JPH0711522B2

JPH0711522B2 - 化学増幅型化学発光免疫測定法

Info

Publication number: JPH0711522B2
Application number: JP1238512A
Authority: JP
Inventors: 暹吉川; 吉郎達; 裕史福村; 総一郎山村
Original assignee: 工業技術院長
Priority date: 1989-09-13
Filing date: 1989-09-13
Publication date: 1995-02-08
Anticipated expiration: 2010-02-08
Also published as: JPH03100466A

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は、新規な化学増幅型化学発光免疫測定法に関す
る。

従来の技術及びその課題血液、尿等の臨床試料等に微量に存在する抗原、抗体等
の物質を分析定量する方法として、放射免疫測定法や酵
素免疫測定法等が開発されている。しかし、前者には放
射性化合物を使用するため保管、取扱、廃棄処理等の管
理上の問題点、短寿命の同位体を使用するため頻繁に試
薬を調整しなければならないこと、装置、施設にコスト
がかかること等の問題点がある。また、後者には測定で
きる物質が限られ又感度も不十分であること、高価な酵
素を抗原又は抗体に標識した化合物を合成する必要があ
ること等の問題点がある。加えて、両者共に不均一法が
中心で煩雑な分離操作を必要とするという問題点もあ
る。

また、免疫反応に引き続いて起こる補体の活性化により
膜の破壊が起こる現象を利用して、リポソーム中にグル
コース、電極活物質、螢光色素等を包埋し、抗体量に応
じて放出された内容物を測定し、抗体量を定量するリポ
ソーム免疫測定法が知られている。しかし、この方法に
はリポソームが不安定でリークが起こり易く又はリポソ
ーム製造の再現性に乏しいという問題点があり、包埋量
が少ないため感度も十分でないという問題点もある。

以上のように、抗原、抗体等の微量の被測定物質を、簡
便に且つ迅速高感度でホモジニアスに測定できる手法は
確立されておらず、かかる手法が要望されているのが現
状である。

課題を解決するための手段本発明者は、上記要望に応えるべく鋭意研究した結果、
リポソーム免疫測定法においてリポソームに代えて特に
赤血球を用い、更に被測定物質と赤血球との補体溶血反
応に、該反応で放出されたヘモグロビンによるルミノー
ル反応を組み合わせることにより、目的を達成できるこ
とを見出し、本発明を完成するに至った。

即ち本発明は、被測定物質を赤血球と補体溶血反応せし
め、次いで赤血球より放出されたヘモグロビンによるル
ミノール反応により化学発光せしめ、その発光量を測定
することを特徴とする化学増幅型化学発光免疫測定法に
係る。

上記本発明によれば、補体溶血反応即ち赤血球細胞膜上
に免疫反応による抗原抗体複合物が存在すると補体の活
性化が起こり該膜上に膜障害複合体が構築され内容物で
あるヘモグロビンの放出が起こる反応により、この放出
は１つの複合体の生成によって十分に起こるとされてい
るので１つの抗原抗体複合物によってヘモグロビンの大
量放出による化学増幅効果が発揮される。更に、内容物
であるヘモグロビンがルミノール反応の触媒であるた
め、この化学発光反応によっても化学増幅効果が発揮さ
れる。

本発明法においては、抗原、抗体、抗原抗体複合物及び
補体が補体溶血反応に必須のものであることから、これ
らのいずれも被測定物質として定量、定性等の各種測定
することができ、また、本発明法は、競争反応、サンド
イッチ法、均一法、不均一法等の従来公知の種々の免疫
計測法にそのまま応用することができる。

本発明においては、大量、均質に得られしかも安定な赤
血球を用いることにより、又ルミノール反応が高感度で
あることから、安定性、再現性、感度等に優れた免疫計
測を発光量の測定により容易に行なうことができる。用
いる赤血球としては、特に限定されないが、ヒツジ、ウ
サギ、マウス、ラット、モルモット、イヌ等の赤血球を
挙げることができる。赤血球は、それ自体膜抗原を有し
ているが、更に、測定しようとする抗原、抗体又は抗原
抗体複合物をその表面に有せしめても良い。抗原、抗体
又は抗原抗体複合物を保持した赤血球の調整法は、特に
制限されず、従来から使用されてきた各種方法を利用で
きる。抗原としては、各種の低分子物質及び高分子物質
のいずれも使用できる。

以下、補体の測定を例にとり、本発明の測定手順を説明
する。赤血球上に抗原抗体複合物が一定量生成している
感作赤血球に、例えば血清等の補体を含む被測定液を加
え、適宜一定温度、時間のもとに反応させる。抗原抗体
複合物の存在によって補体の活性化が起こり赤血球膜上
に膜障害複合体が構築され、内容物の放出が起こる。赤
血球中にはヘモグロビンが高濃度で含まれており、ヘモ
グロビンはルミノールの化学発光を触媒する。この後、
氷温にする、EDTA等を加える等の補体結合反応の停止操
作を行なう。ルミノール反応は、常法により行なうこと
ができる。即ち、通常上記停止操作をした反応液に、暗
所一定温度のもとルミノール及び過酸化水素を一定量加
え化学発光させる。化学発光の発光量の測定も常法例え
ば光子計数法等により行なうことができる。発光量は反
応後一定時間の総量（積分値）又は最大値のいずれの値
を用いても良く、濃度が既知の標準サンプルを用いて検
量線を作成し、未知試料の定量等の測定を行なう。

リークしていないヘモグロビンにはルミノール発光反応
の接触作用はなく、又非溶血赤血球には該反応の妨害作
用もない。従って、本発明法においては、非溶血赤血球
を分離することなく、そのままのホモジニアスな測定系
で測定を行なうことができる。

発明の効果以上のように、本発明方法によれば、特別な標識化合物
を用いることなく、原理的には赤血球上で免疫反応が１
分子でも生ずれば、血球の分離も必要なく均一系で、著
しく増幅されしかも安定性や再現性にも優れた免疫測定
を行なうことができる。

従って、本発明によれば、抗原、抗体、補体等の微量の
被測定物質を、簡便に且つ迅速高感度で測定できる新規
な化学増幅型化学発光免疫測定法が供給されるという格
別な効果が奏される。

実施例以下実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、
本発明は以下の実施例により何等限定されるものではな
い。

実施例１抗ヒツジ赤血球抗体の計測を行なった。

ヒツジ赤血球を、Ca⁺⁺とMg⁺⁺を含有するpH7.4のゼラチ
ンベロナールバッファー（以下、GVA⁺⁺という）に、１
×10⁹cells/mlの割合で懸濁した。この懸濁液に、上記
抗体を含むウサギ血清試料を等量加えた液より５μｌ取
り、これを37℃で10分免疫反応させ、次いでモルモット
血清をGVB⁺⁺で500倍に希釈した補体溶液12.5μｌとGVB
⁺⁺20μｌとを加え、37℃で60分補体結合反応させた後氷
冷し反応を停止させた。反応後の反応液にGVB⁺⁺37.5μ
ｌを加え、更に1mMのルミノール溶液50μｌを加え、サ
ンプルカップを暗箱に入れ、5mM過酸化水素溶液50μｌ
を加え、25℃で化学発光反応を起こさせた。化学発光測
定は光子計数法（浜松ホトニクス・ユニバーサルホトン
カウンティングシステムを使用）により行なった。第１
図は、上記血清試料（抗体）の希釈倍率を変化させたと
きの光子計数の最大カウント数をプロットしたものであ
り、これにより目的抗体が精度良く測定できることが明
らかである。

実施例２ヒト補体の計測を行なった。

低温下、正常ヒト血清の162〜608倍のGVB⁺⁺希釈溶液
に、５×10⁸cells/mlの割合で市販（石津製薬（株）
製）のヒツジ感作赤血球（抗原抗体複合物が生成してい
る）を懸濁した懸濁液を26:4の比で混合し、37℃で２時
間振盪インキュベートし、その後氷冷しEDTA・GVBを加
え補体結合反応を停止させた。この反応液60μｌに、1m
Mのルミノール溶液50μｌを加え、サンプルカップを暗
箱に入れ、5mM過酸化水素溶液50μｌを加え、37℃で化
学発光反応を起こさせた。化学発光測定は光子計数法
（浜松ホトイクス・ユニバーサルホトンカウンティング
システムを使用）により行なった。第２図は、補体の希
釈倍率に対して光子計数の最大カウント数をプロットし
たものであり、これにより目的補体が精度良く測定でき
ることが明らかである。

一方、比較のため、上記反応停止後の反応液を2.8ml取
り、3000rpmで５分遠心分離して得た上清を用い、従来
法である吸光度測定法に従って、光路長1cm、波長541nm
で吸光度を測定した（日立557型二波長分光光度計使
用）。

第３図は、本発明法により測定した光子計数の最大カウ
ント数及び測定時間内の総カウント数に対して、同じサ
ンプルにつき従来法により測定した吸光度をプロットし
たものである。吸光度と発光量との相関係数は、0.99で
あり、本発明法によれば低補体化サンプルでも血球分離
をすることなく少量のサンプルで且つ高感度で測定がで
きることが判る。

実施例３ジニトロフェニル化したウシγーグロブリン（以下、DN
P-GGBという）を抗原としてその測定を行なった。

ジニトロフルオロベンゼンにより膜表面にジニトロフェ
ニル（以下、DNPという）基を保持させたヒツジ赤血球
懸濁液（１×10⁹cells/mlGVB⁺⁺）2.5μｌに、種々の濃
度でDNP-GGBをGVB⁺⁺に溶解した試料液1.25μｌ及び抗DN
P抗体を含むウサギ血清1.25μｌを加え、37℃で10分競
争免疫反応させ、次いでモルモット血清をGVB⁺⁺で10倍
に希釈した補体溶液12.5μｌ及びGVB⁺⁺20μｌを加え、3
7℃で60分補体結合反応させた後氷冷し反応を停止させ
た。この反応液を２倍希釈し、1mMのルミノール溶液50
μｌを加え、サンプルカップを暗箱に入れ、5mM過酸化
水素溶液50μｌを加え、25℃で化学発光反応を起こさせ
た。化学発光測定は光子計数法（浜松ホトニクス・ユニ
バーサルホトンカウンティングシステムを使用）により
行なった。

第４図は、上記試料液中のDNP-GGBの量に対して光子計
数の最大カウント数をプロットしたものであり、DNP-GG
Bの量が多いほど上記競争免疫反応において反応にあず
かる赤血球が少なくなりその結果最大カウント数が少な
くなることを示している。これにより目的抗原が精度良
く測定できることが明らかである。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１の結果を示すグラフである。第２図及
び第３図は実施例２の結果を示すグラフである。第４図
は実施例３の結果を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献特開昭60−363（ＪＰ，Ａ) 特開昭60−364（ＪＰ，Ａ) 特開昭60−29665（ＪＰ，Ａ) 特開昭56−96249（ＪＰ，Ａ) 「化学大辞典４」化学大辞典編集委員会編共立出版発行昭和37年７月31日発行Ｐ. 862「ルミノール」「ルミノール発光試験」の項

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】被測定物質を赤血球と補体溶血反応せし
め、次いで赤血球より放出されたヘモグロビンによるル
ミノール反応により化学発光せしめ、その発光量を測定
することを特徴とする化学増幅型化学発光免疫測定法。
【請求項２】赤血球が、抗原、抗体又は抗原抗体複合物
を表面に有している請求項１に記載の測定法。
【請求項３】被測定物質が、抗原、抗体、抗原抗体複合
物又は補体である請求項１に記載の測定法。