JPH0733B2 - デヒドロゲナーゼの精製法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、デヒドロゲナーゼの精製法に関するものであ
り，さらに詳しくは微生物菌体からの還元型ニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチドデヒドロゲナーゼ又は還元
型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸デヒド
ロゲナーゼを高塩濃度下にてアフィニティクロマトグラ
フィーを行うことにより，簡単にかつ高純度に精製する
方法に関するものである。

（従来の技術） 還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドデヒドロ
ゲナーゼ又は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオ
チドリン酸デヒドロゲナーゼ 〔以下NAD（Ｐ）Ｈデヒドロゲナーゼと略記する〕は，
次式 〔NAD（Ｐ）は,NAD（ニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチド）あるいはNADP（ニコチンアミドアデニンジヌク
レオチドリン酸）を表し， NAD（Ｐ）Ｈは,NADH（還元型NAD）あるいはNADPH（還元
型NADP）を表す。〕 のようにアクセプターの共存下でNAD（Ｐ）Ｈの酸化を
触媒する酵素で， NAD（Ｐ）H:アクセプターオキシドレダクターゼとも呼
ばれており，特に臨床検査用試薬の一つとして広く利用
されている。

具体的には下記，式のように目的定量物の変化量は
NAD（Ｐ）Ｈの変化量を導いた（式）のち,NAD（Ｐ）
Ｈデヒドロゲナーゼを利用してアクセプターを還元し
（式），その呈色の度合を可視光で比色定量する方法
である。

（発明が解決しようとする課題） NAD（Ｐ）Ｈデヒドロゲナーゼを利用しないで直接NAD
（Ｐ）Ｈの変化量を紫外線領域の340nmにて測定する方
法（式を利用）もあるが，目的定量物の変化量をNAD
（Ｐ）Ｈの変化量を導く反応の平衝がNAD（Ｐ）Ｈ生成
の方向に向いていない場合には，目的物質の正確な定量
は困難である。

一方,NAD（Ｐ）Ｈデヒドロゲナーゼの反応はほとんど不
可逆的であるので，反応系の最後にNAD（Ｐ）Ｈデヒド
ロゲナーゼの反応（式）を組合せることにより，反応
が目的の方向に進み，目的物質の定量を正確に行うこと
ができる。

さらにアクセプターとして分子吸光係数の大きな色素を
用いれば，それだけ感度も増大する。このように,NAD
（Ｐ）Ｈデヒドロゲナーゼは臨床検査において重要な酵
素であり，その需要が近年増加している。

微生物菌体よりNAD（Ｐ）Ｈデヒドロゲナーゼを採取す
る方法については，従来より文献等で知られており，例
えばAtkinsonらはTHE AMERICAN TYPE CULTURE COLLECTI
ONのカタログに記載されているBacillus stearothermop
hilus NCA 1503（ATCC 7954）からのNAD（Ｐ）Ｈデヒド
ロゲナーゼの精製方法について報告している。（Jounal
of Applied Biochemistry,1巻,247頁,1979年）。

従来，微生物菌体よりNAD（Ｐ）Ｈデヒドロゲナーゼを
採取するには，菌体を破砕後，塩あるいは界面活性剤を
含む溶液などで抽出し，核酸の除去，硫酸アンモニウム
を用いた塩析による分画などを行った後，種々の担体を
用いたカラムクロマトグラフィーが実施されていた。特
にカラムクロマトグラフィーとしては，イオン交換クロ
マトグラフィー例えばDEAE（ジエチルアミノエチル）−
又はTEAE（トリエチルアミノエチル）−セルロース，吸
着クロマトグラフィー例えばハイドロキシアパタイトあ
るいはゲル濾過クロマトグラフィー例えば適度に架橋し
たデキストランゲル又はポリアクリルアミドゲルなどを
種々組み合せるという煩雑な工程をへていた。そのた
め，製品としてのNAD（Ｐ）Ｈデヒドロゲナーゼを得る
までに日数がかかるだけでなく，クロマトグラフィーの
回数がふえることによりNAD（Ｐ）Ｈデヒドロゲナーゼ
の回収率の低下が生じていた。

さらに，菌体よりのNAD（Ｐ）Ｈデヒドロゲナーゼ抽出
液中には菌体由来の種々の物質が混在しているがため，
上述のような工程によってもなお高純度のNAD（Ｐ）Ｈ
デヒドロゲナーゼを得るのはかなり困難であった。例え
ばClostridium kluyveriiからのNAD（Ｐ）Ｈデヒドロゲ
ナーゼはArchives of Biochemistry and Biophysics,13
2巻,91頁,1969年に記載されれているように，その工業
生産品には多量の異種蛋白質が含有されているがため，
この工業生産品をさらにゲル濾過クロマトグラフィーと
イオン交換クロマトグラフィーにより精製を行ってい
る。その結果，精製度で30倍向上しているが，それでも
90％程度の純度までしか純化されていない。

最近,MainsらはBacillus stearothermophilusからのNAD
（Ｐ）Ｈデヒドロゲナーゼの精製について報告した。
（The Biochemical Journal,191巻,457頁,1980年）。

すなわち，菌体を破砕後，塩化ナトリウムを加え70℃で
処理し，次いでクロマトグラフィーとしてDEAE−セルロ
ースクロマトグラフィー，ハイドロキシアパタイトクロ
マトグラフィー及びCibacron Blue 3GA（リアクティブ
ブルー２のCiba−Geigy社登録商標）−アガロースクロ
マトグラフィーを行い精製を行っている。しかしなが
ら，それでもまだ少量の異種蛋白質の残存が認められて
いる。

このようにNAD（Ｐ）Ｈデヒドロゲナーゼの精製は煩雑
で，かつ高純度のものを得るのは困難であるからNAD
（Ｐ）Ｈデヒドロゲナーゼは製造費が高くつき，臨床検
査用試薬としての重要性が言われているもののその利用
に著しい支障となっている。それゆえに，高純度のNAD
（Ｐ）Ｈデヒドロゲナーゼを効率よく，かつ工業的な規
模で取得する方法の確率が強く要望されている。

（課題を解決するための手段） 本発明者らは，これらの観点から，簡単な精製操作で高
純度のNAD（Ｐ）Ｈデヒドロゲナーゼを効率よく得る方
法を提供することを目的として鋭意研究した結果，クロ
マトグラフィーとして高塩濃度下でアフィニティクロマ
トグラフィーを行うだけで，上記の目的がすべて達成さ
れることを見い出し，本発明に到達したものである。

すなわち，本発明は微生物菌体から得たNAD（Ｐ）Ｈデ
ヒドロゲナーゼ含有粗酵素溶液を,NAD（Ｐ）Ｈデヒドロ
ゲナーゼの特異的吸着担体に0.5M濃度ないし飽和濃度の
塩類共存下に接触させて,NAD（Ｐ）Ｈデヒドロゲナーゼ
を該吸着担体に吸着させ，ついで吸着したNAD（Ｐ）Ｈ
デヒドロゲナーゼを溶離することを特徴とするデヒドロ
ゲナーゼの精製法である。

本発明に用いられる微生物菌体としては,NAD（Ｐ）Ｈデ
ヒドロゲナーゼ生産能を持つ微生物菌体であればいかな
るものでも利用でき，起源を限定するものではないが，
工業的には耐熱性NAD（Ｐ）Ｈデヒドロゲナーゼを大量
に産出するBacillus stearothermophilusが好ましい。
これらの微生物菌体から得たNAD（Ｐ）Ｈデヒドロゲナ
ーゼ含有粗酸素溶液としては，たとえば菌体を水あるい
は緩衝液に懸濁させ，自己消化法，凍結溶解法，ホモジ
ナイザー法，摩砕法，高圧法あるいは浸透圧ショック法
などで破砕し，遠心分離して得た上清液を用いればよ
い。また，このものをさらに硫酸プロタミン，硫酸スト
レプトマイシン，ポリエチレンイミン，水性二相分配法
などで除核酸処理して得た溶液を用いてもよく，または
さらに硫酸アンモニウム分画,pH処理，熱処理などを行
った溶液を用いてもよい。

このようにして得たNAD（Ｐ）Ｈデヒドロゲナーゼ含有
粗酵素溶液と， NAD（Ｐ）Ｈデヒドロゲナーゼの特異的吸着担体とを0.5
M濃度ないし飽和濃度の塩類共存下で，単に混合する
か，あるいはカラムに充填した上記担体に通液すること
によりNAD（Ｐ）Ｈデヒドロゲナーゼを上記担体に特異
的に吸着させることができる。この際,NAD（Ｐ）Ｈデヒ
ドロゲナーゼ以外の異種蛋白質を担体に吸着させないた
めに,0.5M濃度ないし飽和濃度の塩類共存下で行うこと
が必要である。そのためには，例えば好ましくは1M濃度
ないし飽和濃度の塩類をあらかじめNAD（Ｐ）Ｈデヒド
ロゲナーゼ含有粗酸素溶液に加えて使用すればよい。用
いられる塩としては，例えば塩化イオン，臭化イオン，
硫酸イオン，リン酸イオン，酢酸イオン，炭酸イオン，
ホウ酸イオンなどの陰イオンと，例えばナトリウム，カ
リウム，リチウム，アンモニウム，マグネシウムなどの
陽イオンを適宜組合せたものがあげられるが，通常は塩
化ナトリウム，塩化カリウム，硫酸アンモニウム，リン
酸ナトリウム，リン酸カリウムなどが適している。

次に，本発明においては担体に吸着させたNAD（Ｐ）Ｈ
デヒドロゲナーゼを担体より溶離させることが必要であ
る。そのためには，まずNAD（Ｐ）Ｈデヒドロゲナーゼ
が吸着した担体を好ましくは0.5M濃度ないし飽和濃度，
特に好ましくは1M濃度ないし飽和濃度の上述の塩類を含
有する緩衝液で洗浄し，担体に吸着していない異種蛋白
質を除いておくことが望ましい。この緩衝液のpHは５〜
10,特に６〜9,さらに７〜９であることが好ましい。こ
のようにして洗浄した後，たとえば以下に述べる溶離液
を用いてNAD（Ｐ）Ｈデヒドロゲナーゼを溶離すること
で，きわめて純度の高いNAD（Ｐ）Ｈデヒドロゲナーゼ
を得ることができる。溶離液としては，例えば好ましく
は0.2mM〜10mM,特に好ましくは0.5mM〜1mMのNADHあるい
はNADPHを含有する緩衝液が用いられる。この緩衝液のp
Hは５〜10,特に６〜９さらには７〜９であることが好ま
しい。

また，溶離させる方法としては，緩衝液を一度に加え
る，いわゆる回分式溶出法でもよいし，あるいは緩衝液
の濃度を連続的に上昇させて溶離させる，いわゆる濃度
勾配溶出法でもよい。

本発明に用いられるNAD（Ｐ）Ｈデヒドロゲナーゼの特
異的吸着担体としては，例えば色素化合物を水不溶性担
体に結合させたものであって,NAD（Ｐ）Ｈデヒドロゲナ
ーゼを特異的に吸着するものであれば，いかなるもので
もよい。これらの中でもアクティブブルー２（カラーイ
ンデックス番号61211）をリガンドとする水不溶性担体
が好ましい。この水不溶性担体としては，例えばセルロ
ース，デキストラン，アガロース，デンプンなどの多糖
類の誘導体，ポリ酢酸セルロース，ポリビニルアルコー
ルの誘導体，ポリスチレン，ポリプロピレン，ポリエチ
レン，ポリビニルクロライド，ポリ（メチルメタクリル
酸）エステル，ポリブテン，ポリペンテン，ポリビニリ
デンクロライド，ポリアクリロニトリル，ポリメタクリ
ル酸，ポリアクリル酸，ポリアミノスチレン，ポリブタ
ジエン，ポリイソプレン，ポリマレイン酸モノエステ
ル，架橋ポリアクリルアミド，ポリメタクリルアミド，
ポリビニルアミン，ポリ（ジアルキルアミノエチルメタ
クリル酸エステル），ポリ（ジアルキルアミノメチルス
チレン），ポリ（ビニルピリジン），ポリ（ビニルピロ
リドン），ポリアクリル酸無水物，ポリメタクリル酸無
水物，ポリマレイン酸無水物，ポリメタクリロニトリ
ル，ポリ（トリフルオロエチレン），ポリ（テトラフル
オロエチレン），ポリ（ジビニルベンゼン），ポリ（α
−メチルスチレン），ポリ（Ｎ−ビニルアミン），ポリ
（テトラメチレングリコールジビニルエーテル），ポリ
ビニルスルホン，ポリビニルスルホキシド，ポリアクロ
レイン，ポリメチルビニルケトンなどの不飽和炭素を含
む単量体からなる重合体，ポリフェニレンオキシドド，
ポリメチレンオキシアド，ポリエチレンオキシド，ポリ
テトラメチレンオキシドなどのポリエーテル類，ポリア
ラニン，ポリフェニルアラニンなどのポリペプチド類，
ナイロン−3,ナイロン−4,ナイロン−5,ナイロン−6,ナ
イロン−7,ナイロン−11,ナイロン−12,ナイロン−6.6,
ナイロン−6.10,ポリ（ｍ−フェニレン−イソフタラミ
ド），ポリ（ｐ−フェニレン−テレフタラミド）などの
ポリアミド，テレフタル酸，イソフタル酸，アジピン
酸，マレイン酸，フマル酸，トリメリット酸などのポリ
カルボン酸と，エチレングリコール，プロピレングリコ
ール，ブチレングリコール，ペンタエリスリトール，ビ
スフェノールＡなどのポリオールとから誘導されるポリ
エステル類，グリコール類，乳酸，ヒドロキシピリバリ
ン酸などから誘導されるポリエステル，ジメチルポリシ
ロキサン，メチルフェニルポリシロキサン，メチルビニ
ルポリシロキサン，ジアノアルキルメチルポリシロキサ
ン，フルオロアルキルメチルポリシロキサンなどのシリ
コンゴム，トリエンジイソシアネート，キシレンジイソ
シアナート，フェニレンジイソシアナート，エチレンジ
イソシアナートジフェニルメタンジイソシアナート，ト
ルエントリイソシアナートなどのポリイソシアナート
と，ポリエチレングリコール，ポリプロピレングリコー
ル，両末端にOH基を有するポリエステルなどのポリオー
ルとから誘導されるポリウレタン類，フェノール−ホル
ムアルデヒド樹脂，キシレン−ホルムアルデヒド樹脂，
尿素−ホルムアルデヒド樹脂，メラミン−ホルムアルデ
ヒド樹脂などのホルムアルデヒド樹脂，ポリイミド，ポ
リベンズイミダゾール，ポリチアゾールなどの４員環を
含むポリマー，ポリカーボナート，ポリスルホンなどの
合成ポリマー類及びガラス，アスベスト，クレイ，マイ
カ，ヒドロキシルアパタイト，活性炭，シリカゲル，ア
ルミナなどの無機物の誘導体及びポリフォスファゼンの
ような合成無機ポリマーなどがあげられる。特に，これ
らの中でもセルロース，デキストラン，アガロース，デ
ンプンなどの多糖類の誘導体が好ましい。このNAD
（Ｐ）Ｈデヒドロゲナーゼの特異的吸着担体を得るに
は，例えばbiochim.biophys.acta 358,1〜13（1974）に
記載されている方法によって色素化合物を水不溶性担体
に結合させればよい。

特に好ましい具体例として，たとえば市販のマートレッ
クスブルー（アミコン社製），アフィゲルブルー（バイ
オラッド社製），ブルーセファロースCL−6B（ファルマ
シア社製）があげられる。

（発明の効果） 本発明によれば簡便な操作にて，かつ公知のいずれの方
法と比べても，収率及び純度ともに高いNAD（Ｐ）Ｈデ
ヒドロゲナーゼを経済的に得ることができる。

また，アフィニティークロマトグラフィーを行うには，
通常緩衝液の種類，濃度,pHなどを考慮する必要があ
り，そのため定まった緩衝液であらかじめ透析処理など
を行う必要があったが，本発明ではそのような煩雑な処
理は必要なく，塩を加えるだけでよい。

（実施例） 以下，実施例をあげて本発明をさらに具体的に説明す
る。

なお,NAD（Ｐ）Ｈデヒドロゲナーゼの酵素活性は,0.06m
Mの2.6−ジクロロフェノールインドフェノール及び1mM
のNADHを含む20mMのリン酸緩衝液（pH7.5）にNAD（Ｐ）
Ｈデヒドロゲナーゼを加えたときの600nmの吸光度の単
位時間当りの減少量の測定より求めたものであり,1マイ
クロモルの2.6−ジクロロフェノールインドフェノール
を減少せしめる酵素活性を一単位とした。

実施例1,比較例１ 公知の方法により得られたバチルス・ステアロサーモフ
ィルスNCA1503（ATCC 7954）の湿菌体1kgを,2Mの塩化カ
リウムと2mMの２−メルカプトエタノールを含む25mMの
リン酸緩衝液（pH7.5）2lに懸濁し，ダイノミル（Willy
A.Bachofen Manufacuturing Engineers社製）を用いて
細胞を破壊した後，遠心分離により不溶物を除去し,NAD
（Ｐ）Ｈデヒドロゲナーゼ含有粗酵素溶液を得た。この
粗酵素溶液をマートレックスブルーＡ（Amicon社製）を
充填した内径4.4cm,高さ25cmのカラムに通じ，ついで2M
の塩化カリウムと2mMの２−メルカプトエタノールを含
む25mMのリン酸緩衝液（pH7.5）1lを通液することによ
り，非吸着の異種蛋白質を完全に除いた後，ひきつづき
上記緩衝液と2mMのNADHを含む緩衝液とを用いた直線濃
度勾配法にて溶出を行ったところ,0.5mMのNADH濃度近く
に目的のNAD（Ｐ）Ｈデヒドロゲナーゼが溶出した。こ
のようにして得たNAD（Ｐ）Ｈデヒドロゲナーゼは，収
量78mg,収率96％であり，比活性はNAD（Ｐ）Ｈデヒドロ
ゲナーゼ1mgあたり3,800単位であった。

また，アクリルアミドディスク電気泳動で単一なバンド
を示した。

比較のため，上記と同様にして得たNAD（Ｐ）Ｈデヒド
ロゲナーゼ含有粗酵素溶液を,2mMの２−メルカプトエタ
ノールを含む25mMのリン酸緩衝液（pH 7.5）にて十分透
析後，あらかじめ同緩衝液にて平衡化しておいたマトレ
ックスブルーＡ充填カラム（内径4.4cm,高さ25cm）に通
じた。この際の非吸着溶出液中及びつづく２−メルカプ
トエタノールを含むリン酸緩衝液（pH 7.5）による洗浄
操作の吸着溶出液中に，カラムへ供給したNAD（Ｐ）Ｈ
デヒドロゲナーゼ活性のおよそ30％ものNAD（Ｐ）Ｈデ
ヒドロゲナーゼ活性が認められた。ひきつづき同緩衝液
と2mMのNADH含有緩衝液とを用いた直線濃度勾配法にて
溶出を行ったところ,0.4mMのNADH濃度近くにNAD（Ｐ）
Ｈデヒドロゲナーゼが溶出した。収率は60％，比活性は
およそ520単位/mgであり，またアクリルアミドディスク
電気泳動でNAD（Ｐ）Ｈデヒドロゲナーゼ及びこれ以外
の多数の異種蛋白質のバンドが認められた。

以上のように,2Mの塩化カリウム存在下でクロマトグラ
フィーを行うことにより，通常の方法に比べて驚くほど
の精製効率が達成できた。

実施例2,比較例２ 公知の方法により得られたバチルス・ステアロサーモフ
ィルスNCA 1503（ATCC 7954）の湿菌体500gを0.1Mのリ
ン酸緩衝液（pH 7.2）2lに懸濁し，フレンチプレスを用
いて細胞を破壊した後，遠心分離により不溶物を除去
し,NAD（Ｐ）Ｈデヒドロゲナーゼを含む上清液を得た。
この上清液2l当り１％硫酸プロタミン水溶液1lを添加
し，十分撹拌した後，生じた沈澱を遠心分離により除去
し，プロタミン処理上清液を得た。この上清液に1Mの硫
酸アンモニウムを添加した後，ブルーセファロースCL−
6B（Farmacia社製）充填した内径4.4cm,高さ10cmのカラ
ムに通じ，ついで1Mの硫酸アンモニウムを含む0.1Mのリ
ン酸緩衝液（pH7.2）を通液した。ひきつづき1mMのNADH
を含む0.1Mリン酸緩衝液にてNAD（Ｐ）Ｈデヒドロゲナ
ーゼを溶出させた。このようにして得たNAD（Ｐ）Ｈデ
ヒドロゲナーゼは，収量36mg,収率90％であり，比活性
は3,600単位/mgで，アクリルアミドディスク電気泳動で
単一なバンドを示した。

比較のため，上記のプロタミン処理上清液を0.1Mリン酸
緩衝液（pH 7.2）にで透析後，あらかじめ同緩衝液にて
平衡化しておいたブルーセファロースCL−6B充填カラム
（内径4.4cm,高さ10cm）に通液し，ついで1Mの硫酸アン
モニウムを含む0.1Mリン酸緩衝液（pH 7.2）を通液し
た。これらの操作によりカラムへ供給したNAD（Ｐ）Ｈ
デヒドロゲナーゼ活性のおよそ22％が流出した。ひきつ
づき1mMのNADHを含む0.1Mリン酸緩衝液をカラムに通液
し，吸着しているNAD（Ｐ）Ｈデヒドロゲナーゼを溶出
させた。得られたNAD（Ｐ）Ｈデヒドロゲナーゼは収率5
5％，比活性は2,100単位/mgであり，アクリルアミドデ
ィスク電気泳動で多数のバンドが認められた。

実施例3,比較例３ 公知の方法により得られたバチルス・ステアロサーモフ
ィルスNCA 1503（ATCC 7954）の湿菌体1kgを,0.1Mのリ
ン酸カリウム緩衝液（pH7.5）2lに懸濁し，ダイノミル
を用いて細胞を破壊した後，牛膵臓のデオキシリボヌク
レアーゼ（10μg/ml）により23℃,15分間処理し，遠心
分離により不溶物を除去することにより,NAD（Ｐ）Ｈデ
ヒドロゲナーゼ含有粗酸素を得た。この粗酵素溶液に塩
化ナトリウムを2M濃度となるように加え,23℃で１時間
撹拌，ついで70℃で１時間撹拌した後,5℃に冷却し，遠
心分離により不溶性蛋白質を除去した。得られたNAD
（Ｐ）Ｈデヒドロゲナーゼ溶液をマートレックスブルー
Ａを充填した内径4.4cm,高さ25cmのカラムに通じ，つい
で2Mの塩化カリウムを含む50mMのリン酸カリウム緩衝液
（pH7.5）1lを通液することにより，非吸着の異種蛋白
質を完全に除いた後，ひきつづき上記緩衝液と2mMのNAD
Hを含む緩衝液とを用いた直線濃度勾配法にて溶出を行
ったところ,0.5mMのNADH濃度付近に目的のNAD（Ｐ）Ｈ
デヒドロゲナーゼが溶出した。

このようにして得たNAD（Ｐ）Ｈデヒドロゲナーゼは，
収量75mg,収率92％であり，比活性は3,750単位/mgであ
った。また，アクリルアミドディスク電気泳動で単一な
バンドを示した。

比較のため，上記と同様にして得たNAD（Ｐ）Ｈデヒド
ロゲナーゼ溶液を,50mMのリン酸カリウム緩衝液（pH7.
5）にて十分透析後，あらかじめ同緩衝液にて平衡化し
ておいたマートレックスブルーＡ充填カラム（内径4.4c
m,高さ25cm）に通じた。この際の非吸着溶出液中及びリ
ン酸緩衝液による洗浄操作での溶出液中に，カラムへ供
給したNAD（Ｐ）Ｈデヒドロゲナーゼ活性のおよそ22％
のNAD（Ｐ）Ｈデヒドロゲナーゼ活性が認められた。ひ
きつづき，同緩衝液と2mMのNADH含有緩衝液とを用いた
直線濃度勾配法にて溶出を行ったところ,0.4mMのNADH濃
度近くににNAD（Ｐ）Ｈデヒドロゲナーゼが溶出した。

このようにして得たNAD（Ｐ）Ｈデヒドロゲナーゼは，
収率63％，非活性500単位/mgであり，アクリルアミドデ
ィスク電気泳動でNAD（Ｐ）Ｈデヒドロゲナーゼ以外の
多数の異種蛋白質のバンドが認められた。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】微生物菌体から得た還元型ニコチンアミド
   アデニンジヌクレオチドデヒドロゲナーゼ又は還元型ニ
   コチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸デヒドロゲ
   ナーゼ含有粗酵素溶液を，還元型ニコチンアミドアデニ
   ンジヌクレオチドデヒドロゲナーゼ又は還元剤ニコチン
   アミドアデニンジヌクレオチドリン酸デヒドロゲナーゼ
   の特異的吸着担体に0.5M濃度ないし飽和濃度の塩類共存
   下に接触させて，還元型ニコチンアミドアデニンジヌク
   レオチドデヒドロナーゼ又は還元型ニコチンアミドアデ
   ニンジヌクレオチドリン酸デヒドロゲナーゼを該吸着担
   体に吸着させ，ついで吸着した還元型ニコチンアミドア
   デニンジヌクレオチドデヒドロゲナーゼ又は還元型ニコ
   チンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸デヒドロゲナ
   ーゼを溶離することを特徴とするデヒドロゲナーゼの精
   製法。
2. 【請求項２】微生物菌体がバチルス・ステアロサーモフ
   ィルスである特許請求の範囲第１項記載の精製法。
3. 【請求項３】還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオ
   チドデヒドロゲナーゼ又は還元型ニコチンアミドアデニ
   ンジヌクレオチドリン酸デヒドロゲナーゼの特異的吸着
   担体がリアクティブブルー２（カラーインデックス番号
   61211）をリガンドとする水不溶性担体である特許請求
   の範囲第１項記載の精製法。