JPH0740957B2

JPH0740957B2 - ペルオキシダーゼ活性測定用の色原体水溶液

Info

Publication number: JPH0740957B2
Application number: JP62314295A
Authority: JP
Inventors: 了一長谷川; 建夫古木; 貴明窪田; 英明鈴木
Original assignee: Teijin Ltd
Current assignee: Teijin Ltd
Priority date: 1987-07-24
Filing date: 1987-12-14
Publication date: 1995-05-10
Anticipated expiration: 2010-05-10
Also published as: JPH01104196A

Description

【発明の詳細な説明】 a.産業上の利用分野本発明は、ペルオキシダーゼ酵素活性を測定するための
色原体水溶液に関する。更に詳しくは、ペルオキシダー
ゼ標識抗体又は抗原を用いる酵素免疫測定方法におい
て、該酵素活性を測定するための、安定でしかも再現性
の良い3,3′,5,5′−テトラアルキルベンジジン又はそ
の塩の色原体水溶液および該色原体水溶液と過酸化物の
水溶液からなる基質溶液を用いて該ペルオキシダーゼ活
性を測定する方法に関する。

b.従来の技術最近、体液中の成分、例えば血液中あるいは尿中の抗原
または抗体などを測定する方法として、抗原または抗体
を酵素で標識した酵素免疫測定法が普及している。代表
的な方法としてサンドイッチ法があるが、この方法では
（１）まず測定しようとする物質（抗原）に対する第１
の抗体をビーズなどの担体に固相化しておき、これに抗
原を加えて抗原を固相化抗体に結合する。（２）次いで
酵素で標識した第２抗体を加え、固相化抗体−抗原標識
抗体複合体を形成する。（３）そして抗原に結合しなか
った酵素標識抗体を洗浄して除去し、その後固相に結合
した酵素活性を測定することにより抗原量を求める。す
なわち、酵素活性は固相に結合した酵素標識抗体の量に
よって決まり、その酵素標識抗体量は固相化抗体に結合
した抗原量によって決まるので、酵素活性は抗原量を表
わすことになる。ここで酵素としては、分子量が比較的
小さく、反応が早く、短時間で感度の高い測定が期待で
きるためペルオキシダーゼが広く用いられている。

さて、ペルオキシダーゼ活性は種々の反応方法で測定さ
れるが、過酸化物の存在下、色原体を酸化させることに
より色素を形成させ、これを比色定量する方法が最も一
般的に行なわれている。かかる色原体としては種々のも
のが使用されるが、テトラアルキルベンジジン、なかで
も非常に鋭敏な感度が得られ、且つ非発癌性である3,
3′,5,5′−テトラメチルベンジジン（以下、TMBとい
う）が開発され（Tetrahedron 30巻,3299頁,1974年参
照）、その有用性のためテストストリップ（特開昭52−
21892号公報）やサンドイッチ法に用いられている（特
開昭62−28666号公報）。

しかしながら例えば、TMBは、水に対する溶解性が極め
て悪く、このため従来はTMBをメタノールなどの有機溶
媒に溶解する方法（米国特許第4,503,143号明細書）
や、Ｎ−メチルピロリドンを含有する水性媒体に溶解す
る方法（特表昭62−500882号公報）や、70％イソプロピ
ルアルコールに溶解後これに緩衝液を加えてpH約８の溶
液とする方法（特開昭62−28666号公報）などの工夫が
されて用いられてきた。

しかしながらTMBをメタノールに溶解する方法は、メタ
ノールが人体にとって有害であるばかりでなく引火性の
ある危険物でもあり、商業生産上著しく制限を受ける。
また、溶解性も必ずしも十分でなく、そのため酵素反応
に必要な量を溶解して４℃に保存すると結晶が析出した
り、あるいはまたメタノールが揮発し易いという問題点
を有している。更に、酵素反応の基質溶液として使用す
る際には、過酸化水素を含有する水性媒体とTMBのメタ
ノール溶液を混合して反応に供するが、この混合の際に
時として濁りを生じたり、また、酵素反応後に酸化体が
析出する場合も見られ、ペルオキシダーゼ活性を測定す
る上で精度，再現性の点において未だ満足できるもので
はない。

また、Ｎ−メチルピロリドンを含有する水性媒体に溶解
する方法においても有機溶剤を取扱う点で好ましくな
く、TMBと過酸化水素とからなる基質溶液の安定性や再
現性の点でも必ずしも十分ではない。

70％イソプロピルアルコールに溶解してから緩衝液を加
えてpHを約８に調整する方法も、同様な問題に加えて調
製操作が煩雑であるなどの欠点を有する。

上記のような従来技術の問題点を解決するため、最近に
なってTMBと過酸化物及びpH2.5〜3.9の範囲に調整する
緩衝物質を含有する水溶液による方法が開示されている
（特開昭62−134100号公報）。

しかしながら、本発明者らによれば、この方法をもって
してもペルオキシダーゼ活性を測定する上で、感度の点
において未だ満足できるものではない。

c.問題点を解決するための手段本発明者らは、かかる事情に鑑みて、TMB等のテトラア
ルキルベンジジンの特性を損うことなく、有機溶媒を用
いずに簡単に調製でき、かつ保存安定性及び感度に優れ
たテトラアルキルベンジジン又はその塩の酵素免疫測定
用の色原体水溶液および正確で再現性の良い基質溶液を
開発すべく鋭意研究の結果、特定の濃度及びpH範囲のテ
トラアルキルベンジジン又はその塩の水溶液とするこ
と、及びそのような水溶液と過酸化物を混合して、特定
の濃度のテトラアルキルベンジジン等を含有し、且つ限
られたpH範囲の基質溶液を用いてペルオキシダーゼ活性
を測定することにより上記目的が達成されることを確認
し、本発明に到達した。

即ち本発明の第１の発明は、0.01〜0.5重量％のテトラ
アルキルベンジジン又はその塩を含有し、且つpHが1.0
〜2.5である酵素免疫測定用の色原体水溶液である。

かかる色原体水溶液のテトラアルキルベンジジンとは、
アルキル部分中に１〜３個の炭素原子を含有するもので
あり、なかでも3,3′,5,5−テトラメチルベンジジンが
好ましい。また、このテトラアルキルベンジジンの塩と
しては、例えば塩酸塩，又は硫酸塩等の無機酸塩が挙げ
られるが、溶解性および商業的入手性の点から3,3′,5,
5′−テトラメチルベンジジンの二塩酸塩が好ましい。

本発明の色原体水溶液は、テトラアルキルベンジジンの
場合には酸性の水溶液に溶解してからpHを調整すること
により得ることができる。またその塩の場合には、単に
水に溶解してからpHを調整する等の方法で得ることがで
きる。

本発明の色原体水溶液において、テトラアルキルベンジ
ジン又はその塩の濃度は0.01ないし0.5重量％である。
0.5重量％以上では溶解性の点で問題があり、0.01重量
％以下では実質的に感度よく発色させるのに不十分であ
る。好ましくは0.02ないし0.2重量％である。

また色原体水溶液のpHは1.0ないし2.5であり、pHが2.5
より大となると溶解性が不十分であり、また色原体水溶
液の安定性が不十分で保存中に水溶液のベースの色がつ
き易くなる。一方、1.0より下がるとpHのコントロール
が不十分となり、過酸化物水溶液と混合して基質溶液を
調製するに際し、pHの変動が生じ易く再現性の点で好ま
しくない。好ましくはpH1.5ないし2.5であり、この範囲
で最良の結果が得られる。また、色原体水溶液の調製に
際しては、色原体と水および酸だけで十分であるが、こ
れに、必要に応じて塩類や安定剤などを添加してもよ
い。

本発明の第２の発明は、第１の発明の色原体水溶液を使
用する方法であって、ペルオキシダーゼ標識抗体又は抗
原を用いる酵素免疫測定方法において、（１）0.01〜0.5重量％のテトラアルキルベンジジン又
はその塩を含有し、且つpHが1.0〜2.5である色原体水溶
液と、（２）過酸化物を含有する水溶液とを混合して、0.003〜0.15重量％のテトラアルキルベ
ンジジン又はその塩及び１〜20mMの過酸化物を含有し、
且つpHが3.9より大で4.5以下である基質溶液を作成し、
該基質溶液を用いてペルオキシダーゼ活性を測定するこ
とを特徴とする酵素免疫測定方法である。

本発明の基質溶液に含有されるテトラアルキルベンジジ
ン又はその塩及び過酸化物の量は、測定すべきペルオキ
シダーゼの性状および濃度に大きく依存するが、好まし
くはテトラアルキルベンジジン又はその塩が0.01〜0.06
重量％、過酸化物が2mM〜6mMの範囲である。

そして重要なことは基質溶液のpHを3.9より大で4.5以下
とする点である。好ましくはpHが4.0〜4.2である。pHが
低すぎると酵素活性が阻害され発色が不十分となり、従
って感度が低下する。例えば、pH4.0のときの発色を100
とすると、pH3.5では約63、pH3.0では約13にまで低下す
る。またpHが高すぎると、濃度にも依存するが色原体の
析出が見られるようになり不都合である。

このように、基質溶液のpH,色原体濃度，および過酸化
物濃度を制御することにより、テトラアルキルベンジジ
ン等の特性を損うことなく十分に高感度でかつ再現性よ
くペルオキシダーゼ活性を測定することができる。

本発明の過酸化物とは、ペルオキシダーゼの存在下で色
原体を酸化することができるものであり、例えば過酸化
水素，メチルハイドロパーオキシド，過酸化尿素等が挙
げられるが、特に過酸化水素が好ましい。本発明の過酸
化物の水溶液は安定したpHで酵素反応を行わしめるため
に、水性緩衝液であることが好ましい。かかる緩衝液は
例えばリン酸水素二ナトリウムとクエン酸から容易に調
整することができる。また、かかる緩衝液における過酸
化物の濃度も、本発明の色原体水溶液と混合されたとき
の過酸化物の濃度が１〜20mMとなるように調整されたも
のであればよい。

したがって本発明の色原体水溶液と過酸化物の水溶液の
混合比や混合法も特に限定されるものではない。

また、本発明の第３の発明は、ペルオキシダーゼ標識抗
体又は抗原を用いる酵素免疫測定用キットにおいて、基
質溶液を形成するものとして、（１）0.01〜0.5重量％のテトラアルキルベンジジン又
はその塩を含有し、且つpHが1.0〜2.5である色原体水溶
液と、（２）1.25mM〜40mMの過酸化物を含有する水溶液を有す
ることを特徴とする酵素免疫測定用キットである。

ここで述べられた色原体水溶液および過酸化物水溶液は
それぞれ別の容器に収容され、測定キットの形で供給す
ることができ、測定の際例えば2:8〜8:2の割合で混合さ
れることによって、既述の第２の発明の基質溶液を形成
する。

本発明でいうペルオキシダーゼ標識抗体または抗原を用
いる酵素免疫測定方法とは、石川榮治らの編集「酵素免
疫測定法」医学書院発行1982年,30−49頁に記載されて
いるような酵素免疫測定法であって、ペルオキシダーゼ
標識抗体または抗原を用い、ペルオキシダーゼ活性量を
過酸化物および色原体からなる基質溶液を用いて測定す
る方法ならいずれの方法にも適用される。また、ペルオ
キシダーゼとは、西洋わさび，牛乳，酵母，白血球，赤
血球等から抽出されるものが挙げられ、特に西洋わさび
のペルオキシダーゼが好ましい。

また、免疫測定法で測定対象となる物質は特に限定され
るものではないが、例えばヒト絨毛性ゴナドトロピン
（HCG），黄体形成ホルモン（LH），卵胞刺激ホルモン
（FSH），甲状腺刺激ホルモン（TSH），プロラクチンな
どのホルモン，またはそれらの抗体；α_２−プラスミン
インヒビター（α₂PI），α_２−プラスミンインヒビタ
ー−プラスミン複合体，プロティンC,プロティンS,プラ
スミノーゲン，アンチトロンビンIII,アンチトロンビン
III−トロンビン複合体，組織プラスミノーゲンアクチ
ベーター，プラスミノーゲンアクチベーターインヒビタ
ーおよびこれらの複合体などの凝固関連因子またはその
抗体；α−フェトプロテイン，ハプトグロブリン,HBs抗
原，肺サーファクタント蛋白特にアポ蛋白（LSP），免
疫複合体,TNF,インターロイキンI,インターロイキンII
などの蛋白類またはその抗体；単純ヘルペスウイルス，
サイトメガロウイルスなどのウイルスまたはその抗体な
どが挙げられる。また抗体としてはポリクローナル抗
体，モノクローナル抗体のいずれでもよい。

本発明のペルオキシダーゼ標識抗体としては、かかる測
定対象物質に対するポリクローナル抗体又はモノクロー
ナル抗体が挙げられるが、なかでも抗プロティンＣ抗
体，抗プロティンＳ抗体，抗α_２−プラスミンインヒビ
ター抗体，抗LSP抗体，抗HCG抗体，及び抗IgA−α鎖抗
体−Ｆ（ab′）_２フラグメント等が好ましい。なかでも
特にこれらのモノクローナル抗体が好ましい。

本発明においては、抗プロティンＣモノクローナル抗体
としては例えば特開昭61−134399号公報及び特開昭61−
283868号公報に、また抗α₂PIモノクローナル抗体とし
ては、例えば特開昭60−222426号公報及び特開昭61−91
200号公報に詳しく記載された方法によって得られたも
のを用いることができる。

更に抗ヒトLSP−モノクローナル抗体としては、例えば
特開昭61−277699号，及び特開昭61−274678号公報に記
載された方法によって得られたもの、特にマウス抗ヒト
LSP−モノクローナル抗体であるPC6,PE10を用いること
ができる。

e.効果かくして、本発明により、テトラアルキルベンジジン等
の特性を損うことなく、簡単かつ安全に調製できる上に
保存安定性及び感度にも優れた色原体水溶液を供給する
ことが可能となった。また、該色原体水溶液と過酸化物
水溶液とからなる制御された基質溶液を用いることによ
り正確で再現性がよくかつ高感度にペルオキシダーゼ活
性を測定することが可能となった。

本発明を以下実施例等によって説明するが、これによっ
て限定されるものではない。

以下において％表示は重量％を表わす。

参考例１抗ヒト・プロティンＳ（PS）モノクローナル
抗体の製造及び精製精製したヒト・PSを雌のBalb/Cマウス（４周齢）２匹に
対して14日間隔で４回免疫した。初回の免疫はリン酸緩
衝生理食塩水（以下PBS）に溶解した50μｇのヒト・PS
を等量のフロイントの完全アジュバント（Complete Fre
und′s adjuvant）と混合し、そのエマルジョンを、腹
腔内に投与し（0.5mg/head）、２回目,3回目は、同じく
50μｇのヒト・PSをフロイントの不完全アジュバント
（Freund′s incomplete adjuvant）と混合し、同じく
腹腔内に投与した。最終免疫は30μｇのヒト・PSをPBS
溶液のまま、マウス尾静脈から追加投与した。最終免疫
の３日後に免疫したマウスの脾臓細胞を細胞融合に用い
た。

免疫したマウスの脾臓細胞と、同系マウスの骨髄腫細胞
（P3U1）を約2:1〜約15:1の割合で混合し、50％ポリエ
チレングリコール1540（和光純薬（製））を融合促進剤
としてKohlerとMilsteinの方法に従い細胞融合を行なっ
た。融合後の細胞は、１×10⁶cells/mlの細胞濃度とな
るように10％FCS・RPMI−1640倍地に懸濁し、96wellsマ
イクロプレート（Coster）に１ウエルあたり100μず
つ分注した。

融合細胞は、CO₂インキュベーター（５％CO₂,37℃）中
で培養し、ヒポキサンチン，アミノプテリン；チミジン
を含む培地（HAT培地）で培地交換を行ない、HAT培地中
で増殖させて、脾臓細胞と、骨髄腫細胞から成るハイブ
リドーマのスクリーニングを行った。

ハイブリドーマの培養上清中の抗体は抗原ヒト・PSをコ
ーティングしたマイクロタイタープレートを用いELISA
法により検出した。第２抗体には、アルカリホスファタ
ーゼ標識ウサギ抗マウスIgG抗体を用い、抗原PSに対す
る結合性を調べた。融合細胞をまいた合計494のウエル
のうち、487のウエルにコロニーの形成が認められ、こ
のうち抗原PSに対して結合性を示す抗体産生陽性ウエル
は94ウエルであった。

これらの抗体産生陽性ウエルのうち４つのウエルについ
て限界希釈法によるクローニングを２回繰り返して行な
い、６個のクローンを得た。得られたクローンは、90％
牛胎児血清（FCS）−10％DMSO中に懸濁させ液体窒素中
に保存した。各クローンの産生するモノクローナル抗体
をクローンをBalb/Cマウス腹腔内で増殖させ、その腹水
からプロティンＡ−Sepharose 4Bカラムを用いて精製し
た。

以上を第１表にまとめた。

参考例２精製したモノクローナル抗体の性質マウス腹水から精製した各クローンのIgGについてクラ
ス及びヒト・PSに対する結合性を調べた。

マウスモノクローナル抗体のクラスは、各クラス特異性
の抗マウス抗血清を用いて、オクタロニー法により決定
した。

この結果を下記第２表に示した。

ヒト・PSに対する結合性は、マイクロタイタープレート
に固相化したヒト・PSと適当な濃度になるように希釈し
たモノクローナル抗体とを反応させ、アルカリ性ファス
ファクターゼ標識化したヤギ抗マウスIgGで検出するこ
とにより評価した。

その結果６種類のモノクローナル抗体のヒト・PSに対す
る結合の強さは、2B9F12〜2B9C10＞3C3G8＞3C4G4＞2B9G
3＞＞2E12C7であることが判明した。

この６種類のモノクローナル抗体のヒト血漿中のC4bp−
PS複合体との結合性を検討したところ、結合性の強さ
は、2E12C7＞＞2B9F10〜2B9C12＞3C3G8＞3C4G4＞2B9G3
であることが判明した。

以上の結果からC4bpとPSとの複合体は認識せず、フリー
のヒト・PSを特異的に認識して結果し得るモノクローナ
ル抗体として2B9F12及び2B9C10が得られた。

実施例１＜色原体水溶液の安定性＞（１）色原体水溶液の調整 3,3′,5,5′−テトラメチルベンジジン二塩酸塩（以下T
MB・2HClという）0.25gを蒸留水500mlに撹拌しながら溶
解し、0.05％の水溶液を得た。同様にTMB・2HCl1g用い
て、0.2％水溶液を得た。これらをHCl水溶液またはNaOH
水溶液で調整して、第３表に記載したようにpHの異なる
色原体水溶液（No.1−〜１〜）を調製した。

（２）色原体水溶液の加速試験（１）で調整した色原体水溶液を入れた試験管を、50℃
の恒温器に入れ加速試験を実施した。水溶液の色の経時
変化を650nmの波長で測定し、結果を第３表に示した。

第３表から、本発明のpH1.0〜2.5の範囲において色原体
水溶液が安定であることが判る。

一方、pHが3.5以上のものは溶解せず、またpHが2.5より
大となると溶解性が不十分で、保存中に色原体水溶液に
着色が見られた。pHが1.0より下がると着色の点では安
定であるが、基質溶液調整の再pHのコントロールが困難
であった。

実施例２＜基質溶液の安定性＞（１）基質溶液の調整１） 3,3′,5,5′−テトラメチルベンジジン水溶液の
調整 TMB・2HClを0.25％および0.05％含有するpH2.0の色原体
水溶液２種類を調整した。

２）過酸化水素水溶液の調整 pH4.10,4.30,4.50,4.80に調整した0.1Mリン酸水素二ナ
トリウム−クエン酸緩衝液のそれぞれに過酸化水素を5.
0mM含有せしめ、過酸化水素水溶液４種類の調整した。

３）基質溶液の調整１）で調整した色原体水溶液と２）で調整した過酸化水
素水溶液とを第４表に記載の組合せで3:7の容量比で混
合し、基質溶液（No.2−〜−a,2−〜−ｂ）８
種類を調整した。

第４表の組み合せのうち、pH4.80のH₂O₂水溶液を用いた
もの（No.2−−ａ及び−ｂ）は、最終pHが4.65とな
り、TMBが析出した。

これに対しpH4.5,pH4.3とpH4.1のH₂O₂水溶液を用いたも
の（２−〜−ａ及び−ｂ）の最終pHは、本発明の範
囲であって、各々4.35,4.18及び4.02であり、TMBの析出
は認められなかった。

（２）基質溶液の安定性（１）で調整した基質溶液のうち、No.2−−ｂ（0.01
5％TMB・2HCl,3.5mM/ H₂O₂,pH4.02）を室温で静置
し、経時的にこの溶液の色の変化を650nmで測定し、結
果を第５表に示した。

第５表から明らかなように、本発明の基質溶液は２時間
後までほとんど問題となる変化は認められなかった。

実施例３＜プロテインＣの測定＞（１）基質溶液の調製実施例２と同様にして0.015％TMB・2HCl及び3.5mM過酸
化水素を含有する基質溶液（pH4.02）を調製した。

（２）プロテインＣの測定抗プロテインＣモノクローナル抗体に0.01M PBS（pH7.
4）を加えて蛋白質濃度が10μg/mlの抗体溶液を調整
し、これにポリスチレンビーズを加えて一夜浸漬した。
ビーズを分離してPBSで洗浄後、0.5％牛血清アルブミン
含有PBS（BSA−PBS）中に一昼夜浸漬し抗プロティンＣ
抗体固定ポリスチレンビーズを得た。プロティンC100ng
/ml,50ng/ml,12.5ng/ml,0ng/mlを含む0.5％BSA−10mM C
aCl₂−0.05Mトリス/HCl溶液（pH7.4）200μを各々試
験管に採り、これに前記の抗体固定ボール各１個と常法
に従って西洋わさびペルオキシダーゼで標識した標識抗
プロテインＣモノクローナル抗体の0.5％BSA−PBS溶液2
00μを加え、37℃で30分反応させた。

次いで、10mM CaCl₂を含む生理食塩液にてビーズを洗浄
後、上記（１）で調製した基質溶液400μを加えて、3
7℃で15分反応させて発色させた。

更に、これに0.1％NaFを含む２％酢酸水溶液1.0mlを加
えて反応を停止させた後、650nmにて吸光度を測定し
た。

また、発色停止後の溶液を室温に放置し、経時的に650n
mの吸光度を測定し、結果を第６表に示した。

（３）プロテインＣ測定のTMB発色時におけるpHの影響上記（２）においてプロテインC100ng/ml及び12.5nm/ml
の場合につき、（１）で調整した基質溶液の代わりに、
0.05％TMB・2HClを含有する色原体水溶液と5.0mM過酸化
水素溶液を混合して得られる基質溶液を用い、このpHを
3.0〜6.0に化えて、TMB発色時におけるpHの影響を650nm
で測定した。結果を第１図に示した。第１図から、成常
人のプロテインＣの値が３〜4ng/mlであることを合せて
考慮すると、特にpH4.0前後において著しく感度が良
く、一方、pH3.9以下では感度があまりよくないことが
明らかである。

比較例１実施例３の基質溶液の代わりに、0.1％TMBを含有するメ
タノール溶液と5.0mM過酸化水素水溶液を3:7（容量比）
で混合して得た基質溶液を用いた以外は、実施例３と同
様に操作し、結果を第６表に示した。

この基質溶液は、0.03％TMB及び3.5mM H₂O₂を含有し、p
H4.49であった。

第６表から明らかなように、基質溶液が水溶液である本
発明の場合（実施例３）には、メタノール溶液の場合
（比較例１）と比べ、TMBの含量は1/2であるにもかかわ
らず、優れた感度を示している。

実施例４＜HCG測定キット＞次の構成試薬からなるHCG測定キットを作成した。

（１）0.06％TMB・2HCl水溶液（pH2.0）（２）5mM H₂O₂含有0.1Mリン酸水素二ナトリウム−クエ
ン酸緩衝液（pH4.1）（３）抗HCGモノクローナル抗体固定化ビーズ（４）ペルオキシダーゼ標識抗HCGモノクローナル抗体
含有0.5％BSA−0.4％シュクロース−0.01M PBS溶液（pH
7.4）（５）0.1％NaF これらの試薬は２〜８℃の冷蔵庫に保存した。（４）の
標識抗体0.75mlにHCGを100mIU/ml含む尿を加え、これに
（３）のビーズを入れ、25℃で30分反応させた。次いで
ビーズを生理食塩水で洗浄した後、（１）の液0.3mlと
（２）の液0.7mlを混合して調製した基質溶液に入れ25
℃15分反応させた。調整した基質溶液のpHは4.0であっ
た。その後（５）を1ml加え発色反応を停止させ650nmに
て吸光度を測定した。吸光度は0.610であった。

一方、50℃の恒温器中に３日間放置した（１）液と
（２）液から調製した基質溶液を用いて、同様に測定し
たときの吸光度は0.580で低下率は５％であり、良好な
安定性を保持した。

実施例５＜α₂PI−プラスミン複合体の測定＞（１）基質溶液の調製 0.045％TMB・2HClの色原体水溶液と5.0mM過酸化水素の
0.1Mリン酸−クエン酸緩衝液を1:1で混合し、基質溶液
として0.023％TMB・2HCl及び2.5mM過酸化水素を含有す
る0.1Mリン酸−クエン酸緩衝液（pH4.0）を調製した。

（２）α₂PI−プラスミン複合体の測定ウサギ抗ヒトプラスミノーゲン抗体に0.01MPBS溶液（pH
7.4）を加えて蛋白質濃度が20μg/mlの抗体溶液を調製
し、これにポリスチレンビーズ（直径6mm）を加えて一
夜浸漬した。次に、ビーズを分離してPBSで洗浄後、0.5
％BSA−PBS中に一昼夜浸漬して抗ヒトプラスミノーゲン
抗体固定ポリスチレンビーズを得た。

α₂PI−プラスミン複合体200ng/ml,100ng/ml,50ng/ml,0
ng/mlを含む0.5％BSA−PBS200μを各々試験管に採り
これに前記の抗体固定ビーズ各１個と常法に従って西洋
わさびペルオキシダーゼで標識した酵素標識抗α₂PIモ
ノクローナル抗体を含む0.25％スキムミルク含有PBS200
μを加え、37℃で60分間反応させた。

反応終了後、反応溶液を分離してからビーズを生理食塩
液で洗浄した後、上記（１）で調整した基質溶液400μ
を加えて、37℃で30分間反応させて発色させた。

更に、これに0.1％NaFを含む２％酢酸水溶液1.0mlを加
えて反応を停止させた後、分光光度計を用いて650nmの
波長の吸光度を測定した。結果を第７表に示した。

第７表から、本発明の基質溶液（pH4.0）によって、感
度良くα₂PI−プラスミン複合体の測定ができることが
判る。

実施例６＜肺サーファクタント・アポ蛋白質（LSP）の
測定＞（１）基質溶液の調査実施例２と同様にして、0.015％TMB・2HCl及び3.5mM過
酸化水素を含有する0.1Mリン酸−クエン酸緩衝液（pH4.
0）を基質溶液として調整した。

（２）LSPの測定マウス抗ヒトLSP−モノクローナル抗体（PC6）にPBSを
加えて蛋白質濃度が10μg/mlの抗体溶液を調製し、これ
にポリスチレンビーズ（直径6mm）を加えて一夜浸漬し
た後、ビーズを分離してPBSで洗浄後、0.5％BSA−PBS中
に一昼夜浸漬して抗LSP−モノクローナル抗体固定ポリ
チレリンビーズを得た。次に、肺胞蛋白症患者肺洗浄液
より分離，精製したヒトLSP300ng/ml,150ng/ml,75ng/m
l,0ng/mlを含む0.5％BSA,3％トリトンＸ−100及び0.6％
ラウリル硫酸ナトリウム（SDS）含有PBS200μを各々
試験管に採り、これに前記の抗体固定ビーズ各１個と常
法に従って西洋わさびペルオキシダーゼで標識した酵素
標識マウス抗ヒトLSP−モノクローナル抗体（PE10）を
含む0.25％スキムミルク含有PBS200μを加え、45℃で
30分反応させた。

反応終了後、反応溶液を分解してからビーズを生理食塩
水で洗浄した後、上記（１）で調整して得られた基質溶
液400μを加えて45℃で15分間反応して発色させた。

更に、これに0.1％NaFを含む２％酢酸水溶液1.0mlを加
えて反応を停止させた後、分光光度計を用いて波長650n
mの吸光度を測定し、結果を第８表に示した。

第８表から、ヒト肺サーファクタント・アポ蛋白質の測
定の場合において、本発明の基質溶液によって感度良く
測定可能なことが判る。

実施例７＜IgA型免疫複合体の測定＞ウサギ抗ヒトC3抗体をプラスミン処理してCH3領域を除
去して作製した抗ヒトC3抗体−Facbフラグメントに、PB
Sを加えて蛋白質濃度が10μg/mlの抗体溶液を調製し、
これにポリスチレンビーズ（直径6mm）を加えて一夜浸
漬した後、ビーズを分離してPBSで洗浄後、0.5％BSA−P
BS中に一昼夜浸漬して抗ヒトC3抗体−Facbフラグメント
固定ポリスチレンビーズを得た。

次に、ヒトIgAとヒトC3を結合剤により共有結合させたI
gA−C3複合体（特開昭60−192263号公報参照）をIgA型
免疫複合体測定用の標準物質として用い、このIgA−C3
複合体400ng/ml,200ng/ml,100ng/ml,50ng/ml,25ng/ml,1
2.5ng/ml,0ng/mlを含む0.5％BSA及び0.25％スキムミル
ク含有PBS400μ各々試験管に採り、これに前記の抗体
固定ビーズ各１個を加え、37℃で60分間反応させた。

反応終了後、反応溶液を分離してからビーズを生理食塩
液で洗浄した後、常法に従って西洋わさびペルオキシダ
ーゼで標識した酵素標識山羊抗ヒトIgA−α鎖抗体−Ｆ
（ab′）_２フラグメントを含む0.5％BSA及び0.25％スキ
ムミルク含有PBS400μを加えて、37℃で60分間反応さ
せた。

次に、反応溶液を分離してビーズを生理食塩液で洗浄し
た後、実施例６（１）で調整して得られた基質溶液400
μを加えて、37℃で30分間反応した発色させた。

更に、これに0.1％Nafを含む２％酢酸水溶液1.0mlを加
えて反応を停止させた後、分光光度計を用いて波長650n
mの吸光度を測定し、結果を第９表に示した。

第９表から、IgA型免疫複合体の測定において、本発明
の基質溶液により感度良く測定可能なことが判る。

実施例８＜ヒト・プロティンＳの測定＞ポリスチレン製ビーズ（直径6mm）を、山羊抗ヒト・PS
抗体（ポリクローナル抗体:American Diagnostica社
製）の20μg/mlの濃度を有するpH7.4の0.01M PBS溶液中
に４℃の温度で１昼夜放置した後、PBSで洗浄してから
0.5％BSA水溶液中に４℃の温度で１昼夜放置してポスト
コーティング処理を実施することにより抗体固定化ビー
ズを得た。

フリーのヒト・プロティンＳを特異的に認識するモノク
ローナル抗体（2B9F12）の1.0mg/mlのPBS溶液1.0mlに、
Ｎ−（ｍ−マレイミド安息香酸）−Ｎ−サクシンイミド
エステル（MBS）の10mg/mlのジメチルホルムアミド溶液
50μを添加し、25℃の温度で30分間反応させた後、セ
ファデックスＧ−25を充填したカラムを用い、0.1Mリン
酸緩衝液（pH6.0）でゲル過を行い、マレイミド化モ
ノクローナル抗体と未反応MBSとを分離した。

一方、西洋わさびペルオキシダーゼ（HRP）の1.0mg/ml
のPBS溶液2.0mlに、Ｎ−サクシンイミジル−３−（２−
ピリジルチオ）プロピオネート（SPDP）の10mg/mlエタ
ノール溶液を添加し、25℃で30分間反応させた後、セフ
ァデックスＧ−25を充填したカラムを用い、0.01M酢酸
緩衝液（pH4.5）でゲル過して精製し、ピリジルジス
ルフィド化HRPを含有する画分を採取してコロジオンバ
ック中で氷冷下に約10倍に濃縮した。次に、これに0.85
％NaClと0.1Mジチオスレイトールとを含有する0.1M酢酸
緩衝液（pH4.5）1mlを添加して、25℃で30分間撹拌して
HRP分子中に導入したピリジルジスルフィド基を還元し
た後、セファデックスＧ−25カラムを用い、0.1Mリン酸
緩衝液（pH6.0）でゲル過して、チオール化HRPを含有
する画分を得た。

次に、得られたマレイミド化モノクローナル抗体とチオ
ール化HRPとを混合し、コロジオンバックを用いて氷冷
下に4mg/mlの蛋白質濃度まで濃縮し、４℃で１昼夜放置
した後、ウルトロゲルAcA44（仏,LKB社製）を充填した
カラムを用いてPBSでゲル過することによりHRP標識モ
ノクローナル抗体を得た。

山羊抗ヒト・プロティンＳ抗体を固定化したビーズ各１
個と精製したヒト・PSを0,50,100,200,400ng/mlの各濃
度で含有する0.1％BSA及び２％スキムミルク含有PBS溶
液（pH7.4）200μと、HRP標識モノクローナル抗体を
含有する0.1％BSA及び２％スキムミルク含有PBS溶液（p
H7.4）200μとを各試験管（ｎ＝２）に添加して37℃
の温度で１時間インキュベートした。

次に、試験管内の溶液を吸引除去した後、PBSで２回洗
浄してから、0.02％TMB・2HCl及び1.5mM過酸化水素を含
有する緩衝液（pH4.0）を400μずつ各試験管に加え、
37℃の温度で30分間インキュベートした後、反応停止剤
として0.1％NaF及び２％酢酸を含有する水溶液1mlを各
試験管に加えて酵素反応を停止させた。

次いで、この溶液を分光光度計を用いて650nmの波長の
吸収強度を測定し、これをヒト・PS濃度とプロットする
ことにより、濃度依存性を有するヒト・PS濃度測定用の
検量線を得た（第２図参照）。

血漿検体中のヒト・PSの濃度測定として、正常混合人血
漿を0.1％BSA及び２％スキムミルク含有PBS溶液（pH7.
4）で50倍に希釈した溶液200μを、抗体固定ビーズ及
びHRP標識モノクローナル抗体溶液200μと共に試験管
に加え、上記と同様にして免疫反応及び発色反応を行っ
た後、分光光度計にて吸光光度を測定した。この値を第
１図の検量線を用いて血漿中の濃度に換算したヒト・PS
濃度を求めた結果、血漿中濃度は10.4μg/mlであった。

【図面の簡単な説明】

第１図は吸光度と基質溶液のpHとの関係を示した図であ
り、図中○−○はプロテインＣ濃度５μg/ml,□−□は
プロテインＣ濃度1.25μg/ml,△−△はプロテインＣ濃
度０μg/mlを示す。このプロテインＣ濃度は、血漿検体
を100倍希釈して測定する系を想定し、血漿濃度換算し
たものである。第２図は本発明の基質溶液を用いた場合のヒト・PS測定
用の検量線を示している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者鈴木英明東京都日野市旭が丘４丁目３番２号帝人株式会社生物医学研究所内 (56)参考文献特開昭62−134100（ＪＰ，Ａ)

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ペルオキシダーゼ標識抗体又は抗原を用い
る酵素免疫測定方法において、（１）0.01〜0.5重量％のテトラアルキルベンジジン又
はその塩を含有し、且つpHが1.0〜2.5である色原体水溶
液と、（２）過酸化物を含有する水溶液とを混合して、0.003〜0.15重量％のテトラアルキルベ
ンジジン又はその塩及び１〜20mMの過酸化物を含有し、
且つpHが3.9より大で4.5以下である基質溶液を作成し、
該基質溶液を用いてペルオキシダーゼ活性を測定するこ
とを特徴とする酵素免疫測定方法
【請求項２】テトラアルキルベンジジンが3,3′,5,5′
−テトラメチルベンジジンである特許請求の範囲第１項
記載の酵素免疫測定方法。
【請求項３】ペルオキシダーゼ標識抗体が、抗プロティ
ンＣ抗体、抗プロティンＳ抗体、抗α_２−プラスミンイ
ンヒビター抗体、抗肺サーファクタント・アポ蛋白質抗
体，抗IgA−α鎖抗体−Ｆ（ab′）_２フラグメント及び
抗ヒト絨毛性ゴナドトロピン抗体から選ばれるいずれか
１種の抗体である特許請求の範囲第１項又は第２項記載
の酵素免疫測定方法。