JPH0746991B2

JPH0746991B2 - ウイルスの固定化方法

Info

Publication number: JPH0746991B2
Application number: JP25379586A
Authority: JP
Inventors: 由紀子松田; 秀樹飯島
Original assignee: 旭化成工業株式会社
Priority date: 1986-10-27
Filing date: 1986-10-27
Publication date: 1995-05-24
Anticipated expiration: 2010-05-24
Also published as: JPS63109780A

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、ウイルスが存在する液体を多孔性膜で、実質
的に垂直濾過し、ついで凍結乾燥して膜孔中にウイルス
を蛋白質などのコーティング剤なしで固定化するウイル
スの固定化方法に関する。本発明における固定化とは、
膜上に蛋白質などをコーティングすることにより達成さ
れるようなものではなく物質を多孔質膜の孔中に閉じ込
め、１ヶ所に保留して動かぬようにすることを意味す
る。本発明方法は、ウイルスの検査、例えば肝炎ウイル
スやエイズウイルスなどの免疫検査や、複数のウイルス
が混在したウイルス液から目的とするウイルスあるいは
ウイルス群を固定化することに利用できる。

（従来技術）ウイルスは細胞内でのみ増殖し、潜在的に病原性をもつ
感染性の実体で、次のような属性をもつものである。
核酸としてDNAかRNAのどちらか一方を持つ。遺伝物質
のみ複製される。二分裂では増殖しない。エネルギ
ー産生系を欠く。宿主のリボゾームを蛋白質合成に利
用する。

現在ウイルスの濃縮方法には、粒子の大きさによる分画
遠心法、溶解度差を利用した等電点処理法、有機溶媒に
よる処理法、吸着溶出を利用した方法、粒子の形、密度
を利用した密度勾配遠心法、酸素処理による方法等があ
り、それぞれのウイルスに適した方法を選択している。
これらのうち膜を用いたウイルスの濃縮方法には、吸着
溶出を利用した方法と濾別による方法とアルギネート膜
による保留溶解による方法がある。

吸着溶出を利用した方法とは、適当な条件を与えウイル
ス粒子の表面荷電により吸着剤をコーティングした膜に
ウイルス粒子を吸着させ、次に塩濃度などの条件を変え
ることによってウイルス粒子をコーティングした膜より
溶出させることができることを利用した濃縮方法であ
る。例えば『Appl.Microbiol.,vol.23（４）76（197
2）.,Wallis,C.et al.』に記載されているように下水な
どの水に浮遊している腸内ウイルスではあらかじめ試料
に除菌、除蛋白を行い、MgCl₂あるいはAlCl₃を加え、ウ
イルスをフィルターに吸着濾過させた後、溶出させてい
る。また、ウイルス培養液では液中の吸着阻止物質をプ
ロタミンなどで除去しpHを5.0に修正し濾過すると、ウ
イルスがフィルターに吸着し、次いでウシ胎児血清を濾
過すると、ウイルスが溶出し、60〜100倍の濃縮液が得
られている。しかし、一般にウイルス粒子を吸着させ、
適当な溶出液で溶出する場合は、ウイルスの感染性の低
下を起こしやすい。そのうえウイルス毎に条件を決める
必要があり、非常に操作が煩雑である。また吸着量に限
界があり、濃縮率は低い。

次に、濾別による方法であるが、これは限外濾過による
濃縮である。『Canad.J.Chem.,vol.33,1452（1955）,Go
rdon,J.L.＆Mason,S.G.』に記載されているように、培
養液などの試料を循環ポンプでフィルターに平行に流
し、吸引でウイルス以外の成分をフィルターで濾過しウ
イルスを濃縮させるものである。これはフィルターに蛋
白質が吸着するため目づまりがしやすく、ウイルスの濃
縮速度は遅い。また、種々の形や大きさを持つウイルス
に適した孔径の膜を選択することはできない。

次にアルギネート膜による方法であるが、『ウイルス実
験学、総論（国立予防衛生研究所学友会編）丸善（197
3）、p47』に記載されているように、この膜はアルギン
酸ナトリウムの溶液にLa（NO₃）₃・6H₂O，AlCl₃・6H₂O
を加えてゲル化したもので、三層（capillaryzone,inte
rmediatelayer,primary gel membrane）からなるもので
ある。ウイルスを、このフィルターに保留させ融解して
回収し、動物または培養細胞によるウイルス分離を行う
ものである。このフィルターにおいてウイルスは中間層
に保留される。しかし、ゲル状であるため、もろく、非
常に取り扱いにくく、保留できるウイルス量は限定され
てくる。しかも、濾過後保留されたウイルスを乾燥状態
で保存しておくことは不可能である。またフィルターを
融解してウイルスを回収しなければならず、ウイルスの
感染性の低下も起こしやすい。このように、アルギネー
ト膜による方法は実用的ではないといえる。

（発明が解決しようとする問題点）ウイルスの濃縮を行う場合、従来の方法ではウイルスの
感染性を維持することと濃縮効率を高めることの２つを
同時に満足することは難しかった。かつウイルスは多く
の場合液体中で浮遊状態にあり、常に空気中への飛散の
可能性があるが、有害ウイルスを取り扱う場合において
人体に対する安全性は考慮されていなかった。

本発明の目的は、ウイルスの種類にかかわらず、ウイル
スの感染性を維持しながら濃縮でき、しかも、取り扱い
操作がより簡単で安全性の高いウイルスの固定化方法を
提供することである。

（問題点を解決するための手段）本発明方法は、ウイルスの存在する液体を、銅アンモニ
ア法再生セルロースからなる多孔性膜で実質的に垂直濾
過し、しかる後、凍結乾燥して、膜孔中にウイルスを固
定化することを特徴とする。

再生セルロースの製法には、ビスコース法、セルロース
エステルのケン化法、銅アンモニア法など、種々のもの
があるが、それぞれ、製造条件の相違により物理的、科
学的な性質に差があり、『再生セルロース』として一律
に論じられるものではない。銅アンモニア法では、不可
欠な酸処理により銅の除去に伴う微細な孔の発生と特異
な分子鎖の凝集構造の発生が認められるため、銅アンモ
ニア法再生セルロースは特異な性質を持つ。

その性質の特徴は親水性で、かつ蛋白質の吸着性が少な
い点にある。本発明者らは、蛋白質と高分子素材との吸
着性に関する相関性を検討した結果、一般的には、親水
性素材ほど、蛋白質の吸着性が小さく、本発明方法に用
いられる銅アンモニア法再生セルロースからなる多孔性
中空繊維が１番小さいことを見いだした。

銅アンモニア法再生セルロースの粘度平均分子量は７×
10⁴以上が好ましく、また0.1N NaOH水溶液中での溶解成
分が少なければ少ないほど望ましい。40℃、48時間、0.
1N NaOH水溶液中に浸漬した際、この溶解分が10ppm以下
であれば、この中空繊維はウイルスを濃縮するのに最も
適している。

上述のようなセルロースからなる膜を作製するには、高
純度なセルロース原液を用いて銅アンモニア法再生セル
ロースを作製するか、あるいは膜を作製後に0.1N NaOH
水溶液で72時間以上洗浄処理すれば良い。高純度セルロ
ース原料を用いれば、上記溶解分が著しく減少するの
で、より好ましい。ここで、『高純度セルロース原料』
とは、α−セルロース含有量が95wt％以上で、重合度が
500以上の木綿リンターおよび木材パルプを指す。これ
らの原料について、ブリーチング、洗浄工程中での分解
および酸化を防止つつ、不純物の混入を避けるため、常
に精製された水を用いると良い。

銅アンモニア法再生セルロースからなる多孔性膜でのウ
イルス固定化に際して、ウイルス径Ｖ（nm）、膜の水流
速平均孔径Ｄ（nm）、膜厚Ｔ（μｍ）とすると、の条件を満たすことが好ましい。

ここで、ウイルス径Ｖとは、球状ウイルスではその直径
を、また、非球状ウイルスでは、楕円体に近似したとき
の短軸の直径を差す。（１）式の値が9.5以上である
と、膜のウイルス阻止率が高く、膜孔中にウイルスが浸
入することができない。

また、（１）式の値が１より小さいとウイルスの損失が
多く、多孔性膜を構成する物質（ウイルスの媒体とよ
ぶ、原液では水が、膜中に補捉されたウイルスでは膜を
構成する再生セルロースが媒体である）1g当たりのウイ
ルス密度をウイルス原液1g（＝1ml）あたりのウイルス
密度より大きくすることが出来ない。

膜によるウイルス粒子の分離機構としては、膜の孔径の
大きさと分離すべきウイルス粒子の粒子径との違いによ
りふるい分ける『ふるい機構』と、膜表面にウイルス粒
子を吸着させる『吸着機構』がある。銅アンモニア法再
生セルロースからなる多孔性膜では、蛋白質の吸着性が
他の高分子素材にくらべて、最も小さいという本発明者
らの検討結果を考慮すれば、銅アンモニア法再生セルロ
ースからなる多孔性膜によるウイルス分離は、殆ど『ふ
るい機構』であると考えられる。

多孔性膜としては、平膜でも中空繊維でも使用できる
が、好ましくは中空繊維である。

銅アンモニア法再生セルロースからなる多孔性中空繊維
において、内壁面から外壁面への膜厚方向に垂直な面に
おける孔径を面内平均孔径で表す時、膜内貫通孔の入口
及び出口における面内平均孔径の間に、極小の部分、該
極小の部分より大きい部分、もうひとつの極小の部分の
順に配列された構造が、中空繊維の膜厚方向に少なくと
も１組存在するものを用いるとよい。ここで言う極小と
は、数学的意味での極小をさす。すなわち、本発明にお
いては、膜表面の面内平均孔径がそのすぐ内側面の面内
平均孔径より小さいような膜は、「膜表面は極小の部
分」とはいわない。

この構造により、従来の多孔質中空繊維にくらべて、銅
アンモニア法再生セルロースからなる多孔性中空繊維の
ウイルスの阻止率を高くすることができ、孔中にウイル
スを補捉できると共に、濾過速度を速めることができ
る。これに対して、面内平均孔径の極小部が少なくとも
１組以上存在しない多孔性中空繊維の場合では、阻止率
を90％以上にするには、透過速度を遅くせざるを得ず、
またウイルスを中空繊維孔中に補捉し、濃縮することは
できない。

銅アンモニア法再生セルロースからなる多孔性中空繊維
において、極小面内空孔率は10％以上であることが好ま
しい。10％未満では、限外濾過速度は急激に低下する。
好ましくは30％以上である。限外濾過速度に及ぼす面内
空孔率の影響は、10％未満では極小面内空孔率の５乗、
10〜30％では約２乗、30％を越えると約１乗に比例して
限外濾過速度は増加する。一方、極小面内空孔率が80％
を越えると、多孔性中空繊維の力学的性質は著しく低下
し、ピンホール等の欠陥部が生じたり、中空繊維を構成
するセルロース分子が、濾液中あるいは被濾過液中に脱
落分散する恐れがある。

中空繊維の膜厚は薄ければ薄いほど、一般的には濾過速
度が大きくなるので好ましい。しかしながら、膜厚が10
μｍ未満になると、中空繊維にはピンホールが多発し、
ウイルス粒子が濾液中に漏れ出てくる。また膜厚が100
μｍ以上になると、濾過速度が大きく低下してしまう。
極小面内空孔率が大きくなれば膜厚をより厚く設計する
方が被補捉ウイルス数が増加して良い。

本発明方法に用いられる銅アンモニア法再生セルロース
からなる多孔性中空繊維は、該中空繊維の内壁面から外
壁面への膜厚方向に層状構造を有し、蛋白質の透過性、
ウイルスの阻止性、ウイルスの補捉性をより支配する極
小部を有している。その極小部分の膜厚方向での厚み
は、該多孔性中空繊維が、ミクロ相分離法で作製される
ため、セルロース濃厚相粒子の直径に相当する。したが
って、その厚みは２μｍ以下である。

本発明方法で用いられる銅アンモニア法再生セルロース
からなる多孔性中空繊維の製造方法としては、例えば、
セルロースリンター（α−セルロース含有量96％以上、
平均分子量2.6×10⁵）を公知の方法で調整した銅アンモ
ニア溶液中に8wt％の濃度で溶解したものを紡糸原液と
して用いる。この紡糸原液に対して、アセトン／アンモ
ニア／水系混合溶液を凝固剤および中空剤として用いて
ミクロ相分離を生起させ、その後、凝固、再生すること
により得られる。ここで、ミクロ相分離とは、溶液中に
高分子の濃厚層あるいは希薄層が直径0.02〜数μｍの粒
子として分散し、安定化している状態を意味する。ミク
ロ相分離の生起は、紡糸中の糸の失透現象によって直接
肉眼観察するか、あるいは紡糸後の糸の電子顕微鏡観察
により、直径１μｍ以下、0.02μｍ以上の粒子の存在で
確認される。

凍結乾燥は、公知の方法を採用することができる。凍結
温度は低いほど、また凍結させるまでの時間は短かいほ
ど、ウイルスの感染性を維持するためには好ましい。例
えば、ウイルスを補捉した中空繊維を液体窒素中で瞬間
的に凍結させ、直ちに真空中で乾燥をはじめるなどの方
法が望ましい。濾過後、速やかに凍結させるためには、
モジュールを解体して中空繊維を取り出さずに、モジュ
ールの形態のままで凍結させることか望ましい。凍結乾
燥前にモジュールを解体することは中空繊維への雑菌汚
染の程度を増大させて、その後の無菌条件下で使用が困
難になるばかりでなく、ウイルスの感染力が低下するの
で、好ましくない。

本発明方法による実施例を説明するに先立ち、本明細書
中に用いられる主な技術用語（物性値）の定義とその測
定方法を以下に示す。

［水流速平均孔径］銅アンモニア法再生セルロースからなる多孔性中空繊維
のモジュールを作製し、そのモジュール状態で、中空繊
維の水の流出量を測定し、（２）式から水流速平均孔径
を求めた。

V:流出量（ml/min） T:膜厚（μｍ） ΔP:圧力差（mmHg） A:膜面積（m²） Prρ：空孔率（−） μ：水の粘性率（cP）空孔率Prρは水膨潤時の見掛け密度ρaw、ポリマーの密
度ρｐより（３）式で求めた。セルロースの場合ρｐ＝
1.561を用いた。

Prρ（％）＝（１−ρaw/ρｐ）×100 （３）［平均分子量］銅アンモニア溶液中（20℃）で測定された極限粘度数
［η］（ml/g）を（４）式に代入することにより平均分
子量（粘度平均分子量）Mvを算出する。

Mv＝［η］×3.2×10³ （４）［極小面内空孔率］銅アンモニア法再生セルロースからなる多孔性中空繊維
をアクリル樹脂で包埋後、ウルトラミクロトーム（LKB
社（スウェーデン）製UltratomeIII8800型）に装着した
ガラスナイフをもちいて、外壁面から膜厚方向に沿って
厚さ約１μｍの試料を順に切り出す。その試料切片をク
ロロホルムで脱包埋後、それぞれの切片の電子顕微鏡写
真をとる。注目する切片の１cm²当たり、孔半径が
（ｒ）〜（ｒ＋dr）に存在する孔の数をＮ（ｒ）drと表
示する。３次および４次の平均孔半径（それぞれ３お
よび４）は次式で定義される。

平均孔径は（５）式および（６）式から計算される。それぞれの切
片の電子顕微鏡写真より平均孔径を計算し、面内平均孔
径の内壁面からの距離に対する図示より、極小面内孔径
を示す面を決定する。その決定された面の空孔率を極小
面内空孔率と定義する。その極小面内空孔率は（７）式
で求められる。

［ウイルス阻止係数］濾過しようとする水溶液単位体積当たりのウイルスの数
No,膜を透過した濾液単位体積当たりのウイルスの数Ｎ
のとき下記（８）式で定義される。

φ＝−log（N/No）（８）（発明の効果）本発明によれば、ウイルスが存在する液体から、ウイル
スの感染性を低下させることなく、かつ人体により安全
に、ウイルスを固定化して濃縮することが出来る。そし
て、血清肝炎ウイルスやエイズウイルスのような感染す
るウイルスの免疫検査を中空繊維の孔中にウイルスを固
定した状態で行える。また、複数のウイルスが混在した
ウイルス液から目的とするウイルスあるいはウイルス群
を分別あるいは固定化濃縮することに利用できる。

（実施例）以下、本発明方法によるウイルスの固定化方法の実施例
を示す。

（実施例１）セルロースリンター（α−セルロース含有量96％以上、
平均分子量2.6×10⁵）を公知の方法で調整した銅アンモ
ニア溶液中に8wt％の濃度で分解し、濾過脱泡を行い、
紡糸原液とした。その紡糸原液を環状紡糸口の外側紡出
口（外径2mmφ）より2.5ml/minで、一方中空剤として、
アセトン45wt％／アンモニア0.575wt％／水54.425wt％
の混合溶液（中空剤）を中央紡出口（外径0.6mmφ）よ
り1.7ml/minでそれぞれアセトン45wt％／アンモニア0.5
75wt％／水54.425wt％の混合溶液（凝固剤）中に直接吐
出し、12m/minの速度で巻き取った。なお、吐出直後の
透明青色状の繊維状物は次第に白色化し、ミクロ相分離
を生起し、ひきつづいて凝固が起こり、繊維としての形
状が維持されていた。その後、2wt％の硫酸水溶液で再
生し、その後、水洗した。水洗後の中空繊維をアセトン
で、中空繊維内部の水分を置換し、その後、10％延伸し
た状態で真空乾燥した（25℃×1.5時間）。このように
して得られた銅アンモニア法再生セルロース多孔性中空
繊維の内径は300.2μｍ、膜厚は28.5μｍ、水流速平均
孔径は10.8nm、極小面内空孔率は28％であった。（１）
式より計算された値は9.4であった。

大腸菌ファージφ×174（IFO20009、ウイルス径25nm）
を大腸菌（IFO13898）に感染させファージ原液を調製し
た。ファージ濃度を寒天重層法によりプラーク形成数か
ら測定したところ、1.9×10⁹（PFU/ml）であった。上記
銅アンモニア法再生セルロース中空繊維100本よりなる
ガラス製ミニモジュールの入口より上記ファージ原液を
中空繊維中空部に送入し、中空部出口を閉じた状態で、
ファージ原液11mlを圧力200mmHgで濾過し、濾液5mlを得
た。濾液1ml中のファージ濃度をプラーク法で定量した
が、ファージは確認されなかった。従って、φは9.2以
上であった。続いてモジュール出口を開き、生理食塩水
をペリスタリックポンプで毎分10mlの流量でモジュール
に送入しながら、膜にかかる圧力が約200mmHgになるよ
う調節して中空部および孔内を十分に洗浄した。洗浄終
了直前の濾液および中空部を通過した洗浄液中にはプラ
ーク形成法によりファージは確認されなかった。モジュ
ール洗浄後、モジュールをそのまま液体窒素中で凍結さ
せ、東京理化器機（株）製凍結乾燥器（FD−１）のチャ
ンバー内にいれ、24時間、中空繊維を凍結乾燥した。

中空繊維孔中に補捉されたファージ量を測定するため
に、凍結乾燥した中空繊維約100mg（中空繊維で40本）
を0.5％セルラーゼ溶液（pH5.0,0.1N酢酸緩衝液にヤク
ルト製オノズカＲ−10を溶解）10ml中に37℃で浸漬して
セルロースを分解し、pHを7.0に調整後、分解液を9000
r.p.mで10分間遠心し、上澄液中のファージ濃度をプラ
ーク法で測定した。中空繊維に固定されていたファージ
が大腸菌に感染して明瞭なプラークを形成したことか
ら、ファージはその感染性が維持されたまま孔中に固定
されていたことが確認できた。上澄液中のファージ濃度
は、3.8×10⁷（PFU/ml）であった。したがって中空繊維
1g中に3.8×10⁹PFUのファージが存在しており、媒体1g
中のウイルス密度は原液より高くなっていた。

（比較例１）セルロース濃度10％、アンモニア濃度７％、銅濃度3.6
％の組成と2000ポイズの粘度を有する銅アンモニア再生
セルロース原液を、２重環状紡口の外側紡出口（外径5m
m）から20ml/minで押し出し、同時に中央の直径1mmの管
からパークロルエチレンを5ml/minで押し出した。次に
押し出された線状紡糸原液を直接空気中に300mm自由落
下させ、次いで11wt％NaOH水溶液に導入し、8mの凝固浴
を巻き取り速度100m/minで通過させた。凝固浴から引き
出した糸は水洗後、３％硫酸で再生し、再び水洗した。
その後130℃で乾燥し、つづいて中空部内の有機溶媒を
押し出した。このようにして得た中空繊維の内径は265
μｍ、膜厚25μｍ、水流速平均孔径は8nm、面内空孔率
は10％以下であった。（１）式から計算した値は9.7で
あった。

実施例１と同様のファージ原液を濾過し、濾液5mlを得
た。濾液中にはプラーク法によりファージは確認されな
かった。実施例と同様にセルラーゼ処理で中空繊維を分
解し、遠心上澄みのファージ濃度をプラーク法で定量し
たところ、ファージは確認されなかった。従って、ファ
ージは中空繊維孔中にはほとんど補捉されていなかっ
た。

（実施例２）以下の条件で実施例１と同様に多孔性中空繊維を作製し
た。セルロース濃度;7％、中空剤組成；アセトン／アン
モニア／水＝40/0.56/59.44、凝固剤組成；中空剤組成
と同じ、中空剤吐出速度;2.2ml/min,紡糸原液吐出速度;
2.2ml/min.、紡糸速度10m/min.。得られた中空繊維の内
径は238.4μｍ、膜厚は29.0μｍ、平均孔径48.6μｍ、
極小面内空孔率は30.2％であった。（１）式より計算し
た値は1.2であった。

実施例１と同様にφ×174のファージ原液（ファージ濃
度7.3×10⁷PFU/mlを濾過した。濾液中のウイルス濃度は
7.1×10⁶PFU/mlであった。したがって、φは1.01であっ
た。実施例１と同様に生理食塩水で十分に洗浄した後、
凍結乾燥した。洗浄終了時の濾液中にはファージが確認
されなかった。

実施例１と同様にセルラーゼ処理をし、中空繊維孔中に
補捉されたファージ量を測定したところ、遠心分離上澄
液中のファージ濃度は7.9×10⁵PFU/mlであった。したが
って中空繊維1g中に7.9×10⁷PFUのファージが存在して
いた。従って、媒体1g中のファージ密度は原液より高く
なっていた。

（実施例３）以下の条件で実施例１と同様に多孔性中空繊維を作製し
た。セルロース濃度;8％、中空剤組成；アセトン／アン
モニア／水＝45/0.575/54.425、凝固剤組成；中空剤組
成と同じ、中空剤吐出速度;1.7ml/min,紡糸原液吐出速
度;2.5ml/min.,紡糸速度10m/min.。得られた中空繊維の
内径は310.84μｍ、膜厚は22.9μｍ、平均孔径20.9μ
ｍ、極小面内空孔率は27.5％であった。（１）式より計
算した値は4.4であった。

実施例１と同様にφ×174のファージ原液（ファージ濃
度1.1×10¹⁰PFU/ml）を濾過した。濾液中のウイルス濃
度は7.9×10⁵PFU/mlであった。したがって、φは4.1で
あった。実施例１と同様に生理食塩水で十分に洗浄した
後、凍結乾燥した。洗浄終了時の濾液および中空部を通
過した洗浄液中にはファージが確認されなかった。

実施例１と同様にセルラーゼ処理をし、中空繊維構造体
中に補捉されたファージ量を測定したところ、遠心分離
上澄液中のファージ濃度は2.1×10⁸PFU/mlであった。従
って、中空繊維1g中に2.1×10¹⁰PFUのファージが存在し
ていた。従って、媒体1g中のファージ密度は、原液より
高くなっており、ファージは中空繊維孔中に濃縮されて
補捉されていた。

（実施例４）実施例２と同様の多孔性中空繊維を用いた。大腸菌ファ
ージとしてT4ファージ（IFO20004）宿主菌として大腸菌
（IFO13168）を用いた。T4のウイルス径は85nmとした。
従って、（１）式より計算した値は1.3であった。ファ
ージ原液のファージ濃度は9.5×10⁹（PFU/ml）であっ
た。この原液を実施例１と同様に濾過した。濾液中のウ
イルス濃度は4.3×10⁶（PFU/ml）であった。従って、φ
は3.3であった。分離に引き続いて実施例１と同様に生
理食塩水で十分に洗浄した後、凍結乾燥した。洗浄終了
時の濾液および中空部を通過した洗浄液中にはファージ
が確認されなかった。

実施例１と同様にセルラーゼ処理をし、中空繊維孔中に
補捉されたファージ量を測定したところ、遠心分離上澄
液中のファージ濃度は1.2×10⁸PFU/mlであった。従っ
て、中空繊維1g中に1.2×10¹⁰PFUのファージが存在して
いた。

以上と全く同じ中空繊維とファージ原液を用いて、同じ
条件で濾過と洗浄を行った。中空繊維を凍結乾燥せずに
室温（25℃）で24時間真空乾燥、あるいは24時間室内放
置（風乾）した。洗浄時の濾液及び中空部を通過した洗
浄液中にはファージは確認されなかった。実施例と同様
にセルラーゼ処理して中空繊維孔中に補捉されたファー
ジ量を測定したところ、遠心分離上澄液中のファージ濃
度はそれぞれ3.7×10⁷PFU/ml（真空乾燥）、2.3×10⁶PF
U/ml（風乾）であった。従って、中空繊維1g中にそれぞ
れ3.7×10⁹PFU（真空乾燥）、2.3×10⁸PFU（風乾）しか
感染性のあるファージが存在していなかった。

（比較例２）以上の条件で実施例１と同様に多孔性中空繊維を作製し
た。セルロース濃度;7％、中空剤組成；アセトン／アン
モニア／水＝40/0.56/59.44、凝固剤組成；中空剤組成
と同じ、中空剤吐出速度;3.5ml/min,紡糸原液吐出速度;
2.2ml/min.、紡糸速度10m/min.。得られた中空繊維は膜
厚は19.2μｍ、平均孔径56.3nmであった。（１）式より
計算した値は0.5であった。

実施例１と同様にφ×174のファージ原液（ファージ濃
度6.3×10⁹（PFU/ml）を濾過した。濾液中のウイルス濃
度は1.8×10⁹（PFU/ml）であった。したがって、φは0.
5であった。実施例１と同様に生理食塩水で十分に洗浄
した後、凍結乾燥した。洗浄終了時の濾液および中空部
を通過した洗浄液中にはファージが確認されなかった。

実施例１と同様にセルラーゼ処理をし、中空繊維孔中に
補捉されたファージ量を測定したところ、遠心分離上澄
液中のファージ濃度は3.3×10⁷PFU/mlであった。したが
って中空繊維1g中に3.3×10⁹PFUのファージが存在して
いた。媒体1g中のファージ密度は原液より低くなった。

（実施例５）セルロースリンター（α−セルロース含有量96％以上、
平均分子量2.6×10⁵）を公知の方法で調整した銅アンモ
ニア溶液中に8wt％の濃度で溶解した。この溶液を25℃
のアセトン／アンモニア蒸気雰囲気下に置かれたガラス
板上に均一に流延し、該雰囲気下に１分間から10分間放
置した後、20℃のアセトン25wt％/2.8％アンモニア水2w
t％／水73wt％の混合溶液にガラス板ごと10分間から60
分間浸漬し、その後20℃の2wt％硫酸水溶液中に10分間
浸漬後、水洗し、しかる後、水分をろ紙ですい取り、20
℃のアセトン（100wt％）中に15分間浸漬し、膜中の水
分をアセトンで置換し、ろ紙にはさんで風乾し、平均孔
径を異にする再生セルロース多孔平膜を得た。

得られた膜は、平均孔径63nm、膜厚133μｍであった。
（１）式より計算した値は4.0であった。この膜をミリ
ポア製ステンレスフィルターホルダーに装着し、実施例
４と同じT4ファージの原液（２×10⁷PFU/ml）を圧力200
mmHgで垂直濾過し、濾液5mlを得た。濾液中のウイルス
濃度は3.2×10²（PFU/ml）、φは4.8であった。次いで
生理食塩水で十分に水洗した後、実施例１と同様に凍結
乾燥した。洗浄時の濾液中にファージは確認されなかっ
た。実施例１と同様にセルラーゼ処理して、膜中に補捉
されているファージ量を定量したところ、膜1g中に3.9
×10⁷PFUのファージが補捉されていた。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】極小面内空孔率Pr（％）が10≦Pr≦80、膜
厚Ｔ（μｍ）が10≦Ｔ≦100で（１）式を満足する銅ア
ンモニア法再生セルロールからなる多孔性中空繊維を用
いて、ウイルス径Ｖ（nm）のウイルスが存在する液体
を、実質的に垂直濾過して、該ウイルスを該膜孔中に補
捉し、しかる後に凍結乾燥して孔中に該ウイルスを固定
化することを特徴とするウイルスの固定化方法。（ただし、Ｄは水流速平均孔径Ｄ（nm）を表す）
【請求項２】多孔性膜が、膜厚内貫通孔の入口及び出口
における面内平均孔径の間に、極小の部分、該極小の部
分より大きい部分、もうひとつの極小の部分の順に配列
された構造を膜厚方向に少なくとも１組有する銅アンモ
ニア法再生セルロースからなる多孔性中空繊維である特
許請求の範囲第１項記載のウイルスの固定化方法。