JPH0740935B2 - Ｃ末端アミド化に関与する酵素ならびにその製造方法および使用 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、Ｃ末端グリシン付加体のＣ末端アミド化に関
与する新規酵素、その調製方法および使用ならびに該酵
素の活性の測定方法およびその方法を用いる該酵素の探
索方法に関する。

〔従来の技術〕 Ｃ末端がアミド化されて初めて生理活性を示すペプチ
ド、例えばカルシトニン、ガストリン、セクレチン、血
管作用性小腸ペプチド（VIP）、成長ホルモン放出因
子、副腎皮質刺激ホルモン放出因子等は、生体内で酵素
反応によりグリシン付加体から生成されることが知られ
ている。これらの生理活性ペプチドの多くは、医薬品と
して有用であり、現在、カルシトニン、セクレチンなど
は医薬品として市販されている。

これらのペプチドの入手は、従来主として生体からの分
離精製によって行われており、工程が煩雑でまた、起源
の生体も入手しにくい。従って、現在市販の上記ペプチ
ドは非常に高価なものとなっている。

そこで、近年、組換えDNA技術を用いて、これらの生理
活性ペプチドを生産しようとする試みが行われている。
しかしながら、大腸菌、酵母、枯草菌などを宿主とした
組換えDNA技術では、生産したペプチドのＣ末端アミド
化ができず、上記ペプチドの生産をおこなう際の障害と
なっている。そこで、生体外でＣ末端アミド化を容易
に、しかも、安価におこなえる技術が望まれている。

一方、前述の生体内酵素反応、すなわちペプチド類Ｃ末
端グリシン付加体のＣ末端アミド化に関与する酵素は、
ペプチジルグリシン−α−アミデーティングモノオキシ
ゲナーゼ（Ｃ末端アミド化酵素）（EC.1.14.17.3）と呼
ばれており（Bradburyら、Nature,298,686,1982:Glembo
tskiら、J.Biol.Chem.,259,6385,1984）、次のような反
応を触媒していると考えられている。

生体内でのアミド化機構の解明、ならびに組換えDNA技
術によって生産されるペプチドの生体外におけるＣ末端
アミド化を目的に、本酵素を精製する試みがなされてい
る。今までに比活性を出発原料に比し100倍以上に高め
た精製例としては、ウシ脳下垂体中葉（Murthyら、J.Bi
ol.Chem.,261,1815,1986）、ブタ脳下垂体（Kizerら、E
ndocrinology.118,2262,1986:Bradburyら、Eur.J.Bioch
em.,169,579,1987）、ブタ心房（Kojimaら、J.Bioche
m.,105,440,1989）、アフリカツメガエル体皮（Mizuno
ら、Biochem.Biophys.Res.Commun.,137,984,1986）、ラ
ット甲状腺腫瘍（Mehtaら、Arch.Biochem,Biophys.,26
1,44,1988）由来のものが報告されている。

これらの精製酵素は、いずれもその活性発現に酵素、銅
イオンを要求し、アスコルビン酸の還元剤添加により、
活性が上昇する性質を持つことが知られている。最近で
は、精製酵素を用いる反応機構の解明に関する研究も進
められてきており、反応中間体の存在が示唆されてきて
いる〔Bradburyら、Eur.J.Biochem.,169,579−584（198
7）、Ramerら、J.Am.Chem.Soc.,110,8526−8532（198
8）、Youngら、J.Am.Chem.Soc.,111,1933−1934（198
9）〕。

しかし、現在のところ、中間体の単離ならびにその中間
体とアミド化酵素との関係を明らかにした例はない。

〔発明が解決しようとする課題〕

前述のように、Ｃ末端アミド化酵素は、生体内で非常に
興味深い作用を示し、特定の生体器官に由来する一定の
純度を有する組成物も知られている。しかし、これらの
組成物を生体外におけるＣ末端アミド化物の生産に用い
るには、その純度および安定性ならびに製造原価の面で
十分なものとはいえない。これらの課題を解決するには
当該酵素に関する基礎的知見の収集、すなわち、Ｃ末端
アミド化反応をおこなう反応機構の解明をおこなうこと
が必要と考え、中間生成物の単離を試みたところ、中間
体を単離し構造決定することに成功した。この結果か
ら、Ｃ末端アミド化反応は、従来考えられていたような
１段階の反応ではなく、中間体（対応するＣ末端α−ヒ
ドロキシルグリシン付加体）を介した２段階の反応であ
ることがわかった。そこで、それぞれの反応を触媒する
酵素の探索について鋭意検討したところ、目的の酵素活
性を有する新規物質を見い出し、本発明を完成した。す
なわち、本発明の目的はＣ末端アミド化に関与する新規
酵素、その調製方法および使用、ならびに該酵素の活性
測定方法およびこの方法を用いる該酵素活性を有する物
質の探索方法を提供するにある。

〔課題を解決するための手段〕 従って、本発明によれば前述の課題を解決すべく、次式
（Ｉ） （上式中、Ａは、天然のα−アミノ酸に由来するα−ア
ミノ基もしくはイミノ基およびα−カルボキシル基以外
の残基を表しており、Ｘは、水素原子またはカルボニル
基を介してＮ原子と結合するアミノ酸誘導体の残基を表
す）で示されるＣ末端グリシン付加体に作用して、次式
（II） （上式中、ＡおよびＸは、前記の意味を表す）で示され
るＣ末端α−ヒドロキシルグリシン付加体を生成し、か
つ、ゲル濾過を使用する分子量決定法により約25,000ダ
ルトンの分子量を有するＣ末端グリシン付加体のＣ末端
アミド化に関与する酵素（以下、「酵素−Ｉ」という場
合もある）が提供される。

なお、式（Ｉ）および（II）ならびに下記式（III）の
カッコ内の水素原子（Ｈ）は、Ａがα−イミノ基を有す
るα−アミノ酸に由来する場合には水素原子を有しない
ことを意味する。

本発明における式（Ｉ）で示されるＣ末端グリシン付加
体、すなわち本発明の酵素の基質としては、一般的に、
前記式の が天然または合成のアミノ酸誘導体類、特に、ペプチド
または蛋白質類に由来し、そのＣ末端アミノ酸残基〔−
Ｎ（Ｈ）−Ａ−CO−で示される〕にグリシンがペプチド
結合した化合物が挙げられる。Ｃ末端アミド酸残基とし
ては天然のα−アミノ酸、特にタンパク質構成アミノ
酸、例えばグリシン、アラニンのような脂肪族アミノ
酸；バリン、ロイシン、イソロイシンのような分枝アミ
ノ酸；セリン、スレオニンのようなヒドロキシアミノ
酸；アスパラギン酸、グルタミン酸のような酸性アミノ
酸；アスパラギン、グルタミンのようなアミド；リジ
ン、ヒドロキシリジン、アルギニンのような塩基性アミ
ノ酸；システイン、シスチン、メチオニンのような含硫
アミノ酸；フェニルアラニン、チロシンのような芳香族
アミノ酸；トリプトファン、ヒスチジンのような複素環
式アミノ酸；プロリン、４−ヒドロキシプロリンのよう
なイミノ酸に由来する残基が挙げられる。また、このア
ミノ酸残基のα−アミノ基もしくはイミノ基に結合する
水素原子またはアミノ酸誘導体の残基〔Ｘ−で示され
る〕の該残基としては、単一のアミノ酸またはα−アミ
ノ基を介してペプチ結合し得るペプチド類であれば、そ
の構成アミノ酸残基の種類およびペプチドの鎖長に制限
はなく、さらにその構成アミノ酸残基にリン酸もしくは
糖またはその他の置換基が共有結合していてもよく、ま
た脂質と複合体を形成していてもよい。前記置換基の具
体的なものとしては、それぞれのアミノ酸残基に対応し
て、アルギニン残基のグアニジノ基に置換する基、例え
ば、メチル基もしくはエチル基などのアルキル基または
アデノシン二リン酸リボース、シトルリンもしくはオル
ニチンに由来する残基；リジン残基のε−アミノ基に置
換する基、例えば、グルコシル基、ピリドキシル基、ビ
オチニル基、リポイル基もしくはアセチル基またはリン
酸、δ−水酸基を有する化合物、δ−グリコシル基を有
する化合物、グルタルアルデヒドもしくは無水シトラコ
ン酸に由来する残基；ヒスチジン残基のイミダゾール基
に置換する基、例えば、メチル基、リン酸基もしくはヨ
ード原子またはフラビンに由来する残基；プロリン残基
に置換する基、例えば、水酸基、ジ水酸基もしくはグリ
コシルオキシ基；フェニルアラニン残基のベンゼ環に置
換する基、例えば、水酸基もしくはグルコシルオキシ
基；チロシン残基の水酸基に置換する基、例えば、グリ
コシルオキシ基、スルホン酸基、沃素原子、臭素原子も
しくは塩素原子または水酸基を有する化合物、ビスエー
テル、アデニン、ウリジンもしくはRNA（リボ核酸）に
由来する残基；セリン残基の水酸基に置換する基、例え
ば、メチル基、グリコシル基、ホスホパンテテイン基、
アデノシン二リン酸リボシルもしくはリン酸基；スレオ
ニン残基の水酸基に置換する基、例えば、グルコシル
基、メチル基もしくはリン酸基；システイン残基のSH基
に置換する基、例えば、グリコシル基、シスチニル基、
デヒドロアラニル基もしくはセレン原子またはヘムもし
くはフラビンに由来する残基；アスパラギン酸またはグ
ルタミン酸残基のカルボキシル基に置換する基、例え
ば、メチル基、リン酸基もしくはγ−カルボキシル基；
アスパラギンまたはグルタミン残基のアミド基に置換す
る基、例えば、グリコシル基、ピロリドニル基もしくは
イミノ基などが挙げられる。

上記基質としてのＣ末端残基にグリシンがペプチド結合
したペプチドまたはその誘導体は天然から抽出したもの
でも、化学合成によって生産したものでもまた組換えDN
A技術を用いて生産したものでもよい。従って、本発明
の基質、式（Ｉ）で示される化合物としては、ペプチド
類、例えば、アミノ酸残基数２〜100程度のペプチド、
カゼイン、プロテインキナーゼ、アデノウィルスEIA蛋
白質、RAS1蛋白質などで代表されるリン酸ペプチドおよ
びその加水分解物、スロンボプラスチン、α_１リポ蛋白
質、リポビテリンなどで代表されるリポ蛋白質およびそ
の加水分解物、ヘモグロビン、ミオグロビン、ヘモシア
ニン、クロロフィル、フィコシアニン、フラビン、ロド
プシンなどで代表される金属蛋白質およびその加水分解
物、コラーゲン、ラミニン、インターフェロンα、セロ
グリコイド、アビジンなどで代表される糖蛋白質および
その加水分解物ならびにその他のＣ末端カルボキシル基
がアミド化されて成熟型の生理活性ペプチド、例えばカ
ルシトニン、セクレチン、ガストリン、血管作用性小腸
ペプチド（VIP）、コレシストキニン、セルレイン、膵
ポリペプチド、成長ホルモン放出因子、副腎皮質刺激ホ
ルモン放出因子、カルシトニン遺伝子関連ペプチド等を
形成するペプチド類各々のＣ末端グリシン付加体（すな
わち、Ｃ末端カルボキシル基とグリシンのアミド結合化
合物）が挙げられる。これらのうち、本発明の酵素組成
物の酵素活性を確認するために好ましい基質としては、
例えば、Ｄ−チロシルバリルグリシン、Ｄ−チロシルト
リプトファニルグリシン、グリシルフェニルアラニルグ
リシン、フェニルアラニルグリシルフェニルアラニルグ
リシン、Ｄ−チロシルロイシルアスパラギニルグリシ
ン、アルギニルフェニルアラニルグリシン、アルギニル
アラニルアルギニルロイシルグリシン、ロイシルメチオ
ニルグリシン、グリシルロイシルメチオニルグリシン、
フェニルアラニルグリシルロイシルメチオニルグリシ
ン、アスパラギニルアルギニルフェニルアラニルグリシ
ン、トリプトファニルアスパラギニルアルギニルフェニ
ルアラニルグリシン、アラニルフェニルアラニルグリシ
ン、リジルアラニルフェニルアラニルグリシン、セリル
リジルアラニルフェニルアラニルグリシン、アルギニル
チロシルグリシン、グリシルメチオニルグリシン、グリ
シルチロシルグリシン、グリシルヒスチジルグリシン、
ヒスチジルグリシルグリシン、トリプトファニルグリシ
ルグリシン、およびグリシルシステイニルグリシン等が
挙げられる（なお、グリシンを除きＤ−と特に示さない
ものはＬ−型を示す）。一方、本酵素組成物の有効利用
（後述する第五の本発明）に好ましい基質としては、前
記Ｃ末端カルボキシル基がアミド化されて成熟型の生理
活性ペプチドを形成する、そのＣ末端カルボキシル基に
グリシンがペプチド結合したペプチド類が挙げられる。

本発明の酵素−Ｉは、前記基質に作用して次式（II） 〔上式中、 の具体例は前記式（Ｉ）について定義したような意味を
有する〕で示されるＣ末端α−ヒドロキシルグリシン付
加体を生成することができる。

式（II）で示される化合物は、 に悪影響を及ぼさない条件下で加水分解するか、後述す
る本発明の第二の酵素で処理することにより対応するＣ
末端アミド化物に転化することができる。

また、前記酵素−Ｉは、ゲル濾過を使用する分子量決定
法により約25,000ダルトンの分子量を有する。すなわち
この分子量は、それ自体公知のゲル濾過法〔例えば、
“生化学実験講座５、酵素研究法、上巻、283〜298
頁”、東京化学同人（1975）〕に従い決定することがで
きる。具体的には、100mMの塩化カリウムを含む50mMの
トリス−塩酸（pH7.4）を平衡化および溶出液として用
い、トヨパールHW−55S（東ソー社製）上でゲル濾過を
行い、β−アミラーゼ（M.W.200,000）、アルコールデ
ヒドロゲナーゼ（M.W.150,000）、BSA（M.W.66,000）、
カルボニックアンヒドラーゼ（M.W.29,000）およびチト
クロームＣ（M.W.15,400）を指標として決定した。

本発明の酵素−Ｉは、さらに以下の理化学的性質により
特定される。すなわち、 （ｉ）至適pHが約５〜７でかつ安定pHが４〜９にあり （ii）作用適温が25〜40℃の範囲にあり、 （iii）金属イオンおよびアスコルビン酸を補因子とす
る。

上記（ｉ）および（ii）の性質は、通常使用される緩衝
液、具体的には、トリス−塩酸、メス−水酸化カリウ
ム、テス−水酸化ナトリウム、ヘペス−水酸化カリウム
緩衝液を用いて測定したものである。なお、本発明の酵
素組成物は、１℃〜55℃の温度範囲内で前記反応を触媒
するが、56℃では約10分で失活し、40℃付近でも若干の
失活がみられる。

金属イオンとしては、Cu²⁺,Zn²⁺,Ni²⁺,Co²⁺,Fe³⁺等が適
当であり、特にCu²⁺,Zn²⁺が好ましい。

Ｃ−末端アミド化において、本発明の酵素（酵素−Ｉ）
と共に作用するもう一種の酵素として、次の酵素（酵素
−II）が挙げられる。すなわち、前記式（II）で示され
るＣ末端α−ヒドロキシルグリシン付加体に作用して、
次式（III） （上式中、ＡおよびＸは、前記の意味を表す）で示され
るＣ末端アミド化物とグリオキシル酸を生成し、かつゲ
ル濾過を用いる分子量決定法により約40,000ダルトンの
分子量を有するＣ末端グリシン付加体のＣ末端アミド化
に関与する酵素（以下「酵素−II」という場合もある）
が提供される。この酵素の特定に使用される の意義および分子量決定法は、酵素−Ｉの特定に用いた
のと同一である。なお、酵素−IIの酵素活性を確認する
ために好ましい基質としては、前記酵素−Ｉについて具
体的に列挙した基質に対応するα−ヒドロキシルグリシ
ン化物が挙げられる。また酵素−IIはその他の理化学的
性質として酵素−Ｉとほぼ同一の性質を有することによ
り特定される。すなわち、 （ｉ）至適pHが約５〜７でかつ安定pHが４〜９にあり、 （ii）作用適温が15〜35℃の範囲にあり、 （iii）金属イオンを補因子とする。

上記（ｉ）および（ii）の性質は、通常使用される緩衝
液、具体的には、トリス−塩酸、メス−水酸化カリウ
ム、テス−水酸化ナトリウム、ヘペス−水酸化カリウム
緩衝液を用いて測定したものである。なお、本発明の酵
素組成物は、１℃〜55℃の温度範囲内で前記反応を触媒
するが、56℃では約10分で失活し、40℃付近でも若干の
失活がみられる。

金属イオンとしては、Cu²⁺,Zn²⁺,Ni²⁺,Co²⁺,Fe³⁺等が適
当であり、特にCu²⁺,Zn²⁺が好ましい。

酵素の調製 以上で説明した本発明の酵素−Ｉおよび酵素−IIは、該
酵素活性を有する原料からそれ自体公知の酵素の分離精
製法により調製することができるが、好ましくは、本明
細書に開示する以下の本発明の調製方法により得ること
ができる。すなわち、酵素−Ｉまたは酵素−IIの酵素活
性含有物を、前記式（Ｉ）で示されるＣ末端グリシン付
加体をリガンドとする基質親和性クロマトグラフィー、
および陰イオン交換クロマトグラフィーで処理すること
を特徴とする酵素−Ｉまたは酵素−IIの調製方法が利用
できる。

この方法に用いる原料は、本発明の酵素を含むものであ
ればすべて対象にすることができるが、後述する酵素−
IIの探索方法に準じて探索される高含有量の酵素−Ｉま
たは酵素−IIを有する生物体由来のものが好ましい。一
般に、これらの酵素活性を有する生物としては、ヒト、
ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、ラットおよ
びマウスなどの哺乳類、ニワトリ、ヤケイおよびカワラ
バトなどの鳥類、イシガメ、マムシ、ガラガラヘビおよ
びコブラなどの爬虫類、イモリ、アフリカツメガエル、
ウシガエルおよびヒキガエルなどの両生類、ヤツメウナ
ギ、メクラウナギ、アブラザメ、シビレエイ、チョウザ
メ、ニシン、サケ、ウナギ、トラフグおよびタイなどの
魚類、ワモンゴキブリ、カイコ、ショウジョウバエおよ
びミツバチなどの昆虫が挙げられる。また、好適な抽出
対象物としては、脳、下垂体、胃、心臓および肝臓など
の器官に由来する均質化物ならびに血液およびリンパ液
などの体液などを含む生物学的流体が挙げられる。

すなわち、前述のような本酵素を有する生物学的流体
を、次式（Ｉ） （上式中、ＡおよびＸは前記の意味を有する）で示され
るＣ末端グリシン付加体をリガンドとする基質類似体親
和性クロマトグラフィーを用い、必要により、酵素の精
製に常用される （１）沈澱による分画、 （２）ヘパリン親和性クロマトグラフィー、 （３）透析、ゲル濾過等により分子量分画方法、 および／または （４）イオン交換クロマトグラフィーとを組み合せて使
用することにより本発明の酵素（酵素−Ｉおよび酵素−
II）を得ることができる。

前記のリガンドとしては、前述の式（Ｉ）で示されるＣ
末端グリシン付加体であればすべて使用できるが、前記
酵素活性を確認するために好ましいものとして具体的に
列挙したグリシンを含め２〜６個のアミノ酸残基からな
るペプチド類が挙げられる。これらのうち、Ｄ−Tyr−T
rp−Gly,Phe−Gly−Phe−GlyおよびGly−Phe−Glyがよ
り好ましいものであるが、Phe−Gly−Phe−Glyをリガン
ドするものが、本発明の酵素（本酵素ともいう）に強い
親和性を有することから特に好ましい。

これらのリガンドは、通常、水不溶性担体に結合せしめ
て使用されるが、リガンドとして用いられるペプチドの
Ｃ末端グリシン残基のカルボキシル基は、遊離の状態で
あることが本酵素との結合に重要であり、Ｎ末端のアミ
ノ酸残基のアミノ基を介して担体と結合させる必要があ
る。すなわち、担体としては、ペプチドのアミノ基と結
合可能なものであれば何でもよく、またアミノ基と反応
する活性基を担体に化学的に導入しても、また、既に導
入された市販の担体を使用してもよい。化学的に導入す
る方法は、一般に使用されている方法でよく、例えば、
“生化学実験法第５巻上巻257頁〜281頁”笠井著 東京
化学同人（1975）に記載されているように、例えばアガ
ロースに臭化シアンを用いて、イミドカルボキシル基を
導入する。市販されている活性化された担体は、基材を
指標とすると、例えばアガロース系、セルロース系、親
水性ポリビニール系等があるが、これらどれを用いても
構わない。アガロース系担体としては、リガンドのアミ
ノ基との結合方法にCNBr法を用いるCNBr活性化セファロ
ース4B（ファルマシア社製）、カルボジイミド法を用い
るCH−セファロース4B、ECH−セファロース4B（以上、
ファルマシア社製）、アフィゲル10、アフィゲル15（以
上、バウオラッド社製）、トレシルクロライド法を用い
るトレシル活性化セファロース4B（ファルマシア社製）
等が挙げられる。セルロース系担体としては、ホルミル
法を用いるホルミルセルロファイン（チッソ社製）が挙
げられる。親水性ポリビニール系担体としては、カルボ
ジイミド法を用いるAF−カルボキシトヨパール650、ホ
ルミル法を用いるAF−ホルミルトヨパール650、トレシ
ルクロライド法を用いるAF−トレシルトヨパール650、
エポキシ活性化法を用いるAF−エポキシトヨパール650
（以上東ソー社製）等が挙げられる。リガンドとの結合
反応はそれぞれの担体の使用説明書に従い反応させれば
良い。

このうち、アフィゲル10について作製方法を記載する。
アフィゲル10とペプチドとの反応は0.001〜1M好ましく
は0.1Mのモップス−水酸化カリウム等の緩衝液中で行
う。反応条件は０〜20℃、10分〜24時間、pH3〜11程度
が可能であるが、好ましくは４℃、４〜24時間、pH5〜
９の条件で行う。アフィゲル10と結合に用いるペプチド
の混合比は、アフィゲル1mlに対し、ペプチドが約25μm
olまでは多く加える程多く結合するので、その範囲内で
いくらでもよいが、結合効率の点から１〜20μmol程度
が好都合に用いられる。反応後、反応時に用いた緩衝液
で十分に洗浄後、トリス−塩酸（pH8.0）を最終濃度50m
Mになるように添加し、４℃で１時間振盪させる等の方
法で未反応の活性基をブロックする。以上で基質類似体
親和性ゲルが作製される。

基質親和性クロマトグラフィーは、バッチ式でもカラム
に充填して連続式に行ってもよい。試料とゲルを接触さ
せる時間は、本酵素が十分に吸着する程度であればよい
が、通常、20〜24時間である。ゲルの平衡化に用いたも
のと同じ組成の低イオン強度でpHが6.0〜11.0好ましく
は7.0〜9.0の緩衝液、例えば10mMヘペス−水酸化カリウ
ム（pH7.0）で非吸着成分を十分に洗い出す。そのう
ち、本酵素活性の存在する画分を溶出する。溶出液は、
本酵素が効率良く得られる組成であれば何でもよいが、
好ましいものとしては、１〜40％程度のアセトニトリル
と共に0.1〜I0M塩化ナトリウムを含むpH7.0〜9.0間の緩
衝液、例えば20％アセトニトリル、0.4M塩化ナトリウム
を含む10mMヘペス−水酸化ナトリウム（pH7.0）が挙げ
られる。また、溶出はカラムに充填した場合、濃度勾配
をかけても構わない。

また、場合により、前記基質類似体親和性クロマトグラ
フィー〔以下、（５）で表す〕工程を実施する前または
後、あるいは前後両方に先に掲げた沈澱による分画〔以
下、（１）で表す〕、ヘパリン親和性クロマトグラフィ
ー〔以下、（２）で表す〕透析、ゲル濾過等による分子
量分画〔以下、（３）で表す〕及び／または、イオン交
換クロマトグラフィー〔以下、（４）で表す〕工程を実
施してもよい。こうして本酵素（酵素−Ｉおよび酵素−
II）は他の夾雑物から分離することができるが、その酵
素−Ｉと酵素−IIの分離には、（３）および／または
（４）の工程を実施することが有効である。一般に、こ
れらの総数１〜６工程を実施し、さらに上記（５）また
は（３）工程を最終段階に実施することが好ましい。各
工程の組み合わせの具体例としては、（５）のみ、
（１）→（５），（５）→（３），（２）→（５），
（１）→（３）→（５），（２）→（３）→（５），
（１）→（５）→（３），（２）→（５）→（３），
（２）→（１）→（５），（１）→（２）→（３）→
（５），（１）→（２）→（５）→（３），（１）→
（３）→（５）→（３），（１）→（２）→（１）→
（５），（１）→（２）→（１）→（３）→（５），
（２）→（１）→（５）→（３），（２）→（１）→
（３）→（５），（２）→（１）→（３）→（５）→
（３），（１）→（２）→（３）→（５）→（３），
（１）→（３）→（２）→（３）→（５），（１）→
（３）→（２）→（３）→（５）→（３），（４）→
（３）→（５），（５）→（３）→（５）→（３），
（１）→（５）→（３）→（５）→（３），（４）→
（５），（１）→（３）→（５）→（４）→（３），
（１）→（３）→（４）→（３）→（５），（１）→
（２）→（３）→（５）→（３）→（４），（１）→
（２）→（３）→（５）→（４）→（３）、または
（４）→（５）→（３）、等が挙げられる。これらのう
ち、（１）→（２）→（３）→（５），（１）→（２）
→（３）→（５）→（３），（１）→（３）→（２）→
（３）→（５）または（１）→（３）→（２）→（３）
→（５）→（３），（１）→（２）→（３）→（５）→
（４）→（３）、の順に工程を進めるのがより好まし
い。

以下、前記（１）〜（４）工程についても詳細に説明す
る。なお、これらはすべて０℃〜10℃、好ましくは４℃
で行う。

（１）の沈澱による分画に使用される物質としては、硫
酸アンモニウム等の塩類、エタノール、アセトンなどの
有機溶媒、ポリエチレングリコール等のポリマー類が挙
げられる。添加する濃度は、特に制限はないが、本酵素
が収率良く回収でき、しかも他の蛋白質成分と分離でき
る条件が好ましい。例えば、30〜50％飽和硫酸アンモニ
ウム、10〜15％（w/v）ポリエチレングリコール6000の
添加では、本酵素は沈澱画分に来るのに対し、多くの蛋
白質は上澄部分に存在するので、効率よく精製される。
なお添加は、スターラーで攪拌しながら序々に行うのが
好ましい、添加終了後少なくとも１時間以上静置したの
ち、遠心分離により、本酵素の存在する画分を回収す
る。沈澱画分を回収した時には、これを適当な緩衝液に
溶解する。緩衝液、pH6.0〜11.0、好ましくはpH7.0〜9.
0であれば組成は何でもよく、例としては、トリス−塩
酸、ヘペス−水酸化カリウム、テス−水酸化ナトリウム
等が挙げられる。また濃度は、緩衝能を保てる範囲であ
れば制限はないが、５〜50mM程度が好ましい。

（１）によって得た活性画分は、次に、再度（１）を行
っても（２）〜（５）のうちの１つの工程いずれに進ん
でもよいが、（１）の分画に硫酸アンモニウム等の塩類
を使用し、（２）か（４）または（５）に進む時は、
（３）の工程か、あるいは適当な緩衝液を添加して次の
工程で用いるゲルに本酵素が結合可能な塩濃度に下げる
必要がある。また、沈澱を溶解して１時間以上静置した
場合や、透析を行った場合には、不溶性の物質が生じる
ことがあるので、これを例えば、遠心分離や濾過を行っ
て除去する。

（２）のヘパリン親和性クロマトグラフィーについて
は、バッチ式でもカラムにゲルを充填して連続式に行っ
てもよい。ヘパリンをリガンドとしたゲルは、市販され
ているものとして、ヘパリンゼファロースCL−6B（ファ
ルマシア社製）、アフィゲルヘパリン（バイオラッド社
製）、ヘパリンアガロース（シグマ社製）、AF−ヘパリ
ントヨパール650（東ソー社製）等がある。

生体抽出液を直接、あるいは（１）に示した沈澱による
分画の処理を行ったのち、ヘパリン親和性ゲルと接触さ
せる。接触時間は、本酵素が十分に吸着する程度であれ
ばよいが、通常は20分〜12時間である。ヘパリンに親和
性のない成分を、本酵素が溶出されない程度にイオン強
度が強く、pHが6.0〜11.0好ましくは7.0〜9.0の緩衝
液、例えば、10mMのヘペス−水酸化カリウム（pH7.0）
で十分に除去する。そののち、本酵素を含む画分を溶出
する。溶出液としては、本酵素活性の回収率が高いもの
がよく、例えば、0.5M−2Mの塩化ナトリウム、塩化カリ
ウム、硫酸アンモニウム等一般に酵素精製に用いられる
塩類を含むpH6.0〜11.0を有するものが好ましい。溶出
は、カラムに充填してある場合、塩濃度勾配によっても
一段階溶出を行っても構わない。例えば、0.3−2.0Mの
塩化ナトリムウを含む10mMヘペス−水酸化カリウム緩衝
液（pH7.0）で溶出する。

（２）の工程で得た活性画分は、次に（１）〜（４）い
ずれの工程に供してもよいが、再度（２）を行ったり、
（４）または（５）に進む場合には、（３）を先に行う
か、多量の50mM以下の低イオン強度のpH6.0〜11.0、好
ましくは7.0〜9.0の緩衝液、例えば5mMヘペス−水酸化
カリウム（pH7.0）等を加えて（２），（４）または
（５）で使用するゲルに本酵素が吸着できるイオン強度
にまで下げる必要がある。

（３）の透析、ゲル濾過等による低分子物質の除去の工
程であるが、透析の場合、使用する膜は、本酵素が通過
できない程度の分画分子量のものであればよいが、1,00
0〜10,000が好ましい。透析の方法は、例えば、“生化
学実験講座第５巻上巻252頁〜253頁”左右田著 東京化
学同人（1975）に記されているような一般に使用される
ものでよく、数時間〜数日、イオン強度の低い、pH6.0
〜11.0、好ましくはpH7.0〜9.0の緩衝液、例えば10mMヘ
ペス−水酸化カリウム（pH7.0）、10mMトリス−塩酸（p
H7.5）等に対して行う。また、透析の際、不溶性の物質
が析出した場合には、例えば遠心分離、濾過等によって
除去する。

ゲル濾過については、一般的にゲル濾過用担体として用
いられるものであれば何でも構わない。例えばセファデ
ックスＧ−10,G−15,G−25,G−50,G−75,G−100、セフ
ァクリルＳ−200,S−300（以上ファルマシア社製）トヨ
パールHW−40,HW−55（東ソー社製）、バイオゲルＰ−
2,P−4,P−6,P−10,P−30,P−60,P−100（以上バイオラ
ッド社製）等が好ましい。なお、使用すべき緩衝液は、
透析の際に用いるべき組成と同様である。ただし、イオ
ン強度があまりに低いと本酵素のゲルへの吸着が起こる
ことが考えられるので、濃度を５〜200mM好ましくは10
〜20mMにする。ゲル濾過の方法は、例えば、“生化学実
験講座第５巻上巻283頁〜298頁”左右田著東京化学同人
（1975）に記載されているように行えば良い。ゲル濾過
担体のベッド体積に対し十分な分離能が得られる量の試
料を添加後、溶出を行い、本酵素活性の存在する画分を
回収する。

（３）の工程によって得られた活性画分は、特別な処理
なしに（１）〜（５）の各工程に進めることができる。

イオン交換クロマトグラフィーについては、一般に市販
されているイオン交換クロマトグラフィー用担体であれ
ば何でも構わない。例えば、Aminex,Dowex,Amberlite,S
P−Sephacryl M,Asahipak,DEAE−Toyopearl,DEAE−Seph
adex,CM−Sepharose,DEAE Bio−Gel A,CM−Cellulose,D
EAE−Cellulofine,Partisil SCY,Mono QおよびMono S等
が好ましい。なお、使用すべき緩衝液および使用方法
は、ヘパリン親和性ゲルの項に記載した方法に準じれば
良い。また、基本的な操作方法は、「新基礎生化学実験
法２、抽出・精製・分析Ｉ」（丸善、1988）などに記載
された一般的な方法に従えば良い。

（４）の工程で得た活性画分を、次に（１）〜（５）い
ずれかの工程に供しても良いが、再度（４）を行った
り、あるいは（２）または（５）に進む場合には、
（３）を先に行うか、多量の50mM以下の低イオン強度の
pH5.0〜11.0、好ましくは6.0〜8.0の緩衝液、例えばヘ
ペス−水酸化ナトリウム（pH7.0）等を加えて、
（２），（４）または（５）で使用するゲルに本酵素が
吸着できるイオン強度にまで下げる必要がある。以上の
精製工程を経ることにより、本発明の酵素の粗生成物が
得られる。かかる、酵素の粗生成物は、さらに、（３）
のゲル濾過工程を用いるタンパク質分離手段により、分
子量約25,000および分子量約40,000にそれぞれピークを
有する画分に単離して、本酵素標品とすることができ
る。

以上の各工程は、それぞれ後述のもう一つの本発明であ
る酵素の活性の測定方法に準じて、式（Ｉ）または式
（II）の化合物を基質に使用して酵素−Ｉおよび／また
は酵素−IIの活性を追い、活性画分を得ることによって
実施される。

酵素組成物の使用 本発明の酵素を含む組成物の使用により次の、第４およ
び第５の本発明、すなわち、前記式（Ｉ）で示されるＣ
末端グリシン付加体を、前記酵素−Ｉを含む組成物で処
理することを特徴とする前記式（II）で示されるＣ末端
α−ヒドロキシルグリシン付加体の製造方法、ならびに
式（II）で示される前記付加体を酵素−IIを含む組成物
で処理することを特徴とする前記式（III）で示される
Ｃ末端アミド化物の製造方法が提供できる。またこれら
の酵素−Ｉおよび酵素−IIは併用することにより単一反
応組成物中で式（Ｉ）の化合物を式（III）の化合物ま
で転化することができる。式（Ｉ）から式（III）の化
合物への転化の工程に酵素−IIを使用することは、酵素
−Ｉ型の酵素のみの存在下では式（II）から式（III）
の化合物への転化に際し、化学的加水分解条件にさらす
必要があるのに比べ、より緩和な酵素反応条件下で前記
転化が達成できるので有意であることが明らかであろ
う。特に、アルカリ条件下で不安定な基質類の処理に適
する。

これらの製造方法は、本発明の酵素を含有するものであ
ればその濃度、純度を問うことなく使用できるが、反応
混合物からの生成物、式（II）の化合物の単離精製を考
慮すると夾雑タンパク質が大幅に除去された本発明の酵
素含有物を使用するのが有利である。なお、本酵素活性
を有する生体抽出液を使用するなら、そのまま、あるい
は単にそれらの濃縮物をも使用することができる。

式（Ｉ）の化合物としては、前述のものが全て含まれる
が、これらの製造方法での使用に適するものとしては、
特に式（III）の化合物、例えばアルギニンバソトシン
（AVT）、黄体形成ホルモン放出ホルモン（LH−RH）、
オキシトシン、ガストリン、ガストリン分泌促進ペプチ
ド（GGRP）、カルシトニン（CT）、血管作用性小腸ペプ
チド（VIP）、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（TR
H）、黒色素胞刺激ホルモン（MSH）、MSH放出抑制ホル
モン（MIH）、コレシストキニンオクタペプタイド（CCK
−８）、サブスタンスＰ（SP）、脂肪動員ホルモン、膵
ポリペプチド（PP）、成長ホルモン放出因子、セクレチ
ン、セルレイン、軟体動物性心臓興奮性神経ペプチド、
バソプレッシン、副腎皮質刺激ホルモン（ACTH）、変色
ホルモン、ボンベシン、明順応ホルモン、モチリン、ア
パミン、アリテシン、エレドイシン、カツシニン、グラ
ニュリベリンＲ、スコトホビン、ヒランベートセルレイ
ン、肥満細胞脱顆粒ペプチド、フィサレミン、フィロセ
ルレイン、フィロメズシン、プロメリチン、ボンビニ
ン、マストパラン、マストパラン−Ｘ、メリチン−１、
ラナテンシンおよびラナテンシン−Ｒ等に本製造方法で
転化することができる、それらの対応する式（Ｉ）また
は式（II）で示される化合物が好ましい。

前記処理は、通常の緩衝液中、特に酵素−Ｉを用いる反
応では反応液にアスコルビン酸およびカタラーゼを添加
して実施することができるが、それぞれ適当量の金属イ
オンの存在下、次に示す酵素活性の測定方法の条件を考
慮して実施することが好ましい。

酵素活性の測定方法およびそれを用いる新規酵素の探索
方法 前述の本発明の酵素−Ｉおよび酵素−IIは、以下の活性
の測定方法により追跡することができ、またこの測定方
法は、前述の本酵素の調製方法を合理的に実施するのに
役立つ。

無論、これらの測定方法は、Ｃ末端アミド化反応が従来
考えられていたような１段階の反応ではなく、中間体
（Ｃ末端α−ヒドロキシルグリシン付加体）を介した２
段階反応であるとの知見に基づくものである。

まず最初に、酵素−Ｉの活性は、（ｉ）その活性を有す
ることが予測される被験体をpH5〜８に緩衝化する工
程、（ii）この緩衝溶液に前記式（Ｉ）で示されるＣ末
端グリシン付加体ならびにＬ−アスコルビン酸およびカ
タラーゼを添加してインキュベーションする工程、なら
びに（iii）式（III）で示される反応生成物をアセトニ
トリル含有緩衝液（pH6〜10）を使用するHPLCで検出す
る工程を含むことを特徴とする方法により測定される。

また、酵素−IIの活性は、（ｉ）その活性を有すること
が予測される被験体をpH4〜８に緩衝化する工程、（i
i）この緩衝溶液に式（II）で示されるＣ末端α−ヒド
ロキシルグリシン付加体を添加してインキュベーション
する工程、ならびに（iii）生成する式（III）で示され
るＣ−末端アミド化物を検出する工程、を含むことを特
徴とする方法により測定される。

これらの方法は、それぞれ本出願の第６および第７の発
明として提供される。

これらの発明にいう被験体としては、それらの酵素活性
を有する流体であればいずれも包含され、特に、それら
の活性を有する生物学的流体、すなわち生物の器官の均
質化物、ならびに体液、例えば血液およびリンパ液、さ
らにこれらの精製処理などの処理液が挙げられる。ま
た、微生物細胞に由来する処理液も生物学的流体に包含
される。

これらの被験体の緩衝化に使用する緩衝剤は特に制限さ
れず通常使用されるものが用いられる。例えばトリス−
塩酸、ヘペス−水酸化カリウムがあげられる。緩衝溶液
中の緩衝剤の濃度は緩衝作用が達成される限りいかなる
濃度でもよいが、通常は20〜200mMが適当である。

それぞれの緩衝溶液は、第６の発明（「前者」という）
についてはpH6〜８、好ましくはpH6.5付近に調節し、第
７の発明（「後者」という）についてはpH4〜８、好ま
しくはpH6付近に調節する。こうして調製した緩衝溶液
に前者で添加されるＣ末端グリシン付加体としては、当
該酵素の基質であって、前述の酵素−Ｉの活性を確認す
るために好ましい基質として列挙した式（Ｉ）で示され
るものを用いるのが好ましい。この化合物の濃度は、一
般に0.1μＭ〜2mM程度が適当である。さらに、補因子と
して機能することが考えられるＬ−アスコルビン酸、活
性化剤としてカタラーゼの添加が必要である。一般に、
Ｌ−アスコルビン酸の濃度は、0.5〜2mMが好ましく、ま
たカタラーゼの濃度は40〜100μg/mlが適当である。ま
た、緩衝溶液に金属イオンを添加してもよいが、この添
加は本活性測定に特に要求されるものでなく、添加によ
り無添加の場合よりもより高い活性が得られることがあ
るので添加することが好ましい。使用する金属イオンと
してはZn²⁺,Cu²⁺,Ni²⁺,Co²⁺,Fe³⁺等が適当であり特にCu
²⁺およびZn²⁺が好ましい。金属イオンの緩衝溶液中の濃
度は０〜1000μＭ、好ましくは０〜10μＭが適当であ
る。限定されるものでないが、かかる金属イオンを提供
する化合物は、CuSO₄,CuCl₂,ZnCl₂,NiCl₂,CoCl₂,FeCl₃
等があげられる。

このような反応組成物の具体的なものとしては、例え
ば、後述の実施例２の組成が参考となろう。一方、後者
における反応組成物は、前記式（Ｉ）の化合物に代え対
応する式（II）の化合物を使用して調製する。この場
合、アスコルビン酸、カタラーゼ等の補因子は必要でな
い。

両測定方法とも、被験体の使用量は特に限定なく種々変
化させることができるが、反応系に存在する基質の量
（ａナノモル（nmol）とする）に対し、好ましくはa pm
ol/hr以上、さらに好ましくは10×a pmol/hr以上、もっ
とも好ましくは10×a pmol/hr〜a mol/hr〔単位は酵素
活性を示し、37℃１時間で反応しうる基質量（例えばピ
コモル（pmol）で表示する。〕の酵素活性を含有するよ
うに調整するのが適当である。

インキュベーションは、１〜55℃、特に前者では好まし
くは25〜40℃、特に好ましくは30℃付近で振盪しながら
２〜24時間反応させ、後者では好ましくは15〜35℃、も
っとも好ましくは25℃付近で静置して１分〜48時間行
う。

以上の工程で、それぞれ生成する式（II）の化合物およ
び式（III）の化合物の検出は、それらの基質と生成
物、例えば、前者では式（Ｉ）の化合物と式（II）の化
合物、後者では式（II）の化合物と式（III）の化合物
を分離測定できる方法であればどのような方法でも使用
できる。一般に分離測定は、以下のクロマトグラフィー
で分離、精製して行うことができる。上記に使用できる
クロマトグラフィーとしては、イオン交換クロマトグラ
フィー、逆相クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニ
ティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィ
ー（HPLC）、薄層クロマトグラフィー（TLC）などが挙
げられる。後者の反応系における式（II）で示される基
質と式（III）で示されるアミド化された生成物は、Ｃ
末端がそれぞれカルボキシル基とアミド基であり、電荷
が異なっている。この性質を用いたイオン交換クロマト
グラフィー、逆相クロマトグラフィーなどが好適であ
る。また、生成物の抗体を用いたアフィニティークロマ
トグラフィーも有効である。しかしながら、前者の反応
系における式（Ｉ）で示される基質と式（II）で示され
る生成物は、通常のクロマト処理では分離がかなり困難
であるが、本発明者らが初めて試みたアセトニトリル含
有緩衝液（pH6〜10、好ましくはpH9）を溶出液として用
いる高速液体クロマトグラフィー（HPLC）によれば有利
に分離測定できる。溶出液は、特にアセトニトリル濃度
の直線濃度勾配をかけて行うのがよい。HPLCのカラムと
しては、本目的に適するものであれば市販のどのような
種類のカラムを使用することもできるが、特に、カプセ
ルパックC18SG,300Å（資生堂製）を使用するのが有利
である。

かくして、それぞれ分離された基質と生成物はそれらの
（必要により結合された）いずれかの化学的または物理
的標識について測定すればよい。この測定には、既知の
標識、既知の測定法が使用でき、一般には基質ペプチド
を構造するアミノ酸に由来するUV吸収を利用するのが好
都合であろう。

以上の測定方法は正確かつ簡便であるので、これらを前
述の生物学的流体に適用することにより、それぞれ酵素
−Ｉまたは酵素−IIの活性を有する酵素の探索を行うこ
とができる。かかる探索方法は、それぞれ本出願の第８
および第９の発明として提供される。

探索の対象となる生物学的流体は、前述の酵素活性を有
することが予測されるものは無論のこと、その他動植物
の生体細胞、組織、抽出液のいずれをも包含する。例え
ば、抽出液は、「実験生物学講座６、細胞分画法」（丸
善、1984）、「生化学実験講座５、酵素研究法（上）」
（東京化学同人、1975）、「基礎生化学実験法１、生物
材料の取扱い方」（丸善1974）、などに記載の一般的な
抽出法に準じて調製すれば良い。

〔実施例〕

次に実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。な
お、本発明はこれによって限定されるものではない。

実施例１ 基質類似体親和性クロマトグラフィー用ゲル
の調製 5mlのアフィゲル10を、イソプロパノールを満たした10m
l容エコノカラム（バイオラッド社製）に計り取った。
イソプロパノールを流し出したのち、50mlの10mM酢酸ナ
トリウム緩衝液（pH4.5）、次いで10mlの0.1Mモップス
−水酸化ナトリウム緩衝液（80mM塩化カルシウムを含
む、pH7.5）で洗浄した。ゲルを20ml容のビンに移した
あと、40mg（約100μmol）のフェニルアラニルグリシル
フェニルアラニルグリシン（Phe−Gly−Phe−Gly、シグ
マ社製）を溶解した上記モップス−水酸化ナトリウム緩
衝液10mlと混合し、４℃で18時間振盪反応させた。その
のち、0.5mlの1Mトリス−塩酸緩衝液（pH8.0）を加えて
４℃で１時間振盪反応し、未反応の活性基を不活化し
た。ゲルを前記モップス−水酸化ナトリウム緩衝液、次
いでイオン交換水で洗浄後、0.02％NaN₃に懸濁し、カラ
ムに充填、４℃で保存した。なお、反応に供したペプチ
ド（Phe−Gly−Phe−Gly）の量と回収された溶液中のペ
プチド量から、ゲル1mlあたり約10μmol結合していると
算出された。

実施例２ 基質としてのフェニルアラニルグリシルフェ
ニルアラニルヒドロキシルグリシンの調製 フェニルアラニルグリシルフェニルアラニルグリシン
（FGFG）（シグマ社製）3mgを測り取り、50mMヘペス−
水酸化カリウム緩衝液（pH5.5）、3mMアスコルビン酸、
10mMヨウ化カリウム、0.25mg/mlカタラーゼ、0.25nM硫
酸銅、7.5％アセトニトリル及び国際特許出願JP89−005
21号明細書の実施例２に記載するようなウマ血清由来の
アミド化酵素組成物を200μ添加し総量10mlとし、30
℃で20時間、好気的にアミド化反応をおこなった。反応
は10％ギ酸添加で停止させ、高速液体クロマトグラフィ
ー（HPLC）を用いて、フェニルアラニルグリシルフェニ
ルアラニルヒドロキシルグリシン（FGFhyG）を分取し
た。HPLCのカラムはカプセルパックC18SG,300Å（資生
堂製）を用いた。溶出溶媒は、1mM炭酸水素アンモニウ
ム（pH9.0）およびアセトニトリルを使用し、アセトニ
トリルを０％から40％まで30分で増加させる直線濃度勾
配をかけた。ペプチドは214nmの吸収で検出した。結果
を第１図に示した。10.7分のフェニルアラニルグリシル
フェニルアラニルグリシンのピークは、Ｃ末端アミド化
反応によりほとんど消滅した。それに伴ない、9.9分の
α−ヒドロキシグリシン誘導体および14.5分のアミド化
体のピークが見られた。これらの物質は、FAB−MSスペ
クトル分析およびNMR分析により構造確認した。第２図
に、グリセリン溶液中のFAB−MSスペクトルの結果を示
した。親ピークは分子量442をあらわしており、そして
フラグメンテーションの結果、Ｃ末端に存在する−OH基
が１つまたは２つ飛んだ425および408m/zのフラグメン
トが確認され、α−ヒドロキシルグリシン付加体である
ことを示していた。9.9分のピークを分取し、すみやか
に10％ギ酸溶液とし、凍結乾燥することにより本発明の
酵素−II用の基質を調製した。この基質は、前記アミド
化酵素組成物に代え、本発明の酵素−Ｉ含有物を用いて
も同様に調製することができた。前述のごとく、α−ヒ
ドロキシルグリシン誘導体は酸性条件では安定である
が、アルカリ条件では不安定であり、酵素反応とは無関
係にアミド化物とグリオキシル酸に分解する。従って、
本実施例の最初におこなったＣ末端アミド化反応は、酸
性条件で実施した。このとき、pH7.5以上で反応させる
と、α−ヒドロキシルグリシン誘導体は確認できなくな
る。公知のＣ末端アミド化酵素が前述の式（Ｉ）で示さ
れるＣ末端グリシン付加体から式（III）で示されるＣ
末端アミド化物とグリオキシル酸に変換すると考えられ
ていたのは、このアルカリ条件での非酵素的変換が含ま
れているためであり、酵素自体の触媒反応は、式（Ｉ）
で示されるＣ末端グリシン付加体から式（II）で示され
るＣ末端α−ヒドロキシルグリシン付加体への変換反応
である。従って、従来のＣ末端アミド化酵素による酸性
条件下でのアミド化反応の収率は、一般に低いものであ
った。

実施例３ ウマ血清からの酵素−Ｉの調製 （１）市販のウマ血清（ギブコ社製）100mlに、ポリエ
チレングリコール6000（和光純薬）25％水溶液（w/v）
を100ml、すなわち最終濃度12.5％になるように攪拌し
ながら序々に添加した。なお、以下すべて４℃にて操作
を行った。12時間静置後、遠心分離（10,000×ｇ、10
分）し、得られた沈澱を120mlの10mMヘペス−水酸化カ
リウム緩衝液（pH7.0）に溶解した、さらに２時間静置
後、生成した不溶性物質を再び遠心分離（10,000×ｇ、
10分）で除き、酵素−Ｉを含む上澄（127ml）を得た。

（２）上記（１）で得た活性画分を、10mMヘペス−水酸
化カリウム緩衝液（pH7.0）で平衡化したヘパリンセフ
ァロースCL−6B（ファルマシア社製）を充填したカラム
（1.6×15cm）にかけた。同緩衝液96mlで非吸着物質を
洗い出した後、0.5M塩化ナトリウムを含む10mMヘペス−
水酸化カリウム緩衝液（pH7.0）で溶出を行った（流速3
0ml（/hr）。第３図に溶出パターンを示した。0.5M塩化
ナトリウム含有緩衝液によって酵素−Ｉは溶出された
〔フラクション番号No.14〜16を集める（100ml）〕 （３）上記画分を、Sephadex G−25ファイン（ファルマ
シア社製）、カラムクロマトグラフィー（5cmφ×23c
m）を用いてゲル濾過をおこなった。溶媒は、10mMヘペ
ス−水酸化カリウム（pH7.0）を用い流速2ml/minで溶出
した。蛋白質は280nmの吸光で検出し、蛋白質を含むフ
ラクション100mlを集めた。

（４）実施例１に従って作製したアフィゲル10−Phe−G
ly−Phe−Glyゲル5mlをカラムに充填し（1.0×6.0c
m）、0.1M塩化ナトリウムを含む10mMヘペス−水酸化カ
リウム緩衝液（pH7.0）で平衡化した。このカラムに上
記（３）で得た試料（18.1ml）をかけた。酵素−Ｉを十
分にゲルに吸着させるために、カラムを通過した液を何
回もカラムを通るように循環させた（流速20ml/hr）。1
2時間後、循環を止め、非吸着物質を35mlの平衡化に用
いた緩衝液で洗い出したのち、0.4M塩化ナトリウム、20
％アセトニトリルを含む8mMヘペス−水酸化カリウム緩
衝液（pH7.0）で溶出を行った（流速20ml/hr）。酵素−
Ｉの活性は溶出画分（10ml）にのみ認められた。

（５）上記（４）で得た精製物を、再び上記（３）の処
理を行った後、10mMヘペス−水酸化カリウム緩衝液（pH
7.0）で平衡化したMonoQカラム（ファルマシア製0.5×5
cm）にのせ、同一緩衝液中でNaClの直線濃度勾配を第３
図のようにかけ、蛋白質を溶出させた。このとき、流速
は0.5ml/minとした。

第１表に、上記（１）〜（５）で行った精製の各工程で
の全蛋白質、全酵素活性、比活性、収率および精製倍率
を示した。

活性測定法は、実施例２に記載のFGFGからFGFhyGの調製
方法に準ずる反応を各精製物について実施し、そこに記
載のHPLCによりFGFhyGを定量することで行った。酵素活
性1Uは、1nmoleのFGFhyGが37℃１時間で生成する量とし
た。

なお、蛋白質量の測定は、ローリーの改良法（Bensadou
nら、Anal.Biochem.,70,265,1976）を用い、標準曲線は
牛血清アルブミン（フラクションＶ、シグマ社製）で作
製した。

第１表で示したように本酵素は、収率２％で約500倍に
精製できた。さらに精製が必要な場合には前記工程
（３）〜（５）を繰り返すか、それらのいずれかの工程
を繰り返せばよい。

実施例４ ウマ血清からの酵素−IIの調製 各精製工程を酵素−IIの活性を追いながら行った以外は
実施例３と同様にウマ血清を処理した。

各精製工程（１）〜（５）の全蛋白質、全酵素活性、比
活性、収率および精製位率を第２表に示す。

活性測定は、10mMヘペス−水酸化カリウム（pH6.5）中
に実施例１で得たフェニルアラニルグリシルフェニルア
ラニルヒドロキシルグリシン（FGFhyG）を5mM濃度に溶
解し、各段階の試料を添加し、総量100μとして30℃
で反応させた。１時間反応後10％ギ酸添加により反応を
停止し、実施例２の条件を用いHPLCで反応生成物を定量
した。このとき、試料無添加のコントロールの反応もお
こない、非酵素的変換がほとんど進んでいないことを確
認した。反応溶液のHPLCパターンを第４図に示す（図中
の反応条件は、37℃pH6.9で反応時間は図中に示した）
活性はユニット（Ｕ）で表示した。1Uは、1nmolのFGF−
NH₂を30℃１時間で生成する酵素量と定義した。

なお、蛋白質量の測定は、実施例３と同様に行った。

第２表で示したように本酵素は、収率２％で、約1800倍
に精製できた。

〔発明の効果〕

本発明の酵素は、式（Ｉ）で示されるＣ末端グリシン付
加体から式（III）で示されるＣ末端アミド化物の製造
に際し、使用可能である。また、酵素−Ｉおよび酵素−
IIを併用することにより、式（II）で示されるＣ末端α
−ヒドロキシルグリシンは付加体が加水分解されないよ
うな温和な反応条件下で効率的に式（III）で示される
Ｃ末端アミド化物を製造することが可能になる。さら
に、本発明の調製方法は、前記本発明の酵素組成物を効
率よくかつ高収率で調製できる効果を有する。

本発明のそれぞれの酵素活性測定方法は、Ｃ末端グリシ
ン付加体から式（II）で示されるＣ末端α−ヒドロキシ
ルグリシン付加体へ変換する酵素活性および式（II）で
示されるＣ末端ヒドロキシルグリシン付加体からＣ末端
アミド化物へ変換する酵素活性を迅速かつ正確に定量す
ることを可能とする。また、これを用いた酵素探索方法
は、従来知ることのできなかった前記活性を有する酵素
の探索を可能にする。

【図面の簡単な説明】

第１図は、FGFGを基質とし、本発明の酵素−Ｉを用い
て、FGFhyGを製造するときのHPLCパターンである。 第２図は、調製したFGFhyGの分子構造を確認するために
おこなったFAB−MSスペクトル分析の結果を示す。 第３図は、Mono Qカラムのクロマトグラフィーによる本
発明の酵素−Ｉと酵素−IIの分離を示したクロマトパタ
ーンである。白四角のプロットは酵素−IIの活性を示
し、黒丸のプロットは酵素−Ｉの活性を示し、破線は食
塩の直線濃度勾配を示す。 第４図は、FGFhyGを基質とし、本発明の酵素−IIを用い
てFGF−NH₂を製造するときの経時的なHPLCパターンであ
る。

フロントページの続き (72)発明者 田島 正裕 神奈川県横浜市港北区新羽町1050番地 株 式会社資生堂研究所内 (72)発明者 柳 光男 神奈川県横浜市港北区新羽町1050番地 株 式会社資生堂研究所内 (72)発明者 岡本 宏 宮城県仙台市青葉区角五郎２―15―３― 205

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】次式（Ｉ） （上式中、Ａは、天然のα−アミノ酸に由来するα−ア
   ミノ基もしくはイミノ基およびα−カルボキシル基以外
   の残基を表しており、Ｘは、水素原子またはカルボニル
   基を介してＮ原子と結合するアミノ酸誘導体の残基を表
   す）で示されるＣ末端グリシン付加体に作用して、次式
   （II） （上式中、ＡおよびＸは、前記の意味を表す）で示され
   るＣ末端α−ヒドロキシグリシン付加体を生成し、か
   つ、ゲル濾過を使用する分子量決定法により約25,000ダ
   ルトンの分子量を有し、至適pHが約５〜７でかつ安定pH
   が４〜９であり、そして作用適温が25〜40℃である、Ｃ
   末端グリシン付加体のＣ末端アミド化に関与する酵素。
2. 【請求項２】請求項１記載の酵素活性含有物を、前記式
   （Ｉ）で示されるＣ末端グリシン付加体をリガンドする
   基質親和性クロマトグラフィー、および陰イオン交換ク
   ロマトグラフィーで処理することを特徴とする請求項１
   記載のＣ末端アミド化に関与する酵素の調製方法。
3. 【請求項３】前記式（Ｉ）で示されるＣ末端グリシン付
   加体を請求項１記載の酵素で処理することを特徴とする
   前記式（II）で示されるＣ末端α−ヒドロキシグリシン
   付加体の製造方法。
4. 【請求項４】（ｉ）請求項１記載の酵素の活性を有する
   ことが予測される被験体をpH5〜８に緩衝化する工程、 （ii）この緩衝溶液に前記式（Ｉ）で示されるＣ末端グ
   リシン付加体、Ｌ−アスコルビン酸およびカタラーゼを
   添加してインキュベーションする工程、ならびに （iii）生成する式（II）で示されるＣ末端α−ヒドロ
   キシルグリシン付加体をpH6〜10のアセトニトリル含有
   溶出液を使用するHPLCで検出する工程、を含むことを特
   徴とする前記酵素活性の測定方法。
5. 【請求項５】請求項４記載の測定方法を被験体に適用す
   ることを特徴とする請求項１記載の酵素の探索方法。