JPH07119237B2

JPH07119237B2 - ヒルジン変異体，その製造法及び抗凝血剤

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Publication number: JPH07119237B2
Application number: JP2303096A
Authority: JP
Inventors: 悟三沢; 整松田; 善文井上; 英之古屋
Original assignee: Japan Energy Corp
Current assignee: Eneos Corp
Priority date: 1990-11-08
Filing date: 1990-11-08
Publication date: 1995-12-20
Anticipated expiration: 2010-12-20
Also published as: JPH04173798A

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、ヒルジン変異体、その製造方法及び該ヒルジ
ン変異体を有効成分として含有する抗凝血剤に関する。

〔従来の技術及び発明が解決しようとする課題〕

薬用ヒル（Hirudo medicinalis）の唾液腺から分泌さ
れる抗血液凝固因子であるヒルジンは、65個及び66個の
アミノ酸から成るペプチドの混合物である。ヒルジンの
構造はDodt等〔FEBSLett.165,180（1984）〕により解明
され、これはヒルジン変異体（Variant）１（HV1）に相
当し、他のヒルジン変異体であるHV2〔Harvey等Proc.Na
tl.Acad.Sci.USA.83,1084（1986）〕はHV1と９個のアミ
ノ酸が異なり、さらに別のヒルジン変異体であるHV3〔D
odt等Biol.Chem.Hoppe−Seyler.367,803（1986）〕は、
Ser³²までHV2と同一で、Ｃ末端側でアミノ酸（Ala⁶³）
の添加を含む、10個のアミノ酸が異なる。これら３変種
の構造を第１図に示す。

これらの天然変異体は65個又は66個のアミノ酸を含み、
２つのドメインを認め得る。つまり、３つのジスルフィ
ド結合を含む球状Ｎ末端部分と、プロトロンビン分子中
のトロンビン切断部位又はフィブリノーゲン切断部位と
相同性を示す酸性Ｃ末端部分である。

本発明者らは、天然変異体ヒルジンHV1とHV3のＣ末端ア
ミノ酸配列を比較すると、HV1のLeu⁶⁴−Gln⁶⁵がHV3では
Asp⁶⁵−Glu⁶⁶に置換されていることを見出した。そし
て、HV1及びHV3の合成遺伝子の作製及びそれらをE.coli
で発現されることについて特許出願（特願平１−207200
号）した。

これらのヒルジン変異体HV1,HV2及びHV3は、それぞれに
抗トロンビン作用を有しているが、副作用として出血時
間の延長をもたらすなど臨床医薬として使用されるには
充分なものとはいえない。本発明者らは、前記ヒルジン
HV1,HV2及びHV3の一時構造をもとに種々のヒルジン変異
体を作製し、その性質を動物モデルにおいて比較したと
ころヒルジンHV1のアミノ酸残基53位以降をHV3の53位以
降のアミノ酸配列で置き換えたHV1とHV3とのヒルジン変
異体（キメラヒルジン）が高い抗トロンビン作用を有す
るだけでなく、出血時間の延長を軽減することを見出
し、本発明を完成するに至った。

〔課題を解決するための手段〕

本発明は、抗トロンビン作用の高い新規なヒルジン変異
体に関する。

また、本発明は、このような抗凝血作用の高く、かつ出
血傾向の低下したヒルジン変異体のアミノ酸配列をコー
ドしているDNA配列、このDNA配列を含む発現ベクターで
大腸菌を形質転換した形質転換微生物及びこの形質転換
微生物を用いてヒルジン変異体を発現させこれを回収す
るヒルジン変異体の製造法に関する。

さらに、本発明は、このようなヒルジン変異体を有効成
分とする抗凝血剤に関する。

本発明の新規なヒルジン変異体は次の一次構造式で示さ
れるアミノ酸配列をもつ。

また、この変異体のアミノ酸配列をコードするDNA配列
は、例えば、次の式で表される。

GTT GTA TAC ACT GAT TGT ACT GAA TCT GGC 30 CAG AAC
CTG TGT CTG TGT GAA GGA TCC AAC 60 GTT TGT GGT CA
G GGT AAC AAA TGT ATC CTC 90 GGG TCT GAT GGT GAA A
AG AAC CAG TGT GTT 120 ACT GGT GAA GGT ACC CCG AAA
CCG CAG TCT 150 CAT AAC CAG GGT GAT TTC GAA CCG A
TC CCG 180 GAA GAC GCG TAC GAT GAA 本発明の（式Ｉ）で示されるヒルジン変異体は化学合成
において製造してもよいし、また遺伝子工学的手法によ
って製造してもよい。

遺伝子工学的手法で製造するには、後述する実施例で示
すようにまず、ヒルジンHV1分泌プラスミドpMTSHV1及び
pMKSHV1を構築し、これで大腸菌を形質転換してこの形
質転換微生物を用いてヒルジンHV1を分泌生産させる。
このプラスミドpMTSHV1は、第３図に示すようにプロモ
ーター（Ptrp）、ジグナルペプチドをコードするDNA配
列（Pho A signal）、ヒルジンHV1のアミノ酸配列をコ
ードするDNA配列及び転写停止シグナルを含有するDNA配
列（rrnBT₁T₂）よりなっている。本発明では、ヒルジン
HV1のアミノ酸残基53位以降のアミノ酸配列をHV3の53位
以降のアミノ酸配列で置換するためにHV1分泌プラスミ
ドpMTSHV1を制限酵素で切断してヒルジンHV1の53位以降
のアミノ酸配列をコードするDNA配列を除く。一方、HV3
を発現させるプラスミドpUCHV3の53位からのアミノ酸配
列をコードするDNA配列を制限酵素を用いて切り出す。
このプラスミドpMTSHV1からヒルジンHV1の53位以降のア
ミノ酸配列をコードするDNA配列を除いたDNAとプラスミ
ドpUCHV3由来のヒルジンHV3の53位以降のアミノ酸配列
をコードするDNAとをDNAリガーゼ等を用いて反応させ本
発明のヒルジン変異体のアミノ酸配列をコードするDNA
を含むプラスミドpMTSHV1C3を構築する。

このプラスミドpMTSHV1C3は、プラスミドpMTSHV1由来の
プロモーター、シグナルペプチドをコードするDNA配
列、ヒルジンHV1の１位〜52位までのアミノ酸配列をコ
ードするDNA配列と転写停止シグナル及びプラスミドpUC
HV3由来のヒルジンHV3の53位以降のアミノ酸配列をコー
ドするDNA配列を含み、該DNA配列が前記ヒルジンHV1の
１位〜52位までのアミノ酸配列をコードするDNA配列と
転写停止シグナルとの間に組込まれている。

このプラスミドpMTSHV1C3を大腸菌に組込で大腸菌を形
質転換し、この形質転換微生物を培養すると菌体及び培
養液中に本発明のヒルジン変異体が産生される。

本発明では、このヒルジン変異体を通常一般的に知られ
ている方法で単離し、クロマトグラフ、逆相HPLCその他
の精製法によって精製する。

得られたヒルジン変異体は動物モデルにおいてヒルジン
HV1よりも高い抗トロンビン活性と低い出血傾向を示
し、通常製剤の製法として一般的に知られている方法で
製剤とすることによってすぐれた抗凝血剤とすることが
できる。すなわち、本発明のヒルジン変異体は、任意慣
用の製薬用担体や、賦形剤を用いて任意慣用の方法で調
製される。投与は例えば静脈内、皮内、皮下もしくは筋
肉内に、また局所に非経口的に行なうことができる。投
与量は症状や投与対象者の年令、性別等を考慮して個々
の場合に応じて適宜決定されるが、通常成人１日当り0.
1〜100mgであり、これを１日１〜数回に分けて投与す
る。

次に本発明において使用するヒルジンHV1分泌プラスミ
ドpMTSHV1及びpMKSHV1を構築するためのプラスミドpUCH
V1,pMT1及びpMK2の構築方法及びプラスミドpMTSHV1C3を
構築するためのプラスミドpUCHV3の構築方法を参考例と
して示す。

参考例１プラスミドpUCHV1及びプラスミドpUCHV3の調
製 pUC18 10μｇをEcoRI 30単位、HindIII 30単位を用いて
37℃で２時間消化した。これをアガロースゲル電気泳動
に供してベクター部分を抽出し、フェノール抽出により
タンパクを除き、冷エタノールで沈澱させた後、50μｌ
のTE緩衝液（10mM Tris−HC1、pH8.0、1mM EDTA）に溶
解した。この溶液の50ngの相当量にHV1又はHV3の二重鎖
DNAを含む10μｌ（66mM Tris・C1、pH7.5、5mM MgCl₂、
5mM DTT、1mM ATP、T4 DNAリガーゼ300単位）を加え、1
6℃で一晩反応させて、プラスミドpUC18のEcoRIとHindI
IIとの間にHV1遺伝子が挿入されたプラスミドpUCHV1及
びHV3遺伝子が挿入されたプラスミドpUCHV3を得た。

参考例２プラスミドpMK2及びプラスミドpMT1の調製（ａ）プラスミドpMK2の調製市販のプラスミドpKK223−３（ファルマシア社製）を制
限酵素PvuI及びNruIで切断して得たtacプロモーターを
含むフラグメントと市販のpUC18を制限酵素PvuI及びPvu
IIで切断して得た複製開始点（Ori）及びアンピシリン
耐性遺伝子を含むフラグメントとをT4リガーゼにより接
合させた。これを大腸菌JM109株に導入して培養し、ア
ンピシリン耐性によりスクリーニングして、tacプロモ
ーターとpUC18の複製開始点（Ori）とを有するベクター
を得た。このプラスミドをpMK2とした。

（ｂ）プラスミドpMT1の調製このプラスミドpMK2 10μｇを30単位のEcoRI及びEco47I
IIで消化し、tacプロモーターを含む断片を除去し、複
製開始点を含む断片をアガロースゲル電子泳動によって
回収した。一方、trpプロモーターの塩基配列をDNA合成
機で合成した。この断片と前記pMK2とをEcoRI及びEco47
IIIで消化した断片をT4DNAリガーゼにより16℃で一晩反
応させた。これを用いて大腸菌JM109株を形質転換し、t
rpプロモーターとpMK2の複製開始点（Ori）とを有する
ベクターを調製した。このプラスミドの塩基配列はサン
ガー等の方法で確認し、pMT1とした。

本発明の実施例を示し、本発明を具体的に説明する。

実施例１（１）ヒルジンHV1分泌プラスミドpMTSHV1の作製プラスミドpMTSHV1は第３図に示した方法に従って構築
した。まず、大腸菌のアルカリホスファターゼ（phoA）
のシグナルペプチドとヒルジンHV1のＮ末端アミノ酸Val
¹−Val²に対応するDNA断片を構築するために、第２図に
示す４種のオリゴヌクレオチドを合成した。脱保護した
のち、10％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により各オ
リゴヌクレオチドを精製した。

２種のオリゴヌクレオチド（S2,S4）各500pmolをリン酸
化後、４種のオリゴヌクレオチド各20pmolを混合し、ア
ニールした。これにT₄DNAリガーゼを含む溶液20μｌ
中、16℃で一晩反応させた。フェノール、クロロホルム
でタンパクを除き、冷エタノールで沈澱させ目的とする
二重鎖DNA断片を得た。この断片10分の１量と制限酵素E
coRIとAccIとで切断したpUCHV1（特願平１−207200）10
0ngとをT₄DNAリガーゼにより、16℃で一晩反応させた。
これを用いて大腸菌JM109株を形質転換し、phoAシグナ
ルペプチドをコードする領域の直後にヒルジンHV1をコ
ードするDNA断片が結合した融合遺伝子を含むハイブリ
ッドプラスミドpSHV1を得た。このプラスミドpSHV1の塩
基配列はサンガー等の方法で確認した。

このpSHV1（10μｇ）を制限酵素EcoRI 30単位、HirdIII
30単位を用いて分解し、アガロースゲル電気泳動に供し
て、275bpの融合遺伝子断片を精製した。

このDNA断片100ngと大腸菌発現ベクターpMT1（特願平１
−212442）を制限酵素EcoRIとHindIIIとで分解したの
ち、アガロースゲル電気泳動によって精製したDNA断片1
00ngをT₄DNAリガーゼにより16℃で一晩反応させた。こ
の反応液を用いて大腸菌JM109株を形質転換し、trpプロ
モーターの下流にphoAシグナルペプチドとヒルジンHV1
をコードする融合遺伝子が連結したヒルジンHV1分泌プ
ラスミドpMTSHV1を得た。このプラスミドpMTSHV1の塩基
配列はサンガー等の方法で確認した。

（２）ヒルジンHV1分泌プラスミドpMKSHV1の作製プラスミドpMKSHV1は第４図に示した方法に従って構築
した。

上記のphoAシグナルペプチドとヒルジンHV1をコードす
る融合遺伝子と大腸菌発現ベクターpMK2（特願平１−21
2442）を制限酵素EcoRIとHindIIIとで分解したDNA断片
をT₄DNAリガーゼで反応させ、大腸菌JM109株を形質転換
し、tacプロモーターの下流に融合遺伝子が連結したヒ
ルジンHV1分泌プラスミドpMKSHV1を得た。このプラスミ
ドpMKSHV1の塩基配列はサンガー等の方法で確認した。

（３）ヒルジンHV1分泌プラスミドによるヒルジンの分
泌生産上記（１）及び（２）で構築したプラスミドpMTSHV1及
びpMKSHV1により形質転換された大腸菌E.coli JM109株
を100μg/mlのアンピシリンを含む2xYT培地（バクトト
リプトン16g/l、バクトイーストエキストラクト10g/l,N
aCl5g/l）で培養した。37℃で24時間培養後、培養液1ml
を集菌した。

沈澱した細胞の各サンプルを1mlの25％シュークロー
ス、50mMTris−HCl（pH7.5）、1mM EDTAに懸濁し、室温
にて10分間処理した。6000×ｇにて10分間の遠心分離に
より集菌したのち、細胞を1mlの冷水に懸濁し、浸透圧
ショックをかけて、細胞のペリプラズム空間中の物質を
放出させた。6000×ｇにて10分間の遠心によりペリプラ
ズム画分から細胞を除去し、上清中の抗トロンビン活性
を測定することにより、ヒルジンの分泌蓄積量を測定し
た。抗トロンビン活性は、トロンビンに対する合成基質
クロモザイムTH（トシルグリシルプロリルアルギニン４
−ニトロアニリドアセテート、ベーリンガーマンハイム
社製）水解活性の阻害度を比色定量試験により測定し
た。

該反応は、1mlの反応容量において、100mMTris・HCl（p
H8.5）、150mM NaCl、0.1％ポリエチレングリコール600
0からなる緩衝液に0.36Uのヒト−トロンビン（シグマ社
製）を加え、標準ヒルジン又は未知のサンプルをこのト
ロンビン反応混合物に添加し、37℃で３分間プレインキ
ュベートした。

終濃度200μＭとなるように基質クロモザイムTHを加
え、Ｐ−ニトロアニリドの遊離を波長405nmで測定し、
１分間あたりの吸収の増加を求め、抗トロンビン活性
（ATU）を測定した。

その結果、プラスミドpMTSHV1を有する株では培地1mlあ
たり450ATUの抗トロンビン活性が認められた。プラスミ
ドpMKSHV1を有する株では培地1mlあたり360ATUの抗トロ
ンビン活性が認められた。また、プラスミドpMTSHV1をH
anahan等の形質転換法により、種々の大腸菌JM101,JM10
3,JM109,TG1,HB101,JA221,IF03301,C600,RR1,DH5に導入
し、分泌生産の検討を行なった結果を第１表に示した。

宿主としてRR1を用いた場合、約2000ATU/mlのHV1が分泌
生産された。

（４）5l発酵槽中での形質転換株E.coli JM109/pMTSHV1
の発酵及び培養液へのヒルジンHV1の分泌上記（３）に記載した方法と同様にして、5lの発酵槽に
おいて、2lの２％グルコースを含む2xYT培地中でプラス
ミドpMTSHV1で形質変換されたE.coli JM109菌株（E.col
i JM109/pMTSHV1）を、37℃、24時間通気撹拌培養を行
なったところ、培養液中に1mlあたり約5300ATUのヒルジ
ンの分泌生産が認められた。

（５）培養液からのヒルジンHV1の精製法発酵の後培養液1.5lを収得し、そして遠心分離（6000×
ｇ、10分間）して上清から細胞を分離した。上清の塩濃
度を塩分計で測定したところ、1.3％であったので、こ
れを10mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.0）で４倍希釈
し、3.2μｍフィルター（ポール社製）を通して濾過し
た。得られた濾液を10mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.
0）で平衡化させたQAE−トヨパールカラム（4.4×7cm）
にかけた。適用後、平衡化緩衝液で洗浄後、0.2M NaCl
でヒルジンHV1を段階溶出させた。溶出液をアミコンの
ダイアフローメンブレン（YM5）を用いて濃縮し、10mM
リン酸カリウム緩衝液（pH7.0）で平衡化したセファク
リルＳ−100のカラムでゲル濾過した。

活性画分をさらに10mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.0）
で平衡化したDEAE−トヨパールカラム（4.4×40cm）に
添加し十分洗浄後、3lの平衡化緩衝液および3lの塩化ナ
トリウム中の0.3Mの平衡化緩衝液の直線の勾配で溶離し
た。最後にウォーターズのデルタプレップ3000によるC₄
逆相HPLCカラムでの精製を行なった。カラムを0.065％
（v/v）トリフルオロ酢酸及び15〜30％（v/v）アセトニ
トリルの直線グラジェントによりカラムからヒルジンを
溶出させた。

精製されたヒルジンHV1のアミノ酸組成及びＮ末端アミ
ノ酸配列を調べたところ、アミノ酸組成値は第２表に示
すように天然型HV1の値を示し、Ｎ末端配列は第３表に
示すようにVal−Val−Tyrであり、phoAシグナルペプチ
ドが正しく切断されていることがわかった。抗トロンビ
ン活性を測定した結果、9600ATU/mgであった。

（６）キメラヒルジンHV1C3分泌プラスミドpMTSHV1C3の
作製プラスミドpMTSHV1C3は第５図に示す方法に従って構築
した。ヒルジンHV1のアミノ酸残基53位以降のアミノ酸
配列をHV3の配列に置換するために、HV1分泌プラスミド
pMTSHV1（10μｇ）を制限酵素KpnI30単位、HindIII30単
位を用いて分解し、アガロースゲル電気泳動に供して、
2.8KbpのDNA断片を精製した。

またプラスミドpUCHV3（特願昭１−207200）10μｇも同
様に、KpnIとHindIIIで分解し、HV3のＣ末端のアミノ酸
配列を有する80bpのDNA断片を精製した。

両者のDNA断片100ngをT₄DNAリガーゼにより16℃で一晩
反応させ、この反応液を用いて大腸菌JM109株を形質転
換し、キメラヒルジンHV1C3分泌プラスミドpMTSHV1C3を
得た。このプラスミドpMTSHV1C3の塩基配列はサンガー
等の方法で確認した。

（７）キメラヒルジンHV1C3分泌プラスミドによるキメ
ラヒルジンの分泌生産上記（６）で構築したプラスミドpMTSHV1C3により形質
転換された大腸菌E.coli RR−１株（E.coli RR−1/pMTS
HV1C3として微生物工業技術研究所に寄託、微工研条寄
第3130号）を100μg/mlのアンピシリンを含む2xYT培地
で培養した。37℃で24時間培養後、培養液1mlを集菌
し、細胞に浸透圧ショックを与え、ペリプラズム画分の
抗トロンビン活性を測定した。

その結果、培地1mlあたり3060ATUの抗トロンビン活性が
認められた。

（８）5l発酵槽中での形質転換株E.coli JM109/pMTSHV1
C3の発酵及び培養液へのキメラヒルジンの分泌プラスミドpMTSHV1C3により形質転換された大腸菌E.col
i JM109株（E.coli JM109/pMTSHV1C3として微生物工業
技術研究所に寄託、微工研条寄第3104号）を5lの発酵槽
において、2lの２％グルコースを含む2xYT培地中で37
℃、24時間通気撹拌培養を行なったところ、ペリプラズ
ム中に350ATU/ml、培養液中に5700ATU/ml、あわせて605
0ATU/mlの抗トロンビン活性が認められた。

（９）キメラヒルジンの精製上記（８）で得られた培養液から上記（５）に従って精
製した。精製されたキメラヒルジンHV1C3のアミノ酸組
成を調べたところ、式１に示すようにＣ末端アミノ酸配
列が変化していることが確認された。比活性は11,250AT
U/mgであった。第６図に精製したHV1及びHV1C3のHPLC p
rofileを示した。この条件は、VYDAC C4（0.37×25cm）
のカラムを使用し、15〜30％アセトニトリルを用いて1m
l/minの速度で30分間linear gradientを行ったものであ
る。

実施例２トロンビン誘発致死反応に対するヒルジンの阻害作用雄性マウス（20〜25g）に無麻酔下でトロンビン（10NIH
ユニット/10g）を静注し、正向反射の消失及び致死を指
標として、被験化合物の抗トロンビン作用を評価した。
尚、被験化合物は、全て生理食塩水に溶解し、トロンビ
ン投与５分前に0.05ml/10gの用量で静注した。結果を第
４表に示す。

結果から明らかなように本発明のキメラヒルジンHV1C3
は、in vivoにおけるトロンビン誘発致死反応におい
て、ヒルジンHV1に比べて約４〜５倍の強い阻害効果を
示した。ヒルジンHV3と比べるとほぼ同程度の阻害効果
であった。

実施例３出血時間の延長作用雄性マウス（20〜25g）を用いてペントバルビタール（4
0mg/kg,i.p.）麻酔下に尾静脈より被験化合物を投与
し、その５分後に化合物投与の反応側の尾静脈に21G注
射針（外径0.85ミリ）を挿入して作製した傷口の出血時
間を測定した。

出血時間は、15秒毎に傷口を濾紙で拭い、濾紙上に血液
斑が確認されなくなった時点とした。結果を第５表に示
す。

一般的に、抗血液凝固剤の副作用としては出血時間の延
長作用があげられる。ところが、本発明のキメラヒルジ
ンHV1C3は、ヒルジンHV1及びヒルジンHV3に比べて明ら
かに出血傾向が低いことが確認された。

実施例４キメラヒルジンHV1C3を含有する製剤実施例１（９）で得た精製キメラヒルジンHV1C3をセフ
ァデックスG25（ファルマシア製）により脱塩し、つい
で0.22μｍのフィルターにより無菌濾過した。この溶液
をバイアルに分注し凍結乾燥した。こうして得られたキ
メラヒルジンHV1C3の凍結乾燥粉末を生理食塩水で溶解
することにより、注射剤として使用することができる。

〔発明の効果〕

本発明のヒルジン変異体は、ヒルジンHV1にくらべて抗
トロンビン作用が強く、しかも出血傾向が低いことから
抗血液凝固剤として有用である。

また、本発明のヒルジン変異体は、遺伝子工学的手法に
よって生産されるので大量に経済的に生産することがで
きる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ヒルジンの自然変異体HV1,HV2及びHV3のアミ
ノ酸配列を示し、第２図は、本発明において使用できる
phoAシグナルベブチドの塩基配列を示す。第３図はヒルジンHV1分泌プラスミドpMTSHV1の構築方法
の概念図を、第４図は、pMKSHV1の構築方法の概念図を
それぞれ示す。第５図は、本発明のヒルジン変異体（HV1C3）を分泌プ
ラスミドの構築方法の概念図を示す。第６図（ａ）は精製ヒルジンHV1の逆相HPLCのクロマト
グラムを、第６図（ｂ）は本発明の精製HV1C3の逆相HPL
Cのクロマトグラムをそれぞれ示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記のアミノ酸配列を有するヒルジン変異
体
【請求項２】（式Ｉ）のアミノ酸配列を有するポリペプ
チドをコードするDNA配列
【請求項３】（式Ｉ）のアミノ酸配列を有するポリペプ
チドをコードするDNA配列を含む発現ベクターを用いて
大腸菌を形質転換してなる形質転換微生物
【請求項４】請求項（３）に記載の形質転換微生物を培
養し、（式Ｉ）で示されるヒルジン変異体を発現させ、
これを回収することを特徴とする（式Ｉ）記載のヒルジ
ン変異体の製造法
【請求項５】（式Ｉ）記載のヒルジン変異体を有効成分
とする抗凝血剤