JPH0720874B2 - 生化学的薬剤及びその製造方法 - Google Patents
生化学的薬剤及びその製造方法Info
- Publication number
- JPH0720874B2 JPH0720874B2 JP60501788A JP50178885A JPH0720874B2 JP H0720874 B2 JPH0720874 B2 JP H0720874B2 JP 60501788 A JP60501788 A JP 60501788A JP 50178885 A JP50178885 A JP 50178885A JP H0720874 B2 JPH0720874 B2 JP H0720874B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- serum
- animal
- blood
- virus
- cells
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/081—DNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/06—Antihyperlipidemics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Virology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Hematology (AREA)
- Obesity (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 発明の背景 1.発明の分野 本発明は山羊のような動物のウイルス免疫による非常に
有用な生体物質の製造方法に関する。より詳細には、本
発明は上記製造方法の他に、前記生体物質の使用による
哺乳動物の治療方法に関し、好ましい態様においては、
山羊または他の試験動物が、受容性ホスト中で通常は免
疫抑制性のパルボウイルスのようなウイルスで処理され
る。
有用な生体物質の製造方法に関する。より詳細には、本
発明は上記製造方法の他に、前記生体物質の使用による
哺乳動物の治療方法に関し、好ましい態様においては、
山羊または他の試験動物が、受容性ホスト中で通常は免
疫抑制性のパルボウイルスのようなウイルスで処理され
る。
従来技術の説明 エドワード・ジエンナー（1749−1823）が最初に、非悪
性微生物株に暴露された人間は、関連する悪性株による
感染から防御されることを見出して以来、ワクチンは実
用されている。ジエンナーによる牛痘潰瘍の浸出液での
患者へのワクチン接種は、この患者を天然痘から一部保
護した。ひき続いて種々のワクチンが製造され、人間お
よび動物の双方に使用された。免疫付与は、種々のバク
テリア、リケツチアまたはウイルスの、生の、弱毒化し
た、または殺した微生物または特異的蛋白質、糖蛋白質
または表面物質の分散液をワクチン接種することにより
行なわれた。これらの中には、炭疽病、狂犬病、腸チフ
ス、コレラ、天然痘、麻疹、ムンプス、百日咳、ペスト
およびポリオに対するワクチンも含まれる。各場合にお
けるワクチンは特定の病原に対する防御をねらいとする
ものであつた。ワクチン接種は長期間の特定の防御を提
供するが、短期における免疫系の調節はひき起すことも
あり、ひき起さないこともある。免疫系はワクチンによ
るチヤレンジまたは増強された活性による感染に応答す
る。この応答はインターフエロン、インターロイキンお
よび他の種々のリンホカインのような抗原特異性の無い
免疫調節モジユレーターの短期における生産をもたらす
であろう。
性微生物株に暴露された人間は、関連する悪性株による
感染から防御されることを見出して以来、ワクチンは実
用されている。ジエンナーによる牛痘潰瘍の浸出液での
患者へのワクチン接種は、この患者を天然痘から一部保
護した。ひき続いて種々のワクチンが製造され、人間お
よび動物の双方に使用された。免疫付与は、種々のバク
テリア、リケツチアまたはウイルスの、生の、弱毒化し
た、または殺した微生物または特異的蛋白質、糖蛋白質
または表面物質の分散液をワクチン接種することにより
行なわれた。これらの中には、炭疽病、狂犬病、腸チフ
ス、コレラ、天然痘、麻疹、ムンプス、百日咳、ペスト
およびポリオに対するワクチンも含まれる。各場合にお
けるワクチンは特定の病原に対する防御をねらいとする
ものであつた。ワクチン接種は長期間の特定の防御を提
供するが、短期における免疫系の調節はひき起すことも
あり、ひき起さないこともある。免疫系はワクチンによ
るチヤレンジまたは増強された活性による感染に応答す
る。この応答はインターフエロン、インターロイキンお
よび他の種々のリンホカインのような抗原特異性の無い
免疫調節モジユレーターの短期における生産をもたらす
であろう。
特定のチヤレンジにのみ応答して活性化する系の妥当性
は簡単である。もし免疫システムが全ての時間高度の活
性で活動するとすれば、システムは成熟前に老化し、シ
ステムが発揮されるべきときに系統的防護を提供し得な
くなるであろう。異常に免疫システムが活発であること
の他の問題は、自己免疫反応の開始により、システムが
自己に対して作動し、正常組織の破壊をひき起すおそれ
である。関節炎は、このような特別な症状の例である。
は簡単である。もし免疫システムが全ての時間高度の活
性で活動するとすれば、システムは成熟前に老化し、シ
ステムが発揮されるべきときに系統的防護を提供し得な
くなるであろう。異常に免疫システムが活発であること
の他の問題は、自己免疫反応の開始により、システムが
自己に対して作動し、正常組織の破壊をひき起すおそれ
である。関節炎は、このような特別な症状の例である。
不適当な調節により免疫システムの活性が増大すること
は、更に適切な応答を生ずる能力の喪失をもたらす。一
例を挙げれば、指のトゲに対して大規模な応答が生じる
ことは全く不適当であり、これは重大な感染に対して応
答が全くないのが不適当であるのと同様である。
は、更に適切な応答を生ずる能力の喪失をもたらす。一
例を挙げれば、指のトゲに対して大規模な応答が生じる
ことは全く不適当であり、これは重大な感染に対して応
答が全くないのが不適当であるのと同様である。
免疫モジュレーションは、癌のような治療の難かしい病
気について特に、自己治癒へ向かつて免疫調節法による
アプローチを提供するであろう。これが可能であるため
に、二つの最低条件が満されねばならない。免疫システ
ムは十分に健全であり調節剤（単数または複数）に反応
できること、そして第２は、適当な刺激下で、免疫シス
テムは、標的抗原（単数または複数）または細胞（単数
または複数）に反応可能なＴ−細胞、Ｂ−細胞およびナ
チュラルキラー細胞の存在を有する必要がある。しかし
ながら、その場合には、非特異的免疫モジュレーター
が、免疫システムのスイツチを押し、治癒の開始に潜在
的に作用することができるであろう。
気について特に、自己治癒へ向かつて免疫調節法による
アプローチを提供するであろう。これが可能であるため
に、二つの最低条件が満されねばならない。免疫システ
ムは十分に健全であり調節剤（単数または複数）に反応
できること、そして第２は、適当な刺激下で、免疫シス
テムは、標的抗原（単数または複数）または細胞（単数
または複数）に反応可能なＴ−細胞、Ｂ−細胞およびナ
チュラルキラー細胞の存在を有する必要がある。しかし
ながら、その場合には、非特異的免疫モジュレーター
が、免疫システムのスイツチを押し、治癒の開始に潜在
的に作用することができるであろう。
多数の免疫モジュレーターが従来単離および報告されて
おり、これらのものは三種の一般グループ即ちインター
フエロン類、インターロイキン類およびコルチコステロ
イドおよびロイコトリエン類のいずれかに属すると思わ
れる。
おり、これらのものは三種の一般グループ即ちインター
フエロン類、インターロイキン類およびコルチコステロ
イドおよびロイコトリエン類のいずれかに属すると思わ
れる。
インターフエロンは通常ウイルス感染に応答して生産さ
れ、白血球および繊維芽細胞により生産される糖蛋白の
仲間である。インターフエロンには、三種の主な型、ア
ルフア、ベータおよびガンマ型が存在する。その分子量
は、15,000ないし40,000ダルトンである。近年、インタ
ーフエロンは組換えDNA技術により製造されている。イ
ンターフエロンは、厳密な種特異性を持つことが見出さ
れており、それを生産した動物種においてのみ有効であ
る。
れ、白血球および繊維芽細胞により生産される糖蛋白の
仲間である。インターフエロンには、三種の主な型、ア
ルフア、ベータおよびガンマ型が存在する。その分子量
は、15,000ないし40,000ダルトンである。近年、インタ
ーフエロンは組換えDNA技術により製造されている。イ
ンターフエロンは、厳密な種特異性を持つことが見出さ
れており、それを生産した動物種においてのみ有効であ
る。
免疫モジュレーターの第二のグループは、インターロイ
キンである。これらは糖蛋白の仲間であり、白血球によ
り生産される。これらのリンホカインは、ナチュラルキ
ラー細胞およびＢ−細胞の活性化を起し、特異的順序の
細胞相互作用の開始および連鎖に作用すると信じられ、
これが現在免疫反応であると認識されている。これらの
成長促進因子および活性化因子は、免疫反応細胞の発生
に関与する。これらのリンホカインは、抗原または細胞
の存在が予期されるとき全ＴおよびＢ細胞を活性化する
点で、抗原非特異的である。見かけ分子量は15,000〜5
0,000ダルトンである。
キンである。これらは糖蛋白の仲間であり、白血球によ
り生産される。これらのリンホカインは、ナチュラルキ
ラー細胞およびＢ−細胞の活性化を起し、特異的順序の
細胞相互作用の開始および連鎖に作用すると信じられ、
これが現在免疫反応であると認識されている。これらの
成長促進因子および活性化因子は、免疫反応細胞の発生
に関与する。これらのリンホカインは、抗原または細胞
の存在が予期されるとき全ＴおよびＢ細胞を活性化する
点で、抗原非特異的である。見かけ分子量は15,000〜5
0,000ダルトンである。
レギュレーターの第三のタイプは、コルチコステロイド
およびロイコトリエン類のものであり、これは炎症にお
けるレギュレーターとして作用する。異常に生産された
とき、ロイコトリエンは即時型過敏症およびアナフイラ
キシーをひき起す。これらは主にアラキドン酸の酸化生
成物である。これに対してコルチコステロイドは免疫シ
ステムの活性を低下させる。コルチコステロイドおよび
ロイコトリエンの双方とも、インターロイキンおよびイ
ンターフエロンよりも低分子量の化合物である。
およびロイコトリエン類のものであり、これは炎症にお
けるレギュレーターとして作用する。異常に生産された
とき、ロイコトリエンは即時型過敏症およびアナフイラ
キシーをひき起す。これらは主にアラキドン酸の酸化生
成物である。これに対してコルチコステロイドは免疫シ
ステムの活性を低下させる。コルチコステロイドおよび
ロイコトリエンの双方とも、インターロイキンおよびイ
ンターフエロンよりも低分子量の化合物である。
商業的に生産されている免疫レギュレーターの全てはマ
イトジエンで刺激されたリンパ球および骨髄細胞の組織
培養液の抽出液または濃縮液である。この例外は遺伝子
工学的に生産されたインターロイキン２であつた。人為
的に生産された他の免疫モジュレーターはインターフエ
ロン類である。これらの生産方法のそれぞれについての
困難さは、生産される個々の物質が生体内で観察される
多大な効果を再現しないことである。多数の免疫レギュ
レーターが局所で感染またはガンに応答して通常生産さ
れるような同じ比率でいつしよに生産を行う現実的な方
法はこれまで発見されていなかつた。従来知られて生産
方法の価格が相当に高いため、免疫レギュレーターの用
途が限られていた。
イトジエンで刺激されたリンパ球および骨髄細胞の組織
培養液の抽出液または濃縮液である。この例外は遺伝子
工学的に生産されたインターロイキン２であつた。人為
的に生産された他の免疫モジュレーターはインターフエ
ロン類である。これらの生産方法のそれぞれについての
困難さは、生産される個々の物質が生体内で観察される
多大な効果を再現しないことである。多数の免疫レギュ
レーターが局所で感染またはガンに応答して通常生産さ
れるような同じ比率でいつしよに生産を行う現実的な方
法はこれまで発見されていなかつた。従来知られて生産
方法の価格が相当に高いため、免疫レギュレーターの用
途が限られていた。
米国における死亡の主な原因の１つは必血管疾患であ
り、１年間に約100万人が死亡している。冠心臓疾患の
発症に対する主な要因の１つは高濃度の血清コレステロ
ールの存在である。血清コレステロール濃度はダイエツ
トによつて変えることができるが、ヒトにおいては大部
分のコレステロールが肝臓で合成され、低密度リポプロ
テインによつて運ばれる。この結果、ダイエツトだけに
よる血清コレステロール濃度の調節は、不可能でないと
しても極めて難しい。
り、１年間に約100万人が死亡している。冠心臓疾患の
発症に対する主な要因の１つは高濃度の血清コレステロ
ールの存在である。血清コレステロール濃度はダイエツ
トによつて変えることができるが、ヒトにおいては大部
分のコレステロールが肝臓で合成され、低密度リポプロ
テインによつて運ばれる。この結果、ダイエツトだけに
よる血清コレステロール濃度の調節は、不可能でないと
しても極めて難しい。
近年、高血清コレステロール濃度を低下させるに有効で
あることが証明された唯一の薬はコレスチラミン（Chol
estyramine）である。コレスチラミンは胆汁酸と結合す
るアニオン交換樹脂であり、これによつて肛門系を経由
して通常戻つてくる胆汁酸およびそれに伴う食じによる
コレステロールの再吸収を減じる。ある種の患者におい
てコレスチラミンの使用が示されているが、血清トリグ
リセリド濃度を更に上昇させることがあるため、その使
用は限られている。
あることが証明された唯一の薬はコレスチラミン（Chol
estyramine）である。コレスチラミンは胆汁酸と結合す
るアニオン交換樹脂であり、これによつて肛門系を経由
して通常戻つてくる胆汁酸およびそれに伴う食じによる
コレステロールの再吸収を減じる。ある種の患者におい
てコレスチラミンの使用が示されているが、血清トリグ
リセリド濃度を更に上昇させることがあるため、その使
用は限られている。
発明の要約 本発明は免疫モジュレーターとして有用な生体物質の生
産のための特異な方法に関しており、更にこの生体物質
が患者の血清コレステロールおよびトリグリセリド濃度
を著しく低下させることが見出された。
産のための特異な方法に関しており、更にこの生体物質
が患者の血清コレステロールおよびトリグリセリド濃度
を著しく低下させることが見出された。
一般的に述べれば、本発明の方法は、パルボウイルスの
ようなウイルスを動物に注射し、次いで十分な量および
／または活性の動物血清生体物質を発生させるための期
間、ウイルスの存在に対して注射された動物を応答させ
る工程から成る。この十分な量および／または活性と
は、試験管内で２〜４×105白血球を含むヒト白血球培
養物に添加し次いで37℃、５％CO2/95％空気雰囲気下で
３日間インキュベーとした際に、50μの動物血清が、
生体物質添加細胞培養物中のＴ−ヘルパーおよびナチュ
ラルキラー細胞の増加が、注射した動物と同種の正常動
物からの血清50μの同様に培養した体外細胞培養物を
添加したものに比較して、少くとも約50％であるような
程度である。この方法の最終工程は所望の生体物質を含
む注射された動物から血清を回収することである。
ようなウイルスを動物に注射し、次いで十分な量および
／または活性の動物血清生体物質を発生させるための期
間、ウイルスの存在に対して注射された動物を応答させ
る工程から成る。この十分な量および／または活性と
は、試験管内で２〜４×105白血球を含むヒト白血球培
養物に添加し次いで37℃、５％CO2/95％空気雰囲気下で
３日間インキュベーとした際に、50μの動物血清が、
生体物質添加細胞培養物中のＴ−ヘルパーおよびナチュ
ラルキラー細胞の増加が、注射した動物と同種の正常動
物からの血清50μの同様に培養した体外細胞培養物を
添加したものに比較して、少くとも約50％であるような
程度である。この方法の最終工程は所望の生体物質を含
む注射された動物から血清を回収することである。
本発明の特に好しい態様は、動物が山羊であり、注射さ
れるウイルスが、パルボウイルスに対して受容性がある
正常なホスト動物（例えば、猫または犬）において免疫
抑制性であるタイプのパルボウイルスである。したがつ
て、本発明の好しい方法においては、ウイルスに対して
非受容性ホストにおいて通常免疫抑制型ウイルスが使用
されている。しかしながら、全く驚くべきことに、これ
が上に概説したサリュートリー効果を持つ注射された動
物血清中に免疫刺激性生体物質を発生させるのである。
れるウイルスが、パルボウイルスに対して受容性がある
正常なホスト動物（例えば、猫または犬）において免疫
抑制性であるタイプのパルボウイルスである。したがつ
て、本発明の好しい方法においては、ウイルスに対して
非受容性ホストにおいて通常免疫抑制型ウイルスが使用
されている。しかしながら、全く驚くべきことに、これ
が上に概説したサリュートリー効果を持つ注射された動
物血清中に免疫刺激性生体物質を発生させるのである。
本発明の別の態様においては、注射された動物は山羊、
馬、羊、ウサギおよび猿から選択される。ウイルス注射
後の時間は少くとも約１ケ月である。注射されかつ免疫
された動物血清は、慣用の硫酸アンモニウム分画だけの
精製のような比較的粗な状態で良い。しかしながら、別
の事例では、十分に生体物質を十分に精製するために更
に精製工程に付する。
馬、羊、ウサギおよび猿から選択される。ウイルス注射
後の時間は少くとも約１ケ月である。注射されかつ免疫
された動物血清は、慣用の硫酸アンモニウム分画だけの
精製のような比較的粗な状態で良い。しかしながら、別
の事例では、十分に生体物質を十分に精製するために更
に精製工程に付する。
実際の実施においては、多数の試験山羊をパルボウイル
スにより普通に免疫し、これらの山羊の血清を一定期間
（例えば、約３ケ月）の後に前に概説した標準方法を用
いて生体物質の存在について試験を行う。陽性である動
物（すなわち、それら動物の血清が生体物質の存在を示
すもの）から採血し、生体物質を含む血清を回収する。
スにより普通に免疫し、これらの山羊の血清を一定期間
（例えば、約３ケ月）の後に前に概説した標準方法を用
いて生体物質の存在について試験を行う。陽性である動
物（すなわち、それら動物の血清が生体物質の存在を示
すもの）から採血し、生体物質を含む血清を回収する。
本発明の生体物質は、好しい結果を得るためにヒトおよ
び家畜のような広い種の哺乳動物に使用できる。
び家畜のような広い種の哺乳動物に使用できる。
図面の簡単な説明 第１〜３図は、本発明の好しい方法によるパルボウイル
ス−免疫陽性山羊血清を硫酸アンモニウム分画したもの
の第一、第二および第三段階カラムクロマトグラフイー
の結果として得られたそれぞれのカラムクロマトグラフ
イーの図である。
ス−免疫陽性山羊血清を硫酸アンモニウム分画したもの
の第一、第二および第三段階カラムクロマトグラフイー
の結果として得られたそれぞれのカラムクロマトグラフ
イーの図である。
好しい態様の記述 以下の実施例は本発明の最良の生体物質製造方法を説明
するものであり、多数の実施例は生体物質による動物の
治療を示す。
するものであり、多数の実施例は生体物質による動物の
治療を示す。
実施例 Ｉ 本実施例は本発明の生体物質の生産及び回収に好ましい
方法について述べる。
方法について述べる。
山羊の免疫 全部で５匹の正常山羊の後背部の複数部位に市販のネコ
の汎白血球減少症ワクチン（米国メイン州ウエストウツ
ド、Dellen Laboratories,Inc.）Ic.c.を用いてパルボ
ウイルスを最初に過免疫した。この第１回のワクチン注
射後、約１ケ月と２ケ月後に各山羊に再び全量1c.c.の
犬由来パルボウイルスワクチン（米国テキサス州、テン
プル、Fromm Laboratories,Inc.のGrafton,Wisconsin又
はDurcmune Vaccine）を注射した。初回のワクチン注射
後約３ケ月経過後に、各山羊の首の頚動脈から全血試料
を採血し各試料を下記の如く処理した。
の汎白血球減少症ワクチン（米国メイン州ウエストウツ
ド、Dellen Laboratories,Inc.）Ic.c.を用いてパルボ
ウイルスを最初に過免疫した。この第１回のワクチン注
射後、約１ケ月と２ケ月後に各山羊に再び全量1c.c.の
犬由来パルボウイルスワクチン（米国テキサス州、テン
プル、Fromm Laboratories,Inc.のGrafton,Wisconsin又
はDurcmune Vaccine）を注射した。初回のワクチン注射
後約３ケ月経過後に、各山羊の首の頚動脈から全血試料
を採血し各試料を下記の如く処理した。
山羊血しよう調製 各山羊血液試料を別々にスイングバケツトロータ形遠心
分離機を用いて2000rpmで45分間遠心分離し（１回に約5
00ml）、赤血球のペレツトを得た。各試料中の赤血球ペ
レツトから血しようを採取し体積を測つた。各血しよう
試料をPBS（pH,7.5）で50倍希釈したものの吸光度（280
nm）を測定し記録した。
分離機を用いて2000rpmで45分間遠心分離し（１回に約5
00ml）、赤血球のペレツトを得た。各試料中の赤血球ペ
レツトから血しようを採取し体積を測つた。各血しよう
試料をPBS（pH,7.5）で50倍希釈したものの吸光度（280
nm）を測定し記録した。
血清調製 使用試薬： 1.0モル塩化カルシウム 14.7gのCaCl2・2H2Oを100mlの蒸留水に溶解 トロンビン Miles Laboratories,Inc.牛トロンビン（500ユニツト/m
l） 次のものを用いてバイアルを再生： 1.0mlの滅菌食塩水 1.0mlのグリセロール 食塩水 0.9gの塩化ナトリウムを100mlの蒸留水に溶解 方法： 血しよう各100ml当り１モルの塩化カルシウム1.0mlを使
う。
l） 次のものを用いてバイアルを再生： 1.0mlの滅菌食塩水 1.0mlのグリセロール 食塩水 0.9gの塩化ナトリウムを100mlの蒸留水に溶解 方法： 血しよう各100ml当り１モルの塩化カルシウム1.0mlを使
う。
血しよう各100ml当り100μのトロンビンを使う。
1. 各血しよう試料を定量してビーカに入れ必要量の塩
化カルシウムとトロンビンを加える。
化カルシウムとトロンビンを加える。
2. 各血しよう／塩化カルシウム／トロンビン混合物を
ゆつくり攪拌しその後各ビーカを水浴（37℃）中で30分
間加熱する。
ゆつくり攪拌しその後各ビーカを水浴（37℃）中で30分
間加熱する。
3. 血しようが凝固したら水浴からビーカを取り出し各
ビーカー中の血しようを小片に切断する。
ビーカー中の血しようを小片に切断する。
4. 各混合物をそれぞれの遠心管に入れ全部の遠心管を
10,000rpm、30分間回転させた。
10,000rpm、30分間回転させた。
5. 各遠心管の底にたまつた凝固物から血清をていねい
に除去し各血清試料を得る。
に除去し各血清試料を得る。
6. 各試料の血清部分の280nmにおける吸光度を測定し
記録した。
記録した。
生体物質の決定 次いで、どのヤギが目的とする生体物質を十分な量で産
生するかを決定するために、試験した各ヤギに由来する
血清サンプルについての生体外アツセイを行つた。まず
正常なヒト白血球細胞を10％ウシ胎児血清を補充したRP
MI−1640培地（カンサス州、レネクサにあるK.C.バイオ
ロジカル社製の標準組織培養用培地）中で培養した。前
述の如く調製したヤギ試験血清から各50μを、全量2m
l中に各々２〜４×105個の培養ヒト白血球細胞を含む各
々の培養物中に添加した。該ヤギ血清を添加した培養物
を５％CO2/95％空気の雰囲気下に37℃で３日間インキュ
ベートした。各培養物を２種の螢光ラベルしたモノクロ
ーナル抗体で別個に染色した。このモノクローナル抗体
はそれぞれＴ−ヘルパー細胞に特異的なもの（ニユージ
ヤージ州、ラリタンにあるオルト・ダイアグノステイツ
ク社から市販されているOKT−４モノクローナル抗体）
およびナチュラルキラー細胞に特異的なもの（カリフオ
ルニア州、マウンテンヴイユーにあるバクトン・デイツ
キンソン社から市販されているLEU−７モノクローナル
抗体）である。この染色は供給者の指示に従つて行い、
約１時間後に、各培養物中のＴ−ヘルパー細胞とナチュ
ラルキラー細胞数をカウントするために、染色したサン
プルを流動細胞計測器、すなわち50H型サイトフロログ
ラフ（マサチユーセツツ州、ウエストウツドにあるオル
ト・インスツルメンツ社製）を用いて分析した。試験動
物の血清を、培養ヒト白血球細胞および上記の如く調製
した正常なヤジ血清50μからなる染色し且つカウント
した対照サンプルと比較した。対照と比較してＴ−ヘル
パー細胞およびナチュラルキラー細胞の数が少なくとも
約50％増加した培養物は本発明の生体物質に対して陽性
であると考えられた。この特異性試験において、ヤジ血
清サンプル５検体のうち３検体が陽性の結果を与えた。
そのうち１検体は約50％増加を示し、他の２検体は125
％という増加を示した。
生するかを決定するために、試験した各ヤギに由来する
血清サンプルについての生体外アツセイを行つた。まず
正常なヒト白血球細胞を10％ウシ胎児血清を補充したRP
MI−1640培地（カンサス州、レネクサにあるK.C.バイオ
ロジカル社製の標準組織培養用培地）中で培養した。前
述の如く調製したヤギ試験血清から各50μを、全量2m
l中に各々２〜４×105個の培養ヒト白血球細胞を含む各
々の培養物中に添加した。該ヤギ血清を添加した培養物
を５％CO2/95％空気の雰囲気下に37℃で３日間インキュ
ベートした。各培養物を２種の螢光ラベルしたモノクロ
ーナル抗体で別個に染色した。このモノクローナル抗体
はそれぞれＴ−ヘルパー細胞に特異的なもの（ニユージ
ヤージ州、ラリタンにあるオルト・ダイアグノステイツ
ク社から市販されているOKT−４モノクローナル抗体）
およびナチュラルキラー細胞に特異的なもの（カリフオ
ルニア州、マウンテンヴイユーにあるバクトン・デイツ
キンソン社から市販されているLEU−７モノクローナル
抗体）である。この染色は供給者の指示に従つて行い、
約１時間後に、各培養物中のＴ−ヘルパー細胞とナチュ
ラルキラー細胞数をカウントするために、染色したサン
プルを流動細胞計測器、すなわち50H型サイトフロログ
ラフ（マサチユーセツツ州、ウエストウツドにあるオル
ト・インスツルメンツ社製）を用いて分析した。試験動
物の血清を、培養ヒト白血球細胞および上記の如く調製
した正常なヤジ血清50μからなる染色し且つカウント
した対照サンプルと比較した。対照と比較してＴ−ヘル
パー細胞およびナチュラルキラー細胞の数が少なくとも
約50％増加した培養物は本発明の生体物質に対して陽性
であると考えられた。この特異性試験において、ヤジ血
清サンプル５検体のうち３検体が陽性の結果を与えた。
そのうち１検体は約50％増加を示し、他の２検体は125
％という増加を示した。
精製および単離プロトコルを通じて、各々の場合におけ
る分離した分画のうちのいずれが目的とする生体物質を
含んでいるかを同定するために、上述した生体外の決定
アツセイを用いた。
る分離した分画のうちのいずれが目的とする生体物質を
含んでいるかを同定するために、上述した生体外の決定
アツセイを用いた。
上記３つの陽性血清サンプルは更に以下に記載の処理を
行つた（１つの血清サンプルについての方法のみを記載
するが、全サンプルの処理方法は同じである）。この例
では各々の陽性血清サンプルは別々に処理されている
が、所望する場合にはこれらサンプルを集めることもで
きる。
行つた（１つの血清サンプルについての方法のみを記載
するが、全サンプルの処理方法は同じである）。この例
では各々の陽性血清サンプルは別々に処理されている
が、所望する場合にはこれらサンプルを集めることもで
きる。
硫酸アンモニウム分画 使用した試薬 硫酸アンモニウム（ミズーリ州、セントルイスにあるシ
グマ、ケミカル社製シグマＳ−5182）0.01Mリン酸ナト
リウム（pH 7.6） 調製法 1. 分画する血清各100mlにつき24.3gの硫酸アンモニウ
ムを計量した。
グマ、ケミカル社製シグマＳ−5182）0.01Mリン酸ナト
リウム（pH 7.6） 調製法 1. 分画する血清各100mlにつき24.3gの硫酸アンモニウ
ムを計量した。
2. 血清サンプルをビーカーに入れ攪拌した。攪拌しな
がら、少量の硫酸アンモニウムを加え、全て溶解したこ
とを確認した入後更に硫酸アンモニウムを加えて、全量
の硫酸アンモニウムがサンプルに加えられるまでこの工
程を繰り返した。その後サンプルを更に30分間ゆるやか
に攪拌した。
がら、少量の硫酸アンモニウムを加え、全て溶解したこ
とを確認した入後更に硫酸アンモニウムを加えて、全量
の硫酸アンモニウムがサンプルに加えられるまでこの工
程を繰り返した。その後サンプルを更に30分間ゆるやか
に攪拌した。
3. 血清サンプルを続いて遠沈管に入れ、10,000rpmで3
0分間遠心分離し、上清を注意深く沈殿から除去した。
該血清の上清分画は「生体物質の決定」の項で記載した
生体外の細胞培養アツセイ法を用いて目的とする生体物
質の存在を試験し、陰性であると判明した後該上清を捨
てた。
0分間遠心分離し、上清を注意深く沈殿から除去した。
該血清の上清分画は「生体物質の決定」の項で記載した
生体外の細胞培養アツセイ法を用いて目的とする生体物
質の存在を試験し、陰性であると判明した後該上清を捨
てた。
4. 工程３で得た遠心分離した沈殿を次いで0.01Mリン
酸ナトリウム（pH 7.6）中に再溶解し、該再溶解した沈
殿の最終容量が最初の血清容量と同じであるようにし
た。
酸ナトリウム（pH 7.6）中に再溶解し、該再溶解した沈
殿の最終容量が最初の血清容量と同じであるようにし
た。
5. 次いで更に分離するために、この血清サンプルにつ
いて工程２および３を繰り返し、再度上清が目的とする
生体物質を含んでいないことを生体外の決定アツセイで
確認した。
いて工程２および３を繰り返し、再度上清が目的とする
生体物質を含んでいないことを生体外の決定アツセイで
確認した。
6. 次いで沈殿を、0.01Mリン酸ナトリウム（pH 7.6）
を用いて最初の血清容量の1/2となるように再溶解し
た。
を用いて最初の血清容量の1/2となるように再溶解し
た。
7. この再懸濁したサンプルを続いて分子量12,000の切
断した透析チユーブ中に入れた。
断した透析チユーブ中に入れた。
8. 次いでこのサンプルを0.01Mリン酸ナトリウム（pH
7.6）に透析し、外液４を３回取りかえて透析を行つ
た。
7.6）に透析し、外液４を３回取りかえて透析を行つ
た。
9. 次に透析チユーブからサンプルを取り出し、遠心管
に入れた。
に入れた。
10. この遠心管を次いで10,000rpmで30分間遠心分離し
た。
た。
11. 次いで遠心管から上清を除去し、その容量を測定
し記録した。この上清につき上述した生体外の設定アツ
セイを再度行い、目的とする生体物質を含んでいないこ
とを確認した。
し記録した。この上清につき上述した生体外の設定アツ
セイを再度行い、目的とする生体物質を含んでいないこ
とを確認した。
12. この上清の波長280nmにおける吸光度を測定し記録
した。
した。
13. サンプルの分画によつて得られた上清分画を滅菌
ビンに入れて貯蔵した。
ビンに入れて貯蔵した。
第一段階のクロマトグラフイ（クリフトン、N.J.のワツ
トマン社製アニオン交換樹脂DE−52を使用） 1. 適当量のDE−52樹脂をpH 7.6の0.01モル燐酸ナトリ
ウムで膨潤させそして平衡にした。
トマン社製アニオン交換樹脂DE−52を使用） 1. 適当量のDE−52樹脂をpH 7.6の0.01モル燐酸ナトリ
ウムで膨潤させそして平衡にした。
2. カラム（4.4cm×83cm）を膨潤DE−52樹脂で充填し
た。カラムを0.01mNaH2PO4（pH 7.6）２リツトルで75cm
の圧力で洗浄した。
た。カラムを0.01mNaH2PO4（pH 7.6）２リツトルで75cm
の圧力で洗浄した。
3. 試料から硫酸アンモニウムで分離した血清40mlを洗
浄と同じ圧力でDE−52カラムに供給した。次いで0.01m
NaH2PO4（pH 7.6）洗浄液で溶離させた。
浄と同じ圧力でDE−52カラムに供給した。次いで0.01m
NaH2PO4（pH 7.6）洗浄液で溶離させた。
4. 全てのたんぱく質画分が完全に溶離するまでカラ
ムからの液体を別々の試験管（150滴／チユーブ、約5.0
ml）に集めた。約1.0リツトルの0.01モルNaH2PO4がカラ
ムを通つた。
ムからの液体を別々の試験管（150滴／チユーブ、約5.0
ml）に集めた。約1.0リツトルの0.01モルNaH2PO4がカラ
ムを通つた。
5. 次いでカラムを.5m NaCl（pH 7.6）を含む0.01モル
NaH2PO4 1.5リツトルで洗浄して結合物質をカラムから
取り出した。緩衝液がなくなるまでカラムからの液体を
別々の試験管（150滴／試験管）に集めた。
NaH2PO4 1.5リツトルで洗浄して結合物質をカラムから
取り出した。緩衝液がなくなるまでカラムからの液体を
別々の試験管（150滴／試験管）に集めた。
6. 収集した全ての試験管について280nmにおける吸光
度を求めた。吸光度（A280）対試験管番号のプロツトを
作成してピークを求めた。このグラフを第１図に示す。
度を求めた。吸光度（A280）対試験管番号のプロツトを
作成してピークを求めた。このグラフを第１図に示す。
7. プロツト上の各々分離したピークに位置する試験管
内の物質を次いでプールしそして前記インビトロ試験法
を用いて分析した。
内の物質を次いでプールしそして前記インビトロ試験法
を用いて分析した。
8. 第一ピーク（第１図のピークＡ）からのプールした
物質は本発明の生体物質を含んでいることがわかつた。
この物質を透析チユーブの区域に入れそして端部を結ぶ
ことにより濃縮した；このチユーブをポリエチレングリ
コール（ミズリー州セントルイスのシグマケミカル社
製、200,000mw）の槽に入れそして当初のプールした容
積の約10％に濃縮した。このチューブを水でよく洗浄し
た。
物質は本発明の生体物質を含んでいることがわかつた。
この物質を透析チユーブの区域に入れそして端部を結ぶ
ことにより濃縮した；このチユーブをポリエチレングリ
コール（ミズリー州セントルイスのシグマケミカル社
製、200,000mw）の槽に入れそして当初のプールした容
積の約10％に濃縮した。このチューブを水でよく洗浄し
た。
9. チユーブ内のプールした物質を次いでPBS（pH 7.
5）に対して透析した。４リツトルを３回用いてポリエ
チレングリコールと塩を除去した。
5）に対して透析した。４リツトルを３回用いてポリエ
チレングリコールと塩を除去した。
10. 透析した物質を次いでチユーブから取り出しそし
て容積を測定した。280nmにおける吸光度の読みを求め
て容積とともに記録した。
て容積を測定した。280nmにおける吸光度の読みを求め
て容積とともに記録した。
第二段階のクロマトグラフイ（ミズリー州セントルイス
のシグマケミカル社製Ｓ−200排除型クロマトグラフ用
樹脂を使用） 1. 溶離カラム（4.4cm×83cm）をＳ−200樹脂で充填し
そして平衡にした、そして２リツトルのPBS（0.15mのNa
Clを含む0.1m NaH2PO4、pH 75）でもつて60cmの圧力で
カラムを洗浄した。
のシグマケミカル社製Ｓ−200排除型クロマトグラフ用
樹脂を使用） 1. 溶離カラム（4.4cm×83cm）をＳ−200樹脂で充填し
そして平衡にした、そして２リツトルのPBS（0.15mのNa
Clを含む0.1m NaH2PO4、pH 75）でもつて60cmの圧力で
カラムを洗浄した。
2. DE−52カラムの第一濃縮ピーク（第１図のピーク
Ａ）からのプールした透析物質15mlを次にＳ−200カラ
ムに装填し、そしてこの試料を工程１のPBSを用いて溶
離させた。カラム流出液を別々の試験管（100滴／管、
約3.0ml）に集めた。
Ａ）からのプールした透析物質15mlを次にＳ−200カラ
ムに装填し、そしてこの試料を工程１のPBSを用いて溶
離させた。カラム流出液を別々の試験管（100滴／管、
約3.0ml）に集めた。
3. 次いで収集した全ての試験管について280nmにおけ
る吸光度の読みを求めた。A280対試験管番号のプロツト
を次いで作成し；このプロツトを第２図に示す。
る吸光度の読みを求めた。A280対試験管番号のプロツト
を次いで作成し；このプロツトを第２図に示す。
4. 第一段階クロマトグラフイ手法の工程７および８に
示したようにして各ピークに位置する試験管内の物質を
プールしそしてポリエチレングリコールで濃縮した。次
いでインビトロ検定法を用いてプールした試料を各々試
験した。
示したようにして各ピークに位置する試験管内の物質を
プールしそしてポリエチレングリコールで濃縮した。次
いでインビトロ検定法を用いてプールした試料を各々試
験した。
5. 最大ピーク（第２図のピークＢ）からのプールした
物質は生体物質を含んでいることがわかつた。透析チユ
ーブを用いてこの物質を４リツトルのPBS（0.15m NaCl
を含む0.01m K2HPO4,pH 7.5）で３回透析した。
物質は生体物質を含んでいることがわかつた。透析チユ
ーブを用いてこの物質を４リツトルのPBS（0.15m NaCl
を含む0.01m K2HPO4,pH 7.5）で３回透析した。
6. 透析した物質を次いでチユーブから取り出しそして
体積を測定して記録した。この透析物質の吸光度
（A280）を次いで求めて、その読みを記録した。
体積を測定して記録した。この透析物質の吸光度
（A280）を次いで求めて、その読みを記録した。
第３段階ゲルクロマトグラフイー〔CM Blue AFFIゲルカ
チオン交換樹脂を使用、バイオーラド社（BioRad Cor
p.,）カリフオルニヤ州リツチモンド 1. カラム（1.5cm×38cm）にCM Blue AFFIゲルを詰め
平衡させ、0.15モルのNaClを含み、pH 7.25の0.01モル
のK2HPO4の２、45cmの圧で洗浄した。次いでこのカラ
ムをK2HPO4緩衝剤の500mlで洗浄した。
チオン交換樹脂を使用、バイオーラド社（BioRad Cor
p.,）カリフオルニヤ州リツチモンド 1. カラム（1.5cm×38cm）にCM Blue AFFIゲルを詰め
平衡させ、0.15モルのNaClを含み、pH 7.25の0.01モル
のK2HPO4の２、45cmの圧で洗浄した。次いでこのカラ
ムをK2HPO4緩衝剤の500mlで洗浄した。
2. Ｓ−200カラム（第２図、ピークＢ）からの最大の
ピークより濃縮した物質の8mlを、次いで前記カラムに
装入した。
ピークより濃縮した物質の8mlを、次いで前記カラムに
装入した。
3. 次に前記カラムを、全てのピーク該当物が溶出する
まで、0.15モルのNaClを含む0.01モルのK2HPO4（pH 7.2
5）で洗浄した。このカラムから排出した液を別の管（9
0滴／管、約2ml）に集めた。
まで、0.15モルのNaClを含む0.01モルのK2HPO4（pH 7.2
5）で洗浄した。このカラムから排出した液を別の管（9
0滴／管、約2ml）に集めた。
4. 前記カラムを再び0.5モルのNaCl（pH 7.25）を含む
0.1モルのK2HPO4の200mlで洗浄して、さらに境界物質を
溶出した。カラムからの排出液は管（90滴／管）に集め
た。
0.1モルのK2HPO4の200mlで洗浄して、さらに境界物質を
溶出した。カラムからの排出液は管（90滴／管）に集め
た。
5. 280nmにおける吸光値が全ての管に対して得、そし
て両方の溶出液からのA280対管数のプロツトを作成し
た。このプロツトは第３図の如くであつた。夫々のピー
ク内の物質はプールされ、そしてこれらは生態外測定検
定を用いて試験した。
て両方の溶出液からのA280対管数のプロツトを作成し
た。このプロツトは第３図の如くであつた。夫々のピー
ク内の物質はプールされ、そしてこれらは生態外測定検
定を用いて試験した。
6. 第１のピーク（第３図、ピークＣ）からの物質は、
生体物質を含むことが知見された。この物質は第１段階
クロマトグラフ法で前述した如く、ポリエチレングリコ
ールで濃縮された。
生体物質を含むことが知見された。この物質は第１段階
クロマトグラフ法で前述した如く、ポリエチレングリコ
ールで濃縮された。
7. 次に、濃縮物を、夫々４の３種の変更を用いて、
PBSに対し透析した。
PBSに対し透析した。
8. 次いで、物質を透析チユーブから取出した。280nm
における吸光度が測定され記録された。
における吸光度が測定され記録された。
9. 該物質を0.2umフイルターを用いて過し、貯蔵し
た。
た。
前述より明らかな如く、陽性漿液サンプル（生体物質の
適当量を含む試料）に対して測定をなした後、生体物質
が全体的に保持されることを確保するために適当な検定
が別個の分別でなされることに関し、逐次分別および分
離法が比較的純粋な生物学的物質をうるために用いられ
る。その最終の生体物質は現在完全に特性されていない
たんぱく様成分から成る。しかしながら、この生成物は
現在、100,000〜120,000ダルトンの範囲の見かけ上の分
子量をもつインターロイキン（interleukin）たんぱく
質又はたんぱく質類であると信じられている。この成分
は又グリコシド化されているように見える。本発明によ
り作られた純粋な生体物質のサンプルは、ATCCに寄託さ
れた。このサンプルは受託番号40105が付与されてい
る。しかしながら、明らかに予備的に又は部分的な特徴
付で固めることは望ましくなく、現在入手しうる関係の
情報の全てを開示する努力においてのみ提供される。
適当量を含む試料）に対して測定をなした後、生体物質
が全体的に保持されることを確保するために適当な検定
が別個の分別でなされることに関し、逐次分別および分
離法が比較的純粋な生物学的物質をうるために用いられ
る。その最終の生体物質は現在完全に特性されていない
たんぱく様成分から成る。しかしながら、この生成物は
現在、100,000〜120,000ダルトンの範囲の見かけ上の分
子量をもつインターロイキン（interleukin）たんぱく
質又はたんぱく質類であると信じられている。この成分
は又グリコシド化されているように見える。本発明によ
り作られた純粋な生体物質のサンプルは、ATCCに寄託さ
れた。このサンプルは受託番号40105が付与されてい
る。しかしながら、明らかに予備的に又は部分的な特徴
付で固めることは望ましくなく、現在入手しうる関係の
情報の全てを開示する努力においてのみ提供される。
多くの場合において、前述の分離及び単離法は好ましい
が、本発明の方法から誘導された生体物質生成物はこの
ような精製をなすことなく用いられることができ、特に
動物に関して用いられることが理解されねばならない。
後者の場合において、分別した陽性のヤギ漿液は、妨害
するインターロイキンは除去されることがあるが、比較
的粗物質は望ましいたんぱく質様成分（類）を含んでい
るので使用されることができる。
が、本発明の方法から誘導された生体物質生成物はこの
ような精製をなすことなく用いられることができ、特に
動物に関して用いられることが理解されねばならない。
後者の場合において、分別した陽性のヤギ漿液は、妨害
するインターロイキンは除去されることがあるが、比較
的粗物質は望ましいたんぱく質様成分（類）を含んでい
るので使用されることができる。
ATCCは米国（20852）メリランド州ロツクビイレエ、パ
ークローンドライブ12301にある。前記の寄託は1984年
３月26日になされた。
ークローンドライブ12301にある。前記の寄託は1984年
３月26日になされた。
実施例 II 生体物質によるヒトの血清中コレステロールの濃度を低
下させる治療 女性がん患者を実施例Ｉに従つて製造され、精製された
生体物質により５例治療した。注射剤は生理食塩水10c.
c.に溶かして静脈注射した。初めの３例の治療は３日連
続で施した。全量150マイクログラムの生体物質を３つ
の投与量に均等に分けて投与した。２週間後、同患者に
2mgの同生体物質を２つの投与量に均等に分けて連続２
日施した。患者の血清を複数回採取し、コレステロール
含量とトリグリセリド含量の分析を行つた。患者には悪
い副作用は認められなかつた。データーを第１表に示
す。
下させる治療 女性がん患者を実施例Ｉに従つて製造され、精製された
生体物質により５例治療した。注射剤は生理食塩水10c.
c.に溶かして静脈注射した。初めの３例の治療は３日連
続で施した。全量150マイクログラムの生体物質を３つ
の投与量に均等に分けて投与した。２週間後、同患者に
2mgの同生体物質を２つの投与量に均等に分けて連続２
日施した。患者の血清を複数回採取し、コレステロール
含量とトリグリセリド含量の分析を行つた。患者には悪
い副作用は認められなかつた。データーを第１表に示
す。
この試験で血清中のコレステロールの濃度は実質的に低
下することが証明された。ただし、この患者についてト
リグリセリド濃度には低下が認められなかつた。
下することが証明された。ただし、この患者についてト
リグリセリド濃度には低下が認められなかつた。
実施例 III 生体物質による血清中コレステロール濃度を低下させる
ウサギの治療 雌ウサギを前記生体物質により１週間治療した。ただ
し、この例では被検物質は実施例Ｉ記載の硫酸アンモニ
ウムによる分別とクロマトグラフイー工程の第一段階に
よつてのみ精製した。従つて、生体物質は相対的に粗製
で、未精製体であつた。ウサギに連続５日間毎日0.25ml
の粗製生体物質を注射した。生体物質は耳の静脈に静脈
注射で投与した。分析用血液はウサギの耳の静脈から集
め、凝固させた。その血清をテクニコン・インスツルメ
ンツSMAC分析器により分析した。試料は、基準を定める
べく実験を開始したその日に抜き取つた。データーを第
２表に示す。実験中に血液と水を任意に与えた。
ウサギの治療 雌ウサギを前記生体物質により１週間治療した。ただ
し、この例では被検物質は実施例Ｉ記載の硫酸アンモニ
ウムによる分別とクロマトグラフイー工程の第一段階に
よつてのみ精製した。従つて、生体物質は相対的に粗製
で、未精製体であつた。ウサギに連続５日間毎日0.25ml
の粗製生体物質を注射した。生体物質は耳の静脈に静脈
注射で投与した。分析用血液はウサギの耳の静脈から集
め、凝固させた。その血清をテクニコン・インスツルメ
ンツSMAC分析器により分析した。試料は、基準を定める
べく実験を開始したその日に抜き取つた。データーを第
２表に示す。実験中に血液と水を任意に与えた。
本実施例は、本発明の粗製生体物質を用いると、ウサギ
のコレステロール及びトリグリセリドの両濃度が低下す
ることを証明するものである。
のコレステロール及びトリグリセリドの両濃度が低下す
ることを証明するものである。
実施例 IV イ．ケイニイヌ（E.CANIS）に感染した犬の生体物質を
使用した治療 エーリツクケイニス（Ehrlichia Canis）は、だにによ
つて伝染されたリケツチア様微生物である。それは犬と
馬だけに伝染するものと信じられており、犬の場合には
致命的である。イ．ケイニイス（E.CANIS）によつて寄
生された生理組織は、末梢白血球であり、上記微生物
は、白血球をつくる幹細胞の不活性や破壊を引き起す。
犬が11月10日にエーリツクケイニス（Ehrlichia Cani
s）を持つていると診断されると、それには０−400白血
球カウント（WBC）、10−20へマトクリツト（hematocri
t）、および末梢白血球中に存在するグラム陽性菌（gra
m pasitive bodics）が現われる。その犬の初期療法
は、週１回の全血輸血を行い、その最後の輸血は12月６
日であつた。生体物質で処理する前に、犬の骨髄を組織
学的に検査すると、骨髄が形成不全で、活性領域がない
ことが証明された。12月12日に、その犬は最初この発明
の生体物質で処理された、この場合、その生体物質は比
較的粗製の硫酸アンモニウムで分別されたタンパク質の
混合物（実施例Ｉに記載されている）であつた。（クロ
マトグラフイ分離がこの物質について行われなかつ
た。）その犬は、1c.c.の生理食塩水中に拡散されたそ
の粗製分別物質の21mgを注射された。４日後に、その犬
のWBCは、800細胞/mm3（cells/mm3）から6300細胞/mm3
に上昇した。その後、その犬は、同じ投用量を使用して
もう２回処理された。最後の治療後15日過ぎて、その犬
は2,800細胞/mm3（cells/mm3）の白血球数および25のヘ
マトクリツト率（hematocrit）を有していた。約４ケ月
後（更に治療することなく）、その犬はイ．ケイニイス
（E.Canis）に感染した何の徴候も示さなかつた。その
データ下に示されている。
使用した治療 エーリツクケイニス（Ehrlichia Canis）は、だにによ
つて伝染されたリケツチア様微生物である。それは犬と
馬だけに伝染するものと信じられており、犬の場合には
致命的である。イ．ケイニイス（E.CANIS）によつて寄
生された生理組織は、末梢白血球であり、上記微生物
は、白血球をつくる幹細胞の不活性や破壊を引き起す。
犬が11月10日にエーリツクケイニス（Ehrlichia Cani
s）を持つていると診断されると、それには０−400白血
球カウント（WBC）、10−20へマトクリツト（hematocri
t）、および末梢白血球中に存在するグラム陽性菌（gra
m pasitive bodics）が現われる。その犬の初期療法
は、週１回の全血輸血を行い、その最後の輸血は12月６
日であつた。生体物質で処理する前に、犬の骨髄を組織
学的に検査すると、骨髄が形成不全で、活性領域がない
ことが証明された。12月12日に、その犬は最初この発明
の生体物質で処理された、この場合、その生体物質は比
較的粗製の硫酸アンモニウムで分別されたタンパク質の
混合物（実施例Ｉに記載されている）であつた。（クロ
マトグラフイ分離がこの物質について行われなかつ
た。）その犬は、1c.c.の生理食塩水中に拡散されたそ
の粗製分別物質の21mgを注射された。４日後に、その犬
のWBCは、800細胞/mm3（cells/mm3）から6300細胞/mm3
に上昇した。その後、その犬は、同じ投用量を使用して
もう２回処理された。最後の治療後15日過ぎて、その犬
は2,800細胞/mm3（cells/mm3）の白血球数および25のヘ
マトクリツト率（hematocrit）を有していた。約４ケ月
後（更に治療することなく）、その犬はイ．ケイニイス
（E.Canis）に感染した何の徴候も示さなかつた。その
データ下に示されている。
この試験は、この発明の生体物質が犬の中にある生存し
ている幹細胞を刺激することによつて免疫モジュレータ
ーとして働らくことが証明された。この結果は試験に伴
つて経験されたWBCにおける多大な増加によつて確認さ
れた。そして、その治療は明らかに効果があつた。
ている幹細胞を刺激することによつて免疫モジュレータ
ーとして働らくことが証明された。この結果は試験に伴
つて経験されたWBCにおける多大な増加によつて確認さ
れた。そして、その治療は明らかに効果があつた。
実施例 Ｖ 羊から分離した生体物質でのブラストフオーメーシヨン
検定 正常な人間のリンパ球は最初、フイコル−ヒストパーク
（Ficoll−Histopaque）の濃度媒体中で通常の遠心分離
技術を使用して分離された。次に、この分離された白血
球は、10％の胎児の子牛血清を含有する生理組織培養媒
体（RPMI−1640）中に分散され、それから生理組織培養
フラスコ（２ミリリツトル／フラスコ）にピヘツトで入
れられた。実施例Ｉに記載されているようにして得られ
た硫酸アンモニウムで分離された羊から得られた粗製の
生体物質が、それから、各テストフラスコに添加され
た。それからその培養物は、３日間熟成され、そして生
理食塩水で洗われた。各培養物中の白血球は、リン酸塩
で緩衝された生理食塩水中に再分散され、そしてそれは
螢光で標識されたねずみ抗ヘルパー（OKT−４）または
ねずみ抗サブレツサー（OKT−８）モノクロン抗体（ニ
ユージヤージー州のラリタンのオルトダイヤステイツク
製）で染色された。またコントロールフラスコが用意さ
れ、そこでは、分離された白血球が同量のRPMI−1600FC
S媒体に拡散され、それにそのテスト培養物に加えられ
た生体物質と同容量の非免疫性の正常な羊の血清が加え
られた。この実験データが表４に示されている。
検定 正常な人間のリンパ球は最初、フイコル−ヒストパーク
（Ficoll−Histopaque）の濃度媒体中で通常の遠心分離
技術を使用して分離された。次に、この分離された白血
球は、10％の胎児の子牛血清を含有する生理組織培養媒
体（RPMI−1640）中に分散され、それから生理組織培養
フラスコ（２ミリリツトル／フラスコ）にピヘツトで入
れられた。実施例Ｉに記載されているようにして得られ
た硫酸アンモニウムで分離された羊から得られた粗製の
生体物質が、それから、各テストフラスコに添加され
た。それからその培養物は、３日間熟成され、そして生
理食塩水で洗われた。各培養物中の白血球は、リン酸塩
で緩衝された生理食塩水中に再分散され、そしてそれは
螢光で標識されたねずみ抗ヘルパー（OKT−４）または
ねずみ抗サブレツサー（OKT−８）モノクロン抗体（ニ
ユージヤージー州のラリタンのオルトダイヤステイツク
製）で染色された。またコントロールフラスコが用意さ
れ、そこでは、分離された白血球が同量のRPMI−1600FC
S媒体に拡散され、それにそのテスト培養物に加えられ
た生体物質と同容量の非免疫性の正常な羊の血清が加え
られた。この実験データが表４に示されている。
このインビトロ検定は、この発明の生体物質が細胞培養
物中で免疫刺激物として作用することを証明している。
ヘルパー／サプレツサーの比の上昇が特に重要である。
物中で免疫刺激物として作用することを証明している。
ヘルパー／サプレツサーの比の上昇が特に重要である。
実施例 VI 癌患者に対する生体物質の効果 末期的な癌患者を、実施例Ｉに記載した精製された生体
物質で治療した。全血液サンプルは患者の第１の処理の
前にその患者から集められ、そしてその患者は処理前に
やぎ誘導生体物質に対する過反応のための皮ふ引つかき
テストを受けた。治療の第１の段階は12月19日に開始し
て３日間毎日精製された刺激剤50マイクログラム（塩水
で総量10c.c.まで稀釈されている）の注射を行なつた。
その塩水／生体物質はゆつくりした静脈内注射によつて
投与された。患者の血液は第３番目の処理後に採集され
た。その第４番目及び第５番目の処理は同一であり、１
月４日および５日に行なわれた。１月６日にその患者の
血液は最終的に採集された。その血液サンプルはEDTAを
含むバキユテーナーを使用して集められた。
物質で治療した。全血液サンプルは患者の第１の処理の
前にその患者から集められ、そしてその患者は処理前に
やぎ誘導生体物質に対する過反応のための皮ふ引つかき
テストを受けた。治療の第１の段階は12月19日に開始し
て３日間毎日精製された刺激剤50マイクログラム（塩水
で総量10c.c.まで稀釈されている）の注射を行なつた。
その塩水／生体物質はゆつくりした静脈内注射によつて
投与された。患者の血液は第３番目の処理後に採集され
た。その第４番目及び第５番目の処理は同一であり、１
月４日および５日に行なわれた。１月６日にその患者の
血液は最終的に採集された。その血液サンプルはEDTAを
含むバキユテーナーを使用して集められた。
血液サンプルのすべてはOKT−４、OKT−８またはLEU−
７モノクロナール抗体（ベツクトン−デイキンソン、マ
ウンテインビユー、CA.）で染色されそしてそれから存
在するＴ−ヘルパー、Ｔ−サツプレツサーおよびナチユ
ラルキラー細胞の数を数えるため50Hサイトフルオログ
ラフでその血液サンプルのすべてを直接分析した。その
データは以下に示され、そしてリンパ球個体数のパーセ
ントとして報告されている。
７モノクロナール抗体（ベツクトン−デイキンソン、マ
ウンテインビユー、CA.）で染色されそしてそれから存
在するＴ−ヘルパー、Ｔ−サツプレツサーおよびナチユ
ラルキラー細胞の数を数えるため50Hサイトフルオログ
ラフでその血液サンプルのすべてを直接分析した。その
データは以下に示され、そしてリンパ球個体数のパーセ
ントとして報告されている。
この療法の終りに、患者は治療期間の間、異常な質的相
違がないことに注目した。治療中に生じた主な変化は患
者のナチユラルキラー細胞集団の増加が2.5倍であつ
た。このナチユラルキラー集団はウイルスによる活性細
胞および腫瘍細胞に対して活性であることが立証され
た。したがつて、この生体物質は患者に対して免疫刺激
薬として働いた。
違がないことに注目した。治療中に生じた主な変化は患
者のナチユラルキラー細胞集団の増加が2.5倍であつ
た。このナチユラルキラー集団はウイルスによる活性細
胞および腫瘍細胞に対して活性であることが立証され
た。したがつて、この生体物質は患者に対して免疫刺激
薬として働いた。
実施例 VII 羊のフートロツト治療における生体物質の効果 フートロツトに感染した109匹の羊の群を実施例Ｉの方
法で製造した粗製硫酸アンモニウム分画による山羊から
得た生体物質で治療した。59匹の羊がフートロツトの臨
床症状を示し、最も進んだ段階では歩行困難となつた。
これらの動物は病気のため足掌の大部分がなくなり、ひ
ざではうことを強いられた。109匹の羊の群の全てに対
し、山羊から得た生体物質を１回筋内に注射し、羊をそ
の後の10日間日々観察した。各羊に1c.c.の粗製生体物
質を投与した。治療により新しいフートロツトの症例は
生じなかつた。10日以内に、以前歩行可能だつた動物は
立ち、歩いた。観察によれば、これらの動物の足掌はも
はや赤く、湿つていることはなく、新しい足掌が生長
し、白つぽく見えた。羊の群れをひき続き30日間観察し
たが、フートロツトの症状の再発はなかつた。この証拠
により、治療されたものと信ずる。
法で製造した粗製硫酸アンモニウム分画による山羊から
得た生体物質で治療した。59匹の羊がフートロツトの臨
床症状を示し、最も進んだ段階では歩行困難となつた。
これらの動物は病気のため足掌の大部分がなくなり、ひ
ざではうことを強いられた。109匹の羊の群の全てに対
し、山羊から得た生体物質を１回筋内に注射し、羊をそ
の後の10日間日々観察した。各羊に1c.c.の粗製生体物
質を投与した。治療により新しいフートロツトの症例は
生じなかつた。10日以内に、以前歩行可能だつた動物は
立ち、歩いた。観察によれば、これらの動物の足掌はも
はや赤く、湿つていることはなく、新しい足掌が生長
し、白つぽく見えた。羊の群れをひき続き30日間観察し
たが、フートロツトの症状の再発はなかつた。この証拠
により、治療されたものと信ずる。
Claims (5)
- 【請求項１】分子量が約100,000以上であるグリコシル
化された蛋白質の生物学的製剤の製造方法において、該
製剤が、免疫転調性でかつ血清コレステロール及び血清
トリグリセリド濃度を低下させる特性をもつものであ
り、 該製造方法が、 ネコ汎白血球減少症またはイヌ由来のパルボウイルス
を、ネコまたはイヌ以外の、ウイルスに対して非受容性
動物（ヒトを除く）に注射し； この注射した動物を、少なくとも１カ月の期間該ウイル
スの存在に対して応答させて動物血液の血清中に該生物
学的製剤を発生させ、それによって50μｌの動物血清
が、それをインビトロで白血球細胞２〜4x105個含むヒ
ト白血球細胞培養物に添加しかつ37℃で５％CO2/95％空
気雰囲気下にて３日間インキュベートした場合、前記の
注射をした動物と同種の正常動物からの50μｌの血清を
添加して同様にインビトロで培養した細胞培養物と比較
して、該生物学的製剤補充細胞培養物中にＴ−ヘルパー
及びナチュラルキラー細胞を少なくとも約50％増加さ
せ、それらの上昇がＴ−ヘルパー及びナチュラルキラー
細胞に対する蛍光標識化モノクローナル抗体で染色する
ことによって検出される、ような活性を示し；次いで 前記製剤を含有する前記注射をした動物から採血し、回
収血液を分画して潜在的干渉物質を目的製剤から分離す
る；ことから成る製造方法。 - 【請求項２】前記動物が山羊、馬、羊、ウサギ及び猿か
ら成る群から選択される特許請求の範囲第１項記載の方
法。 - 【請求項３】前記動物が山羊である特許請求の範囲第２
項記載の方法。 - 【請求項４】前記回収血清から該蛋白製剤を単離する工
程を含む特許請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項５】前記ウイルスを最初の注射の後、間隔をお
いて繰返し注射することを特徴とする特許請求の範囲第
１項記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/598,744 US4572834A (en) | 1984-04-10 | 1984-04-10 | Biologic and method of preparing same |
| PCT/US1985/000597 WO1985004586A1 (en) | 1984-04-10 | 1985-04-09 | Virus immunization of an animal for the in vivo production of a biologic useful as an immunomodulator |
| US598744 | 2000-06-21 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61502680A JPS61502680A (ja) | 1986-11-20 |
| JPH0720874B2 true JPH0720874B2 (ja) | 1995-03-08 |
Family
ID=24396745
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60501788A Expired - Fee Related JPH0720874B2 (ja) | 1984-04-10 | 1985-04-09 | 生化学的薬剤及びその製造方法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4572834A (ja) |
| EP (1) | EP0158317B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0720874B2 (ja) |
| AT (1) | ATE72756T1 (ja) |
| CA (1) | CA1264032A (ja) |
| DE (1) | DE3585416D1 (ja) |
| WO (1) | WO1985004586A1 (ja) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4687665A (en) * | 1984-04-10 | 1987-08-18 | Clinical Reference Laboratory, Inc. | Biologic and method of preparing same |
| US4883662A (en) * | 1984-04-10 | 1989-11-28 | Clinical Biotechnologies, Inc. | Method of increasing natural killer cell population of cancer patients |
| US4772552A (en) * | 1984-04-23 | 1988-09-20 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Monoclonal antibody which recognizes a 200-220 KD antigen on natural killer cells |
| US5643565A (en) * | 1985-09-20 | 1997-07-01 | Chiron Corporation | Human IL-2 as a vaccine adjuvant |
| DE3877102T2 (de) * | 1987-09-22 | 1993-07-15 | Clinical Biotechnologies Inc | Methode fuer die behandlung von viraler gehirnentzuendung. |
| EP0308724B1 (en) * | 1987-09-22 | 1992-05-20 | Clinical Biotechnologies, Inc. | Use of a immunistimulating biologic to manufacture a medicament to treat human immunodeficiency virus |
| US5219578A (en) * | 1991-02-25 | 1993-06-15 | Innovet, Inc. | Composition and method for immunostimulation in mammals |
| US6927068B2 (en) * | 2002-01-30 | 2005-08-09 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy | Rapid and non-invasive method to evaluate immunization status of a patient |
Family Cites Families (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US1171299A (en) * | 1914-07-13 | 1916-02-08 | Robert A Archibald | Leucocytic extract and method of making the same. |
| US2136131A (en) * | 1937-03-09 | 1938-11-08 | Robert G Green | Distemper vaccine and method of preparing the same |
| US2271819A (en) * | 1939-02-06 | 1942-02-03 | Fromm Lab Inc | Distemper vaccine and method of preparing the same |
| US2271818A (en) * | 1939-02-06 | 1942-02-03 | Fromm Lab Inc | Distemper vaccine and method of preparing the same |
| US3002888A (en) * | 1958-06-11 | 1961-10-03 | American Home Prod | Lipid-mobilizing composition |
| US3002887A (en) * | 1958-06-11 | 1961-10-03 | American Home Prod | Method of purifying a dialyzable lipid mobilizer contained in blood |
| US3128230A (en) * | 1961-04-04 | 1964-04-07 | Sunbury Milk Products Co | Milk having antibodies therein and process for producing same |
| NL300960A (ja) * | 1962-11-27 | |||
| US3465077A (en) * | 1964-07-01 | 1969-09-02 | Cornell Res Foundation Inc | Protecting horses against infectious equine rhinopneumonitis with live bovine rhinotracheitis virus inoculation |
| US3577525A (en) * | 1964-07-01 | 1971-05-04 | Cornell Res Foundation Inc | Adenovirus vaccine against canine hepatitis |
| US3376198A (en) * | 1965-07-21 | 1968-04-02 | Collins Products Inc | Method of producing antibodies in milk |
| US3991182A (en) * | 1971-10-19 | 1976-11-09 | The Regents Of The University Of California | Transfer factor |
| GB1443948A (en) * | 1972-10-20 | 1976-07-28 | Piktor Ltd | Production of immunological material |
| US3911108A (en) * | 1973-02-14 | 1975-10-07 | Diamond Shamrock Corp | Process of producing bovine milk products containing specific antibodies |
| US3892627A (en) * | 1973-06-04 | 1975-07-01 | Rohm & Haas | Feline panleukopenia vaccine |
| US4193991A (en) * | 1978-12-20 | 1980-03-18 | Cornell Research Foundation, Inc. | Canine parvovirus vaccine |
| US4193990A (en) * | 1979-02-16 | 1980-03-18 | Cornell Research Foundation, Inc. | Heterotypic canine parvovirus vaccine |
| US4444887A (en) * | 1979-12-10 | 1984-04-24 | Sloan-Kettering Institute | Process for making human antibody producing B-lymphocytes |
| HU182087B (en) * | 1980-01-15 | 1983-12-28 | Mta Kiserleti Orvostudomanyi K | Process for preparing an active substance for the selective inhibition of the multiplication of normal cells and of cells in myeloide leukemia |
| DE3009126A1 (de) * | 1980-03-10 | 1981-10-08 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V., 3400 Göttingen | Verfahren zur gewinnung von funktionell und morphologisch intakten und lebensfaehigen leukozyten aus blut |
| US4303645A (en) * | 1980-04-18 | 1981-12-01 | Cornell Research Foundation, Inc. | Modified living canine parvovirus vaccine |
| US4448879A (en) * | 1981-03-26 | 1984-05-15 | Hooper Trading Company | High yield process for in vitro production of serum-free and mitogen-free interleukin-2 |
-
1984
- 1984-04-10 US US06/598,744 patent/US4572834A/en not_active Expired - Lifetime
-
1985
- 1985-04-09 AT AT85104272T patent/ATE72756T1/de not_active IP Right Cessation
- 1985-04-09 JP JP60501788A patent/JPH0720874B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1985-04-09 DE DE8585104272T patent/DE3585416D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1985-04-09 CA CA000478531A patent/CA1264032A/en not_active Expired
- 1985-04-09 WO PCT/US1985/000597 patent/WO1985004586A1/en not_active Ceased
- 1985-04-09 EP EP85104272A patent/EP0158317B1/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0158317A2 (en) | 1985-10-16 |
| WO1985004586A1 (en) | 1985-10-24 |
| ATE72756T1 (de) | 1992-03-15 |
| EP0158317A3 (en) | 1988-04-20 |
| EP0158317B1 (en) | 1992-02-26 |
| US4572834A (en) | 1986-02-25 |
| JPS61502680A (ja) | 1986-11-20 |
| CA1264032A (en) | 1989-12-27 |
| DE3585416D1 (de) | 1992-04-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2564486B2 (ja) | 肝細胞増殖因子 | |
| Steffen et al. | Immunogenicity and specificity of collagen: V. Demonstration of three different antigenic determinants on calf collagen | |
| Sheldrake et al. | Intestinal uptake of intact maternal lymphocytes by neonatal rats and lambs | |
| JPH0769905A (ja) | 赤血球及びその転換法 | |
| JPH0648956A (ja) | ヒト免疫不全ウィルス感染・増殖抑制剤 | |
| Judd et al. | Antibodies that define NANA‐independent MN‐system antigens | |
| CN109843904A (zh) | 用于降低治疗性蛋白的异质性的连续方法 | |
| JPH0720874B2 (ja) | 生化学的薬剤及びその製造方法 | |
| EP0124896B1 (de) | Verfahren zur Gewinnung von Viren bzw. Virusantigenen und deren Anwendung in Diagnose und Therapie (Impfstoff) | |
| US4883662A (en) | Method of increasing natural killer cell population of cancer patients | |
| WO1984001289A1 (en) | Purified and antigenically selective vaccines for domestic animals | |
| Coombs et al. | Species-characterizing antigens of ‘L’and ‘ERK’cells | |
| US4687665A (en) | Biologic and method of preparing same | |
| CN107304230A (zh) | 一种抗犬细小病毒精制抗体及其制备方法 | |
| IE57724B1 (en) | Biologically active polypeptides | |
| FI78483C (fi) | Rening av modulatorer foer immunsystem. | |
| EP0308717B1 (en) | Method of treating viral encephalitis | |
| EP0308724B1 (en) | Use of a immunistimulating biologic to manufacture a medicament to treat human immunodeficiency virus | |
| Wilson et al. | Separation of ciliary dyskinesia substances found in serum and secreted by cystic fibrosis leukocytes and lymphoid cell lines, using protein A-Sepharose CL-4B | |
| CN1059237C (zh) | 重组人肝细胞生成素的生产方法及其治疗严重肝病的用途 | |
| EP1104770A2 (en) | Compositions and methods for detecting and treating acquired immunodeficiency syndrome | |
| RU2068694C1 (ru) | Способ выделения фрагмента с3d компонента с3 комплемента человека | |
| RU2000119729A (ru) | Композиции, полученные из mycobacterium vaccae и способы их использования | |
| JP2002504885A (ja) | 後天性免疫不全症候群を検出しそして処置するための組成物および方法 | |
| Sellei | THE OCCURRENCE OF THOMSEN‐FRIEDENREICH RECEPTORS IN BOVINE ERYTHROCYTES OF VARIOUS FV GENOTYPES |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |