JPH0714342B2

JPH0714342B2 - エステラーゼの製法

Info

Publication number: JPH0714342B2
Application number: JP2213266A
Authority: JP
Inventors: 元是佐藤; 孝平高橋; 武爾柴谷; 浩二柳谷
Original assignee: 田辺製薬株式会社
Priority date: 1990-08-10
Filing date: 1990-08-10
Publication date: 1995-02-22
Anticipated expiration: 2010-02-22
Also published as: US5273897A; DE69114599T2; JPH0494683A; EP0470575A1; DE69114599D1; EP0470575B1

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、高活性エステラーゼの製法に関する。

（従来の技術）エステラーゼは、エステル結合を加水分解する酵素であ
り、同時にエステル合成反応及びエステル交換反応に対
する触媒能を有するため、近年、有機合成反応に利用す
る試みが盛んに行われている。

一方、微生物のエステラーゼとしてはアルスロバクター
属、バチラス属、シュードモナス属、セラチア属、コリ
ネバクテリウム属、マイクロコッカス属、アプシディア
属、ムコール属、キャンディダ属、リゾプス属等の微生
物を培養することにより得られることが知られている。

（発明が解決しようとする課題）上記の如き微生物のエステラーゼは、工業的に用いられ
ているプロチアーゼ、セルラーゼ等の酵素に比較して、
その生産性が低く、工業的に用いるには高価であるとい
う難点を有しているため、高活性のエステラーゼ製法の
開発が望まれている。

（課題を解決するための手段）本発明者らは、高活性カルボン酸エステルを加水分解す
るエステラーゼ（以下、エステラーゼという）の製法に
ついて、種々研究を重ねた結果、当該エステラーゼ産生
微生物の培養初期から、培地中にアミノ酸とポリオール
化合物の脂肪酸エステルとを添加した場合には、エステ
ラーゼ活性が顕著に高くなることを見出し、本発明を完
成するに到った。

かかる知見に基づく本発明は、エステラーゼ生産能を有
する微生物を培養してエステラーゼを生産するに際し、
培地にエステラーゼの誘導物質として、アミノ酸とポリ
オール化合物の脂肪酸エステルとを添加することを特徴
とする高活性エステラーゼの製法である。

本発明において、誘導物質として培地に添加されるアミ
ノ酸としては、特に限定されず、例えば脂肪族アミノ
酸、芳香族アミノ酸或いは複素環式基を有するアミノ酸
などが挙げられる。脂肪族アミノ酸としては、グリシ
ン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシンなどの
モノアミノカルボン酸、セリン、スレオニンなどのオキ
シアミノカルボン酸、システイン、シスチンなどの含硫
アミノ酸、アスパラギン酸、グルタミン酸などのモノア
ミノジカルボン酸などが挙げられ、芳香族アミノ酸とし
ては、フェニルアラニン、チロシンなどが挙げられる。
また複素環式基を有するアミノ酸としてはヒスチジン、
トリプトファン、プロリン、オキシプロリンなどが挙げ
られる。

これらのアミノ酸は遊離のものの他、塩酸塩、硫酸塩な
どの酸付加塩でも、ナトリウム塩、カリウム塩などのア
ルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのア
ルカリ土類金属塩であっても好適に使用することができ
る。

これらアミノ酸のうち、グリシン、アラニン、スレオニ
ン、プロリン、ヒスチジン、アルギニン、セリン、グル
タミン酸、アスパラギン酸などが好ましく、とりわけ、
プロリン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸
が好ましい。

上記アミノ酸と共に培地に添加されるポリオール化合物
の脂肪族エステルとしては、ソルビタン脂肪酸エステ
ル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルなど
があげられる。ソルビタン脂肪酸エステルとしては、ソ
ルビタンと炭素数12〜18の飽和又は不飽和脂肪酸とのエ
ステルがあげられ、具体的には、例えばソルビタンモノ
ラウリル酸エステル、ソルビタンモノミリスチン酸エス
テル、ソルビタンモノオレイン酸エステル、ソルビタン
トリオレイン酸エステルなどがあげられる。また、ポリ
オキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルとしては、ポ
リオキシエチレンソルビタンと炭素数12〜18の飽和又は
不飽和脂肪酸とのエステルがあげられ、具体的には、例
えばポリオキシエチレンソルビタンモノラウリル酸エス
テル、ポリオキシエチレンソルビタンモノミリスチン酸
エステル、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアリ
ン酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタントリステ
アリン酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタンモノ
オレイン酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタント
リオレイン酸エステルなどがあげられる。

上記各成分は、いずれも微生物の培養初期に、培地中に
添加しておく必要があり、アミノ酸の添加量は、培地中
の濃度として約0.1〜４％、とりわけ約0.5〜２％である
のが好ましい。

また、ポリオール化合物の脂肪酸エステルの添加量は、
培地中の濃度として約0.1〜４％、とりわけ約0.5〜２％
であるのが好ましい。

本発明において使用される微生物としては、エステラー
ゼを生産する能力を有する微生物であればよく、例えば
このような能力を有する黴、細菌、酵母、放線菌等の微
生物を好適に使用することができる。具体的には黴とし
てはアプシディア属、アスペルギルス属、フサリウム
属、ギベレラ属、ムコール属、ノイロスポラ属、トリコ
デルマ属又はリゾプス属に属する微生物があげられ、細
菌としてはマクロモバクター属、アルカリゲネス属、バ
シルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム
属、プロビデンシヤ属、シュードモナス属、セラチア属
に属する微生物があげられ、酵母としてはキャンディダ
属又はサッカロマイコプシス属に属する微生物があげら
れ、又放線菌としてはノカルディア属に属する微生物が
あげられる。

係る微生物の具体例としては、例えばアプシディア・コ
リンビフェラ（Absidia corymbifera）IFO 4009、同IFO
4010、アスペルギルス・オクラセウス（Aspergillus o
chraceus）IFO 4346、アスペルギルス・テレウス（Aspe
rgillus terreus）IFO 6123、フサリウム・オキシスポ
ラム（Fusarium oxysporum）IFO 5942、同ATCC 659、フ
サリウム・ソラニ（Fusarium solani）IFO 5232、ギベ
レラ・フジクロイ（Gibberella fujikuroi）IFO 5268、
ムコール・アングリマクロスポラス（Mucor angulimacr
osporus）IAM 6149、ムコール・シルシネロイデス（Muc
or circinelloides）IFO 6746、ムコール・フラバス（M
ucor flavus）IAM 6143、ムコール・フラギリス（Mucor
fragilis）IFO 6449、ムコール・ジェネベンシス（Muc
or genevensis）IAM 6091、ムコール・グロボサス（Muc
or globosus）IFO 6745、ムコール・ヒエマリス（Mucor
hiemalis）OUT 1045、同OUT 1047、ムコール・ジァン
セニ（Mucor janssenii）OUT 1050、同IFO 5398、ムコ
ール・ジャバニカス（Mucor javanicus）IFO 4569、同I
FO 4570、同IFO 4572、同IFO 5382、ムコール・ランプ
ロスボラス（Mucor lamposporus）IFO 6337、ムコール
・ペトリンスラリス（Mucor petrinsularis）IFO 675
1、ムコール・プランベウス（Mucor plumbeus）IAM 611
7、ムコール・プライニ（Mucor praini）IAM 6120、ム
コール・プシラス（Mucor pusillus）IAM 6122、ムコー
ル・ラセモサス（Mucor racemosus）IFO 4581、ムコー
ル・ラマニアヌス（Mucor ramannianus）IAM 6128、ム
コール・レカルバス（Mucor recurvus）IAM 6129、ムコ
ール・シルバティカス（Mucor silvaticus）IFO 6753、
ムコール・スピネッセンス（Mucor spinescens）IAM 60
71、ムコール・サブチリシマス（Mucor subtilissimu
s）IFO 6338、ノイロスポラ・クラッサ（Neurospora cr
assa）IFO 6068、リゾプス・アリザス（Rhizopus arrhi
zus）IFO 5780、リゾプス・デレマー（Rhizopus delema
r）ATCC 34612、リゾプス・ジャポニカス（Rhizopus ja
ponicus）IFO 4758、トリコデルマ・ビリデ（Trichoder
ma viride）OUT 4208、同IFO 4847、アクロモバクター
・サイクロクラステス（Achromobacter cycloclastes）
IAM 1013、アルカリゲネス・フェカーリス（Alcaligene
s faecalis）OUT 8030、バシルス・スフェリカス（Baci
llus sphaericus）IFO 3525、バシルス・サブチルス（B
acillus subtilis）OUT 8104、同OUT 8106、ブレビバク
テリウム・ケトグルタミカム（Brevibacterium ketoglu
tamicum）ATCC 15588、コリネバクテリウム・アルカノ
リティカム（Corynebacterium alkanolyticum）ATCC 21
511、コリネバクテリウム・ハイドロカーボクラスタム
（Corynebacterium hydrocarboclastum）ATCC 15592、
コリネバクテリウム・プリモリオキシダンス（Coryneba
cterium primorioxydans）ATCC 31015、プロビデンシヤ
・アルカリファシエンス（Providencia alcalifacien
s）JCM 1673、シュードモナス・ムタビリス（Pseudomon
as mutabilis）ATCC 31014、シュードモナス・プチダ
（Pseudomonas putida）ATCC 17426、同ATCC 17453、同
ATCC 33015、セラチア・リクエファシエンス（Serratia
liquefaciens）ATCC 27592、セラチア・マルセッセン
ス（Serratiamarcescens）ATCC 13880、同ATCC 14764、
同ATCC 19180、同ATCC 21074、同ATCC 27117、同ATCC 2
1212、同FERM BP-487、セラチア・プリムティカ（Serra
tia prymutica）IAM 1255、キャンディダ・パラプロシ
ロシス（Candida parapsilosis）IFO 0585、キャンディ
ダ・ボイディニ（Candida boidinii）IFO 10240、サッ
カロマイコプシス・リポリティカ（Saccharomycopsis l
ipolytica）IFO 0717、同IFO 0746、同IFO 1195、同IFO
1209、同IFO 1548、ノカルディア・アステロイデス（N
ocardia asteroides）IFO 3384、同IFO 3424、同IFO 34
23、ノカルディア・ガードネリ（Nocardia gardneri）A
TCC 9604などがあげられる。

これらの微生物は野性株、変異株であってもよく、更に
はこれらの微生物から遺伝子組み換え、細胞融合などの
生物工業的手法により誘導されるものであってもよい。

上記微生物を培養する培地としては、上記の如きエステ
ラーゼ産生微生物が生育、増殖しうるものであれば、い
ずれの培地をも用いることができる。例えば、炭素源と
してデキストリン、ブドウ糖、庶糖の如き糖類、クエン
酸、フマル酸、グルコン酸の如く有機酸、窒素源として
硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウ
ムの如く無機アンモニウム塩又はミーストＳ、酵母抽出
液、ペプトン、コーンスティープリカー、カゼイン加水
分解物等の如き有機窒素源等を好適に用いることができ
る。また、培地には、必要に応じ、燐酸塩、マグネシウ
ム塩、カリウム塩、カルシウム塩等の無機塩、鉄、マン
ガン、ニッケル、銅、亜鉛等の金属イオンを適当量添加
してもよい。

また、培養は、上記のごとき慣用の培地にアミノ酸とポ
リオール化合物の脂肪酸エステルとを添加後、常温ない
し加温下（好ましくは約20〜40℃）、好気的条件下、pH
約５〜８で好適に実施することができる。

エステラーゼの採取時期は、菌体内外のエステラーゼ蓄
積量が最大となる菌体増殖の後期から定常期にかけて行
うのが適当である。

以上のようにして培養菌体内外に産生されたエステラー
ゼは、公知の方法、例えば、培養液を遠心分離、糖密濾
過膜（旭化成製のEMP-113、日東電工製のNTM9002C-1
等）等により菌体を除去するか、更に、上清液を限外濾
過膜（旭化成製のSIP 1013、日東電工製のNTU 2020等）
等により濃縮することにより酵素溶液として取得するこ
とができる。

上記酵素溶液は、必要に応じ、無機塩類（例えば、硫酸
アンモニウム等）による塩析法、親水性有機溶媒（例え
ば、アルコール類、アセトン等）による分画沈澱、イオ
ン交換樹脂及び多種カラムクロマトグラフィーによる吸
脱着法、ゲル濾過法、蛋白沈澱剤（例えば、核酸、タン
ニン等）を利用する方法又はこれらを適宜組合せてエス
テラーゼを分離・精製することができ、またかくして得
たエステラーゼは等電点沈澱法、透析法、電気透析法、
電気泳動法等により更に精製することもできる。

以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。

なお、本実施例中、％は、特に言及しないかぎり、w/v
％を表す。

（実施例）実施例１下記組成の基本培地60mlにポリオキシエチレンソルビタ
ンモノオレイン酸エステル（Tween80）0.5v/v％、第１
表記載のアミノ酸１％を添加し、50％ml容の振とうフラ
スコに分注し、滅菌する。この培地にセラチア・マルセ
ッセンスSr41（微工研条寄第487号）を接種し、30℃、1
40cpmにて２時間振とう培養し、培養終了後、培養液を
遠心分離（5000g、20分）して菌体を除去することによ
り、酵素溶液を調製し、下記の活性測定方法に従って、
該酵素溶液のエステラーゼ活性を測定した。

基本培地組成：デキストリン１％、硫酸アンモニウム0.
2％，ミーストS1％，燐酸−カリウム0.1％、硫酸マグネ
シウム0.05％、塩化カルシウム0.01％、硫酸第一鉄0.00
1％、ポリアルキレングリコール誘導体系界面活性剤
（カラリン102、三洋化成工業（株）製）0.1％v/v（水
酸化ナトリウムによりpH7.0に調整）（活性測定法）２％ポリビニルアルコール（ポバール117、クラレ社
製）225mlと局方品オリーブ油75mlの混液を５〜10℃に
て10分間、14,500rpmで乳化し、得られるオリーブ油乳
化液5.0mlと0.25Mトリス塩酸緩衝液（pH8.0）4.0ml（2.
5mM塩化カルシウムを含む）を37℃で10分間予熱してお
く。これに1mlの酵素液を加え、37℃で20分間反応させ
た後、アセトン−エタノール混液20mlを加えて反応を停
止し、フェノールフタレインを指示薬として0.05N NaOH
溶液で滴定する。ブランクとして、先にアセトン−エタ
ノールを加えた後、酵素液を加え、同様に滴定する。以
上の方法で１分間に１μmolの脂肪酸を遊離する酵素量
を１単位とした。

（結果）結果を下記第１表に示す。

実施例２実施例１の基本培地組成に、ポリオキシエチレンソルビ
タンモノオレイン酸エステル（Tween80）0.5v/v％を添
加し、更に下記第２表に示す量のＬ−プロリン及び／又
はＬ−ヒスチジン塩酸塩を添加した培地60mlを500ml容
の振とうフラスコに分注し、滅菌する。この培地にセラ
チア・マルセッセンスSr41（微工研条寄第487号）を接
種し、30℃、140cpmにて24時間振とう培養する。培養終
了後、実施例１と同様に酵素溶液を調製し、エステラー
ゼ活性を測定した。

（結果）結果を下記第２表に示す。

実施例３実施例１の基本培地組成にＬ−プロリン１％、Ｌ−ヒス
チジン塩酸塩0.5％を添加し、更に下記第３表に示す量
のポリオール化合物の脂肪酸エステル0.5％を添加した
培地60mlを500ml容の振とうフラスコに分注し、滅菌す
る。この培地にセラチア・マルセッセンスSr41（微工研
条寄第487号）を接種し、30℃、140cpmにて24時間振と
う培養する。培養終了後、実施例１と同様に酵素溶液を
調製し、エステラーゼ活性を測定した。

（結果）結果は下記第３表の通りである。

実施例４実施例１の基本培地組成に、ポリオキシエチレンソルビ
タンモノオレイン酸エステル（Tween80）0.5v/v％、Ｌ
−プロリン１％を添加した培地60mlを500ml容の振とう
フラスコに分注し、滅菌する。この培地（初発pH:細菌
7.0、かび6.0）に第４表記載の微生物を接種し、30℃、
140cpmにて24時間振とう培養する。培養終了後、実施例
１と同様に酵素溶液を調製し、下記活性測定方法でエス
テラーゼ活性を測定した。

（活性測定方法）酵素液10μをリパーゼ定量用試薬であるリパーゼキッ
トＳ〔基質：三酪酸ジメルカプロール、大日本製薬
（株）製〕の基質溶液1mlに加え、30℃で10分間反応さ
せ、反応終了後、発色剤である5,5'−ジチオビス（２−
ニトロ安息香酸）と反応させ、遊離した５−チオ−２−
ニトロ安息香酸を412nmの吸光度で測定する。以上の方
法で１分間に１μmolの５−チオ−２−ニトロ安息香酸
を遊離する酵素量を１単位とした。

（結果）結果を下記第４表に示す。

参考例実施例１の基本培地組成に、Ｌ−プロリンを1.0％、Ｌ
−ヒチジンを0.5％、ポリオキシエチレンソルビタンモ
ノオレイン酸エステル（Tween80）を0.5v/v％添加した
培地60mlを500ml容の振とうフラスコに分注後、滅菌す
る。この培地に、セラチア・マルセッセンスSr41（微工
研条寄第487号）を接種し、30℃、140cpmにて24時間振
とう培養する。上記培養液750mlを遠心分離して菌体を
除去し、得られる上澄液にラセミ型トランス−３−（４
−メトキシフェニル）グリシッド酸メチルエステル312g
を含むトルエン1.5を添加する。該混合物に50mMトリ
ス−塩酸緩衝液745mlと200mM塩化カルシウム水溶液5ml
を加えた後、10N水酸化ナトリウム水溶液でpHを８に保
ちつつ30℃で３時間後撹拌する。反応液からトルエン層
を分取した後、炭酸水素ナトリウムを添加してアルデヒ
ドを除去し、乾燥後、溶媒を留去する。得られる結晶を
イソプロパノールから再結晶させることにより、（2R,3
S）−３−（４−メトキシフェニル）グリシッド酸メチ
ルエステル125g（白色結晶）を得る。

〔α〕_Ｄ＝−205.4゜（発明の効果）本発明方法によれば、培地にエステラーゼの誘導物質と
して、アミノ酸とポリオール化合物の脂肪酸エステルと
を添加するだけで、無添加の場合に較べて、顕著に高い
活性を有するエステラーゼを製造することができるの
で、工業的に極めて効率的にエステラーゼを製造するこ
とができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献特開昭57−110189（ＪＰ，Ａ) 特開昭62−118884（ＪＰ，Ａ) 特開昭57−63086（ＪＰ，Ａ) 特開昭53−59093（ＪＰ，Ａ)

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】カルボン酸エステルを加水分解するエステ
ラーゼ産生能を有する微生物を培養して当該エステラー
ゼを生産するに際し、培地に当該エステラーゼの誘導物
質として、アミノ酸とポリオール化合物の脂肪酸エステ
ルとを添加することを特徴とする高活性エステラーゼの
製法。
【請求項２】アミノ酸がグリシン、アラニン、スレオニ
ン、プロリン、ヒスチジン、アルギニン、セリン、グル
タミン酸及びアスパラギン酸から選ばれる１種以上であ
る請求項１記載の製法。
【請求項３】ポリオール化合物の脂肪酸エステルが、ソ
ルビタンと炭素数12〜18の飽和又は不飽和脂肪酸とのエ
ステル又はポリオキシエチレンソルビタンと炭素数12〜
18の飽和又は不飽和脂肪酸とのエステルである請求項１
記載の製法。
【請求項４】アミノ酸がＬ−アスパラギン酸、Ｌ−グル
タミン酸、Ｌ−ヒスチジン及びＬ−プロリンから選ばれ
る１種以上であり、ポリオール化合物の脂肪酸エステル
がソルビタンモノラウリン酸エステル、ソルビタンモノ
ミリスチン酸エステル、ソルビタンモノステアリン酸エ
ステル、ソルビタントリステアリン酸エステル、ソルビ
タンモノオレイン酸エステル、ソルビタントリオレイン
酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタンモノミリス
チン酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタンモノス
テアリン酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタント
リステアリン酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタ
ンモノオレイン酸エステル又はポリオキシエチレンソル
ビタントリオレイン酸エステルである請求項１記載の製
法。
【請求項５】アミノ酸がＬ−ヒスチジン及びＬ−プロリ
ンから選ばれる１種以上であり、ポリオール化合物の脂
肪酸エステルがポリオキシエチレンソルビタンモノオレ
イン酸エステルである請求項１記載の製法。