JPH0720885B2 - 単純ヘルペスウイルス感染症の予防又は治療剤 - Google Patents
単純ヘルペスウイルス感染症の予防又は治療剤Info
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- JPH0720885B2 JPH0720885B2 JP60242912A JP24291285A JPH0720885B2 JP H0720885 B2 JPH0720885 B2 JP H0720885B2 JP 60242912 A JP60242912 A JP 60242912A JP 24291285 A JP24291285 A JP 24291285A JP H0720885 B2 JPH0720885 B2 JP H0720885B2
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- hsv
- human
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/081—DNA viruses
- C07K16/085—Orthoherpesviridae (F), e.g. pseudorabies virus or Epstein-Barr virus
- C07K16/087—Herpes simplex virus
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 （イ）産業上の利用分野 本発明は、単純ヘルペスウイルス（Herpes simplex vir
us,HSV）に対するヒトモノクローナル抗体を有効成分と
する、HSV感染症の予防又は治療剤に関する。
us,HSV）に対するヒトモノクローナル抗体を有効成分と
する、HSV感染症の予防又は治療剤に関する。
（ロ）従来技術 細胞融合の技術を用いて、特異的な抗体を産生するがや
がては死滅する運命にあるリンパ球又はＢ細胞（抗体産
生細胞）と、培養器の中で永久に増殖しつづけるミエロ
ーマ細胞（骨髄腫細胞）を融合させることにより、特異
抗体を永続的に産生分泌するハイブリドーマ（融合細
胞）株を樹立させる方法は公知である。
がては死滅する運命にあるリンパ球又はＢ細胞（抗体産
生細胞）と、培養器の中で永久に増殖しつづけるミエロ
ーマ細胞（骨髄腫細胞）を融合させることにより、特異
抗体を永続的に産生分泌するハイブリドーマ（融合細
胞）株を樹立させる方法は公知である。
かかる方法によって作成されたハイブリドーマが産生す
るモノクローナル抗体は、高い精度と信頼度をもつ純粋
な化学試薬として、検査試薬や標識試薬，アフィニティ
ークロマトグラフィーなどに応用ができる他、各種疾患
の治療薬，予防薬としての応用も期待できるものであ
る。
るモノクローナル抗体は、高い精度と信頼度をもつ純粋
な化学試薬として、検査試薬や標識試薬，アフィニティ
ークロマトグラフィーなどに応用ができる他、各種疾患
の治療薬，予防薬としての応用も期待できるものであ
る。
ところで、モノクローナルなウイルス抗体を得ようとす
る場合には、ウイルス抗体産生細胞とミエローマ細胞と
を融合させ、クローニングによってウイルス抗体産生性
のハイブリドーマを得ればよいことは一般論としては知
られている。そして、具体的には、例えば、特公昭59−
2276号公報には、インフルエンザウイルス又は狂犬病ウ
イルスで免疫されたBALB/Cマウスの脾臓細胞（抗体産生
細胞）と、同種のマウスのミエローマ細胞とを融合させ
ハイブリドーマを得、これをクローニングすることによ
って、モノクローナルな抗ウイルス．マウス抗体を産生
するハイブリドーマを得たことが開示されている。ま
た、特開昭58−175489号公報には、単純ヘルペスウイル
スで免疫したマウスの脾臓細胞とマウスのミエローマ細
胞とを融合させ、抗単純ヘルペスウイルス・マウス抗体
を産生するハイブリドーマを得たことを開示されてい
る。
る場合には、ウイルス抗体産生細胞とミエローマ細胞と
を融合させ、クローニングによってウイルス抗体産生性
のハイブリドーマを得ればよいことは一般論としては知
られている。そして、具体的には、例えば、特公昭59−
2276号公報には、インフルエンザウイルス又は狂犬病ウ
イルスで免疫されたBALB/Cマウスの脾臓細胞（抗体産生
細胞）と、同種のマウスのミエローマ細胞とを融合させ
ハイブリドーマを得、これをクローニングすることによ
って、モノクローナルな抗ウイルス．マウス抗体を産生
するハイブリドーマを得たことが開示されている。ま
た、特開昭58−175489号公報には、単純ヘルペスウイル
スで免疫したマウスの脾臓細胞とマウスのミエローマ細
胞とを融合させ、抗単純ヘルペスウイルス・マウス抗体
を産生するハイブリドーマを得たことを開示されてい
る。
（ハ）発明が解決しようとする問題点 以上のごとく、抗ウイルス抗体を産生するハイブリドー
マに関しては、具体的な成功例は抗ウイルス．マウス抗
体を産生するマウス−マウスハイブリドーマだけであ
る。しかし、ヒトの病気の予防や治療等のためには、同
種タンパクである抗ウイルス・ヒト抗体の方が有用でか
つ安全であり、そのためには、ヒトの抗体産生細胞を用
いてマウス−ヒトハイブリドーマやヒト−ヒトハイブリ
ドーマを樹立する必要がある。しかしながら、動物の場
合と異なり、ヒトの場合には、ヒトをあらかじめ多量の
ウイルスで免疫し有効に刺激された抗体産生細胞を採取
して細胞融合に用いるといった方法をとるわけにはいか
ないので、適切な抗体産生細胞の採取，調製が困難であ
るといった問題等があり、未だ明確な成功例の報告がな
い。
マに関しては、具体的な成功例は抗ウイルス．マウス抗
体を産生するマウス−マウスハイブリドーマだけであ
る。しかし、ヒトの病気の予防や治療等のためには、同
種タンパクである抗ウイルス・ヒト抗体の方が有用でか
つ安全であり、そのためには、ヒトの抗体産生細胞を用
いてマウス−ヒトハイブリドーマやヒト−ヒトハイブリ
ドーマを樹立する必要がある。しかしながら、動物の場
合と異なり、ヒトの場合には、ヒトをあらかじめ多量の
ウイルスで免疫し有効に刺激された抗体産生細胞を採取
して細胞融合に用いるといった方法をとるわけにはいか
ないので、適切な抗体産生細胞の採取，調製が困難であ
るといった問題等があり、未だ明確な成功例の報告がな
い。
（ニ）問題点を解決するための手段 本発明者らは、抗HSV・ヒトモノクローナル抗体を得、
これをHSV感染症の予防や治療に用いることを目的とし
て鋭意研究を行なった結果、in vitroでマイト−ジエン
の存在下にHSV又はHSV由来の蛋白若しくは糖蛋白で感作
したヒトの抗体産生細胞と、マウスのミエローマ細胞と
を融合させるという方法によって、抗HSVヒトモノクロ
ーナル抗体を産生するマウス−ヒトハイブリドーマを得
ることができた。そして、このハイブリドーマ及び／又
はそれに由来する細胞株を培養し、培養物からHSVに対
するヒトモノクローナル抗体を採取し、これがHSVに対
する中和活性と感染抑制能を有することを確認して、本
発明を完成した。
これをHSV感染症の予防や治療に用いることを目的とし
て鋭意研究を行なった結果、in vitroでマイト−ジエン
の存在下にHSV又はHSV由来の蛋白若しくは糖蛋白で感作
したヒトの抗体産生細胞と、マウスのミエローマ細胞と
を融合させるという方法によって、抗HSVヒトモノクロ
ーナル抗体を産生するマウス−ヒトハイブリドーマを得
ることができた。そして、このハイブリドーマ及び／又
はそれに由来する細胞株を培養し、培養物からHSVに対
するヒトモノクローナル抗体を採取し、これがHSVに対
する中和活性と感染抑制能を有することを確認して、本
発明を完成した。
即ち、本発明は、単純ヘルペスウイルス１型又は２型感
染細胞の細胞膜及び細胞質と反応し、非感染細胞とはほ
とんど反応しないという性質を有する、分子量が約16万
でIgG型の、単純ヘルペスウイルスに対するヒトモノク
ローナル抗体を有効成分とする、単純ヘルペスウイルス
感染症の予防又は治療剤である。
染細胞の細胞膜及び細胞質と反応し、非感染細胞とはほ
とんど反応しないという性質を有する、分子量が約16万
でIgG型の、単純ヘルペスウイルスに対するヒトモノク
ローナル抗体を有効成分とする、単純ヘルペスウイルス
感染症の予防又は治療剤である。
ヒトの抗体産生細胞とは、ヒトのリンパ球（又はＢ細
胞）であって、抗体を分泌している又は分泌する能力を
持った細胞をいう。これは脾臓，リンパ節，末梢血，骨
随，扁桃，アデノイド等の細胞の中に含まれている。本
発明の目的のためには、いかなるソースのリンパ球でも
用いることができるが、好ましいのは脾臓又は扁桃又は
アデノイドから採取されたものである。
胞）であって、抗体を分泌している又は分泌する能力を
持った細胞をいう。これは脾臓，リンパ節，末梢血，骨
随，扁桃，アデノイド等の細胞の中に含まれている。本
発明の目的のためには、いかなるソースのリンパ球でも
用いることができるが、好ましいのは脾臓又は扁桃又は
アデノイドから採取されたものである。
マウスのミエローマ細胞としては、８−アザグアニン耐
性株を用いるのが有利であり、公知のものとしては、BA
LB/CマウスのP3×63Ag8株,P3−NS1/1−Ag4−１株,P3×6
3Ag8U1株,SP2/OAg14株,P3×63Ag8.6.5.3株,MPC11−45.
6.TG1.7株,SP−１株等がある。
性株を用いるのが有利であり、公知のものとしては、BA
LB/CマウスのP3×63Ag8株,P3−NS1/1−Ag4−１株,P3×6
3Ag8U1株,SP2/OAg14株,P3×63Ag8.6.5.3株,MPC11−45.
6.TG1.7株,SP−１株等がある。
ヒトの抗体産生細胞とマウスのミエローマ細胞とを融合
させるに先立って、ヒトの抗体産生細胞をin vitroでマ
イト−ジエンの存在下に感作するのが好ましい。
させるに先立って、ヒトの抗体産生細胞をin vitroでマ
イト−ジエンの存在下に感作するのが好ましい。
ヒトの場合、正常人でもHSVに対する抗体を産生し得る
能力のあるリンパ球を有している場合が多いが、その数
が少ないためにそのままでは目的とするハイブリドーマ
を得るために利用することができない。これに対し、in
vitroでヒトの抗体産生細胞を感作する方法によれば、
感作により細胞の分化及び増殖を促進し、目的とする抗
体産生細胞の数を任意に増大させることができる。かく
してHSVで感作された抗体産生細胞を用いて細胞融合を
行なうことによって、効率良く抗HSVモノクローナル抗
体を産生するハイブリドーマを得ることができる。HSV
としては１型（例えば、KOS株,Hayashida株）と２型
（例えば、YS−４株）が知られている。感作のために
は、これらのウイルスだけでなく、かかるウイルス由来
の蛋白若しくは糖蛋白を用いてもよい。
能力のあるリンパ球を有している場合が多いが、その数
が少ないためにそのままでは目的とするハイブリドーマ
を得るために利用することができない。これに対し、in
vitroでヒトの抗体産生細胞を感作する方法によれば、
感作により細胞の分化及び増殖を促進し、目的とする抗
体産生細胞の数を任意に増大させることができる。かく
してHSVで感作された抗体産生細胞を用いて細胞融合を
行なうことによって、効率良く抗HSVモノクローナル抗
体を産生するハイブリドーマを得ることができる。HSV
としては１型（例えば、KOS株,Hayashida株）と２型
（例えば、YS−４株）が知られている。感作のために
は、これらのウイルスだけでなく、かかるウイルス由来
の蛋白若しくは糖蛋白を用いてもよい。
マイト−ジエンは、リンパ球の分化及び増殖を促進させ
るものなら何でもよいが、例えば、ポークウイドマイト
−ジエン（PWM），プロテインA,フイトヘムアグルチニ
ン（PHA）コンカナバリンＡがある。好ましいのはPWMで
あり、通常２〜200μg/ml,好ましくは20〜100μg/mlの
量で用いられる。
るものなら何でもよいが、例えば、ポークウイドマイト
−ジエン（PWM），プロテインA,フイトヘムアグルチニ
ン（PHA）コンカナバリンＡがある。好ましいのはPWMで
あり、通常２〜200μg/ml,好ましくは20〜100μg/mlの
量で用いられる。
感作の方法条件は特に限定されるものではないが、抗原
（HSV,又はHSV由来の蛋白若しくは糖蛋白）の濃度は1mg
/ml〜１μg/ml,リンパ球（抗体産生細胞）の濃度は１×
105〜１×107個/mlが適当であり、培養温度は35〜40℃
で培養時間は４〜10日、好ましくは６〜８日である。培
養液は人，牛，馬等の血清を含むものなら何でも良い
が、特に胎児牛血清（FCS）を含む培養液（例えばRPMI1
640）が好ましい。かくして得られたウイルスで感作し
たヒトの抗体産生細胞とマウスのミエローマ細胞とは、
次いで公知の方法に従って細胞融合せしめられる。例え
ば、抗体産生細胞とミエローマ細胞を10:1〜1:10。好ま
しくは1:1〜1:3の比率で混合し、適当な細胞融合用溶
液、例えば約35％ポリエチレングリコール（分子量1,00
0〜6,000程度）および約7.5％ジメチルスルホキシドを
含むRPMI1640を加えて、室温〜37℃で１〜数分間攪拌
し、その後10％FCS加RPMI1640で徐々に希釈し、洗浄の
後HAT（ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン）
選択培養液にて細胞濃度が１〜５×105個/mlとなるよう
に調整する。これを0.2mlずつ、例えば96穴プレートに
分注し、５％CO2を含む空気中で35〜38℃で２〜３週間
培養する。HAT培養液なかではハイブリドーマのみが生
存し、８−アザグアニン耐性のミエローマ細胞及びミエ
ローマ同士の融合細胞は生存し得ない（未融合の抗体産
生細胞は数日で死滅する）。
（HSV,又はHSV由来の蛋白若しくは糖蛋白）の濃度は1mg
/ml〜１μg/ml,リンパ球（抗体産生細胞）の濃度は１×
105〜１×107個/mlが適当であり、培養温度は35〜40℃
で培養時間は４〜10日、好ましくは６〜８日である。培
養液は人，牛，馬等の血清を含むものなら何でも良い
が、特に胎児牛血清（FCS）を含む培養液（例えばRPMI1
640）が好ましい。かくして得られたウイルスで感作し
たヒトの抗体産生細胞とマウスのミエローマ細胞とは、
次いで公知の方法に従って細胞融合せしめられる。例え
ば、抗体産生細胞とミエローマ細胞を10:1〜1:10。好ま
しくは1:1〜1:3の比率で混合し、適当な細胞融合用溶
液、例えば約35％ポリエチレングリコール（分子量1,00
0〜6,000程度）および約7.5％ジメチルスルホキシドを
含むRPMI1640を加えて、室温〜37℃で１〜数分間攪拌
し、その後10％FCS加RPMI1640で徐々に希釈し、洗浄の
後HAT（ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン）
選択培養液にて細胞濃度が１〜５×105個/mlとなるよう
に調整する。これを0.2mlずつ、例えば96穴プレートに
分注し、５％CO2を含む空気中で35〜38℃で２〜３週間
培養する。HAT培養液なかではハイブリドーマのみが生
存し、８−アザグアニン耐性のミエローマ細胞及びミエ
ローマ同士の融合細胞は生存し得ない（未融合の抗体産
生細胞は数日で死滅する）。
培養後、培養液中の抗体価をチェツクし、目的とする抗
体を産生しているハイブリドーマのみを選択し単離する
（クローニング）。培養液中の抗体価のチェックは、ラ
ジオイムノアッセイ法（RIA），酵素抗体法（ELISA），
螢光抗体法などの、抗原への抗体の結合ものものを検出
する方法と、ウイルスの生物活性を阻害する抗体の活性
をみる方法等で行なうことができる。クローニングによ
って選択された、本発明の抗ウイルス・ヒト抗体を産生
するマウス−ヒトハイブリドーマは、凍結して保存する
ことができる。かかるハイブリドーマのセルライン（細
胞株）及び／又はそれに由来する細胞株を適当な方法で
大量に培養すると、培養上清から本発明の目的とするヒ
トモノクローナル抗体を得ることができる。また、この
ハイブリドーマを動物に移植して腫瘍化し、その腹水や
血清からモノクローナル抗体を得ることもできる。
体を産生しているハイブリドーマのみを選択し単離する
（クローニング）。培養液中の抗体価のチェックは、ラ
ジオイムノアッセイ法（RIA），酵素抗体法（ELISA），
螢光抗体法などの、抗原への抗体の結合ものものを検出
する方法と、ウイルスの生物活性を阻害する抗体の活性
をみる方法等で行なうことができる。クローニングによ
って選択された、本発明の抗ウイルス・ヒト抗体を産生
するマウス−ヒトハイブリドーマは、凍結して保存する
ことができる。かかるハイブリドーマのセルライン（細
胞株）及び／又はそれに由来する細胞株を適当な方法で
大量に培養すると、培養上清から本発明の目的とするヒ
トモノクローナル抗体を得ることができる。また、この
ハイブリドーマを動物に移植して腫瘍化し、その腹水や
血清からモノクローナル抗体を得ることもできる。
本発明は、かくして得られたモノクローナル抗体を有効
成分とする、HSV感染症の予防又は治療剤である。予防
あるいは治療剤の形態は、水溶液あるいはそれを凍結乾
燥した粉体である。この薬剤は、0.1mg/mlないし50mg/m
l,望ましくは１〜10mg/mlのモノクローナル抗体を含
む。塩類としては、0.5〜1.5％（w/v）の塩化ナトリウ
ム，望ましくは0.9％（w/v）である。さらに、0.001〜
0.1M,望ましくは0.02Mのリン酸ナトリウム（pH7.0〜pH
7.8）を加える。タンパク安定剤としては、0.1mg/ml〜1
0mg/mlのヒト血清アルブミンおよび／または0.1％〜５
％マンニトールおよび／または0.01〜1mg/mlポリエチレ
ングリコール（分子量1,000ないし10,000）を加える。
投与方法は、主に、静脈注射あるいは点滴であるが、筋
肉内注射も可能である。投与量は0.01〜10mg/kg体重／
日であり、望ましくは0.1〜1mg/kg体重／日である。
成分とする、HSV感染症の予防又は治療剤である。予防
あるいは治療剤の形態は、水溶液あるいはそれを凍結乾
燥した粉体である。この薬剤は、0.1mg/mlないし50mg/m
l,望ましくは１〜10mg/mlのモノクローナル抗体を含
む。塩類としては、0.5〜1.5％（w/v）の塩化ナトリウ
ム，望ましくは0.9％（w/v）である。さらに、0.001〜
0.1M,望ましくは0.02Mのリン酸ナトリウム（pH7.0〜pH
7.8）を加える。タンパク安定剤としては、0.1mg/ml〜1
0mg/mlのヒト血清アルブミンおよび／または0.1％〜５
％マンニトールおよび／または0.01〜1mg/mlポリエチレ
ングリコール（分子量1,000ないし10,000）を加える。
投与方法は、主に、静脈注射あるいは点滴であるが、筋
肉内注射も可能である。投与量は0.01〜10mg/kg体重／
日であり、望ましくは0.1〜1mg/kg体重／日である。
（ホ）以下、参考例と実施例により本発明を詳述する。
参考例１（HSVに対するモノクローナル抗体を産生する
ハイブリドーマ） （１）HSV抗原の作製 単層に増殖したVero細胞（約２×108個）に、4.4×106P
FU（プラーク形成単位）/mlのHSV（KOS株）を接種し
た。37℃で２時間吸着させたのち、２％ウシ血清を含む
MEM培地で24時間培養した。この細胞をリン酸緩衝生理
食塩水で洗浄したのち、超音波により細胞を破壊した。
これを6000ppmで30分間遠心した上清を得、これを30％
シヨ糖溶液の上に重層し、30000rpmで３時間遠心した。
遠心管の底に沈澱したペレットをウイルス抗原として用
いた。
ハイブリドーマ） （１）HSV抗原の作製 単層に増殖したVero細胞（約２×108個）に、4.4×106P
FU（プラーク形成単位）/mlのHSV（KOS株）を接種し
た。37℃で２時間吸着させたのち、２％ウシ血清を含む
MEM培地で24時間培養した。この細胞をリン酸緩衝生理
食塩水で洗浄したのち、超音波により細胞を破壊した。
これを6000ppmで30分間遠心した上清を得、これを30％
シヨ糖溶液の上に重層し、30000rpmで３時間遠心した。
遠心管の底に沈澱したペレットをウイルス抗原として用
いた。
（２）HSVによるリンパ球感作 ヒトの扁桃リンパ球を培養液Ａ（RPMI1640＋20％胎児牛
血清＋20mM HEPES＋2mMグルタミン＋1mMNaピルビン酸＋
0.02mg/mlセリン＋80μg/mlゲンタマイシン）に浮遊さ
せた。細胞濃度は17×105個/mlであった。この細胞浮遊
液を1.2mlずつ、培養プレート（24穴）の12穴に入れ
た。それらを３穴ずつ４群に分け、第１群は無添加、第
２群はHSV（KOS株，部分精製標品）16ngタンパク/ml、
第３群にはPWM20μg/ml、第４群には同量のHSVとPWMを
添加した。この培養プレートを37℃,5％CO2−空気で６
日間培養した。
血清＋20mM HEPES＋2mMグルタミン＋1mMNaピルビン酸＋
0.02mg/mlセリン＋80μg/mlゲンタマイシン）に浮遊さ
せた。細胞濃度は17×105個/mlであった。この細胞浮遊
液を1.2mlずつ、培養プレート（24穴）の12穴に入れ
た。それらを３穴ずつ４群に分け、第１群は無添加、第
２群はHSV（KOS株，部分精製標品）16ngタンパク/ml、
第３群にはPWM20μg/ml、第４群には同量のHSVとPWMを
添加した。この培養プレートを37℃,5％CO2−空気で６
日間培養した。
（３）マウス・ミエローマ細胞P3×63Ag8U1株（P3U1と
略記する）との細胞融合。
略記する）との細胞融合。
前もってP3U1を培養液Ｂ（RPMI1640＋10％胎児牛血清＋
2mMグルタミン＋80μg/mlゲンタマイシン）中で培養し
ておいた。使用時の細胞濃度は６×105個/mlであった。
上記（２）の感作リンパ球（３穴を一緒にした）４群と
P3U1を、それぞれ別々に無血清RPMI1640で２回洗浄し
た。各群のリンパ球と５×106個のP3U1とを試験管の中
で一緒にした。1500rpmで５分間遠心し、上清を捨て
た。細胞ペレットを、試験管をたたくことによって、よ
く分散させた。これに0.5mlのポリエチレングリコール
液（RPMI1640 5.75ml＋ポリエチレングリコール1000 3.
5ml＋ジメチルスルホキサイド0.75ml）（PEG液と略記す
る）を加えて、細胞をゆるやかに浮遊させた。１分後に
0.5ml＋RPMI1640を加え、さらに１分後に1mlRPMI、さら
に２分後に4mlのHAT培養液（RPMI1640＋20％胎児牛血清
＋80μg/mlゲンタマイシン＋95μＭヒポキサンチン＋0.
4μＭアミノプテリン＋1.6μＭチミジン）、さらに２分
後には4mlのHAT培養液を加えた。最後に、HAT培養液で2
5ml細胞浮遊液とした。これを培養プレート（96穴）１
枚に蒔いて、37℃,5％CO2含有空気中で培養した。一週
間毎に半量の培養液を新しいHT培養液（HATからＡを除
去したもの）で交換していきハイブリドーマを得た。
2mMグルタミン＋80μg/mlゲンタマイシン）中で培養し
ておいた。使用時の細胞濃度は６×105個/mlであった。
上記（２）の感作リンパ球（３穴を一緒にした）４群と
P3U1を、それぞれ別々に無血清RPMI1640で２回洗浄し
た。各群のリンパ球と５×106個のP3U1とを試験管の中
で一緒にした。1500rpmで５分間遠心し、上清を捨て
た。細胞ペレットを、試験管をたたくことによって、よ
く分散させた。これに0.5mlのポリエチレングリコール
液（RPMI1640 5.75ml＋ポリエチレングリコール1000 3.
5ml＋ジメチルスルホキサイド0.75ml）（PEG液と略記す
る）を加えて、細胞をゆるやかに浮遊させた。１分後に
0.5ml＋RPMI1640を加え、さらに１分後に1mlRPMI、さら
に２分後に4mlのHAT培養液（RPMI1640＋20％胎児牛血清
＋80μg/mlゲンタマイシン＋95μＭヒポキサンチン＋0.
4μＭアミノプテリン＋1.6μＭチミジン）、さらに２分
後には4mlのHAT培養液を加えた。最後に、HAT培養液で2
5ml細胞浮遊液とした。これを培養プレート（96穴）１
枚に蒔いて、37℃,5％CO2含有空気中で培養した。一週
間毎に半量の培養液を新しいHT培養液（HATからＡを除
去したもの）で交換していきハイブリドーマを得た。
（４）ヒトIgGと抗HSV抗体の測定 酵素抗体法（ELISA）によって測定した。ヒトIgGを測定
するためにヤギ抗ヒトIgG抗体（10μg/ml）を、あるい
は抗HSV抗体を測定するためにHSV（KOS株）１μｇタン
パク/mlをそれぞれファルコン・ミクロテストIIIの96穴
プレートに固定した。このプレートにハイブリドーマ培
養上清60μｌを加えて、室温で１時間放置した。0.05％
Tween−20を含有するリン酸緩衝生理食塩水（Tween−PB
S）で３回洗浄ののち、ギヤ抗ヒトIgG抗体−アルカリフ
ォスファターゼ（2000倍希釈液）を60μｌ加えて、室温
で１時間反応させた。さらにTween−PBSで３回洗浄した
のち、Ｐ−ニトロフェニルフォスクエートを1Mジエタノ
ールアミン＋1mM MgCl2のpH9.8溶液に0.6mg/mlの割合で
溶かした溶液100μｌを加えた。30分から60分後に405m
μの吸光度を測定し、標準IgG液あるいは標準HSV陽性血
清との比較から、その値を算出した。
するためにヤギ抗ヒトIgG抗体（10μg/ml）を、あるい
は抗HSV抗体を測定するためにHSV（KOS株）１μｇタン
パク/mlをそれぞれファルコン・ミクロテストIIIの96穴
プレートに固定した。このプレートにハイブリドーマ培
養上清60μｌを加えて、室温で１時間放置した。0.05％
Tween−20を含有するリン酸緩衝生理食塩水（Tween−PB
S）で３回洗浄ののち、ギヤ抗ヒトIgG抗体−アルカリフ
ォスファターゼ（2000倍希釈液）を60μｌ加えて、室温
で１時間反応させた。さらにTween−PBSで３回洗浄した
のち、Ｐ−ニトロフェニルフォスクエートを1Mジエタノ
ールアミン＋1mM MgCl2のpH9.8溶液に0.6mg/mlの割合で
溶かした溶液100μｌを加えた。30分から60分後に405m
μの吸光度を測定し、標準IgG液あるいは標準HSV陽性血
清との比較から、その値を算出した。
全群とも96穴プレート１枚に細胞を蒔き、96穴中の、ハ
イブリドーマが生育してきた穴の数、さらにそのうちヒ
トIgGを産生しているハイブリドーマをもつ穴の数、そ
して抗HSV抗体を産生している穴の数を第１表に示し
た。第１表には、３つの扁桃より、リンパ球を分離した
例を示したが、どの場合にもHSVとPWMを加えたときに最
も多くの抗HSV抗体産生ハイブリドーマが生育した。
イブリドーマが生育してきた穴の数、さらにそのうちヒ
トIgGを産生しているハイブリドーマをもつ穴の数、そ
して抗HSV抗体を産生している穴の数を第１表に示し
た。第１表には、３つの扁桃より、リンパ球を分離した
例を示したが、どの場合にもHSVとPWMを加えたときに最
も多くの抗HSV抗体産生ハイブリドーマが生育した。
（５）抗HSV抗体産生ハイブリドーマのクローニング クローニングは限定希釈法を用いた。抗HSV抗体陽性の
穴より細胞を取り出し、細胞数を数え培養液Ｂを用い１
個／穴あるいは10個／穴で細胞を蒔いた。２週間後に細
胞が十分増殖したので、この上清に抗HSV抗体があるか
否かをELISAによって測定し、抗HSV抗体産生ハイブリド
ーマを選別した。
穴より細胞を取り出し、細胞数を数え培養液Ｂを用い１
個／穴あるいは10個／穴で細胞を蒔いた。２週間後に細
胞が十分増殖したので、この上清に抗HSV抗体があるか
否かをELISAによって測定し、抗HSV抗体産生ハイブリド
ーマを選別した。
（６）抗HSVモノクローナル抗体の調製 得られたハイブリドーマの１つD34を無血清培地ITES（R
PMI1640 2容＋ダルペットMEM1容＋F12 1容＋インシュリ
ン8.5μg/ml＋トランスフェリン２μg/ml＋エタノール
アミン20μｍ＋セレナイト2.5×10-8M）で培養した。そ
の培養清480mlを得て、これを限外濾過（アミコンPM3
0）で14mlにした。これを0.02Mリン酸ナトリウム（pH7.
8）析し、同緩衝液で平衡化したDE52カラム（2cm×14c
m）にかけた。未吸着分画（21ml）にヒトモノクローナ
ル抗体が回収された。酵素抗体法で測定したとき、培養
上清には、1.9μg/ml精製モノクローナル抗体標品には2
8μg/mlのヒトIgGが含まれていた。ドデシル硫酸ナトリ
ム−ポリアクリルアミド（５％ゲル）電気泳動にかける
と、分子量約16万の位置に単一のバンドが形成された。
PMI1640 2容＋ダルペットMEM1容＋F12 1容＋インシュリ
ン8.5μg/ml＋トランスフェリン２μg/ml＋エタノール
アミン20μｍ＋セレナイト2.5×10-8M）で培養した。そ
の培養清480mlを得て、これを限外濾過（アミコンPM3
0）で14mlにした。これを0.02Mリン酸ナトリウム（pH7.
8）析し、同緩衝液で平衡化したDE52カラム（2cm×14c
m）にかけた。未吸着分画（21ml）にヒトモノクローナ
ル抗体が回収された。酵素抗体法で測定したとき、培養
上清には、1.9μg/ml精製モノクローナル抗体標品には2
8μg/mlのヒトIgGが含まれていた。ドデシル硫酸ナトリ
ム−ポリアクリルアミド（５％ゲル）電気泳動にかける
と、分子量約16万の位置に単一のバンドが形成された。
参考例２ 抗HSVモノクローナル抗体の性質 （１）螢光抗体法により、モノクローナル抗体の特異性
を調べた。HSV1型のKOS株の感染したVero細胞をスライ
ドグラス上にアセトンで固定し、これにモノクローナル
抗体を含むハイブリドーマ培養上清を室温で１時間反応
させ、洗浄後、さらにフルオレッセインイソチアシアネ
ートでラベルされれたヤギ抗ヒトIgG（10倍希釈液）を
室温で１時間反応させた。こうして作成したスライドを
螢光顕微鏡で観察した。その結果、ハイブリドーマD34,
7−4,5−11,H2そしてH3の産生するモノクローナル抗体
はいずれもウイルスの感染した細胞の細胞膜と細胞質に
反応し、非感染細胞には全く反応しないことが判った。
さらにHSVの１型のHayashida株やHSV2型のYS−４株の感
染した細胞にも反応することが判った。
を調べた。HSV1型のKOS株の感染したVero細胞をスライ
ドグラス上にアセトンで固定し、これにモノクローナル
抗体を含むハイブリドーマ培養上清を室温で１時間反応
させ、洗浄後、さらにフルオレッセインイソチアシアネ
ートでラベルされれたヤギ抗ヒトIgG（10倍希釈液）を
室温で１時間反応させた。こうして作成したスライドを
螢光顕微鏡で観察した。その結果、ハイブリドーマD34,
7−4,5−11,H2そしてH3の産生するモノクローナル抗体
はいずれもウイルスの感染した細胞の細胞膜と細胞質に
反応し、非感染細胞には全く反応しないことが判った。
さらにHSVの１型のHayashida株やHSV2型のYS−４株の感
染した細胞にも反応することが判った。
（２）クローニングされたハイブリドーマより産生され
るMCA,D34,H2,H3のサブクラスとＬ鎖を検討した。ヒツ
ジ抗ヒトIgG1,抗ヒトIgG2,抗ヒトIgG3及び抗ヒトIgG4を
用いてオクターローニ法によりサブクラスを見た結果、
３つのMCAすべてが抗IgG1抗体とのみ沈降線を生じた。
さらにアルカリ・フォスファターゼ−ヤギ抗−ヒトＫ
鎖，あるいは抗ヒト入鎖を用いたELISAにより、D34はＫ
鎖,H2とH3は入鎖をもっていることが判明した。
るMCA,D34,H2,H3のサブクラスとＬ鎖を検討した。ヒツ
ジ抗ヒトIgG1,抗ヒトIgG2,抗ヒトIgG3及び抗ヒトIgG4を
用いてオクターローニ法によりサブクラスを見た結果、
３つのMCAすべてが抗IgG1抗体とのみ沈降線を生じた。
さらにアルカリ・フォスファターゼ−ヤギ抗−ヒトＫ
鎖，あるいは抗ヒト入鎖を用いたELISAにより、D34はＫ
鎖,H2とH3は入鎖をもっていることが判明した。
（３）酵素抗体法（ELISAにより、D34,H2とH3のヘルペ
ス属ウイルスに対する反応性を検討した。第２表に示し
た如く、D34,H2,H3いずれも試験したHSV1型および２型
ウイルスのすべてに反応し、非感染宿主HEL（human enb
ryonic lung）細胞には反応しなかった。また他のヘル
ペス属ウイルス,VZV,CMVや、Epstein−Barrウイルス（E
BV）にも反応しなかった。従って、これら３つのモノク
ローナル抗体はHSV1型と２型に対して特異的に反応する
ことがわかった。
ス属ウイルスに対する反応性を検討した。第２表に示し
た如く、D34,H2,H3いずれも試験したHSV1型および２型
ウイルスのすべてに反応し、非感染宿主HEL（human enb
ryonic lung）細胞には反応しなかった。また他のヘル
ペス属ウイルス,VZV,CMVや、Epstein−Barrウイルス（E
BV）にも反応しなかった。従って、これら３つのモノク
ローナル抗体はHSV1型と２型に対して特異的に反応する
ことがわかった。
（４）抗HSVモノクローナル抗体の免疫沈降分析ヒトモ
ノクローナル抗体が反応するウイルス粒子の構成成分
が、何であるか決めるために、免疫沈降分析を行なっ
た。Vero細胞にHSV1型（Fukuda株）または２型（UW268
株）を感染させＨ−グルコサミン又はＳ−メチオニンで
アイソトープ標識を行なった。標識した細胞を、0.01M
Tris・HCl−0.15M NaCl−１％デオキシコール酸ナトリ
ウム−１％Triton×100−0.1％ドデシル硫酸ナトリウム
（SDS）−1mMフェニルメチルスルフォニルフルオライド
（pH7.4）（溶解液）によって溶解した。これにモノク
ローナル抗体を加えて、抗原・抗体複合物を形成させて
おき、さらにプロテインＡ−セファロース4Bによって複
合体を吸着精製した。これを、0.125M Tris HCl−１％S
DS−３％２−メルカプトエタノール15％グリセリン（pH
8.2）で３分間100℃処理し、その上清をSDS−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動にかけた。泳動後ゲルを乾燥さ
せ、Ｘ線フイルムに−70℃でさらした。結果は第１図と
第３表に示す通りであり、ハイブリドーマD34と５−11
の産生するモノクローナル抗体は、Ｘ線フイルムのバン
ドの重なり具合から、いずれもHSV1型又は２型の糖蛋白
Ｂに対する抗体であることがわかった。同様な実験から
７−4,H−2,H−３も糖蛋白Ｂに対する抗体であることが
わかった。
ノクローナル抗体が反応するウイルス粒子の構成成分
が、何であるか決めるために、免疫沈降分析を行なっ
た。Vero細胞にHSV1型（Fukuda株）または２型（UW268
株）を感染させＨ−グルコサミン又はＳ−メチオニンで
アイソトープ標識を行なった。標識した細胞を、0.01M
Tris・HCl−0.15M NaCl−１％デオキシコール酸ナトリ
ウム−１％Triton×100−0.1％ドデシル硫酸ナトリウム
（SDS）−1mMフェニルメチルスルフォニルフルオライド
（pH7.4）（溶解液）によって溶解した。これにモノク
ローナル抗体を加えて、抗原・抗体複合物を形成させて
おき、さらにプロテインＡ−セファロース4Bによって複
合体を吸着精製した。これを、0.125M Tris HCl−１％S
DS−３％２−メルカプトエタノール15％グリセリン（pH
8.2）で３分間100℃処理し、その上清をSDS−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動にかけた。泳動後ゲルを乾燥さ
せ、Ｘ線フイルムに−70℃でさらした。結果は第１図と
第３表に示す通りであり、ハイブリドーマD34と５−11
の産生するモノクローナル抗体は、Ｘ線フイルムのバン
ドの重なり具合から、いずれもHSV1型又は２型の糖蛋白
Ｂに対する抗体であることがわかった。同様な実験から
７−4,H−2,H−３も糖蛋白Ｂに対する抗体であることが
わかった。
実施例１ 抗HSVモノクローナル抗体のウイルス中和活性 モノクローナル抗体のウイルス中和活性（力価）は以下
のようにし求めた。ウイルス液25μｌ中に150PFUを含
む）と段階希釈したモノクローナル抗体液25μl,及び補
体として新鮮モルモット血清（7.5％w/w）25μｌを、96
穴マイクロプレート中で混合した。37℃で60分間反応さ
せ後、96穴マクロプレート中のVero細胞単層培養へ移し
感染させた。37℃の炭酸ガス培養器で２日間培養後、10
％ホルマリンで細胞を固定し0.15％クリスタルバイオレ
ットで染色し、各穴のプラークを観察した。ウイルス中
和力価は、プラーク数を80％減少させるモノクローナル
抗体溶液（1mg/ml）の最高希釈倍数をもって表示した。
第４表に示すようにモノクローナル抗体D34は、HSVに結
合はするが、HSV1型，及び２型のいずれをも中和しな
い。
のようにし求めた。ウイルス液25μｌ中に150PFUを含
む）と段階希釈したモノクローナル抗体液25μl,及び補
体として新鮮モルモット血清（7.5％w/w）25μｌを、96
穴マイクロプレート中で混合した。37℃で60分間反応さ
せ後、96穴マクロプレート中のVero細胞単層培養へ移し
感染させた。37℃の炭酸ガス培養器で２日間培養後、10
％ホルマリンで細胞を固定し0.15％クリスタルバイオレ
ットで染色し、各穴のプラークを観察した。ウイルス中
和力価は、プラーク数を80％減少させるモノクローナル
抗体溶液（1mg/ml）の最高希釈倍数をもって表示した。
第４表に示すようにモノクローナル抗体D34は、HSVに結
合はするが、HSV1型，及び２型のいずれをも中和しな
い。
他の２つのモノクローナル抗体H2とH3は、補体非存在下
においても１型及び２型の両方を中和した。第５表はモ
ノクローナル抗体H2の中和スペクトラム（範囲）を示し
ている。H2はHSV1型と２型の用いた株の全てに対して高
い中和力価を保有していた。
においても１型及び２型の両方を中和した。第５表はモ
ノクローナル抗体H2の中和スペクトラム（範囲）を示し
ている。H2はHSV1型と２型の用いた株の全てに対して高
い中和力価を保有していた。
実施例２ HSV感染に対する各種モノクローナル抗体の防御効果 段階希釈した抗体溶液（1ml）をH2,H3及びHIgG（ヒトIg
G）に関しては５匹,D34に関しては10匹のBALBcマウスを
１群として腹腔内へ投与した。30分後にHSV1型（Miyama
GC+株）,2.5×105PFUを腹腔内へ投与し、感後15日目で
生存率を判定した。結果は第２図に示した。マウスの感
染死を50％防御するのに必要な抗体量は、各々H2が0.20
mg/kg,H3が0.35mg/kgD34及びHIgGは各々40,380mg/kg以
上であった。それ故、H2はHIgGの1900倍の防御効果に相
当する能力があることになる。
G）に関しては５匹,D34に関しては10匹のBALBcマウスを
１群として腹腔内へ投与した。30分後にHSV1型（Miyama
GC+株）,2.5×105PFUを腹腔内へ投与し、感後15日目で
生存率を判定した。結果は第２図に示した。マウスの感
染死を50％防御するのに必要な抗体量は、各々H2が0.20
mg/kg,H3が0.35mg/kgD34及びHIgGは各々40,380mg/kg以
上であった。それ故、H2はHIgGの1900倍の防御効果に相
当する能力があることになる。
実施例３ ハイブリドーマ培養上清より、DEAEセファセル・カラム
クロマトグラフィーとトヨパールHW−65によって、モノ
クローナル抗体H2を精製した。H2水溶液を、0.02Mリン
酸ナトリウム（pH7.4）を含む0.14M塩化ナトリウム水溶
液に十分透析した。タンパク濃度を5mg/mlに調整した
後、ヒト血清アルブミンを終濃度1mg/mlになるように加
えた。このタンパク混合液を凍結乾燥し、ヒトモノクロ
ーナル抗体製剤を作製した。
クロマトグラフィーとトヨパールHW−65によって、モノ
クローナル抗体H2を精製した。H2水溶液を、0.02Mリン
酸ナトリウム（pH7.4）を含む0.14M塩化ナトリウム水溶
液に十分透析した。タンパク濃度を5mg/mlに調整した
後、ヒト血清アルブミンを終濃度1mg/mlになるように加
えた。このタンパク混合液を凍結乾燥し、ヒトモノクロ
ーナル抗体製剤を作製した。
第１図は、抗HSVモノクローナル抗体の免疫沈降分析の
結果を示す、Ｘ線フイルムの説明図である。第２図は、
モノクローナル抗体のHSV感染防御効果（生存率）を示
す図である。
結果を示す、Ｘ線フイルムの説明図である。第２図は、
モノクローナル抗体のHSV感染防御効果（生存率）を示
す図である。
フロントページの続き (72)発明者 松本 洋一 東京都日野市旭が丘４丁目３番２号 帝人 株式会社生物医学研究所内 (56)参考文献 特開 昭58−175489（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−42397（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−128323（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−216125（ＪＰ，Ａ) Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕ ｎｉｔｙ，ｖｏｌ．29，ｎｏ．２（1980) Ｐ．724−732
Claims (1)
- 【請求項１】単純ヘルペスウイルス１型又は２型感染細
胞の細胞膜及び細胞質と反応し、非感染細胞とはほとん
ど反応しないという性質を有する、IgG型の、単純ヘル
ペスウイルス１型又は２型の糖蛋白Ｂに反応し、かつ中
和活性を有するヒトモノクローナル抗体を有効成分とす
る、単純ヘルペスウイルス感染症の予防又は治療剤。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/JP1985/000537 WO1986002092A1 (fr) | 1984-09-28 | 1985-09-27 | Hybridome homme-souris produisant un anticorps humain antiviral, procede de preparation et anticorps monoclonal humain antiviral |
| WO85/537 | 1985-09-27 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6272627A JPS6272627A (ja) | 1987-04-03 |
| JPH0720885B2 true JPH0720885B2 (ja) | 1995-03-08 |
Family
ID=13846585
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60242912A Expired - Lifetime JPH0720885B2 (ja) | 1985-09-27 | 1985-10-31 | 単純ヘルペスウイルス感染症の予防又は治療剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0720885B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2269127T3 (es) * | 1999-04-22 | 2007-04-01 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) | Utilizacion de la glucosa-6-fosfato isomerasa y de sus anticuerpos para el diagnostico y la terapia de la artritis, y el ensayo de compuestos antiartriticos. |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2519650B1 (fr) * | 1982-01-13 | 1985-07-12 | Univ Paris Curie | Lignees cellulaires hybrides murines anti-herpes, procede d'obtention, anticorps monoclonaux anti-herpes, applications biologiques |
| CH652145A5 (de) * | 1982-01-22 | 1985-10-31 | Sandoz Ag | Verfahren zur in vitro-herstellung von hybridomen welche humane monoklonale antikoerper erzeugen. |
| JPS58216125A (ja) * | 1982-06-09 | 1983-12-15 | Asahi Chem Ind Co Ltd | ヒト抗体の産生方法 |
| US4535057A (en) * | 1982-07-26 | 1985-08-13 | Amf Incorporated | Immunoassay employing monoclonal herpes simplex antibody and biotin-avidin detection system |
-
1985
- 1985-10-31 JP JP60242912A patent/JPH0720885B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ＩｎｆｅｃｔｉｏｎａｎｄＩｍｍｕｎｉｔｙ，ｖｏｌ．２９，ｎｏ．２（１９８０）Ｐ．７２４−７３２ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6272627A (ja) | 1987-04-03 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |