れた断片（ｂ）（14bpの合成アダプター）に連結せしめ
た。生成物（断片（ａ）‐（ｂ））を調製用ゲル電気泳
動により過剰のアダプター分子から分離した。約1.5ピ
コモルの単離断片（ａ）‐（ｂ）を、約1.5ピコモルの
断片（ｃ）（250bpのEcoR I-XbaI pre-SおよびHBsAg N
−末端領域）に10単位のT4 DNAリガーゼの存在下で連結
せしめた。約１ピコモルの生成物（断片（ａ）‐（ｂ）
‐（ｃ））を、５単位のT4 DNAリガーゼの存在下で、１
ピコモルの断片（ｄ）（1580bpのXbaI-BamH I,HBsAg C
−末端区域およびGAPDH終止因子）および0.01ピコモル
のBamH I消化した酵母菌ベクターpC1/1に連結せしめ
た。pC1/1中にクローニングされたカセットを含有する
プラスミドをE. coliHB101の形質転換後に単離した。
このプラスミドをpHBpreSGAP347/19Tと命名した。断片
（ａ），（ｂ），（ｃ）および（ｄ）を得るために用い
た方法を次に説明する。
断片（ａ）:50μｇのプラスミドpHBS56-GAP347/33（後
述）をBamH IおよびHind III（各10単位）で消化するこ
とにより、346bpのpBR322および1061bpのGAPDHプロモー
ターを含有する1407bpのBamH I-Hind III断片を調製し
た。この断片を１％のアガロース中で調製用ゲル電気泳
動により単離した。
GAPDHプロモーターおよびADHターミネーターの支配下に
HBsAgを含有するプラスミドベクターpHBS-56GAP347/33
を、次のようにして作製した。pGAP-347（前述）をSph
Ｉで完全に消化し、次いでHind IIIで部分的に消化し
て、約1060bpのGAPDHプロモーターおよび約530bpのpBR3
22を含有する約1700bpのSphI-Hind III断片を得た。こ
の1700bpのSphI-Hind III GAPDHプロモーター断片を、8
40bpのHind III-Hind III断片（HBsAgコード領域、26塩
基の５′非コード領域および128bp3′非コード領域を含
有し、後述のpHBS-56から得た）と連結せしめ、次いでA
DH-1終止領域を含有する350bpのHind III-SphＩ断片（p
HBS-56から単離した）と連結せしめた。2900bpのSphＩ
発現カセットを単離し、そしてSphＩで前もって消化し
たpHBS-56中でクローニングした。プロモーター、遺伝
子および終止領域が正しい配向にある得られたプラスミ
ド（pHBS-56GAP347/33）を単離した。
ADHプロモーターおよびターミネーターの支配下にHBsAg
遺伝子を含有するプラスミドpHBS56は、次のようにして
得た:26bpのpre-S領域、681bpのsAg領域および128bpの
３′−非翻訳領域を含有するHBsAgコード領域から得ら
れたTaqI-HpaＩ断片〔Valenzuela等、Nature（1979）28
0:815-819〕をEcoR Iリンカーと連結せしめ、そしてpBR
322中のEcoR I部位においてクローニングした。EcoR I
リンカーは配列GGAATTCCを有する。こうしてプラスミド
pHBS5を得た。
pHBS5のHBsAg-DNAセグメントをEcoR I消化により切り出
し、クレノウ断片を用いて平滑末端化し、そして両端に
おいて次の配列CAAGCTTGのHind IIIリンカーを使って接
合する。Hind IIIで消化した後、このHBsAg断片を、ADH
1プロモーターとターミネーター配列との中間のHind II
I部位で消化されたプラスミドpADH5（後述）のHind III
部位に挿入した。制限分析により決定した時に正しい方
向でHBsAg遺伝子をもつプラスミドをpHBS22と命名し
た。pHBS22をSphＩで消化してHBsAg発現カセットを含有
する約1500bpの断片を得、これをSphＩで消化されたpC1
/1中に挿入してpHBS56を与えた。
プラスミドpADH5は、−９位で終わる1500bpADH1プロモ
ーター断片を含有し〔Hitzeman等、Nature，（1981）29
3:717〕、このプロモーターはHind III部位でヌクレオ
チド913から1368までの約450bpのターミネーター単位に
連結されており、ベクターYEp13のBamH I部位中にクロ
ーニングされている〔BroachおよびHicks,Gene（1979）
8:121〕。
断片（ｂ）:pre-S領域の最初の３アミノ酸（met-glu-tr
p）をコードしかつ制限部位のために追加の５塩基を含
む14bpのHind III-EcoR Iアダプター分子を化学合成に
より得た： 断片（ｃ）:pre-S領域のセグメント（52アミノ酸）およ
び（HBsAg）Ｎ−末端領域の最初の32アミノ酸をコード
する250bpのEcoR I-XbaＩ断片は、プラスミドpHBV-3200
（５μｇ）〔Valenzuela等、Nature（1979）280:815-81
9〕を酵素EcoR IおよびXbaＩ（各10単位）で消化するこ
とより得、そして６％のポリアクリルアミド中の調製用
ゲル電気泳動により単離した。
断片（ｄ）:HBsAgタンパク質の残りのＣ−末端領域（19
4アミノ酸）をコードする約680bpおよび３′HBsAg非コ
ード領域およびGAPDHターミネーター領域に相当するほ
ぼ900bpを含有する約1580bpのXbaI-BamH I断片。この断
片は、（50μｇ）のプラスミドpHBS70-7Δ（後述）をXb
aＩおよびBamH I（各10単位）で消化し、そして生じた1
580bpの断片を調製用ゲル電気泳動により単離すること
によって得た。
プラスミドpHBS70-7Δは、BamH I部位中にクローニング
されたHBsAg遺伝子のためのGAPDH発現カセットを含有す
るpC1/1誘導体である。このカセットは、次のようにし
て、pUH7から作製されたpBR322誘導体であるプラスミド
pUH-7Δから得た。
プラスミドpUH7は、５′末端にGAPDHプロモーターが隣
接しそして３′末端にはGAPDHコード領域に次いでGAPDH
ターミネーターが隣接する、HBsAg遺伝子のコード領域
および３′非コード領域を含有する。このプラスミドは
pUH28（前述）とほとんど同一であり、唯一の相違は、p
UH7がpUH28中に存在するGAPDH構造遺伝子の最初の７つ
のコドンを含有しないことである。プラスミドpUH7はpU
H-28と同様にして作製するが、唯一の差はpGAP2のBal31
切除の程度がpUH7ではGAPDH構造遺伝子の最初の７コド
ンに相当する全ヌクレオチドがBal31により除去される
ものであったことにある。
pUH-7Δは、HBsAg遺伝子の３′非コード領域の一部分お
よびGAPDH遺伝子のコード領域が除去されている、pUH7
由来のプラスミドである。これを作製するため、２つの
断片を調製した。第１の断片は、pBR322配列並びにGAPD
Hプロモーターおよびターミネーター配列を含有する。
この断片は、pUH7をNcoＩで消化し、次いでSalＩで部分
的に消化することによって得た。NcoI-SalＩベクターの
バンド（ほぼ7kbp）をゲル電気泳動により精製した。12
8塩基対の３′非翻訳領域をもつHBsAgコード領域を含有
する第２断片は、pUH7をNcoI-HpaＩで消化することによ
って得た。0.8kbpの断片をゲル精製によって得た。上記
の両断片をそれらのNcoＩ付着末端で連結せしめ、クレ
ノウ断片を用いて陥凹末端をフィルインし、そして得ら
れた平滑末端を連結せしめpUH-7Δを得た。
2.イムノアッセイ用の免疫血清および抗体の調製 2a.HSV1糖タンパク質に対するウサギ血清 レンチルレクチンのカラムを用いたHSV1のアフィニティ
クロマトグラフィーにより、HSV1糖タンパク質を調製し
た。この糖タンパク質混合物を使用してウサギを免疫感
作した。
2b.HSV1糖タンパク質に対するウサギ抗体 レンチルレクチンのカラムに結合したHSV1糖タンパク質
に、HSV1糖タンパク質に対する血清（ａにおけるように
して調製した）を吸着させた。次いで吸着物質を溶出せ
しめ、HSV1糖タンパク質に対する精製抗体を得た。
2c.HBsAgに対するモノクローナル抗体（3A11） Valenzuela等、Nature（1982）298:347-350に記載され
るようにして遺伝子操作された酵母菌により、HBsAgを
生産した。この抗原を常法に従い使用してマウスのモノ
クローナル抗体を調製した〔KohlerおよびMilstein,Nat
ure（1975）256:495-497〕。
2d.CSペプチドに対するモノクローナル抗体（2A-10） 合成CSペプチドに対するモノクローナル抗体は、ニュー
ヨーク大学のV.Nussenzweig博士から入手した。
3.イムノアッセイ 3a.抗HSV1糖タンパク質被覆ビーズによるハイブリッド
抗原の捕捉および西洋ワサビペルオキシダーゼ（HPR）
に結合した抗HBsAg抗体による発色 HSV1糖タンパク質に対する抗体で被覆されたポリスチレ
ンビーズを、ミクロタイターのウエル中で42℃において
２時間異なる希釈度の酵母菌抽出物（または対照）と共
にインキュベーションした。インキュベーションの際に
gD抗原は固相抗体と結合するだろう。未結合物質を除去
するためにビーズを洗浄した後、HRPと接合したHBsAgに
対する第２抗体を（Abbott Auzyme§Kitから）、ビーズ
上の抗体抗原複合体とともに、室温において２時間そし
て４℃において一夜インキュベーションした。両者の抗
原決定基（gDおよびHBsAg）を含有する抗原分子に依存
して、抗体−抗原−抗体のサンドイッチが形成するだろ
う。ビーズを洗浄して未結合接合体を除去した。ペルオ
キシダーゼの活性（これはHBsAgの量に比例する）をｏ
−フェンレンジアミン〔OPD、アボット（abbott）〕を
用いて比色法によりアッセイし、そして発色を492〜600
nmにおける吸光度により決定した。限界内で、試料中の
抗原の量が多くなればなるほど、492〜600nmにおける吸
光度は高くなる。結果は、酵母抽出物1mlについてのOD
492-600単位の合計数として表わす。
3b.抗HBsAg被覆ビーズを用いるハイブリッド抗原の捕捉
およびウサギ抗HSV1糖タンパク質抗体へ結合したHRP接
合ヤギ抗ウサギ抗体を用いる発色 HBsAgに対するモルモット抗体で被覆されたビーズ（Abb
ott Auzyme§Kitから）を、酵母抽出物（または対照）
と共に42℃で２時間インキュベートした。水で洗浄した
後、HSV1−糖タンパク質に対する第２ウサギ抗体の1/20
0希釈液を加えた。インキュベーションを室温で２時
間、次いで４℃で一夜実施した。水で洗浄した後、第３
のペルオキシダーゼ接合ヤギ抗ウサギ抗体を加え、そし
てインキュベーションを室温で一時間続けた。上記のよ
うにしてペルオキシダーゼ活性を決定し、そして発色を
492〜600nmにおいて測定した。
3c.HBsAg ELISAアッセイ HBsAgに対するモルモット抗体で被覆されたビーズ（Abb
ott-Auzyme§Kitから）を、酵母抽出物（または対照）
と共に42℃で２時間インキュベートした。水洗後、第２
のペルオキシダーゼ接合ヤギ抗モルモット抗体を加え、
そしてインキュベーションを室温において１時間続け
た。上記のようにしてペルオキシダーゼ活性を決定し、
そして発色を492〜600nmにおいて測定した。
4.ウエスタン分析 形質転換した酵母細胞を10％のポリアクリルアミドゲル
上で電気泳動し〔Laemmli,Nature（1970）277:680〕、
そして続いてニトロセルロース上にタンパク質をエレク
トロブロッティングした〔Towbin等、Proc.Natl.Acad.S
ci.USA（1979）76:3450〕。２枚の同一フィルターをブ
ロッティングした。一方のフィルターをPBS中の10％ヤ
ギ血清と共に１時間予後インキュベーションし、続いて
ウサギ抗HSV1糖タンパク質抗血清であるいはCSタンパク
質に対するモノクローナル抗体（2A-10）で４℃におい
て12時間処理した。フィルターをPBS中の５％ヤギ血清
で洗浄し、そして西洋ワサビペルオキシダーゼと接合し
た第２のヤギ抗ウサギまたは抗マウス抗体（Boehringer
-Mannheim）を加えた。最後に、このフィルターを西洋
ワサビペルオキシダーゼ発色剤（Bio-Rad）と共にイン
キュベーションし、そして洗浄した。
第２のフィルターをPBS中の0.5％ゼラチンで１時間洗浄
し、続いて前述のようにして調製したHBsAgに対するモ
ノクローナル抗体（3A11）と共に室温で12時間インキュ
ベートした。このフィルターをPBSで洗浄し、そして西
洋ワサビペルオキシダーゼと接合した第２のヤギ抗マウ
ス抗体（Boehringer-Mannheim）を加えた。最後に、フ
ィルターを西洋ワサビペルオキシダーゼ発色剤（Bio-Ra
d）と共にインキュベートし、そして洗浄した。
結果 1.ハイブリッド抗原（preS-HBsAg-gD）のための発現ベ
クターpDC103の作製 gD遺伝子を含有する断片を、プラスミドpDC101（前述）
のpre-S領域に存在する単一のEcoR I部位中にクローニ
ングした。EcoR I部位はこの領域のコドン３および４に
及ぶ。gD遺伝子を含有する断片の調製、ベクターpDC101
の線状化およびホスファターゼ処理、gD断片とベクター
との連結、並びにE. coliHB101の形質転換について以
下に説明する。
1a.pDC101の線状化およびホスァフターゼ処理 10μｇのpDC101をEcoR Iで線状化した。EcoR Iはpre-S
領域の第３および第４のコドン内部を切断する。線状化
されたプラスミドを38単位の子牛腸ホスファターゼ（Bo
ekringer）で37℃にて45分間処理した。EDTAおよびSDS
をそれぞれ20ミリモルおよび0.5％の最終濃度に添加
し、そして65℃に10分間加熱することにより、反応を停
止した。反応混合物をフェノール：クロロホルム：イソ
アミルアルコール（25:24:1）で抽出し、水相をCL6Bカ
ラムに通過させてSDSを除去し、そしてブタノールで60
μｌに濃縮した。
この試料を１％調製用アガロースゲル上へ負荷し、そし
て6930bpのバンドを電気溶出させた。電気溶出した混合
物をブタノールで濃縮し、フェノール：クロロホルム：
イソアミルアルコール（25:24:1）で抽出し、エタノー
ルで沈澱させた。この線状化されそしてホスファターゼ
処理されたベクターを、TE中に約50ng/μｌの濃度に再
懸濁させた。
1b.gD遺伝子を含有する断片の調製 gD含有断片をpYHS119（前述）から得た。この目的に、1
0μｇのpYHS119を各100単位のBamH IおよびNcoＩで300
μｌの反応液中で消化した。37℃において３時間インキ
ュベーションした後、この反応混合物を調製用１％アガ
ロースゲル上に負荷し、そしてgD断片およびGAPDHター
ミネーターを含有する1788bpのBamH I-NcoＩ断片をゲル
から電気溶出した。ブタノールで濃縮した後、電気溶出
したDNA断片をフェノール：クロロホルム：イソアミル
アルコール（25:24:1）で抽出し、エタノールで沈澱
し、そしてTE中に50μg/μｌの濃度で再懸濁させた。
約2.5μｇの1788bp断片を30単位のNarＩで消化した。Na
rＩはgD遺伝子を３′末端で切断して２つのバンド（そ
れぞれgDおよびGAPDHターミネーターを含有する断片888
bpおよび900bp）を生成した。この反応混合物をフェノ
ール：クロロホルム：イソアミルアルコール（25:24:
1）で抽出し、エタノールで沈澱させた。沈澱物を20μ
ｌのTE中に再懸濁させた。
次の配列を有するEcoR I-NcoＩアダプターを合成した： このアダプターは、それぞれpDC101ベクターおよびgD断
片へ連結させたとき、EcoR IおよびNcoＩ部位を再生す
る。それはまた、pre-S領域のコドン４〜７およびgD断
片の最初のコドンのために用意される。次の配列を有す
る第２アダプターを合成した： このアダプターNarI-（EcoR I）は、それぞれpDC101ベ
クターおよびgD断片に連結させた時、NarＩ部位を再生
するが、EcoR Iを再生しない。
それは、また、gD断片の最後の３コドンおよびpre-S遺
伝子の第８コドンのために用意される。
２つのアダプターを、gDを含有する880bpのNcoI-NarＩ
断片に連結せしめた。連結は14℃において17時間実施し
た。次いでこの混合物を１％のアガロースゲル中で電気
泳動し、そして873bpと1078bpとの間の領域中のバンド
（φx/HaeIII MW標準に従う）を電気溶出した。DNA溶液
をブタノールで濃縮し、フェノール：クロロホルム：イ
ソアミルアルコール（25:24:1）で抽出し、そしてエタ
ノールで沈澱させた。沈澱物を水（30μｌ）中に再懸濁
させた。
1c.連結およびE.coli HB101の形質転換 精製したgD断片（連結アダプターをもつ）キナーゼ処理
し、そしてEcoR Iで線状化されアルカリホスファターゼ
処理されたpDC101に連結せしめた。連結は室温において
2.5時間実施した。反応混合物をエタノールで沈澱さ
せ、水中に再懸濁させ、そしてこれを用いてE. coliHB
101を形質転換せしめた。このようにしてプラスミドpDC
102が得られた。
1d.pDC102からのBamH IカセットのpC1/1へのクローニン
グによるpDC103の作製 プラスミドpDC102をBamH Iで部分的に消化した。GAPDH
プロモーターおよびターミネーターの支配下にハイブリ
ッド抗原を含有する生じた4203bp断片を、ゲル電気泳動
により精製し、そしてBamH I消化されアルカリホスファ
ターゼ処理されたpC1/1（前述）に連結せしめた。連結
は室温において３時間実施した。反応混合物をエタノー
ルで沈澱させ、水中に再懸濁させ、E. coliHB101の形
質転換に使用した。このようにしてプラスミドpDC103が
得られた。
2.単純疱疹ウイルスのgDエプトープおよびHBsAgエプト
ープが融合タンパク質に存在することの立証 2a.イムノアッセイ HSV gDおよびHBsAgエピトープが同一分子中に存在する
かどうかを決定するために、pDC103またはpHBpreSGAP34
7/19T（対照プラスミド、前述）により形質転換された
酵母の細胞溶解産物を、前述の２つのイムノアッセイの
各々を用いて試験した。
プラスミドpDC103またはpHBpreSGAP347/19Tを用いて、H
innen等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1978）75:1929-193
3の手順に従って、サッカロミセス・カルルスベルゲン
シス（Saccharomyces carlsbergensis）菌株2150-2-3
（Mat a,ade 1,leu 2-04,cir°）を形質転換した。形質
転換体をleu−プレート上で選択した。
単一の形質転換体コロニーを2.5mlの選択的leu-培地中
に接種し、そして30℃において24時間増殖させた。この
飽和培養物の0.5mlのアリコートを0.002％のアデニンを
含有するYEPD50ml中に接種し、そしてOD650６〜10まで
増殖させた。溶解緩衝液（10mMNaPO4,pH7.5,0.1％トリ
トンX-100）中でガラスビーズと共に攪拌し、そして遠
心分離により細胞破片を除去することにより、細胞不含
溶解産物を調製した。溶解産物をアッセイ緩衝液（50mM
NaPO4,pH7.0,0.1％BSA）中に希釈し、そしていくつかの
希釈液を試験した。
抗原を捕捉するための固定化抗HSV1糖タンパク質抗体お
よび第２のHRP接合した可溶性抗HBsAg抗体を使ったサン
ドイッチアッセイにおいて得られた結果を表１に詳しく
示す。発色は、抗HSV1糖タンパク質抗体で被覆されたビ
ーズへ結合した抗原中に存在するHBsAgエピトープに比
例する。表１が示すように、pDC103を含有する形質転換
体からの酵母溶解産物は固定化抗体および可溶性抗体の
両者と複合体を形成できるハイブリッド抗原を含有した
が、一方HBsAgを生産する対照プラスミドを担持してい
る細胞からの対照溶解産物はそのような能力をもたなか
った。それらの結果は、HBsAgエピトープおよびgDエピ
トープの両者は、pDC103形質転換体からの溶解産物中の
同一分子中に存在したことを示す。
抗原を捕捉するための固定化抗HBsAg抗体、およびgDエ
ピトープを検出するための第２の可溶性抗HSV1糖タンパ
ク質を用いると、同様な結果が得られる。この場合、発
色は抗HBsAg抗体で被覆されたビーズに結合した抗原中
に存在するgDエピトープに比例する。結果を表２に示
す。
表１および表２に記載する結果は、gDエピトープおよび
HBsAgエピトープの両者は同一分子中に存在することを
示した。さらに、これらの結果は、酵母中で合成される
ハイブリッド抗原が粒子中に組み立てられて存在するこ
とを示した。なぜなら、HBsAg単量体ではHBsAgへの結合
に用いられたAbbott Auzyme イムノアッセイにおいて
抗体との反応が非常に貧弱であるからである。
2b.ウエスタン分析 gDおよびHBsAgエピトープを含有する融合タンパク質が
合成されていたことをさらに確認するために、gDに対す
る血清またはHBsAgに対するモノクローナル抗体を用い
て、酵母抽出物についてウエスタン分析（前述）を実施
した。
このために、酵母菌株2150-2-3をpDC103,pYHS119,pHBpr
eSGAP347/19TまたはpC1/1（後者の３つは対照である）
で形質転換した。形質転換体をlue−プレート上で選択
した。
単一の形質転換体コロニーを2.5mlの選択的leu-培地中
に接種し、そして30℃において24時間増殖させた。この
飽和培養物の0.5mlのアリコートを0.002％アデニンを含
有するYEPD50ml中に接種し、そして低い密度（A6501.2-
2.3）に増殖させた。細胞を収穫し、そして約150〜300
μｌの細胞をタンパク質ゲルのための100μｌの試料緩
衝液中に懸濁させた〔Laemmli，Nature（1970）227:68
0〕。試料を煮沸し、渦動攪拌し、そして遠心により不
溶性物質を除去した。
各試料のアリコート（25μｌ）を２つの10％のポリアク
リルアミドゲル（Laemmli,前掲）の各々に負荷した。２
つのゲルを同時に電気泳動させた。電気泳動後、タンパ
ク質をTowbin等〔Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A（1979）7
6:4350〕の方法に従いニトロセルロースフィルター（BA
85,0.45μm,Schleicher and Schuell）上にブロッティ
ングした。
１枚のフィルターをウサギ抗HSV1糖タンパク質抗体で処
理し、そして西洋ワサビペルオキシダーゼと接合した第
２のヤギ抗ウサギ抗体（前述）を使用して発色させた。
この方法を用いて、pDC103で形質転換された酵母細胞の
抽出物中に約65kdの強いバンドが検出された。この分子
量はpreS-HBsAg-gD融合体の予想の大きさ（64.6kd）
（クローニングしたDNA配列から計算した）に非常に近
似する。したがって、この結果は、pDC103で形質転換さ
れた酵母中で融合タンパク質が合成されていたことを示
した。予想通り、gDについて予想される大きさを有する
ずっと小さいバンド（約30kd）がpYHS119で形質転換さ
れた酵母細胞の抽出物中で検出されたが、一方抗gDと反
応性のバンドはpC1/1またはpHBpreSGAP347/19T形質転換
体からの抽出物中に検出されなかった。
第２の同じフィルターをHBsAgに対するモノクローナル
抗体（3A11）で処理し、そして西洋ワサビペルオキシダ
ーゼと接合した第２のヤギ抗マウス抗体（前述）を使っ
て発色させた。この方法を用いると、pDC103で形質転換
された酵母菌細胞の抽出物中に65kdのバンドが検出され
たが、pHBpreSGAP347/19Tにより形質転換された細胞か
らの抽出物中に30kdのバンドは検出されず、そしてpYHS
119またはpC1/1形質転換体の抽出物中には全くバンドが
存在しなかった。これらの結果は、gDエピトープおよび
HBsAgエピトープの両方を含む融合タンパク質がpDC103
を担持している酵母菌細胞中で合成されていたことを示
した。この融合タンパク質は、gD（30kd）およびHBsAg
（30kd）断片の説明となる予想の大きさ（65kd）を有し
ていた。
3.gD-HBsAg融合タンパク質は粒子に組み立てられる。
preS-HBsAg-gD融合タンパク質が粒子に組み立てられつ
つあることを確認するため、pDC103で形質転換された菌
株の溶解産物をCsCl中の密度勾配にかけた。pHBpreSGAP
347/19Tを含有する細胞からの溶解産物を対照として使
用した。
単一形質転換体のコロニーを2.5mlの選択的leu-培地に
接種し、そして30℃において30時間増殖させた。この飽
和培養物の2mlのアリコートを使用して200mlの選択的le
u-培地に接種し、そして細胞を30℃においてOD650１〜
３まで増殖させた。溶解緩衝液（10mMNaPO4,pH7.5,0.1
％トリトンX-100）中でガラスビーズと共に攪拌し、そ
して細胞破片を遠心により除去することによって、細胞
不含溶解産物を調製した。SW-41ポリアロマー管中で1ml
の10mMNaPO4（pH7.5）あたり1.4gのCsClの溶液5.3mlを
添加し、そしてその上に1mlの同緩衝液あたり1.4gのCsC
lの溶液5.3mlを重層することにより調製したCsCl勾配上
に、0.6mlのアリコートを適用した。
勾配を30Krpmで４℃において36時間遠心した。23の0.5m
l画分を集め、そしてAbbott Auzyme§アッセイを用いて
それらの各々におけるHBsAg活性を検出した。タンパク
質をBio-Radアッセイにより測定した。得られた結果を
表３に示す。ハイブリッド構成物（pDC103）を含有する
細胞からの溶解産物は、画分18〜12に及ぶ単一ピークの
HBsAg活性を含有し、画分10において約（1.25g CsCl/ml
に相当する）最大の活性を有する。この活性は対照溶解
産物中に検出されるものと同時に移動し、このことによ
り、preS-HBsAg-gD融合タンパク質が、HBsAg単独で得ら
れるものに類似した粒子に組み立てられつつあることが
示され、外皮に包まれていると思われる。
4.ハイブリッド抗原（preS-HBsAg-CS）のためのpC1/1-M
CS発現ベクターの作製 4a.MCSコード領域の合成およびpDC101中へのクローニン
グ プラスミドpC1/1-MCSは、HBsAg-preSと組み合わされた
プラスモジウム・ファルシパルム（Plasmodium falcip
arum）のサーカムスポロゾイト（circumsporozoite;C
S）からの反復領域のハイブリッドである。P. falcipa
rumのCSタンパク質をコードする遺伝子はクローニング
されており、そしてこれらのポリペプチドの構造は明ら
かにされている〔Dame等、Sceince（1984）225:593およ
びEnea等、Sceince（1984）225:628、詳細についてはこ
れらの両記載を参照のこと〕。主な免疫優性（immunodo
minant）エピトープは、縦列の反復配列により形成され
たCS分子の大きなドメイン内に位置する。P. falciparumCSの41の反復四つ組（tetrad）のうちの
37を含んで成る４アミノ酸の反復Asn.Ala.Asn.Proをコ
ードするオリゴマーをキナーゼ処理し、そして連結せし
めて様々な長さの連鎖体を形成した。Asn.Val.Asp.Pro
（4/41の四つ組）をコードするキナーゼ処理したリンカ
ーを両端に連結せしめ、EcoR Iオーバーハングおよび配
向をスクリーニングするためのいくつかの他の制限部位
を造成する。
反復四つ組およびエンドリンカーの両者の配列を下に示
す。
この連結混合物をEcoR Iで消化し、そして５％未変性ア
クリルアミドゲル上で泳動した。300〜600塩基対に広が
るバンドを切り出し、溶出し、そして1a節に記載のよう
にしてEcoR Iで線状化されホスファターゼ処理されてい
るpDC101（前述）中に連結せしめた。
１〜10反復の大きさの範囲の７つの挿入断片が単離され
た（表４参照）。pC1/1（前述）中にクローニングする
ためにCS反復を含有するBamH I発現カセットを単離する
ために、反復体を初めにpHG101中にクローニングした。
このベクターはpDC101と同一であるが、preSコード領域
中のBamH I部位を欠く。
pHG101を作製するため、次の手順に従った:pDC101をEco
R Iで完全に消化し、次いでBamH Iで部分的に消化し
た。この消化から生ずる最大断片を、１％アガロースゲ
ルから対応するバンドを切り取りそしてDNAを溶出させ
ることによって精製した。次いでこの断片をフォスファ
ターゼ処理した。この手順により、EcoR I部位とBamH I
部位との間の30塩基対のpreSコード領域が除去された。
除去された配列を、pDC101中に存在する同一アミノ酸を
コードするがBamH I部位を再生しないキナーゼ処理され
た30マーの断片に連結せしめることにより、置き換えた
（配列を下に示す）。
４つのpDC101クローン（表４に示す）からのEcoR I断片
をpHG101中にサブクローニングした。この目的に、pDC1
01-MCSプラスミドをEcoR Iで消化した。挿入断片をゲル
電気泳動により精製し、そしてpHG101（前もってEcoR I
で消化され、アルカリホスファターゼで処理されてい
る）に連結せしめた。得られたプラスミド（pHG101-MC
S、表４参照）を酵母発現ベクターの調製において使用
した。
4b.HG101-MCSからのBamH I発現カセットをpC1/1にクロ
ーニングすることによるpC1/1-MCSの作製 プラスミドpHG101-MCS29,pHG101-MCS33およびpHG101-MC
S31をBamH Iで消化した。GAPDHプロモータおよびターミ
ネーターの支配下にハイブリッド抗原を含有する得られ
た断片を、ゲル電気泳動により精製し、そしてBamH I消
化されアルカリホスファターゼ処理されたpC1/1（前
述）に連結せしめた。連結は室温で３時間実施した。反
応混合物をエタノールで沈澱させ、水に再懸濁させ、そ
してこれを使用してE. coliHB101を形質転換せしめ
た。このようにしてプラスミドpC1/1-MCS29,pC1/1-MCS3
3およびpC1/1-MCS31が得られた。
5.マラリア病原虫のサーカムスポロゾイトエピトープお
よびHBsAgエピトープが融合タンパク質中に存在するこ
との立証 MCSエピトープおよびHBsAgエピトープを含有する融合タ
ンパク質が合成されつつあることを確かめるために、MC
SまたはHBsAgに対するモノクローナル抗体を使って酵母
抽出物についてウエスタン分析（前述）を実施した。
この目的に、酵母菌株サッカロミセス・セレビシェー
（Saccharomyces cerevisiae）PQ17（mat a,leu 2-04,
cir°）をpC1/1-MCS29（もしくはpC1/1-MCS31もしくはp
C1/1-MCS33）、pHBpreSGA347/19TまたはpC1/1（後の２
つは対照である）で形質転換した。形質転換体をleu-プ
レート上で選択した。
単一形質転換体のコロニーを2.5mlの選択的leu-培地中
に接種し、そして30℃において24時間増殖させた。この
飽和した培養物の0.5mlのアリコートを50mlのYEPD中に
接種し、低密度（A6501.2〜2.3）まで増殖させた。細胞
を収得し、そして約150〜300μｌの濃縮細胞をタンパク
質ゲルのための試料緩衝液100μｌ中に再懸濁した〔Lae
mmli,Nature（1970）227680〕。試料を煮沸し、渦動攪
拌し、そして不溶性物質を遠心により除去した。
各試料のアリコート（25μｌ）を、２つの10％ポリアク
リルアミドゲル（Laemmli、前掲）の各々に負荷した。
２つのゲルを同時に電気泳動した。電気泳動後、Towbin
等、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.（1979）76:4350の方法
に従い、タンパク質をニトロセルロースフィルター（BA
85,0.45μm,Schleicher and Schuell）上にブロッティ
ングした。一方のフィルターをモノクローナル抗MCS抗
体（2A-10）で処理し、そして西洋ワサビペルオキシダ
ーゼに接合した第２のヤギ抗マウス抗体（前述）で発色
させた。
予想される通り、抗MCSと反応性のバンドはpDC103形質
転換体からの抽出物中に全く検出されなかった。pC1/1-
MCS29（１反復）、pC1/1-MCS33（４反復）およびpC1/1-
MCS31（６反復）により形質転換された酵母からの抽出
物中に、約30kd,34kdおよび35kdのバントが検出され
た。第２の同じフィルターをウエスタン分析にかけたと
き、すべてのバンドがモノクローナル抗体（3A11）と反
応した。
これらの結果は、MCSエピトープおよびHBsAgエピトープ
を含有する融合タンパク質が、pC1/1-MCSプラスミドを
含有する酵母細胞中で合成されつつあったことを示す。
融合タンパク質は、MCSおよびHBsAgの両断片の説明とな
る予想されるサイズを有していた。
酵母中にハイブリッド抗原が存在しかつ粒子に組み立て
られることを更に確認するために、形質転換体の抽出物
を用いてHBsAgについてELISAアッセイを実施した。HBsA
gモノマーはAbott-Auzyme イムノアッセイにおいて抗
体との反応が非常に乏しいので、ELISAにおける抽出物
の反応性が組み立てられた粒子の存在を指示する。
pC1/1-MCS29で形質転換された酵母抽出物からのELISAの
結果は、約0.63〜2.06mg/lの粒子の発現レベルを示し、
一方pC1/1-MCS33については、この値は約0.22〜1.22mg/
lであった。
上記結果は、着目のエピトープを有するポリペプチドに
融合された粒子形成性ポリペプチドを発現するハイブリ
ッドDNA構成物を使用することにより、粒子を細胞内
で、特に単細胞微生物内で生産することができ、そこで
粒子形成性タンパク質と着目のエピトープの両方のエピ
トープ部位が提示される。このようにして、粒子形成性
ポリペプチドのエピトープと粒子形成性ポリペプチドに
融合した着目の天然ポリペプチドのエピトープの両方に
対する抗体の生産を可能とする免疫原が生産される。こ
こで、前記着目のポリペプチドは本来は粒子形成性ポリ
ペプチドに接合されない。このようにして、低抗原性の
エピトープは高い結合特異性および／または高い力価を
有する抗体の形成をもたらすことができる。また、有効
な免疫応答を得ることのできる安全で有効なワクチンを
提供することができる。さらに、複数のハイブリッド遺
伝子を用いることにより、異なる病原体のエピトープを
有する粒子を得ることができるので、同一粒子が同一種
の異なる株、別種の病原体などに対するワクチンのため
のキャリヤーとして働くことができる。
なお、前記のサッカロミセス・カールスベルゲンシス
（Saccharomyces carlsbergensis）2150-2-3（pDC10
3）は1984年９月７日にATCCに寄託され、ATCC Accessio
n No.20726を与えられた。また、サッカロミセス・セレ
ビシェー（Saccharomyces cerevisiae）,PO17（pC1/1-
MCS29）は1985年９月５日にATCCに寄託され、ATCC Acce
ssion No.20770を与えられた。
上記の説明においては本発明の理解を目的として具体例
等によって詳細を記載したが、特許請求の範囲に属する
限り、変形および変法が実施できることは言うまでもな
い。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/09 (72)発明者 フイリツプ ジエイ．バル アメリカ合衆国，カリフオルニア 94563, オリンダ，ブルツクウツド ロード 73 (56)参考文献 特開 昭56−63995（ＪＰ，Ａ) Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．298（22 Ｊｕ ｌｙ 1982） Ｐ．347−350

Claims (8)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】１または複数の病原性ウイルス又は毒素に
    存在するエピトープとして機能するポリペプチドに融合
    した、Ｂ型肝炎表面抗原から誘導される粒子形成性ポリ
    ペプチドの少なくとも一部分を含んで成る新規ハイブリ
    ッドペプチドであって、少なくとも１つの前記ポリペプ
    チドの少なくとも１つのエピトープを提供するととも
    に、発現の際に前記ハイブリッドポリペプチドが細胞宿
    主内で粒子を形成することができることを特徴とする、
    新規ハイブリッドポリペプチド。
  2. 【請求項２】前記ポリペプチドが、Ｂ型肝炎表面抗原の
    前表面ポリペプチドの少なくとも約25アミノ酸を介して
    前記粒子形成性ポリペプチドに結合している、特許請求
    の範囲第１項記載のハイブリッドポリペプチド。
  3. 【請求項３】前記宿主が単細胞微生物である、特許請求
    の範囲第１項記載のハイブリッドポリペプチド。
  4. 【請求項４】前記ポリペプチドの少なくとも１つが、病
    原体のエンベロープポリペプチドまたは他のオリゴペプ
    チドである、特許請求の範囲第１項記載のハイブリッド
    ポリペプチド。
  5. 【請求項５】１または複数のオリゴペプチドに融合した
    Ｂ型肝炎表面抗原の少なくとも主要部分を含んで成るハ
    イブリッドポリペプチドであって、少なくとも１つのオ
    リゴペプチドの少なくとも１つのエピトープを提供する
    とともに、発現の際に前記ハイブリッドポリペプチドが
    細胞宿主内で粒子を形成することができる、特許請求の
    範囲第１項記載のハイブリッドポリペプチド。
  6. 【請求項６】前表面ポリペプチドの少なくとも一部分を
    介して単純疱疹ウイルスのエンベロープＤタンパク質ま
    たはプラスモジウム・ファルシパルム（Plasmodium fa
    lciparum）のサーカムスポロゾイト（circumsporozoit
    e）タンパク質の少なくとも一部分に結合したＢ型肝炎
    表面抗原を含んで成る、特許請求の範囲第１項記載のハ
    イブリッドポリペプチド。
  7. 【請求項７】前記ポリペプチドが粒子形態である、特許
    請求の範囲第１項に記載のハイブリッドポリペプチド。
  8. 【請求項８】１または複数の病原性ウイルス又は毒素に
    存在するエピトープとして機能するポリペプチドに融合
    した、Ｂ型肝炎表面抗原から誘導される粒子形成性ポリ
    ペプチドの少なくとも一部分を含んで成り、少なくとも
    １つの前記ポリペプチドの少なくとも１つのエピトープ
    を提供するとともに発現の際に細胞宿主内で粒子を形成
    することができるハイブリッドポリペプチドを生産する
    方法であって、 読み枠内において前記粒子形成性ポリペプチドの前記部
    分をコードする第一DNA配列を、前記細胞宿主により認
    識される転写および翻訳調節シグナルを有するフランキ
    ング領域と共に、前記ポリペプチドをコードするDNA配
    列に連結せしめ発現DNA構成物を提供し、 前記DNA構成物を前記細胞宿主中に導入し、 そして 前記宿主を増殖させ、それにより前記ハイブリッドポリ
    ペプチドが形成されそして粒子に組み立てられる、こと
    を含んで成る方法。
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