JPH0739438B2 - プロタミン鉱酸塩の抽出方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、魚の白子からプロタミンを抽出する方法に関
する。

従来技術 プロタミンは分子量（約4000〜約10000）の比較的小さ
い塩基性蛋白質であり、ニシン、サケ、マスなどの魚の
精子中に核酸（DNA）と結合した核蛋白として存在す
る。

プロタミン塩類、特にその硫酸塩はヘパリンの血液凝固
を阻止する作用や、インシュリンの薬効を持続させる働
き、酵素を安定化する働きあるいは抗生物質を安定化す
る働き等が知られており、それらの性質を利用して各種
医薬品等に使用されている。

従来、魚の白子からプロタミン塩類を得る方法として、
白子を硫酸等の希鉱酸の水溶液で処理しプロタミンおよ
びその他の蛋白（以下、他の蛋白を「夾雑蛋白」とい
う）を抽出し（以下、以上の過程を「抽出工程」とい
い、該工程で得られた溶液を「抽出液」という）、次い
で抽出液にメタノール等のアルコールを添加して硫酸プ
ロタミンおよびその他の夾雑蛋白を沈澱させ、次にその
沈澱物を分離、乾燥し、さらに得られた固体を温水によ
り抽出し、該温水を冷却してプロタミン塩類を析出させ
て、その析出物を溶液から分離し（以下、以上の過程を
「分離工程」という）、さらに分離した固体を精製する
（以下、この工程を「精製工程」という）方法が知られ
ている。

従来の分離工程においては、抽出液にアルコールを添加
して沈澱させたプロタミン塩類（以下、代表的な硫酸プ
ロタミンについて説明する）はそれを一旦取り出してア
ルコールを留去し乾燥させねばならないため、操作が繁
雑でありかつ作業の流れが非常に悪い。

さらに、抽出工程に使用した鉱酸水溶液はアルコール等
が添加されるため、再び抽出用の溶液として使用するこ
とが不可能である。そのために資源の無駄使いが多く、
かつ非常にコストの高く付くものである。

また沈澱の際、硫酸プロタミンのみならず、夾雑蛋白も
一緒に沈澱してくるためにさらに硫酸プロタミンと夾雑
蛋白を分離しなければならない。硫酸プロタミンは、前
記の沈澱物を温水により抽出し該溶液を冷却し析出させ
ることにより夾雑蛋白から分離されるが、その時同時に
夾雑蛋白も程度の差はあれ同じ様に温水に抽出されそれ
が冷却されると析出してくるため、得られた硫酸プロタ
ミンは必然的に夾雑蛋白が混入した純度の悪いものとな
る。実用に耐ええる程度の純度を有する硫酸プロタミン
を得るにはさらに精製工程が必要である。かつ硫酸プロ
タミンは、冷却される温度においてもある程度の溶解度
があるために希鉱酸で抽出された硫酸プロタミンをすべ
て回収することはできず収量が悪くなるという問題点も
ある。

さらに従来方法において収量を上げるためには、該沈澱
物の温水による抽出を繰り返さなければならないため、
操作が繁雑であるという問題点も存在する。

プロタミンを抽出する方法は、たとえば特公昭59−3151
8号公報、特公昭59−31519号公報あるいは特開昭55−26
34号公報に記載されている。

特開昭55−2634号公報記載の技術は、無機塩類のみを使
用しデオキシリボ核酸を分解せずプロタミンと共にデオ
キシリボ核酸をも同時に抽出する目的のものであるため
プロタミンの収率が非常に悪い。

特公昭59−31518号公報および特公昭59−31519号公報に
記載の技術は白子を希鉱酸のみで抽出するものである
が、次にプロタミンを分離するために該抽出液はメタリ
ン酸ナトリウムおよび硫酸アンモニウム等が加えられ
る。プロタミンが分離された溶液は再び白子を抽出させ
るための溶液に使用できない。

硫酸プロタミンを分離する別の方法としては、たとえば
特公昭59−31519号公報、特公昭59−31518号公報、特開
昭55−2603号公報、特開昭55−2612号公報あるいは特開
昭55−2634号公報等に一連に記載されている。

これらに開示された分離工程は、抽出液に縮合リン酸塩
を加えて難溶性のプロタミンリン酸塩として沈澱させ、
この沈澱物を高濃度の硫酸アンモニウム溶液で複分解し
て硫酸プロタミンを分離する方法である。

しかしこの方法はプロタミンリン酸塩として一旦取り出
さなければならないため、作業の流れが悪く、工程が繁
雑になるという欠点がある。

縮合リン酸塩を使用して抽出液から蛋白質を沈澱させる
と、プロタミンのみならず他の多量の夾雑蛋白も一緒に
沈澱してくる。そのためにそれを複分解して得た硫酸プ
ロタミンはどうしても夾雑蛋白を含有し純度が非常に悪
いものとなる。そのために実用に供する程度の純度を有
した硫酸プロタミンを得るには、分離工程の後に必ず精
製工程を必要とした。精製工程は分離された硫酸プロタ
ミンの酸性希薄水溶液を吸着剤で処理した後、有機溶剤
で分別沈澱させる繁雑なものである。

発明が解決しようとする問題点 本発明者らは硫酸プロタミンをより高純度、高収率で得
る抽出方法を検討した結果、硫酸プロタミンおよび夾雑
蛋白は、無機塩の濃度が違う溶液に対して、白子から抽
出される度合、溶解性を著しく異にすることを発見し
た。この新たな知見を利用することにより前記のような
問題点をすべて解消し、純度の高いプロタミン硫酸塩を
簡便にしかも効率良く得ることができるのみならず、硫
酸プロタミン分離後の抽出液を再び利用することのでき
る方法を完成するに至った。

問題点を解決するための手段 本発明の第１の特徴はプロタミンを含有する魚の白子を
鉱酸と鉱酸塩の混合溶液で抽出するプロタミン鉱酸塩の
抽出方法に関する。

本発明の第２の特徴はプロタミンを含有する魚の白子を
鉱酸と鉱酸塩の混合溶液で抽出し、抽出液を冷却するこ
とにより、プロタミン鉱酸塩を析出回収すると共に上澄
み液を、酸および塩濃度を調整して、再度抽出用溶液と
して使用することを特徴とするプロタミン鉱酸塩の抽出
方法に関する。

本発明を第１図から第３図を用いて説明する。

第１図〜第３図は本発明抽出方法のフローチャートであ
る。白子は必要ならば摩砕して第１図に示すごとく鉱酸
／塩類混液で抽出し、抽出液（粗プロタミン鉱酸塩が含
まれている）を採取し、残渣（白子の抽出滓や夾雑蛋白
質が含まれている）を除去し、抽出液を冷却して上澄み
液（夾雑蛋白質を主とし、プロタミン鉱酸塩を少量、お
よび鉱酸／塩類を含んでいる）を除き沈澱を採取する。
この沈澱中にはプロタミン鉱酸塩が比較的高純度で含ま
れているが、より純度を上げるため第３図のごとき精製
工程にかけてもよい。第２図は第１図で示した上澄み液
中のプロタミン鉱酸塩を廃棄することなく回収すると共
に酸および塩を排出することによって生ずる排水上の問
題を解消するため、上澄み液を再度抽水用の溶媒として
循環再使用する方法を示すものである。再使用に際して
は上澄み液中の酸／塩類濃度を抽出に適する濃度に再調
整する 本発明の抽出に使用しうる魚の白子は摩砕した白子ある
いは摩砕していない白子いずれでもよく、プロタミンを
含有する魚の白子、たとえばニシン、サケ、マスあるい
はサバ等の白子であればよく特に限定されるものではな
い。

本発明の抽出に使用しうる鉱酸は硫酸あるいは塩酸等を
挙げる事ができるが、プロタミンの抽出に通常用いられ
る鉱酸であればよい。硫酸が特に好ましい。

鉱酸は３〜20重量％の濃度の水溶液で使用する。３重量
％より低い濃度で使用するとプロタミンの抽出効率が低
下する。20重量％より濃いと、鉱酸単独の場合と比較し
て、抽出される夾雑蛋白の量が少ないという本発明の利
点が失われる。

鉱酸とともに使用する鉱酸塩は抽出に用いる酸と同種の
酸塩を用いるのが好ましく、塩酸塩、硫酸塩等、特に硫
酸アンモニウムあるいは硫酸ナトリウムが望ましい。

鉱酸塩の濃度は使用する鉱酸あるいはその濃度、および
鉱酸塩の種類等により適宜調整する。たとえば鉱酸に６
〜14重量％硫酸を使用し、鉱酸塩に硫酸アンモニウムを
使用する場合、硫酸アンモニウムは硫酸水溶液１リット
ル当たり1.8〜3.2モル、好ましくは2.26〜2.5モル含ま
れるように添加する。1.8モルより少ない量で使用する
と、鉱酸単独の場合と比較して、抽出される夾雑蛋白の
量が少ないという本発明の利点が失われる。3.2モルよ
り多い量で使用するとプロタミンの抽出効率が低下す
る。また鉱酸塩として硫酸ナトリウムを使用する場合、
前述と同様の理由で硫酸ナトリウムは硫酸水溶液１リッ
トル当たり0.8〜1.8モル、好ましくは1.0〜1.4モル含ま
れるように添加する。

鉱酸と鉱酸塩の混合溶液は抽出する白子重量の１〜５倍
の量、好ましくは２倍の量を使用する。例えば白子1Kg
を抽出する場合、混合溶液は２リットルを使用すること
が好ましい。５倍量より多いと抽出液中のプロタミン鉱
酸塩の濃度が低く、後の分離工程において抽出液からの
プロタミン鉱酸塩の回収が充分行えない。１倍量より少
ないとプロタミンの抽出量が減少する。

鉱酸と鉱酸塩の混合溶液は20〜40℃、好ましくは25〜30
℃の液温で使用する。20℃より低い温度で使用するとプ
ロタミンの抽出効率が低下する。40℃より高い温度で使
用すると抽出されたプロタミン鉱酸塩が短時間の内に分
解してしまう。

抽出時間は白子の摩砕状態あるいは抽出手段にもよるが
通常30〜60分以内で充分である。

次に本発明に従い得られた抽出液は冷却すると析出物と
上澄み液とに分離する（以下、この過程を分離工程とい
う：即ち、本発明第２の態様である抽出方法は、抽出工
程と抽出液からプロタミン鉱酸塩を分離する分離工程を
含む）。

析出物は、実用に供する程度には充分純度の高いプロタ
ミン鉱酸塩である。

本発明の特徴はプロタミン鉱酸塩を極めて簡単な方法で
抽出、分離できるとともに、作業が連続的に実施でき中
断されることがないために、作業性が非常に良いことで
ある。

本発明の別の特徴は、第２図に示すごとく上澄み液の鉱
酸および鉱酸塩の濃度を調整することにより、それを抽
出用溶液として再利用できることにある。

上澄み液を再利用する時の鉱酸および鉱酸塩の濃度は、
前述したように抽出の際調整した濃度にすればよい。

上澄み液を再利用する際、まず上澄み液をアンモニア等
のアルカリで中和することが望ましい。その時液温は20
〜30℃が好ましい。本操作を行うことにより上澄み液に
存在する夾雑蛋白のみを析出させ取り除くことができ
る。

本発明に従い上澄み液を再利用することにより、上澄み
液に残存するプロタミン鉱酸塩を無駄にすることがな
い。

また本発明に従い上澄み液を再利用すると廃液量を低減
できるため公害性の点においても有効である。

本発明により純度の高いプロタミン鉱酸塩が得られるの
は、抽出工程においてはプロタミンとともに抽出される
夾雑蛋白の量が少ないということ、抽出液を冷却しても
夾雑蛋白はほとんど析出せず、プロタミン鉱酸塩のみが
析出することを利用したことにある。

表１に、硫酸／硫酸アンモニウムおよび硫酸／硫酸ナト
リウムの混合溶液を例にとり白子を抽出し、それを100
倍に希釈した溶液の夾雑蛋白にもとずく紫外部吸収（28
0nm）を測定した結果を示す。

表２に硫酸水溶液、硫酸／硫酸アンモニウムおよび硫酸
／硫酸ナトリウムの混合溶液に対する硫酸プロタミンの
５℃での溶解度（重量％）を例にとり示した。

表１および表２中、硫酸アンモニウムおよび硫酸ナトリ
ウムの濃度は硫酸水溶液１リットルに添加されたモル数
をいう。

表１から本発明に従うとプロタミンを選択的に抽出する
ことができることがわかる。従来方法により硫酸のみか
らなる溶液で抽出した場合液に比べ夾雑蛋白が約２分の
１以下に減少させることが可能であることがわかる。

表２からたとえば７％硫酸水溶液のみからなる抽出液の
場合は、硫酸プロタミンの溶解度が1.5重量％であるの
に、７％硫酸と1.9モル硫酸アンモニウムの混合溶液か
らなる抽出液の場合は約0.13重量％しかなく、冷却する
ことにより硫酸プロタミンが充分析出することがわか
る。

表３に本発明に従い得られた抽出液の冷却前の溶液およ
び冷却および冷却後析出物を取り除いた溶液中の夾雑蛋
白の存含有を、夾雑蛋白にもとずく波長280nmの紫外部
吸収を測定することにより比較した結果を示した。

表３より本発明により得られた抽出液を冷却しても夾雑
蛋白は析出しないことがわかる。

本発明に従えば、抽出液中には夾雑蛋白が少なく、かつ
それを冷却した場合、プロタミン鉱酸塩は充分析出する
が夾雑蛋白は析出しないために、充分実用に供すること
のできる程度の純度を有するプロタミン鉱酸塩を得るこ
とができる。

本発明で得られたプロタミン鉱酸塩をさらに精製するに
は第３図に示すごとく、得られたプロタミン鉱酸塩を少
量の無機塩、好ましくは硫酸塩、たとえば硫酸アンモニ
ウムあるいは硫酸ナトリウムとともに温水に溶解させ、
その後該溶液を冷却しプロタミン鉱酸塩を析出させ、該
溶液から分離し、それを乾燥すればよい（以下、以上の
操作を「精製工程」という。） 精製工程におけるプロタミン鉱酸塩の濃度は濃厚な程良
い。

精製工程に使用する温水は、溶解させるプロタミン鉱酸
塩が溶解する温度であればよい。

精製工程に使用する鉱酸塩は温水１リットルに対して0.
05〜0.2モルの量を添加する。0.05モルより少ないかあ
るいは0.2モルより多いと温水を冷却後硫酸プロタミン
を効率良く析出させることができない。

温水は10℃以下、好ましくは５℃以下に冷却する。10℃
より高いとプロタミン鉱酸塩を効率良く析出させること
ができない。

温水のpHは特に調整する必要はない。調整する場合は、
プロタミン鉱酸塩を添加後硫酸塩を添加する前にpH2〜
７の範囲にすることが望ましい。

精製を行うことにより、分離工程の際プロタミン鉱酸塩
の析出物に付着する塩、酸および夾雑蛋白を除去でき
る。

本発明の精製工程は、プロタミン鉱酸塩の溶解性が溶液
１に対して硫酸アンモニウムあるいは硫酸ナトリウム
濃度の0.05〜0.2モル溶けたという極めて低い濃度域の
溶液中で最少になるという新たな知見に基づくものであ
る。

表４に硫酸プロタミンを例にとり、水温５℃、pH2.5の
水溶液中におけるそれの溶解度（重量％）と硫酸塩濃度
の関係を表した。表中、濃度は溶液１に対して溶かし
た硫酸塩のモル数を表す。

表４より硫酸プロタミンの溶解度は硫酸塩の濃度が0.05
〜0.2モルの範囲で最少になるのがわかる。

実施例１ 抽出工程 冷凍した鮭の白子を解凍、水洗い、水切りを行い摩砕し
た。

摩砕した鮭の白子1Kgおよび2.35モルの硫酸アンモニウ
ムを10％（2N）硫酸２リットルに添加し、30℃で１時間
攪拌した。攪拌後、残渣を遠心分離により取り除き硫酸
プロタミン抽出液2.5リットルを得た。

抽出液中には硫酸プロタミンが53.3g（2.13重量％）
（乾燥換算）含まれていた。

分離工程 抽出液2.5リットルを５℃に冷却しその温度で16時間静
置し、硫酸プロタミン析出物と上澄み液とに分離させ
た。上澄み液は傾瀉して回収した。

硫酸プロタミン析出物は白色アメ状で、収量は102gであ
った。

回収した上澄み液は2.43リットルであった。成分は硫酸
7.26％、硫酸アンモニウム1.72モル／リットル、夾雑蛋
白1.6重量％、硫酸プロタミン0.4重量％（9.72g）であ
った。

精製工程 分離工程で得られた硫酸プロタミン102gを800mlの温水
（40〜50℃）に溶解し、該溶液１リットル当り約0.14モ
ルの硫酸アンモニウムの濃度とした。その後溶液を５℃
に冷却しその温度で一夜静置し硫酸プロタミン析出物と
上澄み液とに分離させた。

上澄み液を傾瀉して取り除き、透明油状の硫酸プロタミ
ンを得た。それを凍結乾燥し白色の硫酸プロタミン43.2
gを得た（収率4.32％）。

再利用 分離工程で回収した上澄み液に濃アンモニア水240mlを
添加し、夾雑蛋白を沈澱させた。沈澱物を遠心分離によ
り取り除き2.48リットルの溶液を回収した。回収溶液の
成分は硫酸アンモニウム2.3モル／リットル、夾雑蛋白
0.14重量％であった。

回収溶液1.92リットルに濃硫酸227gを添加し、該溶液を
抽出用溶媒として再利用した。溶液の成分は硫酸10.7
％、硫酸アンモニウム2.3モル／リットルであった。

実施例２ 実施例１の精製工程を行わない以外は実施例１と同様に
行なった。得られた白色飴状硫酸プロタミンを凍結乾燥
し、白色の硫酸プロタミン53.2g（収率5.32％）を得
た。

比較例 冷凍した鮭の白子を解凍、水洗い、水切りを行い磨砕し
た。磨砕した鮭の白子100gを５％（1N）硫酸500mlに添
加し、室温26℃、１時間攪拌した。攪拌後、残渣を遠心
分離により取り除き、硫酸プロタミン抽出液550mlを得
た。

該抽出液にメタノール2750mlを添加し、５℃で一夜放置
し硫酸プロタミンと夾雑蛋白を再沈澱させた。沈澱物を
遠心分離（8000rpm、20分）により分離し、減圧下メタ
ノールを留去し乾燥させた。

乾燥した沈澱物を100mlの温水（30〜40℃）で２回、50m
lの温水で１回抽出した。その抽出水溶液を室温で遠心
分離（10000rpm、２時間）抽出されなかった固体から分
離し、濁液180mlを得た。

濁液を５℃に冷却しその温度で２日間放置し硫酸プロタ
ミンを析出させた。

析出した硫酸プロタミンの上澄み液を傾瀉して取り除
き、透明油状の硫酸プロタミンを得た。それを凍結乾燥
し白色の硫酸プロタミン4.30gを得た（収率4.30％）。

実施例３ 実施例１、実施例２および比較例で得た硫酸プロタミン
を試料とし、その純度検討した。

純度はクロマトグラフィー、吸光分析、硫酸プロタミン
を水に溶かした時の溶液の溶状および抗菌活性により測
定した。

クロマトグラフィーは高速液体クロマトグラフィーを使
用した。試料の純度は和光純薬工業製硫酸プロタミン
（鮭製）を標品とし、その純度を1.00として比較しHPLC
純度として示した。またHPLC純度と試料の収率を掛けた
ものを標品換算収率として示した。ここで標品換算収率
とは白子100gから得られる硫酸プロタミンの量を標品程
度の純度を有した硫酸プロタミン量に換算した場合の収
率を言い、硫酸プロタミンの分離効率比較の尺度と考え
て良い。それらの結果を表５中に示した。

HPLC純度を比較すると、例えば実施例１で本発明に従い
得られた硫酸プロタミンの純度は、従来法により得られ
たものよりも約1.2倍も良いことがわかる。また、標品
換算収率を比較すると本発明は従来法に比べ約1.1倍も
高効率で分離できることがわかる。

抗菌活性は和光純薬工業製硫酸プロタミン（鮭製）を標
品に使用し、ペーパーディスク法において枯草菌（B.su
btilis IAM1069株）に対する抗菌活性を1.00として比較
し抗菌力比活性として示した。また抗菌力活性と試料の
収率を掛けたものを標品換算性収率として示した。標品
換算活性収率とは白子100gから得られる硫酸プロタミン
の量に対して同等の抗菌力を示すために必要とする標品
の量に換算した場合の収率を言い硫酸プロタミンの分離
効率比較の尺度と考えて良い。それらの結果を表５中に
示した。

抗菌力比活性を比較すると、例えば実施例１で本発明に
従い得られた硫酸プロタミンは、従来法により得られた
ものよりも約1.1倍も良いことがわかる。また、標品換
算活性収率を比較すると本発明従来法に比べ約1.1倍高
効率で分離できることがわかる。

吸光分析は、該酸に起因する260nmおよび夾雑蛋白に起
因する280nmでの吸光度を測定した。測定は試料の濃度
0.1重量％の水溶液を温度20℃で行なった。その結果を
表６中に示した。

純粋な硫酸プロタミンは220nm以上の光に対しては吸収
がない。表６からわかるように本発明に従い得られた硫
酸プロタミンは従来法により得られた硫酸プロタミンに
比べ、夾雑物の量が非常に少ないことがわかる。

溶状の目視観察は、各試料の２％水溶液（20℃）で行な
った。本発明（実施例１および２）に従い得られた硫酸
プロタミンは完全に溶解するのに対して、従来法（比較
例）で得られた硫酸プロタミン完全に溶解せず不溶物の
存在が認められた。

発明の効果 本発明に従うと魚の白子から純度のよい硫酸プロタミン
を極めて簡単に、効率よく、しかも公害性のない、安価
な、簡便な工程で、連続的に抽出、分離できる。

【図面の簡単な説明】

第１図から第３図は、本発明プロタミン鉱酸塩の抽出方
法の態様を示すチャートである。

フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭55−2634（ＪＰ，Ａ) 特公 昭59−31518（ＪＰ，Ｂ２) 日本化学会編「新実験化学講座20 生物 化学工」丸善（昭53−６−20）Ｐ．14−19

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】プロタミンを含有する魚の白子を鉱酸と鉱
   酸塩の混合溶液で抽出するプロタミン鉱酸塩の抽出方
   法。
2. 【請求項２】プロタミンを含有する魚の白子を鉱酸と鉱
   酸塩の混合溶液で抽出し、抽出溶液を冷却することによ
   りプロタミン鉱酸塩を折出回収すると共に上澄み液を酸
   および塩濃度を調整して、再度抽出用溶液として使用す
   ることを特徴とするプロタミン鉱酸塩の抽出方法。
3. 【請求項３】鉱酸と鉱酸塩の混合溶液として、３〜20重
   量％の鉱酸水溶液１リットル当り硫酸アンモニウム1.8
   〜3.2モルあるいは硫酸ナトリウム0.8〜1.8モルの濃度
   を有する混合溶液を用いることを特徴とする、第１項記
   載の抽出方法。