JPH0715469B2 - ヒトの肺表面活性物質の測定方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、ヒトの肺表面活性物質のアポ蛋白に対する抗
体を利用した、ヒトの肺表面活性物質の測定方法に関す
るものである。

背景技術 動物の肺胞には、肺表面活性物質と称するリン脂質を主
成分とする生理活性物質が存在する。これは肺胞の内壁
を覆い、肺胞上皮保護作用を有すると共に、動物が呼吸
機能を維持する上に重要な生理的機能を有している。即
ち、肺表面活性物質は、呼吸時、呼気時における肺胞内
面の表面張力を変化させるといった特異な表面活性を有
しており、肺胞相互間の安定性に寄与して、抗無気肺作
用を示すと云われている。かかる肺表面活性物質が不足
すると肺胞は虚脱し、安定した換気能力を維持できなく
なり例えば、新生児呼吸緊迫症候群（IRDS）のごとき症
状が現われる。

かかる疾患を有する新生児の出生を予防するためには、
胎児肺の成熟度と関連のある羊水中の肺表面活性物質の
量を測定し、胎児が未熟肺のまま出生しようとしている
場合には、例えば、ステロイド投与により肺表面活性物
質の分泌促進といった、子宮内治療を行なうことが可能
である。

そして、従来、羊水中の肺表面活性物質の量を測定又は
推定する方法としては、いくつかの方法が提案されてい
る。例えば、肺表面活性物質のマーカーとして、羊水中
のL/S比（レシチンとスフィンゴミエリンの比）や羊水
中のジバルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）量が
測定されているが、前者の方法は、肺表面活性物質の主
成分であるリン脂質を測定するものではなく、IRDSとの
相関性が低いという欠点があり、後者の方法は、感度が
悪いという問題点がある。

また、成人で肺表面活性物質が不足すると、成人呼吸緊
迫症候群（ARDS）のごとき症状が現われる。それらの肺
疾患の診断を目的として肺洗浄液の中の肺表面活性物質
の量、例えば、肺表面活性物質のマーカーとしてDPPCや
ホスファチジルグリセロール（PG）量が測定されている
が、感度が十分ではないという問題点がある。

一方、肺洗浄液の物理化学的手法を用いた測定として、
表面張力等の測定も行なわれており、同様の目的で患者
の排泄する喀痰も診断対象となっている。具体的には、
喀痰の粘度、色調などの測定、喀痰中の気道粘液量を反
映するフコース（Fucose）の測定などが行なわれてい
る。肺洗浄液採取に比べ、喀痰の採取は、容易であるこ
とにその測定対象液としての優位性がある。

ところで、肺表面活性物質の約90％はリン脂質や中性脂
質等の脂質であるが、約10％は蛋白であり、これらは脂
質と蛋白の複合体、即ちリポ蛋白として存在している。
肺表面活性物質から脂質を除去すると水不溶性の蛋白が
得られ、これをアポ蛋白（LSP）と呼んでいるが、分子
量約36,000（36K）の等蛋白が主成分である。リン脂質
に比べ、蛋白は特異性に優れまた高感度に検出し得るの
で、肺表面活性物質のマーカーとして蛋白を用いること
も検討され、いわゆるポリクローナル抗体による免疫学
的定量も行なわれてきた。しかしながら、従来の方法
は、測定に長時間を要しまた感度も十分ではないという
問題点があった。

そこで、本発明者らは、肺表面活性物質を構成するアポ
蛋白に対するモノクローナル抗体を作成し、これを用い
て測定する方法を既に提案（特開昭62−64956号）し
た。

しかしながら、上記のごとく免疫学的測定を行なう場
合、標準物質であるアポ蛋白と羊水や喀痰等の検体中の
肺表面活性物質とは、その免疫学的測定法における反応
性に差が見られた。これは、検体中の肺表面活性物質
は、アポ蛋白とその10倍量のリン脂質により構成される
ため（喀痰の場合には更に気道粘度も含まれる）、抗体
を用いてアポ蛋白の測定を目ざす場合、リン脂質や気道
粘液による免疫反応の阻害があるためである。これを避
けるためには、免疫反応を非常に長い時間行なわねばな
らずIRDSやARDSなど緊急の疾患の診断に不便であるとい
う問題点があった。

発明の開示 本発明者らは、特開昭62−64956号に述べているアポ蛋
白に特異的な２種のモノクローナル抗体、あるいはポリ
クローナル抗体を用いて、免疫学的測定法の種々の条件
を検討した。その結果、免疫反応緩衝液に加える界面活
性剤の種類によって、ある場合にはアポ蛋白と検体中の
肺表面活性物質中のリポ蛋白が、短時間に免疫学的測定
上同等の挙動に到達すること、すなわち、リポ蛋白中の
アポ蛋白を正しくとらえていることを見い出し、本発明
に到達した。

即ち、本発明は、抗原−抗体反応からなる免疫学的方法
により、検体中のヒトの肺表面活性物質を測定する方法
において、免疫反応に用いる緩衝液に、陰イオン性界面
活性剤と非イオン性界面活性剤を共存させて免疫反応を
行なわせることを特徴とする、検体中のヒトの肺表面活
性物質の測定法である。

図面の簡単な説明 第１図は、羊水検体希釈用緩衝液（２％トリトン）にお
けるSDS濃度変化による、羊水検体中の肺表面活性物質
（リポ蛋白）の測定値を示す図である（免疫反応37℃、
1hr）。

第２図は、羊水検体希釈用緩衝液（％SDS）におけるト
リトン濃度変化による、羊水検体中の肺表面活性物質
（リポ蛋白）の測定値を示す図である（免疫反応37℃,1
hr）。

第３図は、羊水検体希釈用緩衝液（２％トリトン）にお
けるSDS濃度変化による、羊水検体中の肺表面活性物質
（リポ蛋白）の測定値を示す図である（免疫反応45℃,3
0分）。

第４図は、免疫反応の経時変化による、羊水中の肺表面
活性物質（リポ蛋白）の測定値を示す図である。

第５図は、SDS濃度とトリトン濃度変化による喀痰検体
中の肺表面活性物質の測定結果を示す。

第６図は、慢性気道疾患々者と気管支−肺胞上皮癌患者
の肺表面活性物質（LSP）量とLSP/フコース比を表す。

発明を実施するための最良の形態 本発明の方法により、短時間の固相免疫反応が可能にな
ったが、その理由としては、次のようなことがあげられ
る。非イオン性界面活性剤のみの使用の場合、免疫反応
に対する劣化効果はいが、界面活性効果としては不十分
なものである。一方、陰イオン性界面活性剤のみの使用
の場合、強力な界面活性効果はあるが、抗体の蛋白変性
をひきおこすため、抗原抗体反応を阻害してしまう。し
かしながら、陰イオン性界面活性剤に非イオン性界面活
性剤を共存させることにより、それぞれの活性剤の長所
が生かされ、陰イオン性界面活性剤による強力な界面活
性効果を保ちながら、非イオン性界面活性剤による蛋白
保護効果があらわれるため、短時間の免疫反応が可能に
なったと考えられる。

本発明において検体とは、ヒトの羊水，喀痰，肺洗浄液
等を意味する。

本発明の免疫学的方法、即ち抗原−抗体反応において用
いられる抗体としては特に限定はなく、肺表面活性物質
のアポ蛋白に対するポリクローナル抗体又はモノクロー
ナル抗体を用いることができる。これらの抗体は、公知
の方法で作成できる。

本発明で使用する界面活性剤としては、非イオン性界面
活性剤としては、ポリオキシエチレンアルキルエーテル
類，ポリオキシエチレンアルキルフェノールエーテル
類，ポリオキシエチレン脂肪酸エステル（モノ）類，ポ
リオキシエチレンアルキルチオエーテル類があり、ま
た、陰イオン性界面活性剤としては、高級アルコール硫
酸エステル類，アルキルスルホン酸塩，アルキルベンゼ
ンスルホン酸塩，ジナフチルメタンジスルホン酸塩類，
アルキルスルホコハク酸塩類，ポリオキシエチレンアル
キルエーテル硫酸エステル塩，ポリオキシエチレンアル
キルフェノール硫酸エステル塩類などがあげられる。

非イオン性界面活性剤としては、例えば、トリトン（Ro
hm ＆ Haas Co.製の商品名）のごときポリオキシエチレ
ンアルキルフェノールエーテル類が好ましく、陰イオン
性界面活性剤としては、ソジウムドデシルサルフェート
（SDS）のごときアルキルスルホン酸塩類が好ましい。
濃度としては、前者は0.25〜４重量％、後者は0.2〜３
重量％程度用いるのが好ましく、前者／後者の濃度比
（重量比）は1.0〜4.0が特に好ましい。トリトン/SDS濃
度比が1.0以下になると、強力な界面活性効果を有するS
DSが優性になり、抗体の蛋白変性をひきおこし、抗原抗
体反応を阻害する傾向がある。

一方、トリトン/SDS濃度比が4.0以上になると、非イオ
ン性界面活性剤になる蛋白保護効果は顕者となるが、ア
ポ蛋白の周囲をとりまく、リン脂質や気道粘液を分散す
る陰イオン性界面活性剤の効果を、マスクしてしまうこ
とになる。

本発明においては、１次抗体を担体に固定化しておくの
が好ましいが、固定化の方法は公知の方法を採用でき、
担体としては固相の、例えば、ポリスチレン，ポリエチ
レン，ポリアクリレート，テフロン，ポリアセタール等
を用いた、ボール，ビーズ，ギヤ，マイクロプレートが
好ましく使用される。

また、標識化の方法や手段、それの検出方法や手段は何
ら限定されるものではなく、公知の方法や手段、例えば
放射性物質又は酵素若しくは蛍光物質で標識された抗免
疫グロブリン抗体またはブドウ球菌蛋白Ａとの２次反応
により測定することができる。標識剤としては、酵素を
用いる方法（EIA）ではホースラディッシュパーオキシ
ダーゼ，β−Ｄ−ガラクトシダーゼ，アルカリフォスフ
ァターゼ等の酵素が、放射性物質を用いる方法（RIA）
では²⁵I,³H等が、蛍光物質を用いる方法（FIA）ではフ
ルオレセンイソチオサイアネート等が通常使用される
が、その標識剤の活性が測定可能であれば、その他のも
のであってもよい。

標識剤が酵素である場合には、その活性を測定するため
に基質が用いられる。基質としては例えば、ホースラデ
ィッシュパーオキシダーゼの基質として、2,2′−アジ
ノジ［３−エチルベンズチアゾリンスルホン酸］アンモ
ニウム酸（ABTS）−H₂O₂,5−アミノサリチル酸−H₂O₂,O
−フェニレンジアミン−H₂O₂,4−アミノアンチピリン−
H₂O₂などが、β−Ｄ−ガラクトシダーゼの基質として、
フルオレセイン−ジ−（β−Ｄ−ガラクトピラノシ
ド）,O−ニトロフェノール−β−Ｄ−ガラクトピラノシ
ドなどを挙げることが出来る。測定のためには、これら
の試薬以外にも溶解剤，洗浄剤，反応停止剤等の公知の
試薬が使用される。

本発明の方法により、検体中の肺表面活性物質中のアポ
蛋白を短時間で簡便に測定することができ、IRDSやARDS
等、緊急性を有する疾患に、有用な測定法を提供しうる
ものと期待される。

以下、実施例により本発明を詳述する。

実施例中の％は重量％を意味する。

実施例１ （１） モノクローナル抗体不溶化ビーズをよく洗浄し
てから、モノクローナル抗体PC6の20μg/mlの濃度を有
するPBS（pH7.4）溶液中に、４℃の温度で１昼夜放置し
た。その結果、ビーズをPBS溶液で洗浄してから、0.5％
牛血清アルブミン（BSA）水溶液中に、４℃の温度で１
昼夜放置してポストコーティング処理を実施して、モノ
クローナル抗体不溶化ビーズを得た。

（２） ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ標識モ
ノクローナル抗体の調製 モノクローナル抗体PE10の1.0mg/mlのPBS溶液に、Ｎ−
（ｍ−マレイミド安息香酸）−Ｎサクシンイミドエステ
ル（MBS）の10mg/mlの濃度のジメチルホルムアミド溶液
50mlを添加し、25℃の温度で30分間反応させた。次い
で、セファデックスＧ−25を充填したカラムを用い、0.
1Mリン酸緩衝液（pH6.0）でゲル濾過を行ない、マレイ
ミド化モノクローナル抗体と未反応MBSとを分離した。

一方、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（HRP）
の1.0mg/mlのPBS溶液に、Ｎ−サクシンイミジル−３−
（２−ピリジルチオ）プロピオネート（SPOP）の10mg/m
lの濃度のエタノール溶液を添加し、25℃で30分間反応
させた。次いで、セファデックスＧ−25を充填したカラ
ムを用い、0.01M酢酸緩衝液（pH4.5）でゲル濾過して精
製し、ピリジルジスルフィド化HRPを含有する画分を採
集して、コロジオンバック中において永冷下に約10倍に
濃縮した。次に、これに0.85％NaClと0.1Mジチオスレイ
トールとを含含有する0.1M酢酸緩衝液（pH4.5）1mlを添
加し、25℃で30分間撹拌して、HRP分子中に導入したピ
リジルジスルフィド基を還元した 次いで、セファデッ
クスＧ−25カラムにかけてゲル濾過し、チオール化HRP
を含有する画分を得た。

上記の如くして得られたマレイミド化モノクローナル抗
体とチオール化HRPとを混合し、コロジオンバックを用
いて永冷下に4mgの蛋白質濃度まで濃縮し、４℃で１昼
夜放置した後、ウルトロゲルAcA44を充填したカラムで
ゲル濾過し、HRP標識モノクローナル抗体を得た。

（３） SDS濃度変化による、羊水検体中の肺表面活性
物質の測定（免疫反応温度:37℃） 羊水検体希釈緩衝液として2.0％トリトンＸ−100と所定
濃度のSDS（0,0.25,0.5,0.75,1.0,2.0,3.0,4.0％）を含
む混合液を用い、羊水検体を含むこの混合液ととHRP標
識モノクローナル抗体PE10希釈液とを、各々200μｍず
つ試験管中のモノクローナル抗体PC6固定ボールに加
え、免疫反応を行なった（37℃,1時間）。次に、試験管
の溶液を吸引除去後、生理食塩水で洗浄してから、3,
3′,5,5′−テトラメチルベンジジン１％含有メタノー
ル溶液/H₂O₂ 0.015％を含有する1Mリン酸−クエン酸緩
衝液（pH4.5）の3/7（V/V）混合溶液を、各0.4mlずつ各
試験管内に加え、室温で15分間インキュベートした後、
反応停止剤として1.5NH₂SO₄水溶液を2mlずつ加えて、酵
素反応を停止させた。そして分光光度計を用いてこの溶
液の450nmの波長の吸収強度を測定した。

一方、アポ蛋白を標準物質とし、前記と同じ混合液を希
釈緩衝液とし、前記と同様にしてSDSのそれぞれの濃度
に対応した検量線を作成しておいた。そして、対応する
SDS濃度の検量線を用いて、前記のごとくして得られた4
50nmの吸収強度から、アポ蛋白（LSP）の濃度を求め
た。それぞれのSDS濃度に対応して得られたLPSの濃度を
第１図に示した。

第１図から、２％トリトンの共存下では、SDS0.25％か
ら3.0％まで、羊水検体中の抗原（LSP）が抗体により比
較的良好に認識されていることがわかる。

実施例２ トリトン濃度変化による、羊水検体中の肺表面性物質の
測定（免疫反応温度:37℃） 羊水検体を用い、１％のSDSと、各濃度のトリトンＸ−1
00（0,0.25,0.5,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0％）を含む混合液
を希釈液として用い、実施例１の（３）と同様の実験を
行なった。トリトンの濃度とLPSの関係は、第２図に示
した。第２図から明らかなように、１％SDS存在下、ト
リトン0.25％から4.0％まで、羊水検体中の抗原を良好
に測定しうることが判明した。

実施例３ SDS濃度変化による羊水検体中の肺表面活性物質の測定
（免疫反応温度:45℃） 羊水検体を用い、２％トリトンＸ−100と各濃度のSDS
（0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0％）を含む混合液を希釈液と
して用いて、45℃で30分実施例１の（３）と同様の免疫
反応を行なった。SDS濃度とLPSの関係は、第３図に示し
た。第３図から明らかなように、45℃の免疫反応温度,2
％トリトン存在下では、SDSは0.2％〜1.0％まで良好な
結果を示し、SDS0.6％で最高の免疫反応を示した。

実施例４ 羊水検体中の肺表面活性物質測定値の経時変化（免疫反
応温度:45℃） 標準物質（アポ蛋白）と羊水検体の希釈液として、
（ａ）トリトンＸ−100 ２％,SDS0.6％、（ｂ）トリト
ンＸ−100 ２％のみ、（ｃ）SDS0.6％のみの緩衝液を
用い、免疫反応をそれぞれ30分,1時間,2時間,3時間,4時
間,5時間に設定し、45℃において実施例１の（３）と同
様な免疫反応を行なった。それぞれの検量線により、羊
水中の肺表面活性物質濃度を免疫反応時間にて読みと
り、第４図にプロットした。

第４図より、（ｃ）のSDS 0.6％のみで免疫反応がまっ
たく進行せず、（ｂ）のトリトン２％では免疫反応の進
行が遅い。これに比較して、（ａ）のトリトン/SDSの混
合溶媒系では、30分で測定値が平衡点に達し、トリトン
/SDSの混合溶媒系を用いての効果が明瞭である。

実施例５ 実施例１で得られたモノクローナル抗体PC6と標識モノ
クローナル抗体PE10を用いて、SDS濃度変化およびトリ
トン濃度変化による喀痰検体中の肺表面活性物質の測定
を行なった。

喀痰を生食にて倍量にし、ホモジェナイズした。次に、
SDS濃度0,1.5,1,1.5,2％のそれぞれに、トリトン0,1,2,
3,4％の濃度の溶液を調製し（計25種類）、この25種類
の希釈液にて、喀痰の生食希釈液を10倍希釈した。

この検体を含むこの混合液とHRP標識モノクローナル抗
体PE10希釈液とを、各々200μｍずつ試験管中のモノク
ローナル抗体PC6固定ボールに加え、免疫反応を行なっ
た（37℃,1時間）。次に、試験管の溶液を吸引除去後、
生理食塩水で洗浄してから、3,3′,5,5′−テトラメチ
ルベンジジン１％含有メタノール溶液/H₂O₂ 0.015％を
含有する1Mリン酸−クエン酸緩衝液（pH4.5）の3/7（V/
V）混合溶液を、各0.4mlずつ各試験管内に加え、室温で
15分間インキュベートした後、反応停止剤として1.5NH₂
SO₄水溶液を2mlずつ加えて、酵素反応を停止させた。そ
して分光光度計を用いてこの溶液の450nmの波長の吸収
強度を測定した。それぞれのトリトン/SDS濃度比（重
量）に対応して得られた吸光度を第５図に示した。

第５図から、トリトン/SDS濃度比が1.0〜4.0（W/W）の
範囲で、喀痰中の抗原（LSP）が抗体により良好に認識
されていることがわかる。

実施例６ ラテックス凝集法を用いたSDSおよびトリトン濃度変化
による喀痰検体中の肺表面活性物質の測定 トリトン/SDS混合溶液25種類をそれぞれ喀痰と等量各50
μｌずつまぜ、最終濃度がSDS0,0.5,1,1.5,2％にそれぞ
れトリトン0,1.2,3,4％になるように調製した。肺表面
活性物質のアポ蛋白を認識するPC6,PE10と混合して固定
したラテックス浮遊液を100μｌ加え、喀痰のトリトン/
SDS希釈液100μｌと混合した。15分間軽い撹拌を行ない
凝集の度合を−，±，＋，にて記録した。その結果を
第１表に示した。

実施例７ 喀痰中の肺表面活性物質の測定 膜性気道疾患々者に気管支−膜胞上皮癌患者をそれぞれ
ｎ＝17とｎ＝３にて、実施例５で決定される条件（トリ
トン3.0％,SDS1％）でLSPとフコースの濃度比を各検体
について求め、その値を各患者群に従って分けた結果を
第６図に示した。

第６図から、気管支−肺胞上皮癌患者の喀痰は、慢性気
道疾患々者の粘性痰および膿性痰に比し、LSP/フコース
比が高く、本法がこれらの鑑別に有用であることがわか
る。

なお、MSは慢性気道疾患々者の粘性痰をPSは同膿性痰を
意味し、BACは気管支−肺胞上皮癌患者の痰を意味す
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭61−275654（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−64956（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−277699（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−277700（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−187862（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−97057（ＪＰ，Ａ)

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】抗原−抗体反応からなる免疫学的方法によ
   り検体中のヒトの肺表面活性物質を測定する方法におい
   て、免疫反応に用いる緩衝液に、陰イオン性界面活性剤
   と非イオン性界面活性剤を1:1〜1:4の濃度比（重量比）
   で共存させて免疫反応を行なわせることを特徴とする、
   ヒトの肺表面活性物質の測定方法。
2. 【請求項２】抗体としてヒトの肺表面活性物質のアポ蛋
   白を認識する第一のモノクローナル抗体と、該アポ蛋白
   を認識するが、第一のモノクローナル抗体とは異なる抗
   原部位と結合する、標識化された第二のモノクローナル
   抗体とを用いて該アポ蛋白を測定することを特徴とする
   請求の範囲第１項記載のヒトの肺表面活性物質の測定方
   法。
3. 【請求項３】免疫反応としてヒトの肺表面活性物質のア
   ポ蛋白を認識する抗体を結合したラテックス粒子を用い
   て、該アポ蛋白を測定することを特徴とする請求の範囲
   第１項記載のヒトの肺表面活性物質の測定方法。
4. 【請求項４】陰イオン性界面活性剤がアルキルスルホン
   酸塩類である請求の範囲第１項記載のヒトの肺表面活性
   物質の測定方法。
5. 【請求項５】非イオン性界面活性剤がポリオキシエチレ
   ンアルキルフェノールエーテル類である請求の範囲第１
   項記載のヒトの肺表面活性物質の測定方法。
6. 【請求項６】陰イオン性界面活性剤がアルキルスルホン
   酸塩類であり、非イオン性界面活性剤がポリオキシエチ
   レンアルキルフェノールエーテルである請求の範囲第１
   項記載のヒト肺表面活性物質の測定方法。