JPH07114711B2 - 還元型補酵素の定量法 - Google Patents
還元型補酵素の定量法Info
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- JPH07114711B2 JPH07114711B2 JP28504987A JP28504987A JPH07114711B2 JP H07114711 B2 JPH07114711 B2 JP H07114711B2 JP 28504987 A JP28504987 A JP 28504987A JP 28504987 A JP28504987 A JP 28504987A JP H07114711 B2 JPH07114711 B2 JP H07114711B2
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は還元型補酵素の定量法及び定量用組成物に関す
る。
る。
還元型補酵素、たとえば還元型ニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチド（NADH）又は還元型ニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチドリン酸（NADPH）の定量はNAD（Ｐ）
Ｈの生成を伴う酵素反応の基質あるいは酵素活性の定量
に有用である。
ジヌクレオチド（NADH）又は還元型ニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチドリン酸（NADPH）の定量はNAD（Ｐ）
Ｈの生成を伴う酵素反応の基質あるいは酵素活性の定量
に有用である。
従来技術及び問題点 従来NAD（Ｐ）Ｈの定量法として例えばNAD（Ｐ）Ｈの
紫外部における吸収を直接測定する方法、NAD（Ｐ）
Ｈを電子伝達体を介して蛍光物質に導き、その蛍光の強
さを測定する方法、NAD（Ｐ）Ｈを電子伝達体を介し
てテトラゾリウム塩からホルマザンに導き、生成色素の
量を比色定量する方法、さらに最近NAD（Ｐ）Ｈに電
子伝達体を作用させ、スーパーオキシドジムスターゼ
（SOD）の存在下あるいは非存在下に生成する過酸化水
素を定量する方法（臨床化学・第15巻・第１号（1986）
20〜27、特開昭59−210899、特開昭62−19100）が知ら
れている。
紫外部における吸収を直接測定する方法、NAD（Ｐ）
Ｈを電子伝達体を介して蛍光物質に導き、その蛍光の強
さを測定する方法、NAD（Ｐ）Ｈを電子伝達体を介し
てテトラゾリウム塩からホルマザンに導き、生成色素の
量を比色定量する方法、さらに最近NAD（Ｐ）Ｈに電
子伝達体を作用させ、スーパーオキシドジムスターゼ
（SOD）の存在下あるいは非存在下に生成する過酸化水
素を定量する方法（臨床化学・第15巻・第１号（1986）
20〜27、特開昭59−210899、特開昭62−19100）が知ら
れている。
これらの方法には、以下のような短所がある。すなわ
ち、については、感度が低く、臨床検査に応用した場
合、紫外部での測定であるため、試料中の生体成分の影
響を受けやすい。については蛍光光度計が必要であ
る。については、微量成分の定量に際して感度が低
く、生成するホルマザンが水に難溶で、器具等に沈着
し、落ちにくく、テトラゾリウム塩、ホルマザンともに
光に不安定なものが多く、試薬保存面および測定時に注
意を要する。さらに生成する色素のλmaxが500nm前後で
あるため生体色素の影響を受けやすい。またについて
は試薬を２種類以上に分けることが必須である。すなわ
ち試料中のNAD（Ｐ）Ｈを測定しようとする場合、まず
試料中のNAD（Ｐ）Ｈに電子伝達体をSODの存在下あるい
は非存在下に作用させ過酸化水素に変換し、これをこの
最初の試薬液（第１試薬液）中に蓄積しておく必要があ
る。次に過酸化水素定量試薬を第２試薬液として第１試
薬液に添加し比色定量しなければならない。第１試薬液
と第２試薬液を混合した液にNAD（Ｐ）Ｈを添加しても
正確な測定を行うことはできない。この事実は、特に生
体試料を測定対象とした場合致命的な欠点となる。
ち、については、感度が低く、臨床検査に応用した場
合、紫外部での測定であるため、試料中の生体成分の影
響を受けやすい。については蛍光光度計が必要であ
る。については、微量成分の定量に際して感度が低
く、生成するホルマザンが水に難溶で、器具等に沈着
し、落ちにくく、テトラゾリウム塩、ホルマザンともに
光に不安定なものが多く、試薬保存面および測定時に注
意を要する。さらに生成する色素のλmaxが500nm前後で
あるため生体色素の影響を受けやすい。またについて
は試薬を２種類以上に分けることが必須である。すなわ
ち試料中のNAD（Ｐ）Ｈを測定しようとする場合、まず
試料中のNAD（Ｐ）Ｈに電子伝達体をSODの存在下あるい
は非存在下に作用させ過酸化水素に変換し、これをこの
最初の試薬液（第１試薬液）中に蓄積しておく必要があ
る。次に過酸化水素定量試薬を第２試薬液として第１試
薬液に添加し比色定量しなければならない。第１試薬液
と第２試薬液を混合した液にNAD（Ｐ）Ｈを添加しても
正確な測定を行うことはできない。この事実は、特に生
体試料を測定対象とした場合致命的な欠点となる。
すなわち生体試料中には、アスコルビン酸、尿酸、カタ
ラーゼ、ビリルビン、ヘモグロビン等過酸化水素消費物
質を存在するため、の方法のような過酸化水素を一定
時間、蓄積する必要がある場合、生体試料中に共存する
過酸化水素消費物質によって、蓄積中の過酸化水素が消
費され、測定値に負誤差を支える。
ラーゼ、ビリルビン、ヘモグロビン等過酸化水素消費物
質を存在するため、の方法のような過酸化水素を一定
時間、蓄積する必要がある場合、生体試料中に共存する
過酸化水素消費物質によって、蓄積中の過酸化水素が消
費され、測定値に負誤差を支える。
上記のような過酸化水素消費物質を除去するためには、
たとえば、アスコルビン酸に対するアスコルビン酸オキ
シダーゼ、尿酸に対するウリカーゼ、ビリルビンに対す
るビリルビンオキシダーゼ等による生体試料の前処理が
考えられるが、これらの前処理用酵素類等を第１試薬液
中に共存させ、前処理を行なわせる場合、逆に、これら
の酵素に混在するカタラーゼ活性や、ペルオキシダーゼ
活性によって、やはり蓄積中の過酸化水素が消費され、
測定値に負誤差を生じる恐れがある。またウリカーゼ等
の過酸化水素を生成する酵素は事実上前処理に使用でき
ない。厳密な前処理系を組もうとすれば、第１試薬液、
第２試薬液以外に、前処理用試薬液類が必要であり、操
作が繁雑となり、はなはだ不便である。また第２試薬液
中にペルオキシダーゼと色源体を共存させなければなら
ず、保存中の試薬の着色による測定誤差は避けられな
い。このようにの方法を実用化するには様々な問題点
が存在する。又NAD（Ｐ）Ｈと特定の色源体とを（ｉ）
ペルオキシダーゼ又はチオールオキシドリダクターゼ及
び（ii）ダイアホラーゼ又は電子キャリヤーの存在下に
反応させて生成する色素を定量することによりNAD
（Ｐ）Ｈを定量する方法が知られている（特開昭60−80
600） 問題点を解決するための手段 本発明によればNAD（Ｐ）Ｈは、下記一般式で表わされ
る化合物もしくはその塩の存在下、NAD（Ｐ）Ｈにペ
ルオキシダーゼ、ジアホラーゼを作用させ生成色素を
定量することにより定量できる。
たとえば、アスコルビン酸に対するアスコルビン酸オキ
シダーゼ、尿酸に対するウリカーゼ、ビリルビンに対す
るビリルビンオキシダーゼ等による生体試料の前処理が
考えられるが、これらの前処理用酵素類等を第１試薬液
中に共存させ、前処理を行なわせる場合、逆に、これら
の酵素に混在するカタラーゼ活性や、ペルオキシダーゼ
活性によって、やはり蓄積中の過酸化水素が消費され、
測定値に負誤差を生じる恐れがある。またウリカーゼ等
の過酸化水素を生成する酵素は事実上前処理に使用でき
ない。厳密な前処理系を組もうとすれば、第１試薬液、
第２試薬液以外に、前処理用試薬液類が必要であり、操
作が繁雑となり、はなはだ不便である。また第２試薬液
中にペルオキシダーゼと色源体を共存させなければなら
ず、保存中の試薬の着色による測定誤差は避けられな
い。このようにの方法を実用化するには様々な問題点
が存在する。又NAD（Ｐ）Ｈと特定の色源体とを（ｉ）
ペルオキシダーゼ又はチオールオキシドリダクターゼ及
び（ii）ダイアホラーゼ又は電子キャリヤーの存在下に
反応させて生成する色素を定量することによりNAD
（Ｐ）Ｈを定量する方法が知られている（特開昭60−80
600） 問題点を解決するための手段 本発明によればNAD（Ｐ）Ｈは、下記一般式で表わされ
る化合物もしくはその塩の存在下、NAD（Ｐ）Ｈにペ
ルオキシダーゼ、ジアホラーゼを作用させ生成色素を
定量することにより定量できる。
一般式（Ｉ）： 式中Ｙは水素原子もしくは を示し、Ｚは酸素原子又はイオウ原子を示し、Ｘは水素
原子、アルキル、アルケニル、アリル、アミノ又は置換
アミノを示し、R1はヒドロキシル、アミノ又は置換アミ
ノを示し、R2は水素原子、ヒドロキシル、アルキル、ア
ルコキシ、アリル、アルケニル、アミノ又は置換アミノ
を示し、R3R4、R5、R6は同一もしくは異なってよく、水
素原子、アルキル、アルケニル、アシル、アリル、ハロ
ゲン原子、ニトロ、スルホ、カルボキシル、ヒドロキシ
ル、アルコキシ、下記一般式III、IV、VI、VIIで表わさ
れる基を示す。
原子、アルキル、アルケニル、アリル、アミノ又は置換
アミノを示し、R1はヒドロキシル、アミノ又は置換アミ
ノを示し、R2は水素原子、ヒドロキシル、アルキル、ア
ルコキシ、アリル、アルケニル、アミノ又は置換アミノ
を示し、R3R4、R5、R6は同一もしくは異なってよく、水
素原子、アルキル、アルケニル、アシル、アリル、ハロ
ゲン原子、ニトロ、スルホ、カルボキシル、ヒドロキシ
ル、アルコキシ、下記一般式III、IV、VI、VIIで表わさ
れる基を示す。
一般式（III）： 一般式（IV）： 一般式（VI）： 一般式（VII）： 式中、A1はアルキレン基を示し、A2はR2と同意義であ
り、B1、B2、B3、B4、B5およびB6は同一もしくは異なっ
て水素原子、アルキル、アルケニル、アシル、アリル、
ハロゲン原子、ニトロ、スルホ、カルボキシル、ヒドロ
キシル、アルコキシ又はヒドロキシアルキルを表わす。
り、B1、B2、B3、B4、B5およびB6は同一もしくは異なっ
て水素原子、アルキル、アルケニル、アシル、アリル、
ハロゲン原子、ニトロ、スルホ、カルボキシル、ヒドロ
キシル、アルコキシ又はヒドロキシアルキルを表わす。
さらに反応にスーパーオキシドジスムターゼ（以下SOD
という）を存在させることによって生成色素が安定化さ
れる。
という）を存在させることによって生成色素が安定化さ
れる。
本発明方法によれば定量に必要な試薬を試料に加えて一
段階で反応させることによって目的を達成できるので極
めて簡便である。
段階で反応させることによって目的を達成できるので極
めて簡便である。
R1およびR2における置換アミノの置換基としてはアルキ
ル、アルケニル、アリル、ヒドロキシアルキル、シクロ
アルキル、アシル、アリルアルキル、アシルアルキル、
カルボキシル、アルコキシ、スルホ、スルホアルキル等
が例示される。
ル、アルケニル、アリル、ヒドロキシアルキル、シクロ
アルキル、アシル、アリルアルキル、アシルアルキル、
カルボキシル、アルコキシ、スルホ、スルホアルキル等
が例示される。
上記各定義におけるアルキルとは炭素数１−５の基を包
含し、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル等
が例示される。
含し、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル等
が例示される。
アルコキシ基とは炭素数１〜５の基を包含し、メトキ
シ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ等が例示される。
シ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ等が例示される。
アルケニルとしては炭素数２〜５の基を包含し、ビニ
ル、プロピレン、ブチレン等が例示される。
ル、プロピレン、ブチレン等が例示される。
アリルとはフェニル、ナフチル（これらの基は置換基を
有していてもよい）等が例示され、置換基としては１〜
４の炭素原子を持つアルキル、ハロゲン原子、アミノ、
アルコキシカルボニルアミノ、アルコキシカルボニルア
ミノアルキル、アルコキシ、アシル等が包含される。
有していてもよい）等が例示され、置換基としては１〜
４の炭素原子を持つアルキル、ハロゲン原子、アミノ、
アルコキシカルボニルアミノ、アルコキシカルボニルア
ミノアルキル、アルコキシ、アシル等が包含される。
アシルとしては、炭素数２〜５の基を包含し、アセチ
ル、プロピオニル、ブチリル等が例示される。
ル、プロピオニル、ブチリル等が例示される。
ハロゲン原子としてはフッ素原子、塩素原子、臭素原子
等が例示される。
等が例示される。
アルケニレンとは炭素数３〜４の基を包含し、−CH＝CH
−CH2−、−CH＝CH−CH＝CH−等が例示される。
−CH2−、−CH＝CH−CH＝CH−等が例示される。
本発明で定量しうる還元型補酵素としては、例えば、NA
DH、NADPH、還元型ピロロキノリンキノン等が挙げられ
るが、これらに限定されない。
DH、NADPH、還元型ピロロキノリンキノン等が挙げられ
るが、これらに限定されない。
本発明を実施するに際しては、一般にpH2〜11の緩衝剤
たとえばリン酸塩、トリス−塩酸、コハク酸塩、シュウ
酸塩、酢酸塩、Good等の0.005〜2mol/l液中に0.1〜1000
IU/mlのペルオキシダーゼおよび0.1〜1000IU/mlのジア
ホラーゼ又はNAD（Ｐ）Ｈオキシドリダクターゼ、0.1〜
500IU/mlのスーパーオキシドジスムターゼ及び化合物
（Ｉ）又はその塩を試料中の還元型補酵素に対し、等モ
ル以上、通常10〜1000倍モル含有させて試薬液とし、こ
れを還元型補酵素を含有する試料に加えて５〜50℃、好
ましくは25〜40℃で反応させる。
たとえばリン酸塩、トリス−塩酸、コハク酸塩、シュウ
酸塩、酢酸塩、Good等の0.005〜2mol/l液中に0.1〜1000
IU/mlのペルオキシダーゼおよび0.1〜1000IU/mlのジア
ホラーゼ又はNAD（Ｐ）Ｈオキシドリダクターゼ、0.1〜
500IU/mlのスーパーオキシドジスムターゼ及び化合物
（Ｉ）又はその塩を試料中の還元型補酵素に対し、等モ
ル以上、通常10〜1000倍モル含有させて試薬液とし、こ
れを還元型補酵素を含有する試料に加えて５〜50℃、好
ましくは25〜40℃で反応させる。
生成色素の定量は定量可能なそれ自体公知の手法が適用
できるが反応後の反応液による吸収を生成色素の極大吸
収波長で試薬ブランクを対照として測定し、予め既知量
についての試験から求めた検量線を利用して試料中の還
元型補酵素を定量できる。
できるが反応後の反応液による吸収を生成色素の極大吸
収波長で試薬ブランクを対照として測定し、予め既知量
についての試験から求めた検量線を利用して試料中の還
元型補酵素を定量できる。
反応液中の還元型補酵素は0.0001〜1mg/mlとなるように
試薬液又は蒸留水で希釈した方が好ましい。
試薬液又は蒸留水で希釈した方が好ましい。
反応系には必要に応じてTritonX−100（商品名、ポリエ
チレングリコールモノ−ｐ−iso−オクチルフェニルエ
ーテル等の界面活性剤が用いられる。
チレングリコールモノ−ｐ−iso−オクチルフェニルエ
ーテル等の界面活性剤が用いられる。
少量のフェノールをペルオキシダーゼの活性化あるいは
色素形成反応促進のために反応系に加えることができ
る。
色素形成反応促進のために反応系に加えることができ
る。
本発明方法は後述の如く還元型補酵素を生成する反応系
に関与する反応物質あるいは酵素活性の定量に好適に応
用できる。特に還元型補酵素生成系が酸素反応である場
合、還元型補酵素生成反応と色素生成反応が同一系内で
行われることができるので短時間に定量できる。
に関与する反応物質あるいは酵素活性の定量に好適に応
用できる。特に還元型補酵素生成系が酸素反応である場
合、還元型補酵素生成反応と色素生成反応が同一系内で
行われることができるので短時間に定量できる。
測定すべき対象が基質である場合にはこれを分解して還
元型補酵素を生成する酵素を、対象が酵素活性である場
合には、その酵素の基質を化合物（Ｉ）又はその塩と共
に試薬液に加え、この試薬液を試料に加えて反応させ、
着色した反応液の吸収を測定することによって基質又は
酵素活性を測定できる。
元型補酵素を生成する酵素を、対象が酵素活性である場
合には、その酵素の基質を化合物（Ｉ）又はその塩と共
に試薬液に加え、この試薬液を試料に加えて反応させ、
着色した反応液の吸収を測定することによって基質又は
酵素活性を測定できる。
前述の如く、本発明方法によれば、生体試料を分析する
試薬系を組む場合、一試薬液系でNAD（Ｐ）Ｈの生成を
比色定量することが可能なのは当然であるが、より正確
な測定値を得るため、前処理用試薬を使用することも可
能である。
試薬系を組む場合、一試薬液系でNAD（Ｐ）Ｈの生成を
比色定量することが可能なのは当然であるが、より正確
な測定値を得るため、前処理用試薬を使用することも可
能である。
すなわち第１試薬液にペルオキシダーゼ、ジアホラーゼ
またはNAD（Ｐ）Ｈオキシドリダクターゼを含む前処理
系を組み、第２試薬液に化合物（Ｉ）又は、その塩を含
む反応系を組むことができる。例えばグリセロールデヒ
ドロゲナーゼを用いて血清中のグリセロールを定量する
系の場合、第１試薬液にペルオキシダーゼ、ジアホラー
ゼ又はNAD（Ｐ）Ｈオキシドリダクターゼ、酸化型NAD、
オスコルビン酸オキシダーゼ等を配し、第２試薬液にグ
リセロールデヒドロゲナーゼ、化合物（Ｉ）又はその塩
を配する。この系ではアスコルビン酸オキシダーゼにペ
ルオキシダーゼ活性が混在していても全く差しつかえな
い。又、特筆すべきは、色源体として、化合物（Ｉ）又
はその塩を用いた場合、カタラーゼ、尿酸、ビリルビン
等の過酸化水素消費物質の影響を受けない点である。こ
のことは第１試薬液で過酸化水素生成を伴う酵素等によ
る副反応を行なわせても、カタラーゼ等を第１試薬液に
共存させて、反応に関与しない過酸化水素を予め消去で
きることを示唆している。このようにより完全な前処理
を行うことにより、第２試薬液添加によって初めて開始
されるグリセロールデヒドロゲナーゼの反応によって生
成するNAD（Ｐ）Ｈの定量を非常に正確に行うことが可
能である。この場合、血清中のグリセロールは、第２試
薬液添加と同時にグリセロールデヒドロゲナーゼによっ
て第１試薬液からのNADがNADHに変換され、さらにジア
ホラーゼ又はNAD（Ｐ）Ｈオキシドリダクターゼ、ペル
オキシダーゼ、化合物（Ｉ）又はその塩からなるNAD
（Ｐ）Ｈ定量用試薬によって発色する。ジアホラーゼ又
はNAD（Ｐ）Ｈオキシドリダクターゼ、ペルオキシダー
ゼの酵素活性が充分であればNADHは瞬時にして発色する
ため、この反応の律速段階は、グリセロールデヒドロゲ
ナーゼの反応である。この事実は酵素を用いた分析法に
とって極めて好ましいことであり、試料中の酵素活性も
正確に測定できることを示している。またペルオキシダ
ーゼと化合物（Ｉ）又はその塩とを分離した二試薬系と
することができるため、保存中の試薬の着色による測定
誤差も回避することができ好都合である。
またはNAD（Ｐ）Ｈオキシドリダクターゼを含む前処理
系を組み、第２試薬液に化合物（Ｉ）又は、その塩を含
む反応系を組むことができる。例えばグリセロールデヒ
ドロゲナーゼを用いて血清中のグリセロールを定量する
系の場合、第１試薬液にペルオキシダーゼ、ジアホラー
ゼ又はNAD（Ｐ）Ｈオキシドリダクターゼ、酸化型NAD、
オスコルビン酸オキシダーゼ等を配し、第２試薬液にグ
リセロールデヒドロゲナーゼ、化合物（Ｉ）又はその塩
を配する。この系ではアスコルビン酸オキシダーゼにペ
ルオキシダーゼ活性が混在していても全く差しつかえな
い。又、特筆すべきは、色源体として、化合物（Ｉ）又
はその塩を用いた場合、カタラーゼ、尿酸、ビリルビン
等の過酸化水素消費物質の影響を受けない点である。こ
のことは第１試薬液で過酸化水素生成を伴う酵素等によ
る副反応を行なわせても、カタラーゼ等を第１試薬液に
共存させて、反応に関与しない過酸化水素を予め消去で
きることを示唆している。このようにより完全な前処理
を行うことにより、第２試薬液添加によって初めて開始
されるグリセロールデヒドロゲナーゼの反応によって生
成するNAD（Ｐ）Ｈの定量を非常に正確に行うことが可
能である。この場合、血清中のグリセロールは、第２試
薬液添加と同時にグリセロールデヒドロゲナーゼによっ
て第１試薬液からのNADがNADHに変換され、さらにジア
ホラーゼ又はNAD（Ｐ）Ｈオキシドリダクターゼ、ペル
オキシダーゼ、化合物（Ｉ）又はその塩からなるNAD
（Ｐ）Ｈ定量用試薬によって発色する。ジアホラーゼ又
はNAD（Ｐ）Ｈオキシドリダクターゼ、ペルオキシダー
ゼの酵素活性が充分であればNADHは瞬時にして発色する
ため、この反応の律速段階は、グリセロールデヒドロゲ
ナーゼの反応である。この事実は酵素を用いた分析法に
とって極めて好ましいことであり、試料中の酵素活性も
正確に測定できることを示している。またペルオキシダ
ーゼと化合物（Ｉ）又はその塩とを分離した二試薬系と
することができるため、保存中の試薬の着色による測定
誤差も回避することができ好都合である。
また注目すべきは、反応によって生成する色素が水溶性
であり、さらにλmaxが700nm前後にあるものが多く、こ
の事は生体試料由来の有色成分たとえばヘモグロビン、
ビリルビン等の影響を極めて受けにくいことを示してい
る。
であり、さらにλmaxが700nm前後にあるものが多く、こ
の事は生体試料由来の有色成分たとえばヘモグロビン、
ビリルビン等の影響を極めて受けにくいことを示してい
る。
本発明で用いられる代表的色源体が第１表に例示され
る。
る。
M:CH3 E:C2H5 α1:CH2CH2CH3 α2:＞CH CH2CH2CH3 D:CH2CH2CH2SO3H 化合物におけるR4、R6、B2、B3、B5、B6いずれも水素を
示す。
示す。
ＹはＨ（化合物１〜29について） （化合物30について）を示す。
R3は２位を、R5は９位を示す。
又はB1は化合物No.16及び17については４位で他はＨ以
外の基について全て３位を示し、B4はＨ以外の基につい
て全て８位を示す。
外の基について全て３位を示し、B4はＨ以外の基につい
て全て８位を示す。
これらの色源体を用いる場合の極大吸収波長（λmax）
及び感度、下記還元型補酵素定量法に用いた場合の血清
中の成分の影響、生成した色素の水への溶解性の度合い
が第２表に示される。
及び感度、下記還元型補酵素定量法に用いた場合の血清
中の成分の影響、生成した色素の水への溶解性の度合い
が第２表に示される。
感度の測定は以下の方法で行なわれた。
20U/mlのペルオキシダーゼ、20U/mlのジアホラーゼ、10
U/mlのスーパーオキシドジスムターゼ、5mg/mlのトリト
ンＸ−100、0.05mg/mlのフェノール、0.05mg/mlの化合
物（Ｉ）を含有する50mMのＮ−（２−アセトアミド）イ
ミノ二酢酸（Goodの緩衝液の一種）のpH7.0の緩衝液を
調整し、この3mlに、50μの300μmol/LのNADH溶液を
加える。37℃で５分間反応させ、反応液のλmaxにおけ
るODを測定する。
U/mlのスーパーオキシドジスムターゼ、5mg/mlのトリト
ンＸ−100、0.05mg/mlのフェノール、0.05mg/mlの化合
物（Ｉ）を含有する50mMのＮ−（２−アセトアミド）イ
ミノ二酢酸（Goodの緩衝液の一種）のpH7.0の緩衝液を
調整し、この3mlに、50μの300μmol/LのNADH溶液を
加える。37℃で５分間反応させ、反応液のλmaxにおけ
るODを測定する。
色源体としてニトロテトラゾリウムブルーを表に示す。
なおニトロテトラゾリウムブルーの場合、上記緩衝液か
ら、ペルオキシダーゼ、スーパーオキシドジスムター
ゼ、フェノールを除去した系を使用して実験を行なっ
た。
なおニトロテトラゾリウムブルーの場合、上記緩衝液か
ら、ペルオキシダーゼ、スーパーオキシドジスムター
ゼ、フェノールを除去した系を使用して実験を行なっ
た。
血清中の成分の影響は、ビリルビン10μg/3ml、もしく
はシステイン10μg/3ml、あるいは尿酸10μg/3ml存在す
る時、５〜10％の影響を±、10〜20％を＋、５％以下を
−として示す。
はシステイン10μg/3ml、あるいは尿酸10μg/3ml存在す
る時、５〜10％の影響を±、10〜20％を＋、５％以下を
−として示す。
生成した色素の水への溶解性の度合いは、ニトロテトラ
ゾリウムブルーと比較した場合の評価である。AAはニト
ロテトラゾリウムブルーに比べ、水への溶解性が著しく
良いもの。Ａは水への溶解性が良いもの。Ｂはニトロテ
トラゾリウムブルーと同程度しか水に溶けないものであ
ることを意味する。
ゾリウムブルーと比較した場合の評価である。AAはニト
ロテトラゾリウムブルーに比べ、水への溶解性が著しく
良いもの。Ａは水への溶解性が良いもの。Ｂはニトロテ
トラゾリウムブルーと同程度しか水に溶けないものであ
ることを意味する。
λmaxが高く、感度が高く、生体成分の影響を受けず、
水に溶けやすいものほど、微量生体成分の定量に適して
いる。
水に溶けやすいものほど、微量生体成分の定量に適して
いる。
本発明で用いれる色源体はジフェニルアミン類を還元し
て得られるロイコ塩基類をベンズヒドロール類と硫酸を
用いて縮合反応を行わせることによって得られる。反応
は30〜100℃で数時間で完了する。目的の色源体を晶出
しうる有機溶媒例えばｎ−オクタノールに反応液を加
え、晶出物をメタノール等の有機溶媒に溶解しシリカゲ
ルクロマトグラフィーによって目的物を単離できる。
て得られるロイコ塩基類をベンズヒドロール類と硫酸を
用いて縮合反応を行わせることによって得られる。反応
は30〜100℃で数時間で完了する。目的の色源体を晶出
しうる有機溶媒例えばｎ−オクタノールに反応液を加
え、晶出物をメタノール等の有機溶媒に溶解しシリカゲ
ルクロマトグラフィーによって目的物を単離できる。
第１表に示される化合物の製造法は特開昭60−218069に
記載されている。
記載されている。
本発明方法は、反応によってNAD（Ｐ）Ｈを化学量論的
に生成する反応系における反応物質あるいは酵素活性の
測定に適用できる。かかる反応系はNAD及びデヒドロゲ
ナーゼを用いる多くの反応系が知られている。かかる物
質としてグルコース、ガラクトース、乳酸、アルコー
ル、リンゴ酸、アルデヒド、キサンチン、コレステロー
ル、、胆汁酸、ラクテートデヒドロゲナーゼ（LDH）活
性、中性脂肪等があげられる。
に生成する反応系における反応物質あるいは酵素活性の
測定に適用できる。かかる反応系はNAD及びデヒドロゲ
ナーゼを用いる多くの反応系が知られている。かかる物
質としてグルコース、ガラクトース、乳酸、アルコー
ル、リンゴ酸、アルデヒド、キサンチン、コレステロー
ル、、胆汁酸、ラクテートデヒドロゲナーゼ（LDH）活
性、中性脂肪等があげられる。
これらの反応系が図式的に次に示され、反応系における
基質、酵素活性が測定できる。
基質、酵素活性が測定できる。
本発明で用いられるNAD（Ｐ）Ｈ定量用組成物は （イ）ペルオキシダーゼ （ロ）ジアホラーゼ又はNAD（Ｐ）Ｈオキシドリダクタ
ーゼ （ハ）化合物（Ｉ）又はその塩 あるいは上記に加えて （ニ）スーパーオキシドジスムターゼからなり、これら
は（イ）２〜100U/ml、（ロ）２〜50U/ml（ハ）0.01〜
1.0mg/ml、（ニ）0.1〜50U/mlの量比にしたものは使用
に便利である。さらに必要に応じて緩衝剤および界面活
性剤をこの組成物に組み合わせることができる。
ーゼ （ハ）化合物（Ｉ）又はその塩 あるいは上記に加えて （ニ）スーパーオキシドジスムターゼからなり、これら
は（イ）２〜100U/ml、（ロ）２〜50U/ml（ハ）0.01〜
1.0mg/ml、（ニ）0.1〜50U/mlの量比にしたものは使用
に便利である。さらに必要に応じて緩衝剤および界面活
性剤をこの組成物に組み合わせることができる。
測定されるべき因子によって必要な基質あるいは酵素を
加えた組成物あるいは別に用意して組合せたキットは種
々の物質もしくは酵素活性の定量に極めて便利で有用で
ある。
加えた組成物あるいは別に用意して組合せたキットは種
々の物質もしくは酵素活性の定量に極めて便利で有用で
ある。
以下に本発明の態様を実施例によって示す。
実施例1.（NADHの定量） 50mM Goodの緩衝液（pH7.0）100mlにペルオキシダーゼ2
000単位、ジアホラーゼ2000単位、スーパーオキシドジ
スムターゼ1000単位、界面活性剤（トリトンＸ−100）5
mg、フェノール5mgおよび化合物No.5を5mgを溶解し、試
薬液を調整する。
000単位、ジアホラーゼ2000単位、スーパーオキシドジ
スムターゼ1000単位、界面活性剤（トリトンＸ−100）5
mg、フェノール5mgおよび化合物No.5を5mgを溶解し、試
薬液を調整する。
別に100、200、300、500、1000μmol/lのNADH溶液を調
製し、試験管に各50μずつを分取し、上記試薬液を各
々3ml加え、37℃に５分間放置した後λmax755nmにおけ
る吸光度を試験盲検を対照として測定する。
製し、試験管に各50μずつを分取し、上記試薬液を各
々3ml加え、37℃に５分間放置した後λmax755nmにおけ
る吸光度を試験盲検を対照として測定する。
結果を第３表に示す。
実施例2.（総コレステロールの定量） 化合物No.5の代りに化合物No.1,2,3,5,6及び22を各5mg
を用いさらに500mgのNAD、500単位のコレステロールデ
ヒドロゲナーゼ及び100単位のコレステロールエステラ
ーゼを加える他は実施例１と同じ組成の試薬液を６種類
調製する。
を用いさらに500mgのNAD、500単位のコレステロールデ
ヒドロゲナーゼ及び100単位のコレステロールエステラ
ーゼを加える他は実施例１と同じ組成の試薬液を６種類
調製する。
試験管に生血清10μと上記発色試液を3mlをとり、37
℃に５分間放置した後、生成色素のλmaxにおける吸光
度を試験盲検を対照として測定し、予め作成した検量線
より血清中の総コレステロール濃度を算出する。対照と
して試料にコレステロールエステラーゼ、コレステロー
ルオキシダーゼを加え生成過酸化水素をペルオキシダー
ゼ及び色源体を用いて定量した結果を第４表に示す。
℃に５分間放置した後、生成色素のλmaxにおける吸光
度を試験盲検を対照として測定し、予め作成した検量線
より血清中の総コレステロール濃度を算出する。対照と
して試料にコレステロールエステラーゼ、コレステロー
ルオキシダーゼを加え生成過酸化水素をペルオキシダー
ゼ及び色源体を用いて定量した結果を第４表に示す。
実施例3.（中性脂肪の定量） 化合物No.5の代りに化合物No.5、化合物No.23、
化合物No.26、化合物No.27、化合物No.28化合物N
o.29をそれぞれ5mg用い、さらにNAD500mg、リポプロテ
インリパーゼ50,000単位、グリセロールデヒドロゲナー
ゼ5000単位を加える他は実施例１（ｂ）試薬液の組成と
同一組成の６種の試薬液を調製する。
化合物No.26、化合物No.27、化合物No.28化合物N
o.29をそれぞれ5mg用い、さらにNAD500mg、リポプロテ
インリパーゼ50,000単位、グリセロールデヒドロゲナー
ゼ5000単位を加える他は実施例１（ｂ）試薬液の組成と
同一組成の６種の試薬液を調製する。
試験管に生血清20μと試薬液3mlをとり、37℃に５分
間放置した後第３表に示した各々の色源体のλmaxにお
ける吸光度を試薬盲検を対照として測定し、予め作成し
た検量線より血清中の中性脂肪濃度を算出する。
間放置した後第３表に示した各々の色源体のλmaxにお
ける吸光度を試薬盲検を対照として測定し、予め作成し
た検量線より血清中の中性脂肪濃度を算出する。
対照として試料にリポプロテインリパーゼを加えて中性
脂肪からグリセールを生成させ、これにグリセロールオ
キシダーゼを作用させて生成する過酸化水素を色素に導
びき反応液の比色によって定量した。結果を第５表に示
す。
脂肪からグリセールを生成させ、これにグリセロールオ
キシダーゼを作用させて生成する過酸化水素を色素に導
びき反応液の比色によって定量した。結果を第５表に示
す。
実施例4.〔乳酸脱水素酵素（LDH）活性の測定〕 化合物No.5の代りに化合物No.5、化合物No.22、
化合物No.24、化合物No.25をそれぞれ5mg用い、さら
にNAD500mg、Ｌ−乳酸ナトリウム50mgを加える他は実施
例１の試薬の組成と同一の組成の試薬液を調製した。
化合物No.24、化合物No.25をそれぞれ5mg用い、さら
にNAD500mg、Ｌ−乳酸ナトリウム50mgを加える他は実施
例１の試薬の組成と同一の組成の試薬液を調製した。
試薬液を予め37℃にて10分間予備加温した後、血清20μ
を添加し、添加後１分後と３分後の吸光度を第３表に
示した各々の色源体のλmaxにおいて試験盲検を対照と
して測定する。３分後と１分後の吸光度差を計算し、予
め作成した検量線より、血清中のLDH活性を算出する。
結果をUV法を用いて測定した数値と対比して第６表に併
記する。
を添加し、添加後１分後と３分後の吸光度を第３表に
示した各々の色源体のλmaxにおいて試験盲検を対照と
して測定する。３分後と１分後の吸光度差を計算し、予
め作成した検量線より、血清中のLDH活性を算出する。
結果をUV法を用いて測定した数値と対比して第６表に併
記する。
実施例5.（総胆汁酸の定量） より正確な測定値を得るため２試薬系を用いる。すなわ
ち50mMのGoodの緩衝液（pH7.0）に100mlにペルオキシダ
ーゼ4000単位、ジアホラーゼ4000単位、スーパーオキシ
ドジスムターゼ2000単位、フェノール10mg、界面活性剤
（トリトンＸ−100）5mg、NAD500mgを溶解し、第１試薬
液とする。
ち50mMのGoodの緩衝液（pH7.0）に100mlにペルオキシダ
ーゼ4000単位、ジアホラーゼ4000単位、スーパーオキシ
ドジスムターゼ2000単位、フェノール10mg、界面活性剤
（トリトンＸ−100）5mg、NAD500mgを溶解し、第１試薬
液とする。
次に50mMのGoodの緩衝液（pH7.0）100mlに３α−ヒドロ
キシステロイドデヒドロゲナーゼ200単位、界面活性剤
（トリトンＸ−100）5mgを溶解し、これに色源体として
化合物No.1、化合物No.2、化合物No.3、化合物
No.5、化合物No.6をそれぞれ10mg溶解した試薬液を５
種類調製し、第２試薬液とする。
キシステロイドデヒドロゲナーゼ200単位、界面活性剤
（トリトンＸ−100）5mgを溶解し、これに色源体として
化合物No.1、化合物No.2、化合物No.3、化合物
No.5、化合物No.6をそれぞれ10mg溶解した試薬液を５
種類調製し、第２試薬液とする。
試験管に生血清50μと第１試薬液1.5mlをとり、37℃
にて５分間予備加温した後、５種類の各第２試薬液を1.
5ml添加し、さらに37℃にて５分間放置する。その後第
３表に示した各々の色源体のλmaxにおける吸光度を試
験盲検を対照として測定し、予め作成した検量線より血
清中の総胆汁酸濃度を算出する。結果を高速液体クロマ
トグラフィー法（HPLC法）を用いて測定した数値と対比
して第７表に示す。
にて５分間予備加温した後、５種類の各第２試薬液を1.
5ml添加し、さらに37℃にて５分間放置する。その後第
３表に示した各々の色源体のλmaxにおける吸光度を試
験盲検を対照として測定し、予め作成した検量線より血
清中の総胆汁酸濃度を算出する。結果を高速液体クロマ
トグラフィー法（HPLC法）を用いて測定した数値と対比
して第７表に示す。
実施例２〜５において本発明の測定法はいずれれも他法
による結果と近似し、正確であることが理解される。
による結果と近似し、正確であることが理解される。
Claims (2)
- 【請求項１】下記一般式（Ｉ）で表わされる化合物〔以
下化合物（Ｉ）という〕又はその塩の存在下、NAD
（Ｐ）Ｈにペルオキシダーゼ、ジアホラーゼを作用
させ、呈色した反応液の吸光度を測定することを特徴と
する還元型補酵素の定量方法。 一般式（Ｉ）： 式中Ｙは水素原子もしくは を示し、Ｚは酵素原子又はイオン原子を示し、Ｘは水素
原子、アルキル、アルケニル、アリル、アミノ又は置換
アミノを示し、R1はヒドロキシル、アミノ又は置換アミ
ノを示し、R2は水素原子、ヒドロキシル、アルキル、ア
ルコキシ、アリル、アルケニル、アミノ又は置換アミノ
を示し、R3、R4、R5、R6は同一もしくは異なってよく、
水素原子、アルキル、アルケニル、アシル、アリル、ハ
ロゲン原子、ニトロ、スルホ、カルボキシル、ヒドロキ
シル、アルコキシ、下記一般式III、IV、VI、VIIで表わ
される基を示す。 一般式（III）： 一般式（IV）： 一般式（VI）： 一般式（VII）： 式中、A1はアルキレン基を示し、A2はR2と同意義であ
り、B1、B2、B3、B4、B5およびB6は同一もしくは異なっ
て水素原子、アルキル、アルケニル、アシル、アリル、
ハロゲン原子、ニトロ、スルホ、カルボキシル、ヒドロ
キシル、アルコキシ又はヒドロキシアルキルを表わす。 - 【請求項２】（イ）ペルオキシダーゼ （ロ）ジアホラーゼ （ハ）化合物（Ｉ）またはその塩 からなるNAD（Ｐ）Ｈ定量用組成物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28504987A JPH07114711B2 (ja) | 1987-11-11 | 1987-11-11 | 還元型補酵素の定量法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28504987A JPH07114711B2 (ja) | 1987-11-11 | 1987-11-11 | 還元型補酵素の定量法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01128799A JPH01128799A (ja) | 1989-05-22 |
| JPH07114711B2 true JPH07114711B2 (ja) | 1995-12-13 |
Family
ID=17686506
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP28504987A Expired - Fee Related JPH07114711B2 (ja) | 1987-11-11 | 1987-11-11 | 還元型補酵素の定量法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07114711B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5817467A (en) | 1995-11-16 | 1998-10-06 | Kyowa Medex Co., Ltd. | Method for quantitatively determining creatinine kinase and a reagent therefor |
-
1987
- 1987-11-11 JP JP28504987A patent/JPH07114711B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH01128799A (ja) | 1989-05-22 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |