JPH0736752B2 - ポリペプチド製品 - Google Patents
ポリペプチド製品Info
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- JPH0736752B2 JPH0736752B2 JP61026992A JP2699286A JPH0736752B2 JP H0736752 B2 JPH0736752 B2 JP H0736752B2 JP 61026992 A JP61026992 A JP 61026992A JP 2699286 A JP2699286 A JP 2699286A JP H0736752 B2 JPH0736752 B2 JP H0736752B2
- Authority
- JP
- Japan
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- galactomannan
- galactosidase
- penicillium
- galactose
- galu
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2465—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1) acting on alpha-galactose-glycoside bonds, e.g. alpha-galactosidase (3.2.1.22)
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、新規な微生物的に誘導されたα‐ガラクトシ
ダーゼ製品に関する。新規な酵素はα‐ガラクマンナン
ガラクトシダーゼと命名された。
ダーゼ製品に関する。新規な酵素はα‐ガラクマンナン
ガラクトシダーゼと命名された。
D-ガラクト‐D-マンナンは、幾つかの豆果の種子の内乳
に見出される貯蔵炭水化物である。ガラクトマンナン
は、β‐Ｄ（1-4）‐マンナンポリマー骨格からなり、
これに種々の量の単一（1-6）‐α‐D-ガラクトピラノ
シル基が結合したものである。
に見出される貯蔵炭水化物である。ガラクトマンナン
は、β‐Ｄ（1-4）‐マンナンポリマー骨格からなり、
これに種々の量の単一（1-6）‐α‐D-ガラクトピラノ
シル基が結合したものである。
ガラクトマンナンは、食品，動物のえさの成分として、
更に化粧，医薬および他の工業的用途に用いられる。典
形的には、ガラクトマンナンはキサンタンゴム，カラゲ
ナンゴム，寒天およびアガロースの如きポリマーをガラ
クトマンナンに添加することにより、インターアクティ
ブ ゲル（interactive gel）の製造に用いられる。こ
の相互作用は、後にゲル化能として言及されている。し
かるに、もしもガラクトマンナン中のガラクトースとマ
ンナンとの割合が非常に高い場合、ゲルは著るしく又は
全然形成されず、これは以下にゲル化能不良又はゲル化
能なしとして言及される。
更に化粧，医薬および他の工業的用途に用いられる。典
形的には、ガラクトマンナンはキサンタンゴム，カラゲ
ナンゴム，寒天およびアガロースの如きポリマーをガラ
クトマンナンに添加することにより、インターアクティ
ブ ゲル（interactive gel）の製造に用いられる。こ
の相互作用は、後にゲル化能として言及されている。し
かるに、もしもガラクトマンナン中のガラクトースとマ
ンナンとの割合が非常に高い場合、ゲルは著るしく又は
全然形成されず、これは以下にゲル化能不良又はゲル化
能なしとして言及される。
ゲル化能不良又はゲル化能なしの問題は、例えばルセル
ネ（lucerne）種子α‐ガラクトシダーゼの如き植物か
ら回収されたα‐グラクトシダーゼを用いてガラクトマ
ンナンからガラクトピラノシル基の幾くつかを除去する
ことにより解決できる（Carbohydr.Res.71（1979）,21
2、および92（1981）,269を参照）。また、植物から回
収された他のα‐ガラクトシダーゼは比較的活性を有す
る例えば、米国特許4,332,894を参照。しかし、植物か
ら回収されたα‐ガラクトシダーゼは比較的に高価であ
る。
ネ（lucerne）種子α‐ガラクトシダーゼの如き植物か
ら回収されたα‐グラクトシダーゼを用いてガラクトマ
ンナンからガラクトピラノシル基の幾くつかを除去する
ことにより解決できる（Carbohydr.Res.71（1979）,21
2、および92（1981）,269を参照）。また、植物から回
収された他のα‐ガラクトシダーゼは比較的活性を有す
る例えば、米国特許4,332,894を参照。しかし、植物か
ら回収されたα‐ガラクトシダーゼは比較的に高価であ
る。
満足なインターアクティブゲル形成をなさせめる十分に
低含量のガラクトピラノシル基を有するガラクトマンナ
ンを製造するためには、例えばグアガラクトマンナンの
如き、ガラクトマンナンから少なくとも約10％（重量／
重量）のガラクトーズ含量を放出することが必要であ
る。
低含量のガラクトピラノシル基を有するガラクトマンナ
ンを製造するためには、例えばグアガラクトマンナンの
如き、ガラクトマンナンから少なくとも約10％（重量／
重量）のガラクトーズ含量を放出することが必要であ
る。
本発明中のガラクトマンナンから放出されるガラクトー
スのパーセントは、特に言及しない限りガラクトマンナ
ン出発物質中のガラクトース含量に基づいている。
スのパーセントは、特に言及しない限りガラクトマンナ
ン出発物質中のガラクトース含量に基づいている。
ガラクトースとマンナンとの所望の低割合を有するガラ
クトマンナンの製造するために、ガラクトピラノシル基
の酵素的除去を、高含量のガラクトマンナンを有する反
応媒質中で行うことができる。好ましくは、反応媒質中
のガラクトマンナンの含量は２〜０％（重量／重量）、
好ましくは８〜50％（重量／重量）の範囲内である。ヨ
ーロッパ特許出願第84200304.8参照。しかし、ガラクト
ピラノシル基の酵素的除去もまた２％ガラクトマンナン
以下を含有する培化中で好都合に行うことができる。
クトマンナンの製造するために、ガラクトピラノシル基
の酵素的除去を、高含量のガラクトマンナンを有する反
応媒質中で行うことができる。好ましくは、反応媒質中
のガラクトマンナンの含量は２〜０％（重量／重量）、
好ましくは８〜50％（重量／重量）の範囲内である。ヨ
ーロッパ特許出願第84200304.8参照。しかし、ガラクト
ピラノシル基の酵素的除去もまた２％ガラクトマンナン
以下を含有する培化中で好都合に行うことができる。
アスペルギルス ニーガー（Aspergillus niger）由来
のα‐ガラクトシダーゼがグア粉およびロキュスト ビ
ーン ガム（locust bean gam）を水解するが報告され
た（J.Bacterjol.129（1977）,850以降、およびJ.Biol.
Chem.224（1969）,2975以降参照）。この結果は、先ず
ガラクトマンナンのマンナン骨格を分裂させ次いでこれ
によりα‐ガラクトシダーゼの攻撃をなさしめる、エン
ド‐β‐マンナンナーゼの実質的量で汚染されたアスペ
ルギルスニーガーを用いることに帰因した。公知のアス
ペルギルスニーガーから得られるガラクトマンナンはゲ
ル化能不良又はゲル化能なしである。ヨーロッパ特許出
願84200304.8の７頁の下部にはアスペルギルスニーガー
α‐ガラクトシダーゼがβ‐マンナナーゼですでに解重
合されたグアガラクトマンナンを水解することが述べら
れている。β‐マンナンナーゼは大低の菌類から生産さ
れる酵素である。β‐マンナンナーゼはβ‐D-（1-4）
‐マンナン結合を分解する。
のα‐ガラクトシダーゼがグア粉およびロキュスト ビ
ーン ガム（locust bean gam）を水解するが報告され
た（J.Bacterjol.129（1977）,850以降、およびJ.Biol.
Chem.224（1969）,2975以降参照）。この結果は、先ず
ガラクトマンナンのマンナン骨格を分裂させ次いでこれ
によりα‐ガラクトシダーゼの攻撃をなさしめる、エン
ド‐β‐マンナンナーゼの実質的量で汚染されたアスペ
ルギルスニーガーを用いることに帰因した。公知のアス
ペルギルスニーガーから得られるガラクトマンナンはゲ
ル化能不良又はゲル化能なしである。ヨーロッパ特許出
願84200304.8の７頁の下部にはアスペルギルスニーガー
α‐ガラクトシダーゼがβ‐マンナナーゼですでに解重
合されたグアガラクトマンナンを水解することが述べら
れている。β‐マンナンナーゼは大低の菌類から生産さ
れる酵素である。β‐マンナンナーゼはβ‐D-（1-4）
‐マンナン結合を分解する。
J.Biol.Chem.245（1970）,786中には、モティエレラ
ビナセア‐α‐ガラクトシダーゼは豆果種のガラクトマ
ンナンからのD-ガラクトースを水解しないことが報告さ
れている。また、バクテリオデスオバトウスからのα‐
ガラクトシダーゼＩおよびα‐ガラクトシダーゼIIは、
完全なグアゴムからガラクトース残留物を除去すること
ができなかった（J.Bacteriol.161（1985）,500参
照）。
ビナセア‐α‐ガラクトシダーゼは豆果種のガラクトマ
ンナンからのD-ガラクトースを水解しないことが報告さ
れている。また、バクテリオデスオバトウスからのα‐
ガラクトシダーゼＩおよびα‐ガラクトシダーゼIIは、
完全なグアゴムからガラクトース残留物を除去すること
ができなかった（J.Bacteriol.161（1985）,500参
照）。
数種の他の微生物α‐グルコシダーゼは当業者に公知で
ある。本発明者らはAppl.Biochem.Microbiol.18（198
2）１頁以降に掲げられているものを含めて大部分の雑
菌性属から選ばれた約200種の異なる菌類および細菌の
菌株を、α‐ガラクトシダーゼ生産に対しスクリーニン
グ試験した。全てのこれらの試験は、もしもマンナン骨
格が分解しない場合、ガラクトマンナンからD-ガラクト
ピラノシル基を分裂させ得ないことが見出された。
ある。本発明者らはAppl.Biochem.Microbiol.18（198
2）１頁以降に掲げられているものを含めて大部分の雑
菌性属から選ばれた約200種の異なる菌類および細菌の
菌株を、α‐ガラクトシダーゼ生産に対しスクリーニン
グ試験した。全てのこれらの試験は、もしもマンナン骨
格が分解しない場合、ガラクトマンナンからD-ガラクト
ピラノシル基を分裂させ得ないことが見出された。
本発明の目的は、マンナン骨格を実質的に分解すること
なく、ガラクトマンナンから相当量のガラクトースを分
裂させ得る微生物のα‐ガラクトシダーゼを提供するこ
とにある。新規α‐ガラクトシダーゼは、本発明中α‐
ガラクトマンナンガラクトシダーゼと呼ばれる。それら
の作用はガラクトマンナンのゲル化能を改良する。
なく、ガラクトマンナンから相当量のガラクトースを分
裂させ得る微生物のα‐ガラクトシダーゼを提供するこ
とにある。新規α‐ガラクトシダーゼは、本発明中α‐
ガラクトマンナンガラクトシダーゼと呼ばれる。それら
の作用はガラクトマンナンのゲル化能を改良する。
本発明の第二の目的は、殆ど又は全くエンド‐β‐マン
ナンナーゼを含有しないα‐ガラクトマンナンガラクト
シダーゼ製品を提供することにある。
ナンナーゼを含有しないα‐ガラクトマンナンガラクト
シダーゼ製品を提供することにある。
マンナン骨格の実質的分解はゲル化能を破崩する。
本発明の別の目的は、微生物α‐ガラクトマンナンガラ
クトシダーゼを提供することにあり、これは相当して高
濃度のガラクトマンナンを含有する反応培質中改良され
たゲル化能を有するガラクトマンナンを製造することが
できる。このような微生物源α‐ガラクトマンナンガラ
クトシダーゼは幾つかの理由が存する。第一に、それら
は植物から回収されるα‐ガラクトシダーゼとして余り
高価でない。第二に、比較的高含量のガラクトマンナン
を含む反応培質を用いることも経済的条件から重要であ
る。
クトシダーゼを提供することにあり、これは相当して高
濃度のガラクトマンナンを含有する反応培質中改良され
たゲル化能を有するガラクトマンナンを製造することが
できる。このような微生物源α‐ガラクトマンナンガラ
クトシダーゼは幾つかの理由が存する。第一に、それら
は植物から回収されるα‐ガラクトシダーゼとして余り
高価でない。第二に、比較的高含量のガラクトマンナン
を含む反応培質を用いることも経済的条件から重要であ
る。
今や驚くべきことに、幾つかのペニシリウム種がα‐ガ
ラクトマンナンガラクトシダーゼ酵素を生産することが
見出された。本発明はこの新規な酵素、その製法および
その使用方法に関する。
ラクトマンナンガラクトシダーゼ酵素を生産することが
見出された。本発明はこの新規な酵素、その製法および
その使用方法に関する。
本発明のα‐ガラクトマンナンガラクトシダーゼ製品
は、これまで知られているα‐ガラクトシダーゼとは同
じでない。公知のα‐ガラクトシダーゼと本発明のα‐
ガラクトマンナンガラクトシダーゼとの差異は、特に免
疫化学的試験により更に特性の違いにより明らかにする
ことが出来る。
は、これまで知られているα‐ガラクトシダーゼとは同
じでない。公知のα‐ガラクトシダーゼと本発明のα‐
ガラクトマンナンガラクトシダーゼとの差異は、特に免
疫化学的試験により更に特性の違いにより明らかにする
ことが出来る。
本発明のα‐ガラクトマンナンガラクトシダーゼ製品
は、比較的高含量のガラクトマンナンを含有する反応媒
質中で、実質的にマンナン骨格を分解することなく、グ
アガムの如きガラクトマンナンから1,6-α‐D-結合ガラ
クトピラノシル残基を分解出来る。好ましくは、本発明
のα‐ガラクトマンナンガラクトシダーゼ製品は、以下
に説明する活性試験に従い、GALU当り0.01EMANU以下、
好ましくは0.001EMANU以下の測定エンド‐β‐マンナナ
ーゼ活性を実質的に有しない。これ等の数値は実験に基
づいている。何故ならそれ等は目的生成物からエンド‐
β‐マンナナーゼを除去する為広範囲の精製手順を含
み；数値は、所望のゲル化能を有するガラクトマンナン
を製造する為α‐ガラクトマンナンガラクトシダーゼの
使用を許容するのに必要なエンド‐β‐マンナナーゼ含
量の減少程度を表わす。例９で説明する如く精製された
α‐ガラクトマンナンガラクトシダーゼ製品は、所望の
ゲル化能を有するガラクトマンナンを得る為適したもの
であった。
は、比較的高含量のガラクトマンナンを含有する反応媒
質中で、実質的にマンナン骨格を分解することなく、グ
アガムの如きガラクトマンナンから1,6-α‐D-結合ガラ
クトピラノシル残基を分解出来る。好ましくは、本発明
のα‐ガラクトマンナンガラクトシダーゼ製品は、以下
に説明する活性試験に従い、GALU当り0.01EMANU以下、
好ましくは0.001EMANU以下の測定エンド‐β‐マンナナ
ーゼ活性を実質的に有しない。これ等の数値は実験に基
づいている。何故ならそれ等は目的生成物からエンド‐
β‐マンナナーゼを除去する為広範囲の精製手順を含
み；数値は、所望のゲル化能を有するガラクトマンナン
を製造する為α‐ガラクトマンナンガラクトシダーゼの
使用を許容するのに必要なエンド‐β‐マンナナーゼ含
量の減少程度を表わす。例９で説明する如く精製された
α‐ガラクトマンナンガラクトシダーゼ製品は、所望の
ゲル化能を有するガラクトマンナンを得る為適したもの
であった。
酵素の特性は次の通りである：分子量は55,000〜67,000
である。最適pHは４〜６の範囲内にある。pI値は約4.3
である。最適温度は55℃（短い時間）であり及び50℃
（長時間）である。詳しくは例10参照。
である。最適pHは４〜６の範囲内にある。pI値は約4.3
である。最適温度は55℃（短い時間）であり及び50℃
（長時間）である。詳しくは例10参照。
本発明のα‐ガラクトマンナンガラクトシダーゼ製品を
用い、非常に弱いゲルから強いゲルまでの範囲の種々の
程度を有するゲルを形成する能力を有するガラクトマン
ナンが、ガラクトピラノシル基が分裂される程度を適当
に選択することにより形成される。ガラクトピラノシル
基が分裂される程度は、本発明のα‐ガラクトマンナン
ガラクトシダーゼ製品を用いてガラクトマンナンを処理
する時間を調節することにより、更に本発明のα‐ガラ
クトマンナンガラクトシダーゼ製品濃度を適当に選ぶこ
とにより制御出来る。本発明のα‐ガラクトマンナンガ
ラクトシダーゼ製品はガラクトマンナンを基準に少なく
とも10％（重量／重量）を分解出来る。本発明の幾つか
の好ましいα‐ガラクトマンナンガラクトシダーゼ製品
は、実質的にマンナン骨格を分解することなく、20％
（重量／重量）更には50％（重量／重量）のガラクトー
スをガラクトマンナンから分裂させ得る。
用い、非常に弱いゲルから強いゲルまでの範囲の種々の
程度を有するゲルを形成する能力を有するガラクトマン
ナンが、ガラクトピラノシル基が分裂される程度を適当
に選択することにより形成される。ガラクトピラノシル
基が分裂される程度は、本発明のα‐ガラクトマンナン
ガラクトシダーゼ製品を用いてガラクトマンナンを処理
する時間を調節することにより、更に本発明のα‐ガラ
クトマンナンガラクトシダーゼ製品濃度を適当に選ぶこ
とにより制御出来る。本発明のα‐ガラクトマンナンガ
ラクトシダーゼ製品はガラクトマンナンを基準に少なく
とも10％（重量／重量）を分解出来る。本発明の幾つか
の好ましいα‐ガラクトマンナンガラクトシダーゼ製品
は、実質的にマンナン骨格を分解することなく、20％
（重量／重量）更には50％（重量／重量）のガラクトー
スをガラクトマンナンから分裂させ得る。
かくして、インキュベーションは、例えば生成ガラクト
マンナン中のガラクトース含量が最初のガラクトース含
量の１〜50％（重量／重量）、特に10〜25％（重量／重
量）に達した時停止し得る。何故なら、本発明のα‐ガ
ラクトマンナンガラクトシダーゼ製品は本質的にエンド
‐β‐マンナナーゼ活性を有さず、実質的にマンナン骨
格を分解することなくガラクトマンナンからガラクトピ
ラノシル残基を分裂出来る。このことは一方では、少な
くとも50,000、好ましくは少なくとも500,000、最も好
ましくは少なくとも1,000,000の平均分子量を有し、更
に一方では所望のゲル化能を有するガラクトマンナンを
調製出来ることを意味する。換言すれば、低分子量を有
するガラクトマンナンは非常に低い或いは全くゲル化能
を示さない。
マンナン中のガラクトース含量が最初のガラクトース含
量の１〜50％（重量／重量）、特に10〜25％（重量／重
量）に達した時停止し得る。何故なら、本発明のα‐ガ
ラクトマンナンガラクトシダーゼ製品は本質的にエンド
‐β‐マンナナーゼ活性を有さず、実質的にマンナン骨
格を分解することなくガラクトマンナンからガラクトピ
ラノシル残基を分裂出来る。このことは一方では、少な
くとも50,000、好ましくは少なくとも500,000、最も好
ましくは少なくとも1,000,000の平均分子量を有し、更
に一方では所望のゲル化能を有するガラクトマンナンを
調製出来ることを意味する。換言すれば、低分子量を有
するガラクトマンナンは非常に低い或いは全くゲル化能
を示さない。
本発明のα‐ガラクトマンナンガラクトシダーゼ製品に
よりガラクトマンナンを処理することは、好ましくは少
なくとも１％（重量／重量）、好ましくは少なくとも２
％（重量／重量）、最も好ましくは少なくとも30％（重
量／重量）のガラクトマンナンを含有する反応媒質中で
好ましく行われる。多量のガラクトマンナンを含有する
反応媒質の使用は、経済的条件に対して好ましい。反応
媒質は好ましくは水性である。
よりガラクトマンナンを処理することは、好ましくは少
なくとも１％（重量／重量）、好ましくは少なくとも２
％（重量／重量）、最も好ましくは少なくとも30％（重
量／重量）のガラクトマンナンを含有する反応媒質中で
好ましく行われる。多量のガラクトマンナンを含有する
反応媒質の使用は、経済的条件に対して好ましい。反応
媒質は好ましくは水性である。
最も重要なガラクトマンナンの例は、グアガラクトマン
ナン（シナポシステトラゴノリバス（Cyanaposis tetra
gonolibus）から得られる）及びロカスト ビーム（loc
ust bean）ガム（セーラトニア シルカ（Ceratonia si
liqua）から得られる）である。別の例は、Adv.Carbohy
dr.Chem.Biochem.35（1978）,341頁以降に示される。普
通のガラクトマンナンは、約20〜50％（重量／重量）ガ
ラクトース、しばしば約35〜45％（重量／重量）ガラク
トースを含有する。グアガラクトマンナンは約35％のガ
ラクトース及び62％のD-マンノースを含有し、更に分子
量は約16×105〜22×105を有すると考えられている。ロ
キュストビーンガムは約20〜25％（重量／重量）のガラ
クトース並びに約75〜80％（重量／重量）のマンノース
を含有し、更に約11×105〜16×105の分子量を有すると
考えられている。
ナン（シナポシステトラゴノリバス（Cyanaposis tetra
gonolibus）から得られる）及びロカスト ビーム（loc
ust bean）ガム（セーラトニア シルカ（Ceratonia si
liqua）から得られる）である。別の例は、Adv.Carbohy
dr.Chem.Biochem.35（1978）,341頁以降に示される。普
通のガラクトマンナンは、約20〜50％（重量／重量）ガ
ラクトース、しばしば約35〜45％（重量／重量）ガラク
トースを含有する。グアガラクトマンナンは約35％のガ
ラクトース及び62％のD-マンノースを含有し、更に分子
量は約16×105〜22×105を有すると考えられている。ロ
キュストビーンガムは約20〜25％（重量／重量）のガラ
クトース並びに約75〜80％（重量／重量）のマンノース
を含有し、更に約11×105〜16×105の分子量を有すると
考えられている。
ガラクトマンナンでゲル化した製品の特別な例は、食品
及び飼料製品、例えばソフトドリンク、パン製造所のゼ
リー及びインスタントのチョコレートパディング（Food
Technol.27（1973）,26頁以降参照）及びペット飼料で
ある。
及び飼料製品、例えばソフトドリンク、パン製造所のゼ
リー及びインスタントのチョコレートパディング（Food
Technol.27（1973）,26頁以降参照）及びペット飼料で
ある。
本発明のα‐ガラクトマンナンガラクトシダーゼ製品
は、微生物、例えばα‐ガラクトマンナンガラクトシダ
ーゼ生産菌類又は細菌、好ましくは菌類を表面培養又は
液内培養し、次いで通常の手法による酵素回収により得
ることが出来る。
は、微生物、例えばα‐ガラクトマンナンガラクトシダ
ーゼ生産菌類又は細菌、好ましくは菌類を表面培養又は
液内培養し、次いで通常の手法による酵素回収により得
ることが出来る。
使用すべき微生物はその選択に対し次の四つの基準を用
い、当業者により選択することが出来る： １）微生物により生産される酵素はα‐ガラクトシダー
ゼ活性を有さなければならない；下記のp-ニトロフェニ
ル‐α‐D-ガラクトピラノシドに対する活性試験を参
照； ２）微生物により生産される酵素は、下記の例８に記載
した寒天Ｇを用いるスクリーニング試験により、少なく
とも0.3gガラクトース／リットル×時間×GALUの開始速
度を有さなければならない。
い、当業者により選択することが出来る： １）微生物により生産される酵素はα‐ガラクトシダー
ゼ活性を有さなければならない；下記のp-ニトロフェニ
ル‐α‐D-ガラクトピラノシドに対する活性試験を参
照； ２）微生物により生産される酵素は、下記の例８に記載
した寒天Ｇを用いるスクリーニング試験により、少なく
とも0.3gガラクトース／リットル×時間×GALUの開始速
度を有さなければならない。
３）微生物により生産される酵素は、GALU当り0.01EMAN
U以下のエンド‐β‐マンナナーゼ活性を有さなければ
らない、下記の活性試験参照。
U以下のエンド‐β‐マンナナーゼ活性を有さなければ
らない、下記の活性試験参照。
４）微生物により生産される酵素は、下記の例10で記載
する試験方法を用い、ゲルが形成されるようなグアガム
のゲル化能を改良することが出来るものでなければなら
ない。
する試験方法を用い、ゲルが形成されるようなグアガム
のゲル化能を改良することが出来るものでなければなら
ない。
表面培養は、同化性窒素源及び炭素源並びに必須の栄養
源を含む半固体培地上で行われる。
源を含む半固体培地上で行われる。
液内培養は、同化性窒素源及び炭素源並びに必須の栄養
源を含む発酵培地中好気性条件下で行われる。pH値、温
度、通気及び攪拌の如き詳細事項は、当業者により容易
に選択出来る。
源を含む発酵培地中好気性条件下で行われる。pH値、温
度、通気及び攪拌の如き詳細事項は、当業者により容易
に選択出来る。
本発明で例示したα‐ガラクトマンナンガラクトシダー
ゼは、周知の種、即ちペニシリウムクリゾゲナム（Peni
cillium chrysogenum）、ペニシリウムイスランジカム
（Penicillium islandicum）及びペニシリウムノタタム
（Penicillium notatum）の菌株により得られる細胞外
酵素である。例示的な菌株は、それぞれDSM3214、DSM32
15及びDSM3216である。
ゼは、周知の種、即ちペニシリウムクリゾゲナム（Peni
cillium chrysogenum）、ペニシリウムイスランジカム
（Penicillium islandicum）及びペニシリウムノタタム
（Penicillium notatum）の菌株により得られる細胞外
酵素である。例示的な菌株は、それぞれDSM3214、DSM32
15及びDSM3216である。
回収したα‐ガラクトマンナンガラクトシダーゼは、そ
のまゝ用いることが出来或いは又例えばイオン交換クロ
マトグラフィー法、分別沈殿又はゲル濾過により、特に
エンド‐β‐マンナナーゼを除去する為精製することが
出来る。好ましくは、本発明のα‐ガラクトマンナンガ
ラクトシダーゼ製品は、酵素溶液の活性度において約25
0GALU/mlを超え（これは培養物中にこれまで見られたも
のよりもはるかに高い濃度である）又は固体形である場
合は250GALU/gを超えるであろう。
のまゝ用いることが出来或いは又例えばイオン交換クロ
マトグラフィー法、分別沈殿又はゲル濾過により、特に
エンド‐β‐マンナナーゼを除去する為精製することが
出来る。好ましくは、本発明のα‐ガラクトマンナンガ
ラクトシダーゼ製品は、酵素溶液の活性度において約25
0GALU/mlを超え（これは培養物中にこれまで見られたも
のよりもはるかに高い濃度である）又は固体形である場
合は250GALU/gを超えるであろう。
α‐ガラクトマンナンガラクトシダーゼは、突然変異し
た菌株からも得ることが出来、その結果はそれ等は微量
のエンド‐β‐マンナナーゼを生産するか又は全く生産
しない。菌株を突然変異せしめる方法は、当業者により
周知であり、例えば紫外線照射及び化学的変然変異誘発
物質を用いる方法である。
た菌株からも得ることが出来、その結果はそれ等は微量
のエンド‐β‐マンナナーゼを生産するか又は全く生産
しない。菌株を突然変異せしめる方法は、当業者により
周知であり、例えば紫外線照射及び化学的変然変異誘発
物質を用いる方法である。
本発明を更に次の実施例により説明するが、本発明はこ
れに制限されるものではない。実施例は幾つかの本発明
の好ましい態様を説明している。記号「TM」は商標であ
ることを示している。
れに制限されるものではない。実施例は幾つかの本発明
の好ましい態様を説明している。記号「TM」は商標であ
ることを示している。
本発明に係るα‐ガラクトマンナンガラクトシダーゼ製
品を製造する為、下記の例１〜６に従って得られた製品
は例９で記載した如く更に精製された。
品を製造する為、下記の例１〜６に従って得られた製品
は例９で記載した如く更に精製された。
例１〜３で使用する菌株は1985年１月にドイツ国ザンム
ルグホンミクロオルガニズメン（DSM）に寄託された。
ルグホンミクロオルガニズメン（DSM）に寄託された。
菌株の培養 α‐ガラクトマンナンガラクトシダーゼ生産菌株を、１
当り次の成分を含有する軟寒天上で増殖させる:40gの
酵母エキス、1.0gの燐酸二水素カリウム、0.1gの硫酸マ
グネシウム七水和物、15gのグルコース及び20gのバクト
TM（ディフコ ラボラトリィ，デトロイト，米国）寒
天。この物質を121℃で20分間又は40分間オートクレイ
ブ処理し、以下にYPGと称する。α‐ガラクトシダーゼ
に対する活性試験 試験の原理は、α‐ガラクトシダーゼが無色のp-ニトロ
フェニル‐α‐D-ガラクトピラノシド（以下にp-NPGal
と称する）と加水分解し、アルカリの場合黄色であるp-
ニトロフェノールを生成することである。１α‐ガラク
トシダーゼ単位（以下GALUと称する）は、次の標準条件
のもとで毎分１μmolのp-NPGalを加水分解する酵素の量
である：基質:0.80mMのp-NPGal、pH:5.5（0.0333Mのア
セテート緩衝液）、温度:37℃及び反応時間:15分。生じ
た色を、波長405nmで分光光度計により測定する。
当り次の成分を含有する軟寒天上で増殖させる:40gの
酵母エキス、1.0gの燐酸二水素カリウム、0.1gの硫酸マ
グネシウム七水和物、15gのグルコース及び20gのバクト
TM（ディフコ ラボラトリィ，デトロイト，米国）寒
天。この物質を121℃で20分間又は40分間オートクレイ
ブ処理し、以下にYPGと称する。α‐ガラクトシダーゼ
に対する活性試験 試験の原理は、α‐ガラクトシダーゼが無色のp-ニトロ
フェニル‐α‐D-ガラクトピラノシド（以下にp-NPGal
と称する）と加水分解し、アルカリの場合黄色であるp-
ニトロフェノールを生成することである。１α‐ガラク
トシダーゼ単位（以下GALUと称する）は、次の標準条件
のもとで毎分１μmolのp-NPGalを加水分解する酵素の量
である：基質:0.80mMのp-NPGal、pH:5.5（0.0333Mのア
セテート緩衝液）、温度:37℃及び反応時間:15分。生じ
た色を、波長405nmで分光光度計により測定する。
更にこの方法の詳細はノボインダストリィ社から1984年
11月29日付けの小冊子AF204/2GBに説明している。
11月29日付けの小冊子AF204/2GBに説明している。
エンド‐β‐マンナナーゼの活性試験 エンド‐β‐マンナナーゼ活性を、標準としてゲマナー
ゼTM1.5L（ノボインダストリィ社）を用いロキュストビ
ーンガムの粘度に関する減少効果により測定した。方法
は、ノボインダストリィ社からの1975年９月16日付けの
小冊子AF156/1GBに説明している。この小冊子において
言及した活性単位はHCUと呼ばれる。ゲマナーゼ1.5Lの
活性は、1,500,000HCU/gである。放出された還元糖の量
を、ソモギィネルソン法（J.Biol.Chem.153（1944）,37
5）を用い更に標準としてマンノースを用いて分析する
ことにより、1HCUは0.011EMANUに対応することが判明
し、こゝにおいて1EMANUは50℃でかつpH5.0で毎分ロカ
ストビームガムから１マイクロモルのマンノース当量を
放出させるエンド‐β‐マンナナーゼ量として定義され
る。
ゼTM1.5L（ノボインダストリィ社）を用いロキュストビ
ーンガムの粘度に関する減少効果により測定した。方法
は、ノボインダストリィ社からの1975年９月16日付けの
小冊子AF156/1GBに説明している。この小冊子において
言及した活性単位はHCUと呼ばれる。ゲマナーゼ1.5Lの
活性は、1,500,000HCU/gである。放出された還元糖の量
を、ソモギィネルソン法（J.Biol.Chem.153（1944）,37
5）を用い更に標準としてマンノースを用いて分析する
ことにより、1HCUは0.011EMANUに対応することが判明
し、こゝにおいて1EMANUは50℃でかつpH5.0で毎分ロカ
ストビームガムから１マイクロモルのマンノース当量を
放出させるエンド‐β‐マンナナーゼ量として定義され
る。
例１ ａ）酵素の調製 振とうフラスコ用基質を、１リットル当り次の成分で調
製した:20gのコーンスティープリカー（コーンプロダク
ト社）、10gの硝酸アンモニウム、10gの燐酸二水素カリ
ウム、1gの硫酸マグネシウム七水和物、10gのグアガム
エクストラLK（NDHノルディスク ドゥローゲハンデレ
ス社、デンマーク）、0.1gのプルロニックTML61（BAS
F、ドイツ連邦共和国）、5gの炭酸カルシウム及び水道
水。pHを6.5に調節し次いで121℃で40分間殺菌を行っ
た。100mlの基質を有する500mlのエルレンマイヤ フラ
スコに、ペニシリウム クリゾゲナム（Penicillium ch
rysogenum）DSM3214で予め接種したYPG軟寒天からの約1
07個胞子で接種した。フラスコを230rpm及び30℃で３日
間又は４日間振とうし、しかる後発酵プロスを遠心分離
した。α‐ガラクトマンナンガラクトシダーゼを有する
上澄みを菌糸から分離した。菌糸を捨て次いで上澄みを
α‐ガラクトシダーゼに対し分析した。これ等の条件の
もとで菌株は10GALU/mlを与えた。
製した:20gのコーンスティープリカー（コーンプロダク
ト社）、10gの硝酸アンモニウム、10gの燐酸二水素カリ
ウム、1gの硫酸マグネシウム七水和物、10gのグアガム
エクストラLK（NDHノルディスク ドゥローゲハンデレ
ス社、デンマーク）、0.1gのプルロニックTML61（BAS
F、ドイツ連邦共和国）、5gの炭酸カルシウム及び水道
水。pHを6.5に調節し次いで121℃で40分間殺菌を行っ
た。100mlの基質を有する500mlのエルレンマイヤ フラ
スコに、ペニシリウム クリゾゲナム（Penicillium ch
rysogenum）DSM3214で予め接種したYPG軟寒天からの約1
07個胞子で接種した。フラスコを230rpm及び30℃で３日
間又は４日間振とうし、しかる後発酵プロスを遠心分離
した。α‐ガラクトマンナンガラクトシダーゼを有する
上澄みを菌糸から分離した。菌糸を捨て次いで上澄みを
α‐ガラクトシダーゼに対し分析した。これ等の条件の
もとで菌株は10GALU/mlを与えた。
ｂ）酵素の精製 １の培養ブロスを、直径11cmのブフナ−ロート上ガラ
ス繊維フィルター（ホワットマンTMGF/D及びGF/F）で濾
過した。濾液を、分子量10,000でカットオフを有するア
ミコンTMホローファイバーカートリッジ（H1P10）を用
い振透により350mlに濃縮し、しかる後濃縮液を、コン
ダクタンスが3mSi（ミリジーメンス）になるまで脱イオ
ン水で洗浄した。しかる後、濃縮液を、GR81PPメンブラ
ン（デダンスケズッケルファブリッケル，デンマーク）
を備えかつ分子量6,000でカットオフを有するアミコン
TMセルを用い50mlに濃縮した。得られたコンセントレー
トのpHを7.0に調節した。
ス繊維フィルター（ホワットマンTMGF/D及びGF/F）で濾
過した。濾液を、分子量10,000でカットオフを有するア
ミコンTMホローファイバーカートリッジ（H1P10）を用
い振透により350mlに濃縮し、しかる後濃縮液を、コン
ダクタンスが3mSi（ミリジーメンス）になるまで脱イオ
ン水で洗浄した。しかる後、濃縮液を、GR81PPメンブラ
ン（デダンスケズッケルファブリッケル，デンマーク）
を備えかつ分子量6,000でカットオフを有するアミコン
TMセルを用い50mlに濃縮した。得られたコンセントレー
トのpHを7.0に調節した。
DEAE-トリスアクリルイオン交換カラムを、50mMトリス
緩衝液（pH7.0）で平衝化させた。（トリスはトリス
（ヒドロメキシメチル）アミノメタンである）。200ml
のイオン交換体を、直径5cmのカラムに詰め更にカラム
を毎時間320mlの流速を有するように充填した。ガラス
フィルターからの濾液についてイオン交換を行い次いで
分画を集めた。α‐ガラクトマンナンガラクトシダーゼ
はこのイオン交換体に弱く結合し次いでトリス緩衝液を
洗浄した後又は塩化ナトリウム勾配法のいずれかにより
溶出させた。分画中のα‐ガラクトマンナンガラクトシ
ダーゼの活性度を測定し次いでこの活性度を有する蛋白
含有フラクションを集め次いで濃縮した。
緩衝液（pH7.0）で平衝化させた。（トリスはトリス
（ヒドロメキシメチル）アミノメタンである）。200ml
のイオン交換体を、直径5cmのカラムに詰め更にカラム
を毎時間320mlの流速を有するように充填した。ガラス
フィルターからの濾液についてイオン交換を行い次いで
分画を集めた。α‐ガラクトマンナンガラクトシダーゼ
はこのイオン交換体に弱く結合し次いでトリス緩衝液を
洗浄した後又は塩化ナトリウム勾配法のいずれかにより
溶出させた。分画中のα‐ガラクトマンナンガラクトシ
ダーゼの活性度を測定し次いでこの活性度を有する蛋白
含有フラクションを集め次いで濃縮した。
蛋白を濃縮し次いで低分子量成分を、分子量10,000でカ
ットオフを有するアミコンTMホローファイバーカートリ
ッジ（H1P10）で洗浄した。
ットオフを有するアミコンTMホローファイバーカートリ
ッジ（H1P10）で洗浄した。
得られた10mlの酵素溶液を、α‐ガラクトマンナンガラ
クトシダーゼ及びエンド‐β‐マンナナーゼの活性を測
定することにより分析した。得られた活性度はそれぞれ
300GALU/ml及び23EMANU/ml（2100HCU/ml）であった。
クトシダーゼ及びエンド‐β‐マンナナーゼの活性を測
定することにより分析した。得られた活性度はそれぞれ
300GALU/ml及び23EMANU/ml（2100HCU/ml）であった。
例２ 例1aで説明したと同じ手順を用いた。但し、使用した菌
株はペニシリウムイスランジカム（Penicillium island
icum）DSM3215であった。収量は17GALU/mlであった。
株はペニシリウムイスランジカム（Penicillium island
icum）DSM3215であった。収量は17GALU/mlであった。
例1bで記載した手順を用い1.4リットルの培養ブロスを
精製し、活性度540GALU/ml及び32EMANU/ml（2900HCU/m
l）を有する部分精製酵素溶液18mlを得た。
精製し、活性度540GALU/ml及び32EMANU/ml（2900HCU/m
l）を有する部分精製酵素溶液18mlを得た。
例３ 例1aで記載したと同じ手順を用いた。但し使用した菌株
はペニシリウムノタタム（Penicillum notatum）DSM321
6であった。収量は4GALU/mlであった。
はペニシリウムノタタム（Penicillum notatum）DSM321
6であった。収量は4GALU/mlであった。
例1bで記載した手順を用い1.1リットルの培養ブロスを
精製し、活性度300GALU/ml及び8EMANU/ml（700HCU/ml）
を有する部分精製酵素溶液18mlを得た。
精製し、活性度300GALU/ml及び8EMANU/ml（700HCU/ml）
を有する部分精製酵素溶液18mlを得た。
例４ ａ）酵素の調製 この例は、パイロットプラントの発酵機内での、ペニリ
シウム クリゾゲナムによるα‐ガラクトマンナンガラ
クトシダーゼの生産を説明する。種培養物は次の培地１
リットルから成り立っていた:50gの大豆糖みつ（エルフ
スオリファブリック、デンマーク）、20gの硫酸アンモ
ニウム、10gの燐酸二水素カリウム、1gの硫酸マグネシ
ウム、5gの炭酸カルシウム及び0.5gのプルロニック。pH
を6.5に調節し次いで培地を、125℃で40分間３リットル
のエルレンマイヤーフラスコ内で殺菌した。30℃に冷却
後、培地に、既に30℃で７日間接種したYPG軟寒天から
のペニシリウムクリゾゲナムの胞子で接種した。フラス
コを30℃で２日間振とうした。800mlのこの種培養物
を、400gの大豆糖みつ、160gの硫酸アンモニウム、80g
の燐酸二水素カリウム、8gの硫酸マグネシウム七水和
物、40gの炭酸カルシウム、3gのプルロニック及び８リ
ットルの容積にした水を含有する主発酵機に移した。pH
を6.5に調節し次いで培地を125℃で120分間殺菌した。1
5％燐酸100mlを別に125℃で30分間滅菌し次いで発酵中p
Hを調節する為用いた。接種後、通気（８リットル／
分）を開始した。520〜830rpmの速度で攪拌も開始し
た。温度を30℃の一定に保った。発酵を65時間維持した
がこの時間においてpHは6.7から7.02に上昇した。しか
る後タンクを冷却し次いで菌糸を遠心分離により分離し
た。上澄み液を分析し次いで活性度3GALU/mlを得た。
シウム クリゾゲナムによるα‐ガラクトマンナンガラ
クトシダーゼの生産を説明する。種培養物は次の培地１
リットルから成り立っていた:50gの大豆糖みつ（エルフ
スオリファブリック、デンマーク）、20gの硫酸アンモ
ニウム、10gの燐酸二水素カリウム、1gの硫酸マグネシ
ウム、5gの炭酸カルシウム及び0.5gのプルロニック。pH
を6.5に調節し次いで培地を、125℃で40分間３リットル
のエルレンマイヤーフラスコ内で殺菌した。30℃に冷却
後、培地に、既に30℃で７日間接種したYPG軟寒天から
のペニシリウムクリゾゲナムの胞子で接種した。フラス
コを30℃で２日間振とうした。800mlのこの種培養物
を、400gの大豆糖みつ、160gの硫酸アンモニウム、80g
の燐酸二水素カリウム、8gの硫酸マグネシウム七水和
物、40gの炭酸カルシウム、3gのプルロニック及び８リ
ットルの容積にした水を含有する主発酵機に移した。pH
を6.5に調節し次いで培地を125℃で120分間殺菌した。1
5％燐酸100mlを別に125℃で30分間滅菌し次いで発酵中p
Hを調節する為用いた。接種後、通気（８リットル／
分）を開始した。520〜830rpmの速度で攪拌も開始し
た。温度を30℃の一定に保った。発酵を65時間維持した
がこの時間においてpHは6.7から7.02に上昇した。しか
る後タンクを冷却し次いで菌糸を遠心分離により分離し
た。上澄み液を分析し次いで活性度3GALU/mlを得た。
ｂ）酵素の精製 11リットルの培養ブロスを、140gの多孔質珪藻土を用い
濾布上で濾過し次いで液体を直径40cmの磁器ロートを用
いて吸収させた。
濾布上で濾過し次いで液体を直径40cmの磁器ロートを用
いて吸収させた。
振透による濃縮を、分子量10,000でカットオフを有する
メリポアTMペリカンカセットで行った。用いたフィルタ
ータイプは番号PTGC00005のポリスルホンであった。こ
れにより、11リットルを１リットルに濃縮した。コンダ
クタンスが3mSi以下になるまで脱イオン水で洗浄を行っ
た。
メリポアTMペリカンカセットで行った。用いたフィルタ
ータイプは番号PTGC00005のポリスルホンであった。こ
れにより、11リットルを１リットルに濃縮した。コンダ
クタンスが3mSi以下になるまで脱イオン水で洗浄を行っ
た。
振とうにより濃縮した溶液を凍結し次いで溶かし、しか
る後pHを7.0に調節した。溶液をガラスフィルター（ホ
ワットマンTMGF/D）で濾過した。
る後pHを7.0に調節した。溶液をガラスフィルター（ホ
ワットマンTMGF/D）で濾過した。
しかる後、濾液をGEAE-トリスアクリルカラムでイオン
交換クロマトグラフィーに委ね、続いて例1bで記載した
と同様にアミコンホローファイバーカートリッジ（PDP1
0）を用いて濃縮した。これにより、活性度20GALU/ml及
び3EMANU/ml以下（250HCU/ml以下）を有する部分精製酵
素溶液160mlを得た。
交換クロマトグラフィーに委ね、続いて例1bで記載した
と同様にアミコンホローファイバーカートリッジ（PDP1
0）を用いて濃縮した。これにより、活性度20GALU/ml及
び3EMANU/ml以下（250HCU/ml以下）を有する部分精製酵
素溶液160mlを得た。
例５ この例はパイロットプラント発酵機内でプニシリウムイ
スランジカムによるα‐ガラクトマンナンガラクトシダ
ーゼの製造を説明する。
スランジカムによるα‐ガラクトマンナンガラクトシダ
ーゼの製造を説明する。
菌種をYPG寒天斜面上で１週間30℃で培養した。斜面か
らの胞子を、以下の組成の１リットル培地から成る種発
酵機に接種する為用いた:20gのコーンスティーブ リカ
ー、10gの硝酸アンモニウム、10gの燐酸二水素カリウ
ム、5gの炭酸カルシウム、20gのラフィノース、1gの硫
酸マグネシウム七水和物、0.1gのプルロニック及び１リ
ットル量までの水道水。pHを6.5に調節した。培地を125
℃で60分間殺菌した。種培養物を30℃で２日間230rpmで
振とうした。この種培養物800mlを、次の基質８リット
ルから成る主発酵機に接種する為用いた:160gのコーン
スティーブ リカー、80gの硝酸アンモニウム、80gの燐
酸二水素カリウム、8gの硫酸マグネシウム七水和物、16
0gのラフィノース、40gの炭酸カルシウム、1gのプルロ
ニック及び８リットル量までの水道水。pHを6.5に調節
した。培地を125℃で120分間殺菌した。温度を30℃に下
げた時、種培養物800mlで接種した。温度を30℃に保持
し、620rpmで攪拌し、圧力を0.5気圧で保持し、通気は
８リットル／分であり更にpHは6.45から5.9に降下し
た。90時間後、発酵を停止し、冷却し次いで遠心分離し
た。上澄み液は7GALU/mlを含有していた。
らの胞子を、以下の組成の１リットル培地から成る種発
酵機に接種する為用いた:20gのコーンスティーブ リカ
ー、10gの硝酸アンモニウム、10gの燐酸二水素カリウ
ム、5gの炭酸カルシウム、20gのラフィノース、1gの硫
酸マグネシウム七水和物、0.1gのプルロニック及び１リ
ットル量までの水道水。pHを6.5に調節した。培地を125
℃で60分間殺菌した。種培養物を30℃で２日間230rpmで
振とうした。この種培養物800mlを、次の基質８リット
ルから成る主発酵機に接種する為用いた:160gのコーン
スティーブ リカー、80gの硝酸アンモニウム、80gの燐
酸二水素カリウム、8gの硫酸マグネシウム七水和物、16
0gのラフィノース、40gの炭酸カルシウム、1gのプルロ
ニック及び８リットル量までの水道水。pHを6.5に調節
した。培地を125℃で120分間殺菌した。温度を30℃に下
げた時、種培養物800mlで接種した。温度を30℃に保持
し、620rpmで攪拌し、圧力を0.5気圧で保持し、通気は
８リットル／分であり更にpHは6.45から5.9に降下し
た。90時間後、発酵を停止し、冷却し次いで遠心分離し
た。上澄み液は7GALU/mlを含有していた。
例4bで記載した手順を用い培養ブロス８リットルを精製
し、活性度60GALU/ml及び1.4EMANU/ml（130HCU/ml）を
有する部分精製酵素溶液500mlを得た。
し、活性度60GALU/ml及び1.4EMANU/ml（130HCU/ml）を
有する部分精製酵素溶液500mlを得た。
例６ この例において、α‐ガラクトマンナンガラクトシダー
ゼをペニシリウムノタタムを用いて製造した。菌種をYP
G寒天斜面上で30℃で１週間増殖させた。胞子を、次の
組成を有する基質１リットルに接種する為用いた:20gの
コーンスティーブ リカー、10gの硝酸アンモニウム、1
0gの燐酸二水素カリウム、1gの硫酸マグネシウム七水和
物、5gのグアガム、20gのラフィノース、5gの炭酸カル
シウム、0.1gのプルロニック及び１リットル量までの水
道水。pHを6.5に調節し次いで培地を125℃で40分間殺菌
した。フラスコを230rpmで２日間30℃で振とうし、しか
る後800mlを次の基質を含む主発酵機に接種する為用い
た:160gのコーンスティーブ リカー、80gの硝酸アンモ
ニウム、80gの燐酸二水素カリウム、8gの硫酸マグネシ
ウム七水和物、40gのグアガム、40gの炭酸カルシウム、
160gのラフィノース、1gのプルロニック及び８リットル
量までの水道水。pHを6.5に調節した。89時間増殖を保
持し、この間pHは6.25から6.95に上昇した。通気は８リ
ットル／分であり、圧力は0.5気圧であり攪拌は520〜83
0rpmであった。発酵が終了すると、タンクを冷却し次い
でブロスを遠心分離し菌糸を除去した。上澄み液は13GA
LU/mlを有した。
ゼをペニシリウムノタタムを用いて製造した。菌種をYP
G寒天斜面上で30℃で１週間増殖させた。胞子を、次の
組成を有する基質１リットルに接種する為用いた:20gの
コーンスティーブ リカー、10gの硝酸アンモニウム、1
0gの燐酸二水素カリウム、1gの硫酸マグネシウム七水和
物、5gのグアガム、20gのラフィノース、5gの炭酸カル
シウム、0.1gのプルロニック及び１リットル量までの水
道水。pHを6.5に調節し次いで培地を125℃で40分間殺菌
した。フラスコを230rpmで２日間30℃で振とうし、しか
る後800mlを次の基質を含む主発酵機に接種する為用い
た:160gのコーンスティーブ リカー、80gの硝酸アンモ
ニウム、80gの燐酸二水素カリウム、8gの硫酸マグネシ
ウム七水和物、40gのグアガム、40gの炭酸カルシウム、
160gのラフィノース、1gのプルロニック及び８リットル
量までの水道水。pHを6.5に調節した。89時間増殖を保
持し、この間pHは6.25から6.95に上昇した。通気は８リ
ットル／分であり、圧力は0.5気圧であり攪拌は520〜83
0rpmであった。発酵が終了すると、タンクを冷却し次い
でブロスを遠心分離し菌糸を除去した。上澄み液は13GA
LU/mlを有した。
例4bで記載した手順を用い7.5リットルの培養ブロスを
精製し、活性度660GALU/ml及び93EMANU/ml（8400HCU/m
l）有する部分精製酵素溶液40mlを得た。
精製し、活性度660GALU/ml及び93EMANU/ml（8400HCU/m
l）有する部分精製酵素溶液40mlを得た。
例７ この例は以下にグアＧと称した標準基質の生成を説明す
る。この基質は完全なマンナン骨格を有するガラクトマ
ンナンを攻撃する能力を欠いているα‐ガラクトシダー
ゼからα‐ガラクトマンナンガラクトシダーゼを区別す
る為好ましく適合している。
る。この基質は完全なマンナン骨格を有するガラクトマ
ンナンを攻撃する能力を欠いているα‐ガラクトシダー
ゼからα‐ガラクトマンナンガラクトシダーゼを区別す
る為好ましく適合している。
１リットルの水道水を75℃に加熱し次いで10gのグア粉
を攪拌しながら添加した。16mlのガマナーゼ（Gamanas
e）1.5Lを添加し次いでpHを5.0に調節した。190gのグア
粉を攪拌しながら一時間添加した。D-ガラクトピラノシ
ル基により保護されていないガラクトマンナンの領域
を、これ等の条件のもとでゲマナーゼに存在するエンド
‐β‐マンナナーゼにより分解させ次いで存在するα‐
ガラクトマンナンガラクトシダーゼを75℃で熱不活性化
した。加水分解を煮沸により停止した。変性したグアＧ
を、96％（重量／量）アルコール500mlを用いて沈殿す
ることにより精製し、濾過し次いで乾燥した。収率のグ
アG140gであった。
を攪拌しながら添加した。16mlのガマナーゼ（Gamanas
e）1.5Lを添加し次いでpHを5.0に調節した。190gのグア
粉を攪拌しながら一時間添加した。D-ガラクトピラノシ
ル基により保護されていないガラクトマンナンの領域
を、これ等の条件のもとでゲマナーゼに存在するエンド
‐β‐マンナナーゼにより分解させ次いで存在するα‐
ガラクトマンナンガラクトシダーゼを75℃で熱不活性化
した。加水分解を煮沸により停止した。変性したグアＧ
を、96％（重量／量）アルコール500mlを用いて沈殿す
ることにより精製し、濾過し次いで乾燥した。収率のグ
アG140gであった。
例８ この例は開始速度、即ち標準スクリーン物質、グアＧ
（例７参照）からガラクトースの遊離を説明する。
（例７参照）からガラクトースの遊離を説明する。
全ての試験部分精製酵素、50mM酢酸ナトリウム緩衝液
（pH5.5）中に希釈し次いで、４％（重量／量）の濃度
でグアＧと共に30及び60分間45℃でインキュベートし
た。ガラクトースの遊離は、ベーリンガーマンハイムの
酵素的にガラクトースUV法を用いキットで測定した。
（pH5.5）中に希釈し次いで、４％（重量／量）の濃度
でグアＧと共に30及び60分間45℃でインキュベートし
た。ガラクトースの遊離は、ベーリンガーマンハイムの
酵素的にガラクトースUV法を用いキットで測定した。
得られた結果を第１表に示す 0.05GALU/mlの濃度でコーヒー豆α‐ガラクトシダーゼ
（ジグマNo.G8507）を試験すると、開始速度は0.5gガラ
クトース／（リットル×時間×GALU）であった。
（ジグマNo.G8507）を試験すると、開始速度は0.5gガラ
クトース／（リットル×時間×GALU）であった。
0.05GALU/mlの濃度でシグマ（No.G9007）から得られた
アスペルギルスニガー‐α‐ガラクトシダーゼを用いる
と、開始速度はこの試験において0.5gガラクトース／
（リットル×時間×GALU）以下であった。
アスペルギルスニガー‐α‐ガラクトシダーゼを用いる
と、開始速度はこの試験において0.5gガラクトース／
（リットル×時間×GALU）以下であった。
又次の菌類α‐ガラクトシダーゼはこの試験においてグ
アＧからガラクトースを遊離させることは出来なかっ
た：アスペルギルス アクレアトゥス（Aspergillus a
culeateus），アスペルギルス オリゲ（Aspergillus
oryzae），セファロスポリウム アクレモニウム（Ceph
alosporium acremonium），フォメス ウングレアトゥ
ス（Fomes unguleatus），イルペックス ラクテウス
（Irpex lacteus），ペニシリウム アクレアトゥム
（Penicillum aculeatum），ペニシリウム アダメツ
（Penicillium adametzi），ペニシリウム クラスト
スム（Penicillium crustosum），ペニシリウム メリ
ニイー（Penicillium mellinii），ペニシリウム オ
キサリカム（Penicillium oxalicum），ペニシリウム
シムプリシシマム（Penicillium simplicissimu
m），ピクノポラス シンナバリウム（Pycnoporus cin
nabarius），ピクノポラス コシナス（Pycnoporus co
ccinus），ピクノポラス ザングイネウス（Pycnoprus
sanguineus），ストプトマイセス リバニイ（Strept
omyces libani），ストレプトマイセス ジオヤンシス
（Streptomyces sioyaensis），トラメテス ヒルスイ
タ（Trametes hirsuita）及びトリコジルマ ハルジア
ナム（Tricoderma harzianum）。
アＧからガラクトースを遊離させることは出来なかっ
た：アスペルギルス アクレアトゥス（Aspergillus a
culeateus），アスペルギルス オリゲ（Aspergillus
oryzae），セファロスポリウム アクレモニウム（Ceph
alosporium acremonium），フォメス ウングレアトゥ
ス（Fomes unguleatus），イルペックス ラクテウス
（Irpex lacteus），ペニシリウム アクレアトゥム
（Penicillum aculeatum），ペニシリウム アダメツ
（Penicillium adametzi），ペニシリウム クラスト
スム（Penicillium crustosum），ペニシリウム メリ
ニイー（Penicillium mellinii），ペニシリウム オ
キサリカム（Penicillium oxalicum），ペニシリウム
シムプリシシマム（Penicillium simplicissimu
m），ピクノポラス シンナバリウム（Pycnoporus cin
nabarius），ピクノポラス コシナス（Pycnoporus co
ccinus），ピクノポラス ザングイネウス（Pycnoprus
sanguineus），ストプトマイセス リバニイ（Strept
omyces libani），ストレプトマイセス ジオヤンシス
（Streptomyces sioyaensis），トラメテス ヒルスイ
タ（Trametes hirsuita）及びトリコジルマ ハルジア
ナム（Tricoderma harzianum）。
例９ この例はグア粉からガラクトースの遊離を説明する。用
いた酵素は、例４で記載した如く製造したペニシリウム
クリゾゲナムα‐ガラクトマンナンガラクトシダーゼ
であった。遊離したガラクトースの量を、ベーリンガー
マンハイム キットを用い例８で記載した如く測定し
次いで遊離したガラクトースの量を、ガラクトース粉1g
当り放出されたガラクトースのmgとして表わす。インキ
ュベーションを温度調節機及び気密蓋を備えた水浴中で
行った。試験したグア粉を、グア粉1g当り20GALUの酵素
及び40％（重量／重量）グア粉の最終濃度を与えるアセ
テート緩衝液と共に湿潤せしめた。得られた結果を第II
表に示す。
いた酵素は、例４で記載した如く製造したペニシリウム
クリゾゲナムα‐ガラクトマンナンガラクトシダーゼ
であった。遊離したガラクトースの量を、ベーリンガー
マンハイム キットを用い例８で記載した如く測定し
次いで遊離したガラクトースの量を、ガラクトース粉1g
当り放出されたガラクトースのmgとして表わす。インキ
ュベーションを温度調節機及び気密蓋を備えた水浴中で
行った。試験したグア粉を、グア粉1g当り20GALUの酵素
及び40％（重量／重量）グア粉の最終濃度を与えるアセ
テート緩衝液と共に湿潤せしめた。得られた結果を第II
表に示す。
第II表から明らかなように、酵素は50℃以上の温度で長
時間安定ではない。酵素の最適pHは5.0〜5.5である。
時間安定ではない。酵素の最適pHは5.0〜5.5である。
酵素の濃縮の効果を、45℃の温度、5.0のpH及び第III表
に示す酵素濃度を用いて上記と同様にインキュベーショ
ンすることにより試験した。得られた結果を第III表に
示す。
に示す酵素濃度を用いて上記と同様にインキュベーショ
ンすることにより試験した。得られた結果を第III表に
示す。
例10 この例は例２及び４ないし６で得られた酵素のアフィニ
ィティ精製を説明する。
ィティ精製を説明する。
例４で得られた部分精製α‐ガラクトマンナンガラクト
シダーゼ30mlを、次の手順によりエンド‐β‐マンナナ
ーゼ活性を有しないまでに精製した:AH-セハロース
TM（ファルマシア，スウェーデン）に結合したガラクト
サミン（シグマNo.G0500）100mlを、緩衝液（50mMの酢
酸ナトリウム（pH5.0））で平衝化した。30mlの溶液を
適用し次いでエンド‐β‐マンナナーゼ及びα‐ガラク
トマンナンガラクトシダーゼの一部をカラムに流した。
α‐ガラクトマンナンガラクトシダーゼを塩化ナトリウ
ム勾配法で溶出させた。エンド‐β‐マンナナーゼを有
しない精製α‐ガラクトマンナンガラクトシダーゼは蛋
白1g当り15GALUの比活性を有し更にエンド‐β‐マンナ
ナーゼは検出限界以下であった。SDSゲル電気泳動によ
れば主蛋白バンドの分子量は55,000〜60,000であること
が見い出された（SDSは硫酸ドデシルナトリウムであ
る）。最適pHは約５〜６であり、最適温度は基質として
p-NPGalについて約50℃であり、更にpI（等電点）は4.3
であった。
シダーゼ30mlを、次の手順によりエンド‐β‐マンナナ
ーゼ活性を有しないまでに精製した:AH-セハロース
TM（ファルマシア，スウェーデン）に結合したガラクト
サミン（シグマNo.G0500）100mlを、緩衝液（50mMの酢
酸ナトリウム（pH5.0））で平衝化した。30mlの溶液を
適用し次いでエンド‐β‐マンナナーゼ及びα‐ガラク
トマンナンガラクトシダーゼの一部をカラムに流した。
α‐ガラクトマンナンガラクトシダーゼを塩化ナトリウ
ム勾配法で溶出させた。エンド‐β‐マンナナーゼを有
しない精製α‐ガラクトマンナンガラクトシダーゼは蛋
白1g当り15GALUの比活性を有し更にエンド‐β‐マンナ
ナーゼは検出限界以下であった。SDSゲル電気泳動によ
れば主蛋白バンドの分子量は55,000〜60,000であること
が見い出された（SDSは硫酸ドデシルナトリウムであ
る）。最適pHは約５〜６であり、最適温度は基質として
p-NPGalについて約50℃であり、更にpI（等電点）は4.3
であった。
例５及び６で得られた他の酵素を同様の手順で精製し
た。例６で得られたα‐ガラクトマンナンガラクトシダ
ーゼは分子量55,000〜60,000を有し、比活性は蛋白1mg
当り75GALUであり、最適pHは約５〜６であり、最適温度
は基質としてp-NPGalについて約50℃であり更にpIは約
4.3であった。
た。例６で得られたα‐ガラクトマンナンガラクトシダ
ーゼは分子量55,000〜60,000を有し、比活性は蛋白1mg
当り75GALUであり、最適pHは約５〜６であり、最適温度
は基質としてp-NPGalについて約50℃であり更にpIは約
4.3であった。
例２及び５で得られたα‐ガラクトマンナンガラクトシ
ダーゼは、分子量62,000〜67,000を有しており更に比活
性は蛋白1mg当り90GALUを有した。この酵素の最適pHは
約４〜5.5であった。pIは約4.3であった。
ダーゼは、分子量62,000〜67,000を有しており更に比活
性は蛋白1mg当り90GALUを有した。この酵素の最適pHは
約４〜5.5であった。pIは約4.3であった。
グア基質を用い全ての三種の酵素に対し２時間のインキ
ュベーションに対し最適温度は55℃であり24時間のイン
キュベーションに対し50℃であった。
ュベーションに対し最適温度は55℃であり24時間のイン
キュベーションに対し50℃であった。
4GALUに対応する例４で得られた高精製酵素量を、50mM
の酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.0）3mlに溶解し、次いで
2gのグア粉を添加した。得られた混合物を45℃で20時間
インキュベートした。しかる後、生成物を乾燥した。14
0mgのガラクトースがこの酵素を用いてのインキュベー
ション中に遊離していたことが見い出された。
の酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.0）3mlに溶解し、次いで
2gのグア粉を添加した。得られた混合物を45℃で20時間
インキュベートした。しかる後、生成物を乾燥した。14
0mgのガラクトースがこの酵素を用いてのインキュベー
ション中に遊離していたことが見い出された。
以下の例11で記載するゲル化試験を用い、以下の内容が
観察された。即ち得られた全てのα‐ガラクトマンナン
ガラクトシダーゼ製品は改良されたゲル化能を有するガ
ラクトマンナンを得る為使用することが出来た。
観察された。即ち得られた全てのα‐ガラクトマンナン
ガラクトシダーゼ製品は改良されたゲル化能を有するガ
ラクトマンナンを得る為使用することが出来た。
例11 この例はゲル化能に対する試験を説明する。
ａ）40mgのキサンタン（シグマNo.G1253）を10mlの脱イ
オン水に懸濁させ次いで材料を溶解するまで加熱した。
同様に第二のグラス内で40mgのロカストビームガム（シ
グマNo.G0753）を、10mlの脱イオン水に懸濁させ次いで
材料を溶解するまで加熱した。75℃で2mlの各々の溶液
を、10mlの試験管内で混合し、しかる後試験管を氷浴内
で放冷せしめた。15分後、試験管を上下に回転させ次い
で混合物は流出しなかった。
オン水に懸濁させ次いで材料を溶解するまで加熱した。
同様に第二のグラス内で40mgのロカストビームガム（シ
グマNo.G0753）を、10mlの脱イオン水に懸濁させ次いで
材料を溶解するまで加熱した。75℃で2mlの各々の溶液
を、10mlの試験管内で混合し、しかる後試験管を氷浴内
で放冷せしめた。15分後、試験管を上下に回転させ次い
で混合物は流出しなかった。
ｂ）前記ａ）に記載した試験においてロカストビームガ
ムの代りにグアガム（シグマNo.G4129）を用いると、混
合物は試験管を上下にした場合流出した。
ムの代りにグアガム（シグマNo.G4129）を用いると、混
合物は試験管を上下にした場合流出した。
ｃ）上記ａ）で記載した試験のロカストビームガムの代
りに、アスペルギルスニガー‐α‐ガラクトシダーゼで
既に処理したグアガムを用いると、試験管を上下にさせ
た場合混合物は流出した。
りに、アスペルギルスニガー‐α‐ガラクトシダーゼで
既に処理したグアガムを用いると、試験管を上下にさせ
た場合混合物は流出した。
ｄ）上記ａ）で記載した試験におけるロカストビームガ
ムの代りに、本発明に係るα‐ガラクトマンナンガラク
トシダーゼをしたグアガムを用いると、ゲルは試験管を
上下にした場合流出しなかった。
ムの代りに、本発明に係るα‐ガラクトマンナンガラク
トシダーゼをしたグアガムを用いると、ゲルは試験管を
上下にした場合流出しなかった。
Claims (6)
- 【請求項１】次の特性： マンナン骨格を実質的に分解することなく、ガラクトマ
ンナンからガラクトースを分裂させることができ、そし
て55,000〜67,000の分子量、４〜６の範囲内に最適pH、
約4.3のpI値、および55℃（短い時間）および50℃（長
時間）の最適温度、 を有する微生物α−ガラクトマンナンガラクトシダー
ゼ。 - 【請求項２】液体又は固体生成物の形で1g当たり少なく
とも約250GALUを有しかつ本質的にエンド−β−マンナ
ナーゼ活性を有しない、特許請求の範囲第１項記載のα
−ガラクトマンナンガラクトシダーゼ。 - 【請求項３】エンド−β−マンナナーゼ活性が1GALU当
たり約0.001EMANU未満である、特許請求の範囲第２項記
載のα−ガラクトマンナンガラクトシダーゼ。 - 【請求項４】次の特性： マンナン骨格を実質的に分解することなく、ガラクトマ
ンナンからガラクトースを分裂させることができ、そし
て55,000〜67,000の分子量、４〜６の範囲内に最適pH、
約4.3のpI値、および55℃（短い時間）および50℃（長
時間）の最適温度、 を有する微生物α−ガラクトマンナンガラクトシダーゼ
の調製方法であって、ペニシリウム クリゾゲナム（Pe
nicillium chrysogenum）、ペニシリウム イスランジ
カム（Penicillium islandium）およびペニシリウム
ノタタム（Penicillium notatum）から成る群から選ば
れるα−ガラクトマンナンガクトシシダーゼ生産菌株を
液内培養し、しかる後培養培地から該微生物α−ガラク
トマンナンガラクトシダーゼを回収することを含んでな
る、前記方法。 - 【請求項５】グアゴム、ロキュストビーンガム等のガラ
クトマンナンの変性方法であって、該ガム中少なくとも
約10％のガラクトース含量が脱離まで、 次の特性： マンナン骨格を実質的に分解することなく、ガラクトマ
ンナンからガラクトースを分裂させることができ、そし
て55,000〜67,000の分子量、４〜６の範囲内に最適pH、
約4.3のpI値、および55℃（短い時間）および50℃（長
時間）の最適温度、 を有する微生物α−ガラクトマンナンガラクトシダーゼ
を用いて溶液中の前記ガムを処理し、しかる後処理物を
加熱する、前記方法。 - 【請求項６】前記微生物α−ガラクトマンナンガラクト
シダーゼが、その1g当たり少なくとも約250GALUを有し
更にGALU当たりエンド−β−マンナナーゼの約0.01EMAN
U未満を有する、特許請求の範囲第５項記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK629/85 | 1985-02-12 | ||
| DK062985A DK153568C (da) | 1985-02-12 | 1985-02-12 | Alfa-galactomannangalactosidase og middel indeholdende denne |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61187787A JPS61187787A (ja) | 1986-08-21 |
| JPH0736752B2 true JPH0736752B2 (ja) | 1995-04-26 |
Family
ID=8095747
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61026992A Expired - Lifetime JPH0736752B2 (ja) | 1985-02-12 | 1986-02-12 | ポリペプチド製品 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0192401B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0736752B2 (ja) |
| AT (1) | ATE84570T1 (ja) |
| DE (1) | DE3687463T2 (ja) |
| DK (1) | DK153568C (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1339101C (en) * | 1986-06-03 | 1997-07-29 | Nicolaas Overbeeke | Production of guar alpha-galactosidase and immunologically related alpha-galactosidases by host organisms transformed with recombinant dna methods |
| DE69024323T2 (de) * | 1989-10-27 | 1996-10-17 | Genencor Int | Antimikrobielles Verfahren und Formulierung unter Verwendung von Endoglycosidase vom Typ II und antimikrobielles Mittel |
| US5238843A (en) * | 1989-10-27 | 1993-08-24 | Genencor International, Inc. | Method for cleaning a surface on which is bound a glycoside-containing substance |
| US5041236A (en) * | 1989-10-27 | 1991-08-20 | The Procter & Gamble Company | Antimicrobial methods and compositions employing certain lysozymes and endoglycosidases |
| US5258304A (en) * | 1989-10-27 | 1993-11-02 | Genencor International, Inc. | Method of removing microorganisms from surfaces with Type II endoglycosidase |
| GB9524752D0 (en) * | 1995-12-04 | 1996-02-07 | Danisco | Modification process |
| US6159721A (en) * | 1997-08-20 | 2000-12-12 | Hercules Incorporated | Amine modified polysaccharides |
| EP1321527A4 (en) * | 2000-08-30 | 2004-08-11 | Amano Enzyme Inc | METHOD FOR INCREASING THE YIELD OF ALPHA-GALACTOSYL-CONTAINING OLIGOSACCHARIDES AND ANTI-CANDIDA COMPOSITIONS |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CH585793A5 (ja) * | 1974-02-01 | 1977-03-15 | Nestle Sa | |
| US4332894A (en) * | 1980-08-15 | 1982-06-01 | Purdue Research Foundation | Conversion of guar gum to gel-forming polysaccharides by the action of α-galactosidase |
| DK147484A (da) * | 1983-03-11 | 1984-09-12 | Unilever Nv | Oparbejdning af polysaccharider |
-
1985
- 1985-02-12 DK DK062985A patent/DK153568C/da not_active IP Right Cessation
-
1986
- 1986-02-11 EP EP86300932A patent/EP0192401B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-02-11 AT AT86300932T patent/ATE84570T1/de not_active IP Right Cessation
- 1986-02-11 DE DE8686300932T patent/DE3687463T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1986-02-12 JP JP61026992A patent/JPH0736752B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE3687463T2 (de) | 1993-04-29 |
| ATE84570T1 (de) | 1993-01-15 |
| EP0192401A2 (en) | 1986-08-27 |
| JPS61187787A (ja) | 1986-08-21 |
| DK153568C (da) | 1988-12-05 |
| DK62985A (da) | 1986-08-13 |
| DK153568B (da) | 1988-07-25 |
| DE3687463D1 (de) | 1993-02-25 |
| EP0192401A3 (en) | 1988-07-06 |
| EP0192401B1 (en) | 1993-01-13 |
| DK62985D0 (da) | 1985-02-12 |
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