JPH0745515B2

JPH0745515B2 - 新規インターフェロンγとその製造方法

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Publication number: JPH0745515B2
Application number: JP58182907A
Authority: JP
Inventors: 維紹谷口; 晴夫菅野; 達也西; テイー．ヴイルセクヤン; ケー．イツプユム
Original assignee: Japanese Foundation for Cancer Research
Current assignee: Japanese Foundation for Cancer Research
Priority date: 1982-09-30
Filing date: 1983-09-30
Publication date: 1995-05-17
Anticipated expiration: 2010-05-17
Also published as: IL69851A0; JPS60126299A; DE3381115D1; DK447083A; EP0112976A2; DK161836B; JPH07231790A; EP0112976B1; ES8504248A1; NO833542L; DK447083D0; ES526154A0; DK161836C; JPH07112435B2; EP0112976A3

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、明確に他と区別されるヌクレオチド配列を持
ち、ヒトインターフェロン−γ（以下IFN−γという）
メツセンジヤーRNA（以下mRNAという）に相補性を示すD
NAおよび該DNAを含む組換え体プラスミドに関する。該D
NAはまた、生物学的に活性を有するIFN−γをコードす
る。本発明はまた、該組換え体プラスミドを含む微生物
に関する。

インターフエロン（以下IFNという）は、1957年にアイ
ザツクス（Isaacs）とリンデンマン（Lindenman）によ
つて見出された抗ウイルス活性蛋白質で、グリコシル化
しているものもある。IFNにはIFN−α、IFN−β、IFN−
γという３種が生産されていることが知られている。そ
の後の研究の結果、抗ウイルス活性に加えて抗腫瘍活性
が見出され、IFNの広範な臨床的応用が期待されてい
る。例えば、IFNは種々のウイルス病および悪性腫瘍に
対して効果があることが報告されている。

しかしながら、その種特異性のゆえに、ヒト由来のIFN
しかヒトに適用できない。大量生産が困難なのでIFNの
使用は限られている。最近組換え体DNA技術がエツシエ
リヒア・コリ・サツカロミセス・セレビシエのような微
生物によるIFN−α、IFN−βの生産に応用されている。
同様の理由で、ヒトIFN−γ生産技術の開発が望まれて
いる。

本発明者らは、ヒトIFN−γを簡便に大量にするためにI
FN−γ遺伝子のクローニングを行つた。

IFN−γが他のIFNに比較して高い抗腫瘍活性を持つてい
ることは報告されている〔Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,7
7、5928〜5932（1980）〕。最近、エツシエリヒア・コ
リ中でIFN−γcDNAをクローニングし、発現させ、さら
に該cDNAのヌクレオチド配列が報告されている〔Gray e
t al.,Nature,295、503（1982）〕。

しかしながら、グレイ（Gray）らによつて報告された配
列と異なるIFN−γcDNA配列の存在の可能性が除かれた
わけではない。もしそのような異なつたcDNAが存在すれ
ば、該cDNAをコードするIFN蛋白は異なる生物活性を示
す可能性がある臨床応用に非常に有用であろう。

以下本発明を詳細に説明する。

本発明により、ヒトIFN−γmRNAを鋳型として用いてヒ
トIFN−γmRNAに相補性を示すDNAを調製し、該DNAを含
む新規組換え体プラスミドを調製する。さらに、該組換
え体プラスミドを宿主微生物に挿入することができる。
該DNAおよび組換え体プラスミドは、とくにエツシエリ
ヒア・コリのような細菌中でヒトIFN−γ遺伝子の増幅
に使用することができる。該細菌はヒトIFN−γを安価
に大量に製造するために有用である。

本発明のDNAと組換え体プラスミドは下記一般的手法で
調製される。

まず、12−Ｏ−テトラデカノイルフオルボール13−アセ
テート、メゼレイン、それらの関連化合物のようなフオ
ルボールエステルの存在下フイトヘマグルチニン（PH
A）、コンカナバリンＡ（ConA）のようなＴ−セルマイ
トゲンによつて誘導されたヒト単核細胞から細胞質RNA
を抽出する。該RNAは、他の誘導物質、たとえばスタフ
イロコツカスのエンテロトキシンＡ（SEA）またはＢ（S
EB）、デアセチルサイモシンαなどで誘導された胸腺、
リンパ節、末稍血由来のヒトＴ−セル、または同様に処
理されたヒトＴ−セルラインから単離することができ
る。

ポリＡ（ポリアデニル酸）を有するヒトIFN−γmRNAを
このRNAから単離する。高いIFN−γmRNA活性を持つmRNA
調製物を鋳型とし、逆転写酵素によつて二重鎖DNAを合
成する。組換え体は試験管内DNA組換え技法を用いエツ
シエリヒア・コリのプラスミドDNAのようなベクターDNA
に該合成DNAを挿入して得られる。ヒトIFN−γmRNAに相
補性を示す挿入DNAを有する組換え体プラスミドを選択
する。

次に、本発明のDNAおよび組換え体プラスミドの製法に
ついて具体的に説明する。

ヒト単核細胞をFicoll/Hypaqueの密度勾配上で400×
ｇ、30分間の遠心分離により、リンパ球に富んだ血小板
残渣（plateletresidues）から単離する。該細胞を12−
Ｏ−テトラデカノイルフオルボール13−アセテートのよ
うなフオルボールエステル5ng/mlで２時間処理する。つ
いでPHA（５μg/ml）、ConAなどのＴ−セルマイトゲン
を加え、混合物を37℃で20〜40時間保つ。細胞を集めて
破砕し、核を除く。全細胞質RNAを、たとえばフエノー
ルで抽出する。また細胞を破砕し、DNAとRNAとを共に、
たとえばフエノールで抽出し、DNAをDNAaseで分解、除
去してRNAを抽出することもできる。

抽出したRNAをNaclまたはKclの高塩濃度（たとえば0.5
M）溶液に溶解し、オリゴ（dT）セルロースのカラムに
通塔して、ポリ（Ａ）を有するmRNAをカラムに吸着させ
る。水、10mMTris−Hcl緩衝液のような低温濃度溶液な
どで溶出し、ポリ（Ａ）を有するmRNAを単離する。

単離したmRNAをシヨ糖濃度勾配遠心で分画する。各画分
のIFNmRNA活性は、各画分中のmRNAの一部を注入したア
フリカツメガエル（Xenopus laevis）の卵母細胞中で合
成される蛋白質のインターフェロン活性（抗ウイルス活
性）を定量することにより調べる。IFN活性の定量はJap
an J.Microbiol.,18、449−456（1974）に記載の方法に
従つて行なう。

次いで、トリのミエロブラストシスウイルスから得られ
る逆転酵素により、高いIFNmRNA活性を有するmRNAを鋳
型として用いmRNAに相補性を示すDNAを試験管内合成す
る。

該合成は次のとおり行なう。

基質としてのデオキシアデノシン・トリフオスフエート
（dATP）、デオキシチミジン・トリフオスフエート（dT
TP）、デオキシグアノシン・トリフオスフエート（dGT
P）およびデオキシシチジン・トリフオスフエート（dCT
P）とともに逆転写酵素を用いて、オリゴ（dT）、Mgcl₂
（たとえば5mM）、NaCl（たとえば30mM）、メルカプト
エタノール（たとえば5mM）およびトリス−Hcl緩衝液
（たとえばpH8.0、40mM）中でmRNAを一定温度（たとえ
ば41℃）で一定時間（たとえば90分間）反応させる。

得られた反応物を、たとえばフエノールで除蛋白し、鋳
型RNAをアルカリまたは核酸分解酵素によつて除く。

mRNAとオリゴ（dT）が存在しない以外は上記の第１鎖
（すなわち一重鎖cDNA）の合成と同様に逆転写酵素によ
り二重鎖cDNAを合成した。逆転写酵素に代えてエツシエ
リヒア・コリDNAポリメラーゼＩを用いても二重鎖cDNA
を合成することができる。上記で合成したcDNAをZncl₂
（たとえば1mA）、酢酸ナトリウム緩衝液（たとえば0.1
M、pH4.5）、NaCl（たとえば0.2M）などの存在下、アス
ペルビルス・オリーゼ由来ヌクレアーゼS₁で処理する。

また、二重鎖DNAはLandらの記載〔Nucleic Acids Res.
９、ｐ。2251−2266（1981）〕に従つて合成することも
できる。すなわち一重鎖DNAを逆転写酵素を用い基質dCT
Pとともに処理してcDNAの３′末端にデオキシシチジル
残基を加える。除蛋白後、延長cDNAをオリゴ（dG）₁₂−
₁₈、逆転写酵素、dATP、dGTP、dCTPおよびdTTPとともに
インキユベートし第二の鎖を合成する。この反応では逆
転写酵素をDNAポリメラーゼＩに代えることができる。

このDNAを、カコジル酸カリウム緩衝液（たとえばpH7.
6、0.14M）、トリス（塩基）（たとえば0.03M）、ジチ
オスレイトール（たとえば0.1mM）、CoCl₂（たとえば1m
M）およびdCTP（たとえば1mM）中、ウシ胸腺より精製し
たターミナルトランスフエラーゼとともに一定温度（た
とえば37℃）で一定時間（たとえば20分間）インキユベ
ートし合成DNAの両３′末端にデオキシシチジル残基を
延長させる。

一方、ベクターとして用いられるプラスミドDNAとして
は、たとえばエツシエリヒア・コリのプラスミドpBR322
DNA〔Gene Vol.2、p.25−113（1977）〕またはその誘導
体が用いられる。二重鎖DNAをプラスミドの制限部位に
挿入する。たとえば、スタンフオード大学のP.Bergから
得たpBR322の誘導体であるp321（J.Virology,45（１）p
408−419（1983））を適当な溶液、たとえばトリス−Hc
l緩衝液（たとえばpH7.5、6mM）、Mgcl₂（たとえば6m
M）、NaCl（たとえば6mM）、２−メルカプトエタノール
（たとえば6mM）および0.02％ウシ血清アルブミンを含
む溶液中でKpnI（宝酒造社製〕で処理し、p321のKpnI部
位を切断する。その後、ターミナルトランスフエラーゼ
の基質としてdCTPに代えてdGTPを用いて上記合成二重鎖
DNAと同様にして両３′末端にデオキシグアニル残基を
延長する。

合成二重鎖DNAと上記両３′末端に鎖延長したプラスミ
ドDNAとをトリス−Hcl緩衝液（たとえばpH7.5、50m
M）、NaCl（たとえば0.1M）、EDTA（たとえば5mM）、な
どと一定温度、一定時間インキユベートし、組換えプラ
スミドを形成させる〔Taniguchiら、Nature Vol.274、
p.223−228（1978）〕。次いで形質転換可能なエツシエ
リヒア・コリ菌株、たとえばエツシエリヒア・コリX177
6（Molecular Cloning of Recombinant DNA,Scott,W.A.
＆Werner,R.編集、Academic Press p.99−114、1977）
をEneaらの方法〔J.Mol.Biol.Vol.96、p.495−509（197
5）〕により該組換えプラスミドで形質転換する。

このようにして得られた新規組換え体プラスミド中に
は、ベクターDNA遺伝子、たとえばエツシエリヒア・コ
リのプラスミドpBR322に由来するβ−ラクタマーゼ（ア
ンピシリンを分解する酵素）遺伝子が存在する。従つ
て、形質転換したエツシエリヒア・コリはアンピシリン
に耐性を示す。以下の手法はこれらアンピシリン耐性
（Ap^R）菌株からヒトIFNmRNAに相補性を示す遺伝子を持
つ新規組換え体プラスミドDNAを有する菌株を選択する
のに一般に用いられる。

まず、上記IFNmRNA活性を持つRNAを鋳型として〔³²P〕
で標識したDNAを合成し、このDNAをヒトの単核細胞から
PHAによる誘導なしに抽出したmRNA（従つて、IFNmRNAは
誘導されていない）に、たとえばNaCl（たとえば0.5M）
を含む反応混合物中で高温（たとえば65℃でインキユベ
ートしてハイブリダイズ（会合）させる。次いで、会合
したDNA（プローブＡ）と非会合DNA（プローブＢ）とを
ハイドロキシルアパタイトカラムクロマトグラフイーに
より分離する。ついで，形質転換株のフイルターに固定
されたDNAをGrunstein−Hognessの方法〔Proc.Natl.Aca
d.Sci.,USA.Vol.72、P.3961〜3965（1975）〕に従つて
プローブＢあるいはプローブＡと別々に会合させ、プロ
ーブＢと会合するがプローブＡとは全く／もしくはほと
んど会合しないDNAを有する菌株をオートラジオグラフ
イーによつて判別する。

次いで、プラスミドDNAをそれぞれの菌株から単離し、8
0％（W/V）ホルムアミド、0.4MNaClなどの存在下に高温
度（たとえば53℃）でIFNmRNAを含むmRNAとインキユベ
ートして会合させる。上記菌株からのプラスミドDNAのc
DNA部分と会合したmRNAは一定条件下でニトロセルロー
スフイルター膜を通過させることによつて会合したDNA
とともに捕獲される、しかし非会合mRNAは同条件下では
捕獲されずフイルター膜を通過する〔実施例、Nygaard,
A.P.＆Hall,B.D.,Biochem.,TaniguchiらProc.Natl.Aca
d.Sci.,77、4003−4006（1980），およびNagataらNatur
e284,316（1980）参照〕。フイルターに捕獲されたmRNA
は90％（V/V）ホルムアマイドのような溶液中で高温度
（たとえば60℃）でフイルターから回収でき、ついでア
フリカツメガエル（Xenopus laevis）の卵母細胞に注入
できる。

インターフエロンが卵母細胞中に合成されると、会合に
用いたDNAはインターフエロンmRNAに相補性のDNAを含ん
でいるに違いなく，この方法でヒトIFN−γmRNAに相補
性を示す遺伝子を有する組換え体プラスミドDNAを固定
できる。

また、IFN−γの公知のDNA配列の一部を合成したものは
選別の為のプローブとして用いられる。プローブDNAは
通常のトリエステル法〔JACS,97、7327（1975）〕で合
成され、選別は主に上記会合方法によつて行なう。

クローン化したcDNAは、たとえばCOS−７細胞のような
サル由来の細胞中で容易に発現する。〔Gulzman,Cell,2
3,175（1981）〕本発明の新規組換え体プラスミドはエツシエリヒア・コ
リのような微生物あるいは真核細胞によるIFN−γの大
量生産に用いられる。

以下に本発明の実施例を示す。

実施例（１）ヒトリンパ球中のIFN−γの誘導：ヒト単核細胞をFicoll/Hygaqueの密度勾配上で400×ｇ
の遠心分離により、リンパ球に富んだ血小板残渣から単
離する〔Proc.Natl.Acad.Sci。,U.S.A。78（６）、3469
−3472（1981）〕。６×10⁶/mlの単核細胞を、血清を含
まないRPMI1640培地（G1BCO製）中でConsolidated Midl
andから得た5ng/mlの12−Ｏ−テトラデカノイルフオル
ボール13−アセテート（TPA）で２時間処理する。次い
で、５μg/mlの精製フイトヘマグルチニン（PHA）を加
える。37℃に20−40時間保つた後、細胞をゴム製ポリス
マン（policeman）を用いてリン酸ナトリウムで緩衝化
した生理的食塩水中に回収する。約４×10⁹細胞を800×
ｇ、５分間の遠心分離でペレツト化し、リン酸ナトリウ
ムで緩衝化した生理的食塩水中に再懸濁する。ついで、
懸濁液を150mlのCorex管内の10mMリボヌクレオチド−バ
ナジル複合体〔S.L.BergerおよびC.S.Birkenmeier,Bioc
hemistry18、5143−5149（1979）〕、10mMNaClおよび1.
5mMMgcl₂を含む10mM氷冷トリス−Hcl（pH7.5）の混合物
80ml中に分散させる。ノニデツトＰ−40（NonidetP−4
0、シグマ社製、USA）を最終濃度0.3％（V/V）で加え、
混合物をSorvallGSローター中で300rpm、５分間遠心分
離し核を除く。上澄みを4mlの10％ドデシル硫酸ナトリ
ウム、4mlの2Mトリス−Hcl（pH9.0）および2mlの0.25ME
DTAを含むCorex管に入れ、直ちにフエノールで抽出す
る。抽出を２回繰返し、RNAをエタノールで沈澱させ
る。得られたRNA250mgを10mlの1mMEDTAに溶かす。65℃
で２分間インキユベートし、高塩濃度溶液〔0.5Mトリス
Hcl（pH7.5）、1MNaCl、50mMEDTA〕2.5mlを加える。混
合物をオリゴdTセルロース・カラム（Ｐ−LBiochemical
s）クロマトグラフイーにかける。吸着したポリＡを有
するmRNAを低温濃度溶液〔10mMTris−Hcl（pH7.5）〕あ
るいは水で溶出し、ポリＡを有するmRNA250μｇを得
る。

（２）シヨ糖密度勾配遠心によるmRNAの分画： mRNAをエタノールで沈澱させ1mMEDTAの0.5mlに溶かす。
70℃で２分間加熱後溶液を、50mMトリス−Hcl、0.2MNaC
lおよび1mMEDTAの溶液中に調製した５−25％シヨ糖密度
勾配中、日立PRS40Tiローター中、26,000rpm、４℃で19
時間遠心分離する。リボソームRNAをサイズマーカーと
して使う為に他の管で遠心分離する。前者を15画分に回
収し、画分中の一部でIFN−γmRNA活性を測定する。結
果を第１表に示す、最大のIFN−γmRNA活性が画分No.8
に存在する。

（３）cDNAとdsDNAの調製画分No.8中のmRNA14.4μｇを各0.5mMのdATP、dGTP、dTT
PおよびdCTR、１μｇのオリゴ（dT）、８単位のAMVトラ
ンスクリプターゼ（Bethesda Reseach Lab.）、5mMMgcl
₂、30mMNaCl、5mMメルカプトエタノールおよび40mMトリ
ス−Hcl（pH8.0）を含む反応液中で37℃、１時間インキ
ユベートする。mRNAに相補性的なcDNAが溶液中に形成さ
れる。蛋白質をフエノールで除き、0.3NNaOHで37℃、15
時間処理してRNAを除く。

次いで、このcDNA（2,65μｇ）を0.14Mカコジル酸カ
リ、30mMトリス、1mM dCTP、0.1mMジチオスレイトール
および1mMCocl₂を含む30μｌの反応液（pH7.6）中、２
単位のターミナルトランスフエラーゼ（Bethesda Resea
ch Lad.）で37℃,20分間処理し、cDNAの末端に約23個の
デオキシシチジル残基を加える。３μｌの0.5M EDTA
（（pH8.0）を加えて反応を止め、蛋白質をフエノール
で除去する。水層を集め、DNAをエタノール添加で回収
する。回収したDNA2.32μｇを、上記逆転写酵素反応溶
液中オリゴ（dT）を１μｇのオリゴ（dG）₁₂−₁₈（Coll
aborative Research Inc.）で置き換えたもので37℃、
１時間処理し4.24μｇの二重鎖DNA（dsDNA）を得る。

次いで、1.78μｇのdsDNAを20μｌの反応溶液〔1.78μ
ｇのdsDNA、0.14Mカコジル酸カリ（pH7.6）、0.03Mトリ
ス−Hcl、0.1mMジチオスレイトール、1mMCocl₂、1mMdCT
P〕中、１単位のターミナルトランスフエラーゼと37
℃、20分間処理して、dsDNAの３′末端に約31のデオキ
シシチジル残基を加える。

（４）dsDNAのクローン化：プラスミドp321の15.6μｇを100μｌの反応液〔6mMトリ
ス−Hcl（pH7.5）、6mMMgcl₂、6mMNaCl、6mM2−メルカ
プトエタノール、0.02％ウシ血清アルブミン〕中KpnI
（宝酒造社製）で37℃、１時間処理してプラスミドp321
のKpn部位を切断する。切断したプラスミドp321を100μ
ｌの反応液〔15.6μｇのDNA、0.14Mカコジル酸カリ、30
mMトリス−Hcl（pH7.6）、1mMdGTP、0.1mMジチオスレイ
トール、1mMCocl₂〕中２単位のターミナル・トランスフ
エラーゼで37℃、20分間処理してp321DNAの両３′末端
に約35のデオキシグアニル残基を加える。

次いで、得られたプラスミドDNAの80μｇと工程（３）
で得られたdsDNA30μｇとを20mMトリス−Hcl（pH7.
5）、100mMNaClおよび1mMEDTAを含む溶液中65℃で２分
間、46℃で120分間、37℃で60分間、室温で60分間イン
キユベートして両DNAを会合させる。エツシエリヒア・
コリX1776（ATCC31244をEneaらの方法〔J.Mol.Biol.,9
6、495−509（1979）〕を用い会合したDNAで形質転換す
る。約5,500のアンピシリン耐性（Ap^R）の菌株を分離す
る。そのうち3,200の菌株を選び、各菌株のDNAを２枚の
ニトロセルロースフイルター上に固定する。³²PO₄ ^--で
標識したプローブのオリゴデオキシヌクレオチド、すな
わち³²P−TGCCAGGACCCATAに37℃で強く会合する６菌株
を選ぶ〔Grunstein−Hognessの方法、Proc.Natl.Acad.S
ci.,U.S.A.,72、3961（1975）〕。

得られた６菌株を44℃で上記と同様の選別方法を行い、
pIFNγ−G4と名づけた強く会合したプラスミドを得る。

（５）該プラスミドpIFNγ−G4のヌクレオチド配列：上記で得られたプラスミドpIFNγ−G4のcDNA挿入部分を
種々の制限酵素で消化して、その切断地図を第１図に示
す。Grayら〔Nature,295、503（1982）〕によつて報告
されたプラスミドP69からのcDNAの制限酵素切断地図も
また比較のために第１図に示す。両cDNAクローンの注目
すべき相異点は、Grayらの報告したcDNAクローンP69に
はないRsaI〔New England Biolabs.社製、U.S.A.〕がク
ローンpIFNγ−G4には在ることである。

次に、ヌクレオチド配列相異を有するように見えるCDNA
の全ヌクレオチド配列をMaxam−Gilbertの方法〔Proc.N
atl.Acad.Sai.,U.S.A.74、560−564（1977）〕に従つて
決定する。配列を第２図に示す。第２図の塩基配列のう
ちヒトIFN−γのＮ−末端領域に相当する配列の一部を
以下に示す。

上記配列とNaturc,295、503（1982）に示されたヒトIFN
−γに対するcDNAクローンの配列を比較するため、相当
するヌクレオチド配列を以下に示す。

プラスミドpIFNγ−G4のcDNA配列は報告されているIFN
−γcDNAとは３つのヌクレオチド（第２図中矢印で示し
た）で違つている結果IFN−γポリペプチドの２個のア
ミノ酸置換（Lys→GlnおよびGln→Arg）がある。置換ア
ミノ酸を第２図中枠で囲つてある。後者の置換すなわち
成熟IFN−γポリペプチドの140番目のアミノ酸のGlnか
らArgへの置換はR.Devosら〔Nucleic Acids Research1
0、2487（1982）〕およびR.Derynckら〔Nucleic Acids
Research10、3605（1982）〕が単離したヒトIFN−γcDN
Aでも見い出されている。

新規cDNAが生物学的活性をもつたヒトIFN−γをコード
することを立証するために、cDNAをSan3A（宝酒造社
製）で切断し、IFN−γmRNAの全コード領域を含むDNAを
第３図に示すごとくプラスミドpKCR〔Ｏ′Hareら.,Pro
c.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.,78、1527（1981）〕に導入し
たプラスミドpHGγG4Aを構築した。このpHGγG4Aにおい
ては該cDNAはSV40初期プロモーターの下流に挿入されて
いる。

プラスミドDNA、pHGγG4AをMcCutchanとPagno.J.;Gance
r Inst.,41、351（1968）の方法に従つてCOS−７細胞に
形質導入した。形質導入72時間後，培地中のインターフ
エロン活性を測定し，結果を第２表に示す。第２表に示
すように、ヒトIFN−γに特徴的な活性が培地中に生産
されており、このことが新規組換えプラスミドpIFNγ−
G4中のcDNAがヒトIFN−γをコードすることを示してい
る。

プラスミドpIFNγ−G4は，アメリカン・タイプ・カルチ
ヤー・コレクシヨン（ロツクビル，マリランド,U.S.A）
にEscherichia coli IG−G4ATCC39123として寄託され
ている。

既に述べたように本発明のインターフェロンと既知のヒ
トインターフェロンの実質的な差異は第９番目のアミノ
酸であるので、既知のインターフェロンとして９番目の
アミノ酸がLysで140番目のアミノ酸がArgであるもの
（以下Lys⁹−IFN−ｒとする）と、本発明のインターフ
ェロン（９番目のアミノ酸がGln、140番目のアミノ酸は
arg、以下Gln⁹−IFN−ｒとする）の効力の比較実験を行
なった。

比較実験１血清中のインターフェロン−γポリペプチ
ド（IFN−ｒ）活性 100μg/mlのIFN−ｒ（Gln⁹−INF−ｒまたはLys⁹−IFN−
ｒ）を含む溶液10μｌとヒト血清490μｌを混ぜ、37℃
で24時間インキユベートした後、５％のウシ血清アルブ
ミン（BSA）を含むMEM培地で50倍に希釈した。INF−ｒ
活性（抗ウイルス活性）は、アームストロング（Armsto
rong）らの方法［アプライド・ミクロバイオロジー（Ap
pl.Micobiol），21,723−725（1971）］により求めた。
対照としては、IFN−ｒのみを含む溶液を４℃で24時間
インキユベートしたものを用いた。その結果を第３表に
示す。

比較実験２トリプシン処理によるINF−ｒの活性化 50μg/mlのIFN−ｒ（Gln⁹−IFN−ｒまたはLys⁹−IFN−
ｒ）を含む溶液45μｌにトリプシン（Worthington製）
溶液５μｌ加え、トリプシンとINF−ｒの比が1:50,1:10
0,1:200,1:400になるように調製し、５℃で60分インキ
ユベートした。この反応液20μｌをトリプシンインヒビ
タ−［シグマ（Sigma）社製］を含むMEM培地980μｌに
加え反応を停止させた。反応液中の抗ウイルス活性は比
較実験１と同様の方法で求めた。その結果を第４表に示
す。

【図面の簡単な説明】

第１図は、pIFNγ−G4cDNAの制限酵素切断地図、及びグ
レイ（Gray）らによつて報告されたプラスミドP69の制
限酵素切断地図である。第２図は、pIFNγ−G4に含まれるインターフエロン−γ
をコードするcDNAの全ヌクレオチド配列である。第３図は、サル細胞中においてcDNAの発現に用いられる
プラスミドpHGγG4の造成過程を示すものである。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者ヤンテイー．ヴイルセクアメリカ合衆国．10021 ニユーヨーク, ニユーヨークイーストセブンテイナインスストリート 180 (72)発明者ユムケー．イツプアメリカ合衆国．11375 ニユーヨーク, フオレストヒルズ，セブンテイフアーストアヴエニユー 110―27 (56)参考文献Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．295（1982）Ｐ. 503−508 ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．10，Ｎｏ．12（1982) Ｐ．3605−3611

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記のペプチド配列を有するインターフェ
ロン−γポリペプチド。
【請求項２】下記のペプチド配列を有するインターフェ
ロン−γポリペプチドをコードするDNAを含む組換え体D
NAを含有する微生物を栄養培地に培養し、該培養物中に
インターフェロン−γポリペプチドを蓄積せしめ該培養
物から該ポリペプチドを採取することを特徴とするイン
ターフェロンγポリペプチドの製造方法。