JPH0720493B2

JPH0720493B2 - 血漿成分の変性及び再構成装置

Info

Publication number: JPH0720493B2
Application number: JP1112299A
Authority: JP
Inventors: ビー．オーカーマトーマス; チャンチン―ハイ; アール．クラークブライアン; ラーチエル．バーナード
Original assignee: アプライドイミューンサイエンシズ，インコーポレイティド
Priority date: 1988-05-06
Filing date: 1989-05-02
Publication date: 1995-03-08
Anticipated expiration: 2010-03-08
Also published as: JPH02167174A; EP0503682A1; CA1325172C; EP0345943A1; EP0345943B1; DE68914513T2; DE68914513D1

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、可溶性血漿成分の分離及び可溶解血漿成分の
再構成を行う血漿処理装置に関する。

〔従来の技術及びその課題〕

血液及びリンパ液は、身体に関する流体のハイウエイで
ある。これらの流体により、身体の一部位から別の部位
に、栄養分、代謝物、成長因子、ホルモン等が輸送さ
れ、身体のある一部分では細胞及び組織により種々の化
合物が産生して身体の別の部分の細胞及び組織が調節さ
れる。更に、これらの流体により、老廃物が除去され、
細胞及び器官が機能するのを妨害する化合物の蓄積を防
止することができる。又、これらの流体は、身体全体に
造血系の細胞を輸送して、それらの細胞が多様な機能を
発揮するようにするとともに、抗原、病原等の場合と同
様に、種々の物質を造血系の細胞に運んで処理又は細胞
応答を誘発することもできる。

多くの状態で、血液中の物質と造血細胞との間の相互作
用により、個人の病気の状態についての有益な情報を提
供することのできる生成物が生成したり、宿主又は他の
固体に関して重要な組成物を提供したり、又は宿主に対
して悪影響を及ぼしたりする。従って、これらの流体に
アクセスしたり、血液流の種々の成分を単離、同定又は
変更したりすることはかなり重要な意味を持っている。

しかしながら、血液は、多種多様の方法で外来環境に応
答する非常に複雑な混合物である。例えば、通常、血餅
により流れが停止する。血漿を使用すると、外来物質と
の接触により、種々の血液成分が活性化され、血液組成
がかなり変化する。このことは、血液又は血漿を再使用
しなければ多くの場合問題とはならないが、血液を宿主
に戻す場合、このような変化により宿主に悪影響が及ぼ
され、その結果、血液を再使用することが不可能とな
る。肺炎、HIV、HTLV−Ｉ等のため供給血液の安全性が
不明であったり、又は適切な血液型の入手容易性の観点
から、多くの場合、血球返還採血の場合のように、人間
の血液を戻すことが望ましい。従って、血液の成分の性
質及び／又は量を変更し且つ血液を取り出した宿主に返
還する血液を節約することにより血液又は血漿を選択的
に処理することを可能にする方法及び装置の開発が重要
となる。このためには、血液に大きな悪影響を及ぼすこ
となくこのような選択的処理を可能とする物質、成分及
び条件の同定確認が必要である。

血液成分を除去するシステムについては、米国特許第4,
086,924号、第4,103,685号、第4,223,672号、第4,362,1
55号、第4,428,744号、第4,464,165号、第4,540,401
号、第4,614,513号及び第4,627,915号、米国再発行特許
第31,688号並びにヨーロッパ特許公開第0082345号に記
載がある。又、補体活性化に関連した記載があるものと
しては、ブレイラット（Breilatt）及びドルソン（Dors
on）、アサイトジェイ（ASALTO J.）、７、57〜63（1
984）及びマクレオド（McLeod）等、アーティフオー
ガンズ（Artif. Organs）、７、443〜449（1983）が挙
げられる。

〔課題を解決するための手段〕

本発明によれば、血液成分を除去又は再構成することに
より血液又は血漿を変性する装置が提供される。この装
置では、血液の一種以上の成分と互いに作用しあう一種
以上の特異的な結合成分が結合した生体適合性高表面積
充填物により、拡張流体経路が設けられている。この装
置により、流体流がスムーズに連続して流れるととも
に、流体流が基材に結合した結合成分と実質的に均一に
接触することができる。又、本装置により、基材に結合
した結合成分に結合する血液の成分を回収することがで
きる。特に、分子生物学手法により生成した多数の成分
が、血液処理に有効であることが判明した。

本発明によれば、血液又は血液流体誘導体と生物適合性
がある固体表面に受容体・リガンド複合体を生成するこ
とを含む血液試料を処理するための方法及び装置が提供
される。この流体流は、特異的な結合対のメンバーが非
拡散的に結合している高表面積基質を含む拡張した、好
ましくは曲がりくねった経路を通して誘導される。流体
流の成分と結合した特異的結合成分との相互作用によ
り、血液流の一種以上の成分の濃度を増加若しくは減少
させたり又は成分の割合を変化することにより、このよ
うな成分が除去又は再構成される。血液流は、使用前に
前処理を施したものでもよい。即ち、血液を赤血球、血
小板、白血球等の除去等の前処理を施したものを用いて
もよく、一方、得られる流体は一種以上の科の細胞を含
有するか、又は実質的に細胞を含有しなくてもよい。
又、酸・クエン酸塩、デキストリン又はヘパリン等の種
々の化合物を添加してもよく、血液流は希釈、濃縮、２
種以上の流れに分割又は同一若しくは異種の宿主から得
た血液若しくは血液成分を添加してもよい。混合する血
液は同系又は同種異系である。

本発明の方法は、種々の目的に使用することができる。
特に、意図する成分と相同の特異的結合対のメンバーを
用いて、血液由来流体中の成分のレベルを減少させるこ
とができる。例えば、プロテインＡ、その結合断片又は
抗体等の類似の結合性を有するタンパク質〔他の細菌性
又は哺乳類Fc受容体〕を用いて、免疫複合体を除去又は
再構成することができる。抗体は、定常領域アイソタイ
プ、例えばIgM,IgG,IgA,IgD若しくはIgEのエピトープ又
はアイソタイプと交差するエピトープに特異的なものを
用いることができる。又、特定の抗原に特異的な血液流
に存在する抗体を、表面に抗原を結合させて除去しても
よい。抗原の代表例としては、DNA、又は他の宿主物
質、特に敗血症性ショックに関連した腫瘍壊死因子（TN
F）等の病気にかかった若しくは異常な状態に関係した
種々の因子又は重症筋無力症におけるアセチルコリン受
容体の抗体が挙げられる。更に、インシュリン、新生物
細胞、ステロイド、例えば、エストロジェン、サイトカ
イン、リンフォカイン及び他の化学療法剤又は治療薬と
して用いられる生物学的薬剤等の血液流の特定成分の濃
度を低下するようにしてもよい。例えば、表面に存在す
る結合成分を変化させることにより、流体流の性質を単
一又は複数の方法で変えることができる。

流体流の性質、特に容易に調整できない性質に及ぼす悪
影響を最少限に抑えながら、流体流を、好ましくはポン
プにより、拡張経路、好ましくは曲がりくねった経路を
通って誘導して、流れを高レベルの結合成分と接触させ
る。次に説明するように、複合体生成条件下ではアナフ
ィラトキシンレベルが通常増加するので、本発明の方法
は、通常、更なる処理と組み合わせて用いる。

膜がプラスチック、例えば、セルロース又はポリスチレ
ン生体適合性物質から構成されている場合には、結合成
分は非拡散的、通常共有結合により膜表面に結合する。
多孔性ビース、中空糸等の構造体をはじめとする他の構
造体を用いることもできるが、膜を用いるのが有利であ
る。材料は、生化学的適合性、官能化の容易性、官能化
レベル、非特異的結合の程度、前処理の有無、加工の容
易性等に基づいて選択する。

材料としては、ニトロセルロース、セルロース、セルロ
ースエステル、例えば、アセテート、ナイロン、ポリプ
ロピレン、ポリエチレン、シリコン、ポリカーボネー
ト、ポリエステル、ホリテレフタレート等又はそれらの
組み合わせが挙げられる。膜は、一般的には約１〜500
μｍ、より一般的には2.5〜25μｍの範囲の孔を有する
ものである。この膜は複数層の形態で用いることがで
き、これらの層は互いに積み重ねてスタックを形成した
ものでよい。スタックは少なくとも２層の膜を有し、10
層以上の膜を有していてもよい。膜スタックは、流体が
膜を通って比較的自由に流れるように分離させるととも
に、高表面積として、血液成分が確実に結合成分と接触
させるようにする。又、膜は連続したスパイラルロール
の形態で用いてもよく、この場合、流れは、スパイラル
を通って切断した面に対して垂直となる。あるいは、溝
付膜を用いてもよく、この場合、溝付層を中央コアーの
まわりに一緒に充填してもよく、また平行構造としても
よい。

孔の表面積は、処理容積によって異なるが、一般的に約
0.2〜3m²、より一般的には0.3〜2.5m²の範囲である。細
胞を実質的に含まない流体の場合には、細胞溶解を考慮
せずに、流量を変化させることができる。流量は、一般
的には約0.001〜0.2／分より、一般的には0.002〜0.1
／分の範囲である。処理容積は、通常少なくとも約50
ml、より一般的には少なくとも250ml、好ましくは約500
mlである。

結合した特異的結合メンバーの膜支持体に対する重量比
は、特異的結合メンバーの性質によって大きく異なる。
ほとんどの場合、タンパク質結合メンバーは、膜1g当た
り約0.5〜50mg、より一般的には約１〜20mgである。
又、処理流体容積に対する結合メンバーの重量の比も特
異的結合メンバーによって大きく異なるが、一般的には
約0.05〜10mg/ml、より一般的には約0.1〜5mg/mlの範囲
である。しかしながら、流体流に存在する成分の量に応
じて、確実に飽和とならないようにし且つ膜に結合した
結合成分が接触する流体成分に対して十分となるよう
に、上記よりも多量又は少量を用いることが必要な場合
があることは言うまでもない。

効果的なＵ字状をしており且つ方向が交互に変化してい
る膜パック又はスタックセパレータを設けて曲がりくね
った経路としてもよい。この場合、流体流は、交互に方
向が変わり、膜パック全体を一方向に流れるとともに、
順次設けた膜パックを反対方向に流れる。流体の流動距
離は処理の目的に応じて大きく異なるが、通常少なくと
も約10〜220cm、より一般的には約20〜40cmである。

結合成分は、使用中及び特異的結合メンバーに結合した
流体成分の回収中の支持体からの溶出が最少となるよう
な方法で支持体に結合する。従って、結合方法として
は、一般的に、膜表面を官能化する共有結合が挙げられ
る。アミン類、カルボン酸類、チロシンの場合における
フェノール等の活性化芳香環、ヒスチジン等の活性複素
環等と反応することのできる官能化表面等、官能化には
種々の手法がある。糖類の場合には、膜又は結合成分と
して、糖類を分解してジアルデヒドとし、これを還元ア
ミノ化条件下でアミンと結合してもよい。その結果得ら
れる脂肪族アミン結合は、強力な非開裂結合であり、膜
を繰り返し使用することが可能となるので、血液成分
を、効率的且つ高収率で膜から単離及び解離することが
できる。ポリスチレン表面を用いる場合には、フリーデ
ル・クラフト条件を用いてハロメチル化、ニトロ化後還
元してアミノ基等とすることにより官能化する。この場
合、フリーデル・クラフト反応は、テトラメチレンスル
ホン又はジメチルスルホキシド中で、特に１容量％の水
の存在下で行う。1987年５月19日出願の米国特許第051,
917号にこれに関連した記載がある。この出願の開示事
項を本発明に利用することができる。芳香族アミノ基を
ジアゾ化して、チロシン又はトリアゾンに対してジアゾ
架橋を形成してもよい。トリアジン類は比較的結合が不
安定であり、通常用いられない。

膜パックの他に、流体と接触する表面積を大きくする他
の構造を用いてもよい。既に述べたように、同軸管状膜
又はコアーの周りにスパイラル状に巻きつけた膜を用い
ることができ、この場合、流れは筒の表面に対して平行
となる。流れは、膜全体について単一方向でもよく、
又、一回以上反対方向に流れを変えて経路を大きく延長
してもよい。

コアーの周りに巻きつけた形態の膜の変わりに、溝付膜
を用いてもよく、この場合、折り重ねた膜により、膜表
面が流体流に接触することになる。表面上の結合成分を
完全に接触させて全ての流体に結合の機会を提供すると
同時に十分空間を使用し且つ閉塞が起きないようにする
どんな手法をも用いることができる。しかしながら、シ
ート状膜を使用すると、血漿が完全で効率的に処理でき
ることが判明した。従って、シート状膜を用いることが
好ましい。

本発明の装置を用いると、特異的結合タンパク質複合体
の生成により、アナフィラトキシンに対する補体活性化
が著しく高まる。アナフィラトキシンは有害であるの
で、血漿を宿主に戻す場合、本発明の装置は、通常、危
険レベルのアナフィラトキシンを安全なレベルまで減少
させる手段とともに用いる。このことは、本発明の装置
から出た流体を珪酸粒子が入っているチャンバーに通す
ことにより達成される。この場合、珪酸により、血液の
他の成分又は血漿特性に著しい悪影響を及ぼすことな
く、危険レベルのアナフィラトキシンが実質的に除去さ
れる。アナフィラトキシン除去装置については、米国特
許出願第191,039号（出願日:1988年５月６日）に説明さ
れている。この出願の開示事項を本発明に利用すること
ができる。

簡単に説明すると、珪酸粒子は、一般的に、約50〜500
μｍの大きさを有し、pHは約３〜７の中性〜酸性であ
る。孔サイズは、一般的には、約50〜350Åであり、表
面積は少なくとも約200m²/gである。本発明の装置を出
た流体流、特に血漿は、一般的には、直接アナフィラト
キシン除去装置に誘導される。

流体に対する珪酸の比は、流体１当たり約10〜100g、
より一般的には15〜50gの範囲である。温度は、一般的
に約20〜40℃、好ましくは約25〜37℃である。周囲温度
で行うのが簡便である。

以下、酢酸セルロース膜をとりあげて本発明を説明す
る。この膜は、不活性ポリエステル支持体上に酢酸セル
ロースの被膜を施したものである。被膜の厚さは、一般
的に少なくとも約100〜200μｍであり、厚さの合計は約
150〜500μｍ、好ましくは約150〜300μｍである。酢酸
セルロース被膜は、適当な揮発性の生理学的に許容され
る溶媒を用いて、適当ないずれかの手段により支持体上
に塗布して設ける。次に、酢酸セルロース被膜を、従来
の手法、例えば、希過ヨウ素酸塩を用いて、所望レベル
まで活性化することができる。これに関しては、米国特
許第4,299,916号及び第4,391,904号に記載がある。

その後、膜を、結合させるべきタンパク質、例えば、プ
ロテインＡ又はアセチルコリン受容体の希薄溶液でフラ
ッシュする。この場合、溶液を、膜パックに通して十分
な時間潅流し、確実に反応を完結させ且つ実質的に全て
のアルデヒド基を反応させてもよい。その後、適当な緩
衝液、好ましくはタンパク質の場合に用いられるよりも
希薄な緩衝液で穏やかにフラッシュ又は潅流して、非共
有的に結合したタンパク質を除去する。次に、膜を、硼
化水素の希薄水溶液と反応させて、生成したシッフ塩基
又はイミン類を還元し、メチレンアミン類を生成するこ
とができる。通常、適当な希薄緩衝液、例えば、硼酸塩
緩衝液に硼化水素を約0.1〜1Mの濃度で溶解して用い
る。反応を完全に行うために、還元を一回以上繰り返
し、毎回還元処理後希薄緩衝液で洗浄する。

最後に、装置を、少なくとも約0.5M以上で且つ約2M以下
の希薄塩水を用いて処理後、30〜50℃の高温で約0.1〜1
Mのグリシンで処理して、残留硼化水素及び共有的に結
合しなかったタンパク質を完全に除去する。PBSでフラ
ッシュ後、膜を一般的に約0.1〜１％の希薄グリセリン
で安定化し、その後、適当な手段、例えば、遠心分離で
乾燥する。

リジンを含有するいずれの組成物も、上記した方法で膜
に結合してもよい。このようにして、上記の方法によ
り、リジン含有化合物をセルロース表面に、浸出が低レ
ベルとなる方法で結合でき、その結果、結合したタンパ
ク質が血漿から抽出され且つその後表面から溶離される
生成物を汚染しない。

セルロース膜の代わりに、ポリスチレン又は他の生体適
合性芳香族含有プラスチックを小粒子の形態で用い、米
国特許出願第051,917号に記載の方法により、少量の水
の存在下でテトラメチレンスルホン中でニトロ化媒体を
用いて表面を官能化してもよい。次に、得られたニトロ
化ポリスチレンを還元してアミノ基として、粒子表面に
複数のアニリン基を有するようにすることができる。

抗体は、例えば、酢酸セルロースについて上記で説明し
たように、過ヨウ素酸塩を用いた公知の手法により酸化
してジアルデヒドを生成することができる。上記したタ
ンパク質のリジンと活性化セルロース表面との間の還元
アミノ化後、活性化抗体を粒子と混合して、還元アミノ
化を生じさせ、粒子に抗体を結合させることができる。
この方法により、高濃度で表面に結合され且つ結合部位
を有するように官能化した抗体を有する粒子を生成する
ことができる。

血漿を、装置を介して循環し、且つ更に適当に処理して
アナフィラトキシンを除去した後、従来の手法を用いて
宿主に戻すことができる。例えば、適当に連続又は不連
続法により血漿を取り出し且つ戻すことができる。

結合した成分を含有する装置は、種々の方法で使用する
ことができる。例えば、約２〜10Mの尿素溶液、約0.1〜
0.8Mの希酢酸、約１〜3Mのグアニジウム塩又は１〜5Mの
MgCl₂等を用いて、抽出した成分を溶離して戻すことが
できる。

具体的にどの溶離剤を選択するかは、意図する物質、物
質を回収するのか捨てるのか、次に使用する方法等によ
り異なる。

本発明の装置によれば、免疫複合体を採取することがで
き、抗原を同定して種々の方法で使用することができ
る。この抗原を使用して、特定の病気の確認及び抗体の
生成に利用したり、抗体の存在を監視するための他の装
置又は抗原・特性免疫エフェクター若しくは調節細胞を
生成するのに用いることができる。又、これらの抗体
は、抗イデオタイプを生成するのに使用して他の試料中
の抗原を同定したり、配列決定のために、プローブを生
成して細胞中の遺伝子又はmRNAを同定するのにも使用す
ることができる。

本発明の理解をさらに深めるために、以下、図面を参照
しながら説明する。第１図は、本発明の装置の概略図で
ある。装置10は、導管14を介して患者の一方の腕12から
の血液を受け入れる。導管14により、第一チャンバー16
に血液が導入され、そこで、一種以上の成分が交換、除
去又は変性される。血液は導管20に出て、導管20により
アナフィラトキシン除去チャンバー22に誘導される。そ
の後、アナフィラトキシンレベルが有害濃度以下である
変性された血液は、導管24を介して患者の他の腕26に誘
導される。この方法では、血液は、患者の必要性に応じ
て変性され、ショックを避けるためにアナフィラトキシ
ンのレベルのを低くしてから患者に戻される。

第２図は、第一及び第二隔室を有する箱形装置の分解図
である。第一隔室には積み重ねた複数の膜が設けられて
おり、第二隔室には珪酸が入っている。膜隔室により、
血液由来の流れが隔室を通って交互の方向に流れるよう
になる。この装置には、入口32及び出口34を備えたハウ
ジング30が設けられている。又、膜隔室には、Ｏリング
36、Ｕリング40及びスクリーン42が入っている。このＵ
リングにより、流れの方向が制御される。スクリーン42
の上面には第二Ｏリング44が設けられており、これによ
り、Ｏリングと膜パック46とを分離している。膜として
は、プロテインＡ、U12又はU38Aを結合せしめたナルジ
ーン（Nalgene）アフィニティークロマトグラフィーユ
ニット（カタログ番号:751−2012及び751−5038）を用
いることができる。膜パックは、複数の膜を積み重ねて
構成してあり、そこに特異的結合対メンバーが結合され
る。好ましくは、各パックは、約５〜25、通常５〜20の
膜から構成されている。血液由来の流れは、特異的結合
対メンバーを含有している膜パック46を通り、孔を通っ
て上昇して各膜と次々と繰り返して接触する。血液由来
の流れが膜パックを通過後に、Ｏリング36、前のＵリン
グ40とは反対の方向に位置しているＵリング40、Ｏリン
グ36、スクリーン42、第二Ｏリング44及び膜パック46の
組立物を、ユニットのサイズ、抽出すべき物質の量、膜
パックの結合容量等に応じて、一回以上繰り返して設け
ることができる。最終成分である特定の成分が何である
かは、本発明においては重要ではない。

種々の成分に対して、種々の生体適合性材料を用いるこ
とができる。例えば、Ｏリング及びＵスペーサは、高密
度のポリプロピレンが適当であり、スクリーン及びハウ
ジングはポリカーボネートが適当である。

膜隔室の構成部材の上には、出口52を有する内部蓋50が
設けられる。出口52の寸法は、ハウジング30の入口32及
び出口34の寸法とほぼ同じである。ポリエチレンフィル
ター（図示していない）、好ましくは孔サイズが35〜60
μｍのポリエチレンフィルターを、出口に対向して設け
珪酸粒子が膜パック隔室に入らないようにする。バリヤ
ー54及び60を用いて、珪酸隔室の所定の部分に珪酸を保
持する。珪酸粒子は、箱62の形態で示してある。珪酸粒
子のサイズは、約50〜300μｍでよい。次に、カバー64
を用いて、ハウジング30を密閉して装置を完成する。

第３図及び第４図に、第三の装置を示す。この装置70は
円筒状であり、膜隔室の役割を果たす円筒74に嵌め込ん
だ円筒状態72が設けられている。内部筒又はスリーブ76
により膜72を取りつけ且つ珪酸隔室80を区画する。次
に、上記した珪酸粒子81を、珪酸隔室80に充填する。第
一スクリーン82及び第二スクリーン84を、それぞれ隔室
80の底部と上部に取りつけて、珪酸粒子が逃散しないよ
うにする。上部キャップ85及び底部キャップ90を用い且
つ内筒76を、それを保持するための突出部86に取りつけ
ることにより装置を組み立てることができる。内筒76内
部には、マウンティング90が設けられている。このマウ
ンティングは、内筒76におけるオリフィス94と一列に並
んでいる導管92を有している。マウンティング90によ
り、第一スクリーン82及び第二スクリーン84が所定の位
置に受入且つ保持され、それにより、珪酸粒子81が膜隔
室74に入るのが防止される。上記キャップ85には、血漿
入口96及び血漿出口100が付いている。

内筒76を突出部86に取りつけた後、膜72を内筒76に嵌め
入れ、続いて、膜72を内部に入れた膜隔室筒74を取りつ
ける。上部珪酸スクリーン82及び84を珪酸上に取りつ
け、且つ血漿入口オリフィス96及び血漿出口100が付い
た上部キャップ85で装置を密閉して装置の組立を完了す
る。

ホットメルト104で所定の位置に保持した網102で膜の上
部を覆い、膜72を構造的に安定化してもよい。

装置を使用する際、血漿は入口96に入り、膜72を通って
下向きに流れる。血漿の流れは、装置を取り囲むように
して循環し、膜が血漿で満たされる。血漿が装置の底部
に到達し、オリフィス94を通って導管92に入る。導管92
から、血漿は、第一スクリーン82及び第二スクリーン84
を通過して、珪酸粒子81の部分にはいり、そこで、アナ
フィラトキシンが除去される。珪酸粒子81を上方向に通
過後、血漿は、上部スクリーン82及び84を通って出口10
0を通過する。

その後、上部キャップ85及び膜隔室74を取り外した後、
スリーブ又は内筒76から膜72を取り出すことにより、容
易に膜が取り外され、再生又は用途に使用することがで
きる。

別の抽出装置等の他の装置を本装置とともに用いてもよ
い。通常、ポンプ又は油圧機械を用いて、患者又は他の
源からの血液を種々の隔室及び導管を通して移動させ
る。又、種々の警報及び制御システムを用いて、流量、
流れの閉塞、気泡、凝固等を検出してもよい。他の部材
としては、別のフィルター、吸収材、化学処理剤、放射
線処理剤等が挙げられる。種々の電子装置を本装置と関
連させて、種々の流体の流れ、結合した物質を除去する
ための溶離剤等を自動化してもよい。

〔実施例〕

以下、実施例により本発明を説明するが、本発明はこれ
らのものに限定されるものではない。

第１図に示した装置は、以下のようにして作製する。ポ
リカーボネートケースに、セルロース膜を10パック入れ
る。各パックには、長方形のシート状膜10枚が入ってい
る。各パックと次のパックとを、ポリプロピレンＯリン
グ及び流れ誘導Ｕリングだけでなく、ポリプロピレン分
離スクリーンでも分離する。10パックの膜を、ポリカー
ボネートケースの入口及び出口と同一直径のアクセスポ
ートを有するポリカーボネート蓋の真下に押しつける。
35〜60μｍの高密度ポリエチレンフィルターでアクセス
ポート上を覆い、珪酸粒子が膜パックが入っている隔室
に侵入しないようにする。同様のフィルターで、珪酸隔
室の出口を覆い、珪酸が血漿と同伴しないようにする。

珪酸は、75〜250μｍの粒子サイズを有するものであ
る。次に、ポリカーボネート蓋をかぶせる。

その後、受容体を、上記した方法により共有結合で膜に
固定する。上記した固定の方法により、珪酸を珪酸隔室
に入れる前に、約400mgの組み換えプロテインＡ（rPA）
を、共有結合で膜に固定する。この方法において、本発
明の装置は、10平方フィートのセルロース膜を有してお
り、そこに、約400μｍのrPAが結合している。

膜は、酢酸セルロースをポリエステル支持体マトリック
ス上に溶液流延することにより製造される。このような
膜（B10−38）は、マサチューセッツ州のベレニア（Bel
lenia）にあるメムテク（Memtek）社により製造されて
いる。この膜には、ポリエステル（ダクロン）不織材料
で強化したセルロース材料が用いられている。強化ウエ
ッブは、膜の生成中に組み込まれ、膜と一体化して膜の
一部分となっているが、膜の特性には大きな影響は及ぼ
さない。膜は、フォーム点で表したとき、主に１〜1.5
μｍの範囲の孔径分布を有している。膜を、乾燥し、プ
ラスチックコアーに巻きつけた後、品質管理の試験を行
う。その後、膜を、化学洗浄で処理し、過ヨウ素酸塩で
酸化して表面を活性化する。次に、膜を十分に洗浄後、
グリセリン溶液及び殺菌水で安定化する。乾燥後、膜を
次の使用のために包装しておいてよい。結合rPAの膜重
量に対する比は、膜1g当たり約5.5mgrPAである。

更に、この膜は、幅が約3.18〜3.25インチ、長さが6.42
〜6.52インチ、厚さが175〜250μｍ、ディスク47mm当た
りの重量が90〜125mg、水流束がHg真空約20〜25インチ
（ml/分/cm²）及びヒトIgG結合容量が約70mg/cm²であ
る。膜は、実質的に非発熱性で無毒性である。

タンパク質は、下記のようにして固定する。乾燥重量を
記録し、装置の二酸化炭素でパージした後、装置を0.2M
硼酸塩緩衝液でフラッシュする。0.5M硼酸塩緩衝液（pH
9.2）にrPAを12.6mg/mlの濃度で溶解して調製した溶液
を、室温で11〜15時間の間装置全体に循環後、0.2M硼酸
塩緩衝液でフラッシュする。この装置を、次に、0.5M硼
酸塩緩衝液に硼化水素ナトリウムを1.0mg/mlの濃度で溶
解して調製した溶液をたっぷりと供給し、0.2M硼酸塩緩
衝液でフラッシュ後、硼化水素化物及びフラッシュ工程
を繰り返す。装置を35℃で1M塩化ナトリウムでフラッシ
ュ後、0.5Mグリセリシン−HClを35℃でフラッシュす
る。その後、グリシン−HCl（0.5M）を37℃で、流出液
が280nmで約0.001未満の化学濃度を示すまで循環する。
次に、この装置を、光学濃度が上記で説明したレベルを
維持するように監視しながら、pHが7.0〜7.2になるまで
リン酸緩衝生理食塩水で連続的にフラッシュした後、0.
5％グリセリンでフラッシュする。この装置を、乾燥を
容易にするために2,000rpmで30分間遠心分離した後、濾
過空気又は窒素を潅流しながら、各ユニットの乾燥重量
が最初の乾燥重量の約10g以内となるまで約40℃に維持
する。

血漿又は他の水性媒体で潅流したときに共有結合したタ
ンパク質が実質的に浸出しないことを確認するために、
下記の実験を行った。ポリエチレン珪酸フィルター、10
平方フィートの膜、400mgのrPA及び90gの珪酸を有す
る、エチレンオキサイドで殺菌した４つの装置を、次の
ようなフラッシュ／潅流プロトコールに附した。２つの
容積500mlの0.9％生理食塩水を、室温で200ml/分の速度
でポンプで装置に供給し、別々に集めた。この際、各々
の試料を採取した。その後、２つの異なる容積500mlの
0.9％生理食塩水を、37℃で200ml/分の速度でポンプで
装置に供給し、別々に集めた。その後、各々の試料を採
取した。

異なる500mlの0.9％生理食塩水を、37℃で50ml/分の速
度で４時間装置に通して連続的に再循環した。この操作
の終わりに、生理食塩水潅流液を別々に集め、アッセイ
用試料を採取した。全ての試料を、rPA特異的エリサ（E
LISA）アッセイ並びに特異性の小さな方法（BCA、バイ
オシンコニニックアシッド（biocinchonic acid）及
び210nm及び280nmでの光学濃度〕測定した。結果を表１
に示す。

装置を閉回路にしなかった以外はフラッシュ／潅流の検
討実験と同様の管及びポンプアッセンブリーを用いた擬
似操作により、BCA活性物質がフラッシュ／潅流プロト
コールに使用されるアッセンブリーの汚染物であること
が判明した。データから明らかなように、潅流中の装置
からの溶出液には、無視できる程度の量（＜0.001％）
のrPAしか検出されなかった。

本発明の装置の結合の特異性を測定するために、下記の
実験を行った。即ち、珪酸を有する装置と珪酸のない装
置の２種類の装置について検討した。この実験では、上
記したようにして、ポリエチレンフィルターを使用し
た。全ての装置をエチレンオキサイドで殺菌した。プロ
トコールは下記の通りであった。

リン酸緩衝生理食塩水１で装置を十分にフラッシュし
た後、正常ヒト血漿1.5を、ポンプで50ml/分の流量で
装置を一回通過させた。この際、潅流前及び潅流後の血
漿試料を採取した。初期段階のデータから、プロテイン
Ａが約１〜1.5の正常血漿で飽和することが判明し
た。２のリン酸緩衝生理食塩水で２回フラッシュ後、
0.5M酢酸を２フラッシュして酢酸洗浄液試料を採取し
た。酢酸洗浄液試料及び潅流前／潅流後血漿の両方を、
プラッドフォード（Bradford）アッセイキット〔バイオ
ーラッド（Bio−Rad 500−001）〕により分析した。潅
流前試料と潅流後試料との間の差から残留血漿に含有さ
れている量を引いたものが総IgG結合量である。又、特
異的に結合したIgGについての結果は、酢酸洗浄液から
得られたものである。これも、回収可能IgGである。

結果を表２に示す。

上記の結果から明らかなように、本発明の装置は、珪酸
隔室を設けても設けなくても、効果的に且つ強固にヒト
血漿からのIgGを結合する。上記のデータから計算する
と、1500mlの処理血漿から平均約3.0gの総IgGが結合す
ることが分かる。

別の検討実験において、免疫複合体が未複合イムノグロ
ブリンに対して優先性であることが、装置の通過前後に
複合体と単量体を測定することにより判明した。結果か
ら明らかなように、結合rPAは、最終的には、最初に結
合した単量体と置換した免疫複合体で飽和状態となっ
た。

装置の有効性をさらに評価するために、酢酸洗浄液を濃
縮し、濃縮溶出液を脱塩後、IEPプレートに入れ、IgG,I
gM及び全血清タンパク質について抗体を用いて展開し
た。その結果、溶出液には、IgGとIgMのみが存在し、他
の血漿タンパク質が存在しないことが判明した。このよ
うにして、rPA受容体に特異的に結合するリガンドのみ
が、本装置により結合し且つ血漿から除去された。

もう一つの重要なものは、血小板である。ほとんどの場
合、血小板は、血液から細胞を除去するのに通常用いら
れる手法、即ち、遠心分離では効率的には除去されな
い。このようなことから、血小板が装置を閉塞するかど
うか及び装置が血小板の生存度及び状態にどのような影
響を及ぼすかを試験により調べた。

IBM 2997型血液細胞分離器による日常血漿交換の４つの
操作の間、装置を、血漿ポンプと濾液採集バッグとの間
にオンライン接続した。三方コックを、装置の直前と直
後に真っ直ぐに接続して、装置に入る前の試験採取と装
置を出た後の試料採取ができるようにした。装置の直前
と直後試料を対で、交換操作の５分、25分及び45分の時
点で採取した。これらの時間は、合計３のうちの約0.
5、約1.0及び約1.5の交換容積と一致する。血小
板・装置の相互作用を確認するために、対の試料につい
て以下の測定を行った：血小板カウント；β−トロンボ
グロブリン（BTG）レベル；及びイントラプラテレット
セロトニンレベル。各操作後、血小板が「集塊」及び凝
集していないが大ざっぱに装置を調べた。

rPAを約500mg結合させ且つ珪酸隔室のない15平方フィー
トの装置を用いたときの結果を表３〜６に示す。

これらの結果から明らかなように、官能性の大きな装置
（IgGが膜に結合された）では、血小板が多少装置内結
合しているが、流路は影響を受けず（血漿が自由に流れ
続ける）、装置内に結合した血小板は活性化されず（β
−タトロンボグロブリンレベルの変化が最少）且つ装置
を通過する血小板は十分に官能性がある（血小板内セロ
トニンレベルの変化なし）。従って、装置の血小板に対
する作用は中立的である。

装置を、血漿からの特異タンパク質、例えば、敗血症性
ショックに関係する腫瘍壊死因子（TNF）の除去に使用
することができることを示すために下記の試験を行っ
た。

この試験には古い正常ヒト血漿を用いた。血漿を２×１
に分解し、各１に17μｇの³⁵S−TNFを添加して合計
で5.1×10⁶cpm/となるようにした。各試料の1mlを5ml
のオプトフラウワー（Optofluor）でカウントして潅流
前の放射能測定を行った。従来の手法により、TNFを³⁵S
−メチオニンで標識した。液体シンチレーションにより
入口及び出口での血漿試料をカウントすることにより、
血漿中のTNFが直接測定できた。この装置には、rPAに関
して上記した方法で結合したモノクローナルα−TNFを
有する４平行フィートの経路が設けられている。又、こ
の装置には、珪酸隔室が設けられていない。装置に結合
したTNFの量は、入口での血漿中のTNFの量から潅流後の
血漿（出口での血漿）に残存しているTNFの量を減じる
ことにより求めた。免疫活性放射標識TNFの分画を、過
剰の抗体を固定した固相ラジオイムノアッセイを用いて
測定した。以下、操作を概略説明する。0.5M炭酸塩緩衝
液（pH9.0）に抗モノクローナル抗体を1000μg/mlの濃
度で添加して調製したストックの10μｌ、25μｌ、50μ
ｌ、100μｌ、125μｌ、150μｌ及び200μｌをレモバウ
エル（Removawell）〔ダイナテクイムロン（Dynatech
Immulon）Ｉ〕を入れ、一晩４℃でインキュベーション
した。これらのウエルを、炭酸塩緩衝液に溶解した５％
BSAの200μｌを用いて、室温で２時間ブロックした。ウ
エルを最低６回PBSで洗浄後、200μｌのPBSに³⁵S−TNF5
〜50μｌを溶解して調製した溶液を各ウエルに添加し、
室温で1.5時間インキュベーションした。インキュベー
ションの終わりに、各ウエル内の溶液をできるだけ完全
にシンチレーションバイアルに移した後、カウントし
た。個々のウエルについてもカウントした。CPM限界率
〔（ウエルについてのCPM/（ウエルについてのCPM＋溶
液におけるCPM）X100％〕を、ウエル当たりの吸着抗TNF
モノクローナル抗体の量に対してプロットした。免疫活
性³⁵S−TNF率を上記プロットから平坦域値として求め
た。これらの結果から、³⁵S−TNFの結合活性が得られ
た。³⁵ S−TNFを含有する血漿を、室温で３時間50ml/分の流
量で、上記した装置に通過させた（結合ヒトIgGを有す
る装置を対照として用いた）。潅流開始後、１時間、２
時間及び３時間の時点で、1mlアリコットを血漿溜から
取り出しカウントした。各装置に、５×500ml生理食塩
水を10分間室温で150ml/分の流速で潅流させた。各洗浄
液の1mlアリコットについてカウントを行った。次に、
５×100ml以下の4M塩化マグネシウムで装置の溶離を行
った。各溶離後、1mlアリコットを取り出し、カウント
した。結果を表７及び表８に示す。

結合活性から、³⁵S−TNFの免疫結合活性が約64.1％であ
った。その後、この免疫反応性レベルを用いて、血漿潅
流及び塩化マグネシウムによる溶離の結果からの計算を
行った。上記の表から明らかなように、1nmTNFを含有す
る血漿１を抗TNF装置に３時間潅流することにより、7
4.3％のTNFが除去された。これに対して、対照装置で
は、2.8％のTNFしか除去されなかった。更に、上記結果
から明らかなように、結合TNFの81.5％が装置から回収
された。

以下、全身性エリトマトーデスの患者の血清からの抗DN
A抗体の除去について検討する。吸着剤としては、米国
特許出願第051,917号（出願日:1987年５月19日）に記載
されている方法で調製されるポリスチレンビーズ（500
μｍ）を用いる。子ウシ胸腺DNA（10mg/ml）を、先端が
細いプローブを用いて１時間音波（脈動排出）処理す
る。剪断されたDNAは、約500〜1500bpの平均サイズを有
している。この剪断されたDNAを、フェノール・クロロ
ホルムで２回抽出後、エタノールで沈澱させる。次に、
剪断されたDNAを10mg/mlで再懸濁後、使用するまで、5m
lアリコットで−20℃の温度で保存する。0.05M冷硫酸
（5ml）に入れたポリスチレンビーズ（精密プラスチッ
クボールビーズ）を容積50mlの冷ポリプロピレン遠心分
離管に入れる。上澄み除去後、1M HClに２％亜硫酸ナト
リウムを溶解して調製した冷溶液45mlを添加する。４℃
で30分間プラットフォームロッカーで混合後、ビーズ
を、容積15mlの冷焼結ガラスフィルターにより真空吸引
で集め、0.5M冷硫酸100mlで洗浄後、冷水200mlで洗浄す
る。その後、抽出したビーズを、容積50mlの冷ポリプロ
ピレン遠心分離管に入れ、0.025M硼酸塩緩衝液（pH9.
2）に³²P−DNAを5mg/mlの濃度で溶解して調製した溶液
を10mgを添加する。この混合物を、一晩４℃の温度で、
プラットフォームロッカーによりインキュベーションす
る。上澄み液を容積10mlのポリプロピレン管に移し、標
識ビーズを水50mlで15回、2M塩化ナトリウムで２回及び
水で15回洗浄する。ビーズの0.125mlアリコットをカウ
ントすると、DNAビーズの充填容積5mlで40,000cpmであ
る。

膜の代わりに上記したビーズを用い、ビーズに、上記し
た方法で、抗DNAを有する患者から採取した血漿試料を
潅流すると、抗DNA抗体がDNAに結合し、自己抗体を実質
的に含有しない血漿流出液が得られる。

本明細書で述べた全ての刊行物及び特許出願は、本発明
に関連する技術分野の水準を示すものである。これらの
全ての刊行物及び特許出願の開示内容は本発明に用いる
ことができる。

以上、本発明の理解を深めるために、図面及び実施例に
よりある程度詳細に説明したが、特許請求の範囲内で変
更及び修正ができることは明白であろう。

〔発明の効果〕

上記したように、本発明の装置は、診断及び治療並びに
変性血漿源の調製等の分野で種々の用途に用いることが
できる。流体流動に用いられる厳しい条件にもかかわら
ず、特異的成分が高効率で除去されるとともに、支持体
に結合した物質の損失がほとんどない。更に、装置を通
過した流れの他の成分だけでなく装置における支持体に
結合した結合成分を含有せず、高い回収率で特異的成分
が回収される。

本発明の装置は、治療に用いることができ、免疫複合
体、腫瘍壊死因子等の宿主に悪影響を及ぼす物質を除去
することができる。更に、本発明の装置は、結合した特
定の物質を溶解して同定することにより、診断にも用い
ることができる。免疫複合体の場合、複合体を単離し
て、抗原をアッセイすることにより、免疫応答を刺激す
る原因をつきとめることができる。このように、本発明
の装置は、複数の実用性及び構造を有しており、血漿を
変性する効果的な方法及び診断並びに治療に使用される
血漿から情報を得る効果的な方法が提供される。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明による装置の概略図であり、第２図は本
発明による箱形装置とその内容物の分解斜視図であり、
第３図は本発明による管状装置の断面立面図であり、第
４図は第３図の装置の部品の斜視図である。 10……本発明の装置、16……第一チャンバー、 20,24……導管、 22……アナフィラトキシン除去チャンバー、 30……ハウジング、36……Ｏリング、 40……Ｕリング、42……スクリーン、 64……膜パック、50……内部蓋、 54,60……バリヤー、62……箱、 64……カバー、70……本発明の装置、 72……円筒状膜、74……円筒、 76……内部筒、80……珪酸隔室、 81……珪酸粒子、82,84……スクリーン、 85,90……キャップ、102……網。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ブライアンアール．クラークアメリカ合衆国，カリフォルニア 94025, メンロパーク，ミルズストリート 1332ビー (72)発明者エル．バーナードラーチアメリカ合衆国，カリフォルニア 94022, ロスアルトス，ラニーミードドライブ 1110 (56)参考文献特開昭63−59967（ＪＰ，Ａ)

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】特異的結合対のメンバーである少なくとも
一種の血漿成分を除去又は再構成することにより血漿を
変性するための装置であって、前記装置が、入口及び出口並びに前記入口及び出口の間に拡張流路を
有する生体適合材料の容器と；前記装置の定格容積で、前記特異的結合対のメンバーが
残りのメンバーと結合するに十分な量で実質的に均一に
且つ不可逆的に結合している高表面積生体適合性セルロ
ース又はポリスチレン多孔性固定支持体であって、前記
流路により前記血漿が前記多孔性支持体を通って誘導さ
れるものを有し、前記多孔性支持体がシート状膜の少なくとも２枚を積み
重ねたスタックを少なくとも２つ包含し、Ｕリングを交互の方向に配置して前記スタックを分離
し、流路を交互に反対方向に誘導することを特徴とする
装置。
【請求項２】前記支持体が固体膜担体上の酢酸セルロー
ス層であり、前記特異的結合対のメンバーが還元的アミ
ノ化により前記酢酸セルロース層に結合したタンパク質
であり、前記孔のサイズが約１〜500μｍである請求項
１に記載の装置。
【請求項３】前記支持体がポリスチレンビーズであり、
前記特異的結合対のメンバーがDNAである請求項１に記
載の装置。
【請求項４】流体受入関係において、前記出口と組み合
わせて珪酸アナフィラトキシン除去隔室を設けた請求項
１に記載の装置。