JPH0726958B2 - フルクトサミンの測定法及び測定用標準溶液 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は体液中のフルクトサミンの測定法並びにこのた
めに好適な標準溶液に関する。

従来技術 糖尿病の物質代謝においては、血液中に存在する過剰の
グルコースにより蛋白質はグリコシル化される。この際
グルコースのカルボニル基はまず遊離蛋白質アミノ基と
シツフの塩基の形成下に反応する。次いでアマドリ転移
によりフルクトサミンが生じ、これは安定なケトアミン
結合を示す。このケトアミン結合の安定性のためにフル
クトサミンの半減期は血清蛋白質の半減期と実質的に同
じである。従つて、フルクトサミンはいわゆる内在性糖
尿病パラメーターとして好適である。すなわちフルクト
サミンは最近一週間の平均血糖量についての明示を可能
とする。インジケーターとしては従来HbA₁として表わさ
れるグルコシルヘモグロビンがこのために測定された。
このパラメーターの監視は糖代謝の長期コントロールに
は好適である。グルコシルヘモグロビンはその長い半減
期のために代謝状態の長期的変化のみを明示し、ヘモグ
ロビン分解の不活性さは短期間における代謝の変動を認
識させないので、このパラーメーターは代謝状態の中期
的コントロールのとめに十分でない。他方、糖尿病患者
における糖代謝は血糖量の測定により監視される。しか
しながら、血糖量は強く変動するので、これは医者に採
血の時点の物質代謝状態に関しての情報しか与えない。
血清中の量による短期間監視とHbA₁cの測定による長期
的コントロールとの間の部分をフルクトサミンとしてあ
らわされるグリコシル化蛋白質の測定が満たす。血清フ
ルクトサミン測定が信頼のおける特異的で実施可能な、
糖尿病患者の監視法であるということは種々の研究によ
り示されている。

フルクトサミンの公知測定法は、例えばジヨンソン（Jo
hnson）等、Clin.Chem.Acta（1982）、第127巻、第87〜
95頁に記載されているように、水性アルカリ性媒体中エ
ノールホルムの形で存在し、かつこの形で容易に酸化さ
れるフルクトサミンを還元型で有色である酸化剤、例え
ばテトラゾリウム塩と反応させることに基づく。この際
生じたホルマザン色素を測光法により測定し、これはフ
ルクトサミンの量に比例する。更に、HPLC分離によるフ
ルクトサミンの測定法がJ.Clin.Chem.Clin.Biochem.第1
9巻（1981）、第81〜87頁に記載されている。

正確な測定を可能にするためには、標準溶液で検量線を
作製し、次いで試料溶液における測定の実施の際に得ら
れた値を検量曲線と比較することにより定めることが必
要である。更に、測定法の精確な管理及び自動分析機の
較正のためにも公知の含量の標準溶液を使用することは
必要である。この目的に使用される標準溶液は測定すべ
き測定パラメーターを公知濃度で含有していなければな
らない。パラメーターの濃度は医学的に重要な測定域に
なければならない。標準溶液の取り扱いは簡単でなくて
はならず、かつ特にできるだけ長い安定性を有していな
ければならない。

従来公知のフルクトサミン測定用標準溶液はいくつかの
又は多くのこれらの前提条件を満たしていない。こうし
て、一方では血清フルクトサミン濃度をモデル物質の形
で模造する対照血清もしくは検量血清が使用される。通
常このためには１−デオキシ−１−モルホリノ−フルク
トース（DMF）が使用される。この種の第１標準は例え
ば一定量のDMFをアルブミン溶液中に秤量することによ
り製造される。この公知標準溶液の欠点はこのモデル物
質DMFが血清フルクトサミンとは異なる構造を有し、従
つて全く異なる挙動をし、かつ異なる反応性を有するの
で得られた値とDMFで作製した検量線との比較で得られ
た値はあまりにも高い値を示す。従つてこのようにして
得られた値をDMF−単位として表わす。

この第１標準溶液に基づいて、次いで血清フルクトサミ
ンを含有する標準溶液を検量する。この種の（第２）標
準溶液は＋35℃における数日間の貯蔵の後、強いフルク
トサミン濃度の不安定性を示す。同時にグルコースが存
在する際、200％以上のフルクトサミン含量の上昇が観
察され、これは継続する非酵素的蛋白質グルコシル化に
起因する。グルコース遮断下には逆にフルクトサミン値
の減少が観察される。

発明が解決しようとする課題 従つて、本発明の課題は容易に取り扱かい可能であり、
その濃度が容易に測定され、かつその安定性を失なうこ
となく長期間にわたつて貯蔵することのできる、血清フ
ルクトサミン測定のための第１及び第２標準溶液を製造
することである。

課題を解決するための手段 この課題は検量のために標準溶液として、そのアミノ酸
単位が少なくとも25％までリジン及び／又はオルニチン
からなるペプチド又は蛋白質を含有し、かつこのペプチ
ド又は蛋白質がグリコシル化型で存在する溶液を使用す
ることを特徴とする、体液中のフルクトサミンを測定す
るための方法により解決する。

本発明方法においてフルクトサミンとは非酵素的にグリ
コシル化された血清蛋白質（グリコシル化血清蛋白
質）、例えばグリコシル化アルブミン、イムノグロブリ
ン又はフイブリノーゲン並びに非酵素的にグリコシル化
された血液蛋白質、例えばリジン−グリコシル化ヘモグ
ロビン及びグリコシル化赤血球膜蛋白質である。

本発明により、パラメーター血清フルクトサミンをグリ
コシル化血清蛋白質類似の形で含有し、かつその血清フ
ルクトサミン値が簡単にC/N−分析により確認可能であ
る標準溶液が提供される。本発明による標準溶液のもう
１つの利点は全く感染の危険性のない完全合成マトリツ
クスとしてこれを使用することができるということであ
る。

このためには人工的にグリコシル化したペプチド又は蛋
白質の溶液を製造し、かつそれぞれ所望の濃度に調節す
る。添加量の変化により正常の及び病的血清フルクトサ
ミン濃度に関する標準溶液が供給される。グリコシル化
ペプチド又は蛋白質の製造は例えば、デイ（J.F.Day）
等著、J.Biol.Chem.254、No.3、1979年、第595〜597頁
に記載された方法と同様にして行なうことができる。こ
の際、血清アルブミン水溶液をグルコースと25℃で８日
間恒温保持し、引き続き遊離グルコースを除去するため
に透析する。

本発明による方法において、標準溶液としてアミノ酸単
位が少なくとも25％までリジン及び／又はオルニチンか
らなるプペチド又は蛋白質を含有し、かつこのペプチド
又は蛋白質がグリコシル化型で存在する溶液を使用す
る。使用したペプチド又は蛋白質は少なくとも５個のリ
ジンもしくはオルニチン単位を、場合により他のアミノ
酸単位と共に有する。有利な実施形においては、ポリリ
ジン、ポリオルニチン又はリジンとゴルニチンとからの
コポリマーを使用する。この種のポリアミノ酸は例えば
Enzymology第III巻、第540頁、1957年、Academic Press
N.Y.及びJ.Biochem、第85巻、1962年、第233頁に記載
された方法により製造可能である。

分子量が約1000より大きいペプチドを使用するのが有利
である。ペプチド又は蛋白質の大きさはあまり厳密では
ない。しかしながら、この分子はなお可溶性でなくては
ならないので約300,000まで、有利には150,000までの分
子量を有する蛋白質を使用することができる。

使用したペプチド又は蛋白質は自体公知法でペプチド又
は蛋白質とグルコースとの恒温保持によりグリコシル化
する。ペプチド又は蛋白質のグリコシル化はすべてのア
ミノ側基の５〜35％がグリコシル化されるまでの時間で
実施するのが有利である。引き続き、反応生成物を十分
に透析する。

ペプチド又は蛋白質としては天然のものでも、合成した
ものでも使用することができる。ポリ−Ｌ−リジン又は
ポリ−Ｌ−オルニチンをグリコシル化型で使用するのが
特に有利であり、この際フルクトサミン含量は簡単なC/
N−元素分析により測定することができる。

このペプチド又は蛋白質を水性媒体中に溶かす。ベース
溶液として人血清を使用することもできる。

この溶液がグルコース不含であるのが有利である、それ
というのもこのようにして長い貯蔵安定性が保証され
る。従つて、人血清を使用する場合、これをグルコース
不含にしなければならない。これは、人血清をグルコー
ス不含緩衝液に対して透析することにより行なわれる。

更に、この標準溶液は検量血清に常用の物質を含有して
いてよい。こうして、例えば澄明化剤、安定剤、分散剤
及び保存剤を添加してよい。澄明化剤としては例えばペ
ンタエリスリツトを使用する。安定剤としては特に亜鉛
及びEDTAが好適である。保存剤としては例えばフエノー
ル又は抗生物質を使用することができる。更に専門家に
公知の助剤を使用することもできる。

本発明により使用した標準溶液の製造は個々の成分の混
合により行なわれ、場合によりpHの調節を緩衝系の添加
により行なう。

通常、更にこの標準溶液を濾過して細菌不含とし、長時
間の貯蔵のために凍結乾燥することができる。

特に有利な実施形においては、本発明による標準を酸性
溶液中、有利に６を下まわるpH値、特に有利には０〜４
の間のpH値で貯蔵するのが有利である。意外にも、この
標準溶液は凍結乾燥を必要とせず、かつこの標準溶液を
長時間にわたつて溶液の形で貯蔵することができる程良
好に安定性である。必要なpH値は無機又は有機酸、例え
ば塩酸、クエン酸又は酢酸の添加により、又は緩衝剤の
添加により達せられる。

本発明により使用した標準溶液は著しく安定であり、急
勾配の検量線を提供するので、正確で、鋭敏なフルクト
サミンの測定が可能である。本発明による方法で得られ
たフルクトサミン濃度の値と、原検量のために使用され
る他の公知法により得られた値との比較は、本発明によ
る方法が非常に簡単に実施され、かつ¹⁴C−グルコース
−組込みにより確認された原検量と良好に一致するとい
うことを示す。

更に、本発明の課題は体液中のフルクトサミンを測定す
るための標準溶液であり、この溶液はアミノ酸単位が少
なくとも23％までリジン及び／又はオルニチンからなる
ペプチド又は蛋白質を含有し、かつこのペプチド又は蛋
白質がグリコシル化型で存在することを特徴とする。

本発明により提供された標準溶液は天然に存在するフル
クトサミンと同じ構造を有し、こうして同じ反応性を有
する。従つて、本発明による標準溶液は第２標準溶液及
び対照血清の原標準化のために、並びにフルクトサミン
測定の検量のための標準溶液として好適である。

実施例 次に実施例につき本発明を詳細に説明する。

例１ ポリリジン−フルクトサミンの製造 250ml丸底フラスコ中にポリ−Ｌ−リジン（製造業者:Si
gma Chemie.、西独；平均分子量39000）500mg及びＤ
（＋）−グルコース1200mgを秤量し、氷酢酸50mlで懸濁
させた。室温で１時間撹拌し、これにより均質な懸濁液
が得られた。その後、ゆつくりとピリジン50mlを滴加
し、この懸濁液を室温で８日間撹拌し、引き続き脱塩水
300ml中に注いだ。この際、透明な溶液が得られ、これ
を10mlに濃縮した。次いで、0.02％HCl 300mlで350mlに
満たし、再び10mlに濃縮する。この工程を0.02％HCl
で、ピリジン臭が消えるまで、６回繰り返した。引き続
き、更に６回脱塩水で濾液が中性になるまで洗浄した。
水溶液50mlの容量から生成物を凍結乾燥させた。

得られた生成物のグリコシル化度をC/N−比を介して元
素分析により測定する。リジン単位に関してC/N比は3.0
であり、グリコシル化リジン単位に関しては6.0であ
る。

この例においてはグリコシル化度はすべてのリジン側基
の30％である。

例２ 人血清をベースとする対照血清において、種種の検量溶
液をフルクトサミンテストにおいて検量した。試薬は次
の組成を有した:0.2M炭酸塩緩衝液中非イオン系分散剤
2.2％、ウリカーゼ4U/ml、ニトロテトラゾリウムブルー
（NBT）5m mol/、pH10.30 種々のフルクトサミン含量の人血清試料各50μをそれ
ぞれ試薬1000μと混合し、吸光度上昇を試薬空値に対
して546nm、37℃で10分〜15分の間で側光機で測定し
た。

検量のためには次の溶液を使用した： ａ）フルクトサミン含量をあらかじめC/N−元素分析に
より決定したポリリジンフルクトサミン溶液； ｂ）¹⁴C−グルコースとの恒温保持及び引き続き完全な
透析を行なつた後シンチレーシヨンカウンター中でフル
クトサミ含量を測定したポリリジンフルクトサミン溶
液； ｃ）Johnson等、Clin.Chem.第32巻、第368〜370頁（198
6年）により¹⁴C−グルコースを用いて試験管内グリコシ
ル化することによりフルクトサミン含量を測定した人血
清アルブミン溶液 これら異なる標準溶液及び対照血清の結果を第１表にま
とめる。この結果は、呈色試験においてグリコシル化ポ
リリジンが生理学的に現われるフルクトサミンと同じ反
応性を有するということを示す。

例３ 本発明による標準溶液の安定性を種々の濃度の酸の添加
により実験した。このためには例１により製造したポリ
リジンフルクトサミンの溶液を相応する酸中に溶かし
た。非希釈溶液テスト列を３週間−18℃で、他の非希釈
溶液テスト列を３週間35℃で貯蔵した。引き続き、フル
クトサミン再検出を測定した。結果を第２表にまとめ
た。温度負荷下での３週間の貯蔵の後にも、検出可能な
フルクトサミン含量は実質的にほとんど変化しないこと
が示された。

例４ ポリ−Ｌ−リジン−Ｌ−フエニルアラニン−フルクトサ
ミンの製造 例１と同様にしてポリ−Ｌ−リジン−Ｌ−フエニルアラ
ニン（Sigma Chemie社、平均分子量46000）とグルコー
スとを反応させる。元素分析を用いて、C/N−比からグ
ルコシル化度38.5％が得られる。

例５ ポリ−Ｌ−オルニチン−フルクトサミンの製造 例１と同様にしてポリ−Ｌ−オルニチン（Sigma Chemie
社、平均分子量32000）とグルコースとを反応させる。

例６ ポリ−Ｌ−オルニチン−Ｌ−ロイシン−フルクトサミン
の製造 例１と同様にしてポリ−Ｌ−オルニチン−Ｌ−ロイシ
ン、1:1（Sigma Chemie社、平均分子量35000）とグルコ
ースとを反応させる。

例７ 種々の負荷度のポリ−Ｌ−リジン−フルクトサミンの製
造 例１と同様にしてポリ−Ｌ−リジン（Sigma Chemie社、
平均分子量39000）とグルコースとを反応させる。

室温で15時間の反応時間において、元素分析からのC/N
−比により、5.1％までグルコシル化されている生成物
が得られる。室温での64時間の反応時間において元素分
析からのC/N−比により8.1％までグリコシル化された生
成物が得られる。室温で120時間の反応時間において、
元素分析からのC/N−比により14.8％までグリコシル化
された生成物が得られる。

例８ 低分子量のポリ−Ｌ−リジン−フルクトサミンの製造 例１と同様にしてポリ−Ｌ−リジン（Sigma Chemie社、
平均分子量3300）をグルコースと反応させる。

元素分析からのC/N−比により生成物は49％までグリコ
シル化されている。

例９ 高分子量ポリ−Ｌ−リジン−フルクトサミンの製造 例１によりポリ−Ｌ−リジン（Sigma Chemie社、平均分
子量102000）をグルコースと反応させる。

元素分析からのC/N−比によれば28％までグリコシル化
されている。

フロントページの続き (72)発明者 クリスチヤン・クライン ドイツ連邦共和国ヴアイルハイム・ブリユ ーテンシユトラーセ 16 (72)発明者 ヴオルフガング・トライバー ドイツ連邦共和国ゼースハウプト・フエー レンシュトラーセ ８ (56)参考文献 特開 昭58−154660（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−15168（ＪＰ，Ａ)

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】体液中のフルクトサミンを測定する方法に
   おいて、検量のための標準溶液として、アミノ酸単位が
   少なくとも25％までリジン及び／又はオルニチンからな
   るペプチド又は蛋白質を含有し、かつこのペプチド又は
   蛋白質がグリコシル化型で存在する溶液を使用すること
   を特徴とするフルクトサミンの測定法。
2. 【請求項２】体液中のフルクトサミンを測定するための
   標準溶液において、アミノ酸単位が少なくとも25％まで
   リジン及び／又はオルニチンからなるペプチド又は蛋白
   質を含有し、かつこのペプチド又は蛋白質がグリコシル
   化型で存在することを特徴とするフルクトサミン測定用
   標準溶液。