JPH0749365B2 - プロポリス抽出物の製造方法 - Google Patents
プロポリス抽出物の製造方法Info
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- JPH0749365B2 JPH0749365B2 JP3162596A JP16259691A JPH0749365B2 JP H0749365 B2 JPH0749365 B2 JP H0749365B2 JP 3162596 A JP3162596 A JP 3162596A JP 16259691 A JP16259691 A JP 16259691A JP H0749365 B2 JPH0749365 B2 JP H0749365B2
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Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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- Y02W—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES RELATED TO WASTEWATER TREATMENT OR WASTE MANAGEMENT
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- Y02W30/50—Reuse, recycling or recovery technologies
- Y02W30/74—Recovery of fats, fatty oils, fatty acids or other fatty substances, e.g. lanolin or waxes
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- Jellies, Jams, And Syrups (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Fats And Perfumes (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、プロポリスを原料とす
る殺腫瘍細胞作用および抗菌作用に優れた抽出物の製造
方法に関する。
る殺腫瘍細胞作用および抗菌作用に優れた抽出物の製造
方法に関する。
【０００２】
【背景技術】プロポリスは、ミツバチにより採取された
樹脂類、ミツバチの唾液分泌物、蜂ロウ、花粉等が混合
された一種のにかわ質であり、抗菌作用、抗炎症作用等
を示す民間薬として古くから知られている。現在、プロ
ポリスは食品添加物として認可されており、プロポリス
のエチルアルコール溶液、界面活性剤でミセル化された
プロポリスのグリセリン懸濁液等、プロポリスを含有し
た種々の飲食物が製造されている。そして、プロポリス
が各種の炎症、潰瘍、アレルギー性疾患等に対して治癒
効果を有していることを示す臨床例や抗悪性腫瘍作用が
認められた症例が、近年、一般的にも知られるようにな
り、これに伴って、健康保持、疾病予防等のためにこの
プロポリスを飲用する人が増加している。
樹脂類、ミツバチの唾液分泌物、蜂ロウ、花粉等が混合
された一種のにかわ質であり、抗菌作用、抗炎症作用等
を示す民間薬として古くから知られている。現在、プロ
ポリスは食品添加物として認可されており、プロポリス
のエチルアルコール溶液、界面活性剤でミセル化された
プロポリスのグリセリン懸濁液等、プロポリスを含有し
た種々の飲食物が製造されている。そして、プロポリス
が各種の炎症、潰瘍、アレルギー性疾患等に対して治癒
効果を有していることを示す臨床例や抗悪性腫瘍作用が
認められた症例が、近年、一般的にも知られるようにな
り、これに伴って、健康保持、疾病予防等のためにこの
プロポリスを飲用する人が増加している。
【０００３】
【発明の目的】プロポリスは、前述したエチルアルコー
ル溶液やグリセリン懸濁液等のかたちで飲食しても人体
にとって有用な物質であるが、本発明は、プロポリスが
有する生物活性作用、特に殺腫瘍細胞作用および抗菌作
用をより効率的に利用することができるプロポリス抽出
物の製造方法を提供することを目的とする。
ル溶液やグリセリン懸濁液等のかたちで飲食しても人体
にとって有用な物質であるが、本発明は、プロポリスが
有する生物活性作用、特に殺腫瘍細胞作用および抗菌作
用をより効率的に利用することができるプロポリス抽出
物の製造方法を提供することを目的とする。
【０００４】
【目的を達成するための手段】本発明者は、プロポリス
に含まれる抗腫瘍物質の探索を進めていく過程で、プロ
ポリスに特定の処理を施すことにより殺腫瘍細胞作用お
よび抗菌作用に優れたプロポリス抽出物が得られること
を見出だし、本発明を完成するに至った。すなわち、本
発明のプロポリス抽出物の製造方法は、プロポリスの
酢酸エチル抽出液から溶媒を蒸散除去した後、得られた
残渣をメチルアルコール中に分散させ、不溶物を除去し
て、メチルアルコール抽出液を得る工程（以下、第１の
工程ということがある）、前記メチルアルコール抽出
液をカラムクロマトグラフィーにかけて、７０％から１
００％（Ｖ／Ｖ）までの酸性メチルアルコール濃度勾配
による溶出操作を行い、酸性メチルアルコール濃度が８
２〜８８％（Ｖ／Ｖ）の範囲内の画分を得る工程（以
下、第２の工程ということがある）、前記画分から溶
媒を蒸散除去した後、得られた残渣をカラムクロマトグ
ラフィーにかけて、７０％から８０％（Ｖ／Ｖ）までの
酸性アセトニトリル濃度勾配による溶出操作を行い、酸
性アセトニトリル濃度が７３〜７６％（Ｖ／Ｖ）の範囲
内の画分を得る工程（以下、第３の工程ということがあ
る）、前記画分から溶媒を蒸散除去した後、得られた
残渣をカラムクロマトグラフィーにかけて、７５％から
９０％（Ｖ／Ｖ）までのエチルアルコール濃度勾配によ
る溶出操作を行い、エチルアルコール濃度が８０〜８５
％（Ｖ／Ｖ）の範囲内の画分を得る工程（以下、第４の
工程ということがある）とを含むことを特徴とするもの
である。
に含まれる抗腫瘍物質の探索を進めていく過程で、プロ
ポリスに特定の処理を施すことにより殺腫瘍細胞作用お
よび抗菌作用に優れたプロポリス抽出物が得られること
を見出だし、本発明を完成するに至った。すなわち、本
発明のプロポリス抽出物の製造方法は、プロポリスの
酢酸エチル抽出液から溶媒を蒸散除去した後、得られた
残渣をメチルアルコール中に分散させ、不溶物を除去し
て、メチルアルコール抽出液を得る工程（以下、第１の
工程ということがある）、前記メチルアルコール抽出
液をカラムクロマトグラフィーにかけて、７０％から１
００％（Ｖ／Ｖ）までの酸性メチルアルコール濃度勾配
による溶出操作を行い、酸性メチルアルコール濃度が８
２〜８８％（Ｖ／Ｖ）の範囲内の画分を得る工程（以
下、第２の工程ということがある）、前記画分から溶
媒を蒸散除去した後、得られた残渣をカラムクロマトグ
ラフィーにかけて、７０％から８０％（Ｖ／Ｖ）までの
酸性アセトニトリル濃度勾配による溶出操作を行い、酸
性アセトニトリル濃度が７３〜７６％（Ｖ／Ｖ）の範囲
内の画分を得る工程（以下、第３の工程ということがあ
る）、前記画分から溶媒を蒸散除去した後、得られた
残渣をカラムクロマトグラフィーにかけて、７５％から
９０％（Ｖ／Ｖ）までのエチルアルコール濃度勾配によ
る溶出操作を行い、エチルアルコール濃度が８０〜８５
％（Ｖ／Ｖ）の範囲内の画分を得る工程（以下、第４の
工程ということがある）とを含むことを特徴とするもの
である。
【０００５】以下、本発明を詳細に説明する。本発明の
プロポリス抽出物の製造方法では、まず、上述した第１
の工程を行う。この第１の工程での出発原料であるプロ
ポリスの酢酸抽出液は、プロポリス（塊状物、粉砕物、
乾燥粉末等）、プロポリスのエチルアルコール溶液、界
面活性剤でミセル化されたプロポリスのグリセリン懸濁
液等を用いて、例えば下記Ｉ、IIおよびIII のようにし
て調製することができる。
プロポリス抽出物の製造方法では、まず、上述した第１
の工程を行う。この第１の工程での出発原料であるプロ
ポリスの酢酸抽出液は、プロポリス（塊状物、粉砕物、
乾燥粉末等）、プロポリスのエチルアルコール溶液、界
面活性剤でミセル化されたプロポリスのグリセリン懸濁
液等を用いて、例えば下記Ｉ、IIおよびIII のようにし
て調製することができる。
【０００６】Ｉ．プロポリスを用いる場合には、プロポ
リスを酢酸エチルで直接抽出することにより、プロポリ
スの酢酸エチル抽出液を得てもよいが、下記ａ〜ｃの要
領で酢酸エチル抽出液を得た方がより好ましい。 ａ．まず、プロポリスを５〜１０倍量（Ｖ／Ｗ）のエチ
ルアルコール［濃度：９５〜９９．５％（Ｗ／Ｗ）］と
混合し、マグネチックスターラー等を用いて２０〜３０
℃で一昼夜以上撹拌して懸濁液を得た後に、この懸濁液
を常圧下ないし減圧下でろ過して、プロポリスのエチル
アルコール抽出液を得る。 ｂ．次いで、得られたエチルアルコール抽出液中の溶媒
をローターリーエバポレーター等を用いて蒸散除去す
る。 ｃ．この後、得られた残渣を、水と酢酸エチルとの１：
１〜１：２混液に分散させ、上層の酢酸エチル層を分取
することによりプロポリスの酢酸エチル抽出液を得る。
リスを酢酸エチルで直接抽出することにより、プロポリ
スの酢酸エチル抽出液を得てもよいが、下記ａ〜ｃの要
領で酢酸エチル抽出液を得た方がより好ましい。 ａ．まず、プロポリスを５〜１０倍量（Ｖ／Ｗ）のエチ
ルアルコール［濃度：９５〜９９．５％（Ｗ／Ｗ）］と
混合し、マグネチックスターラー等を用いて２０〜３０
℃で一昼夜以上撹拌して懸濁液を得た後に、この懸濁液
を常圧下ないし減圧下でろ過して、プロポリスのエチル
アルコール抽出液を得る。 ｂ．次いで、得られたエチルアルコール抽出液中の溶媒
をローターリーエバポレーター等を用いて蒸散除去す
る。 ｃ．この後、得られた残渣を、水と酢酸エチルとの１：
１〜１：２混液に分散させ、上層の酢酸エチル層を分取
することによりプロポリスの酢酸エチル抽出液を得る。
【０００７】II. プロポリスのエチルアルコール溶液を
用いる場合には、上記ａの操作は省略して、上記ｂおよ
びｃの操作を行うことによりプロポリスの酢酸エチル抽
出液を得る。 III.界面活性剤でミセル化されたプロポリスのグリセリ
ン懸濁液を用いる場合には、まず、この懸濁液を１〜２
倍量（Ｖ／Ｖ）のイソプロピルアルコールやＤＭＳＯ
（ジメチルスルホキシド）等と混合し、マグネチックス
ターラー等で撹拌しながら前記懸濁液に対して１０〜１
５倍量（Ｖ／Ｖ）の５〜１０％（Ｗ／Ｖ）食塩水と、同
じく２〜３倍量（Ｖ／Ｖ）の酢酸エチルとを加え、２０
〜３０℃で５〜１０分撹拌を続ける。撹拌後、静置また
は低速遠心して、上層の酢酸エチル層を分取することに
よりプロポリスの酢酸エチル抽出液を得る。
用いる場合には、上記ａの操作は省略して、上記ｂおよ
びｃの操作を行うことによりプロポリスの酢酸エチル抽
出液を得る。 III.界面活性剤でミセル化されたプロポリスのグリセリ
ン懸濁液を用いる場合には、まず、この懸濁液を１〜２
倍量（Ｖ／Ｖ）のイソプロピルアルコールやＤＭＳＯ
（ジメチルスルホキシド）等と混合し、マグネチックス
ターラー等で撹拌しながら前記懸濁液に対して１０〜１
５倍量（Ｖ／Ｖ）の５〜１０％（Ｗ／Ｖ）食塩水と、同
じく２〜３倍量（Ｖ／Ｖ）の酢酸エチルとを加え、２０
〜３０℃で５〜１０分撹拌を続ける。撹拌後、静置また
は低速遠心して、上層の酢酸エチル層を分取することに
よりプロポリスの酢酸エチル抽出液を得る。
【０００８】本発明の方法における第１の工程では、上
述のようにして得られるプロポリスの酢酸エチル抽出液
から溶媒を蒸散除去した後、得られた残渣をメチルアル
コール中に分散させ、不溶物を除去して、メチルアルコ
ール抽出液を得る。ここで、酢酸エチル抽出液からの溶
媒の蒸散除去は、常法に基づき、ローターリーエバポレ
ーター等により行うことができる。また、残渣を分散さ
せたメチルアルコール中からの不溶物の除去は、常法に
基づき、ろ過や低速遠心等により行うことができる。第
１の工程で用いるメチルアルコールの濃度は、９９．５
〜９９．７％（Ｗ／Ｗ）であることが好ましい。
述のようにして得られるプロポリスの酢酸エチル抽出液
から溶媒を蒸散除去した後、得られた残渣をメチルアル
コール中に分散させ、不溶物を除去して、メチルアルコ
ール抽出液を得る。ここで、酢酸エチル抽出液からの溶
媒の蒸散除去は、常法に基づき、ローターリーエバポレ
ーター等により行うことができる。また、残渣を分散さ
せたメチルアルコール中からの不溶物の除去は、常法に
基づき、ろ過や低速遠心等により行うことができる。第
１の工程で用いるメチルアルコールの濃度は、９９．５
〜９９．７％（Ｗ／Ｗ）であることが好ましい。
【０００９】本発明の方法では、第２の工程として、上
述した第１の工程で得られたメチルアルコール抽出液を
カラムクロマトグラフィーにかけて、７０％から１００
％（Ｖ／Ｖ）までの酸性メチルアルコール濃度勾配によ
る溶出操作を行い、酸性メチルアルコール濃度が８２〜
８８％（Ｖ／Ｖ）の範囲内の画分を得る。この第２の工
程で用いるカラムは、予め７０％（Ｖ／Ｖ）酸性メチル
アルコール（ｐＨは溶離剤のｐＨと同じ）で平衡化して
おくことが好ましい。また、カラムクロマトグラフィー
としては液体クロマトグラフィーが特に好ましく、液体
クロマトグラフィーを行う場合のカラムとしては、ＯＤ
Ｓ系カラム［例えば、東ソー（株）製のＯＤＳ ８０Ｔ
M ］等を用いることが好ましい。酸性メチルアルコール
濃度が８２〜８８％（Ｖ／Ｖ）の範囲内の画分は、例え
ば液体クロマトグラフィーの場合、オートマチックフラ
クションコレクター等を用いて常法により得ることがで
きる。また、以下のクロマト操作においては、紫外線
（例えば波長２５４ｎｍ）の吸収を自動的に測定、記録
することにより、画分の溶出を検出することができる。
なお、第２の工程で溶離剤として用いる７０〜１００％
（Ｖ／Ｖ）酸性メチアルコール、およびカラムの平衡化
のために第２の工程で用いられることがある７０％（Ｖ
／Ｖ）酸性メチルアルコールとは、それぞれ、当該濃度
（Ｖ／Ｖ）のメチルアルコールに酢酸等の揮発性酸を加
えてｐＨを３．４〜３．６に調整した液を意味する。
述した第１の工程で得られたメチルアルコール抽出液を
カラムクロマトグラフィーにかけて、７０％から１００
％（Ｖ／Ｖ）までの酸性メチルアルコール濃度勾配によ
る溶出操作を行い、酸性メチルアルコール濃度が８２〜
８８％（Ｖ／Ｖ）の範囲内の画分を得る。この第２の工
程で用いるカラムは、予め７０％（Ｖ／Ｖ）酸性メチル
アルコール（ｐＨは溶離剤のｐＨと同じ）で平衡化して
おくことが好ましい。また、カラムクロマトグラフィー
としては液体クロマトグラフィーが特に好ましく、液体
クロマトグラフィーを行う場合のカラムとしては、ＯＤ
Ｓ系カラム［例えば、東ソー（株）製のＯＤＳ ８０Ｔ
M ］等を用いることが好ましい。酸性メチルアルコール
濃度が８２〜８８％（Ｖ／Ｖ）の範囲内の画分は、例え
ば液体クロマトグラフィーの場合、オートマチックフラ
クションコレクター等を用いて常法により得ることがで
きる。また、以下のクロマト操作においては、紫外線
（例えば波長２５４ｎｍ）の吸収を自動的に測定、記録
することにより、画分の溶出を検出することができる。
なお、第２の工程で溶離剤として用いる７０〜１００％
（Ｖ／Ｖ）酸性メチアルコール、およびカラムの平衡化
のために第２の工程で用いられることがある７０％（Ｖ
／Ｖ）酸性メチルアルコールとは、それぞれ、当該濃度
（Ｖ／Ｖ）のメチルアルコールに酢酸等の揮発性酸を加
えてｐＨを３．４〜３．６に調整した液を意味する。
【００１０】本発明の方法では、第３の工程として、上
述した第２の工程で得られた酸性メチルアルコール濃度
が８２〜８８％（Ｖ／Ｖ）の範囲内の画分から溶媒を蒸
散除去した後、得られた残渣をカラムクロマトグラフィ
ーにかけて、７０％から８０％（Ｖ／Ｖ）までの酸性ア
セトニトリル濃度勾配による溶出操作を行い、酸性アセ
トニトリル濃度が７３〜７６％（Ｖ／Ｖ）の範囲内の画
分を得る。この第３の工程における前記画分からの溶媒
の蒸散除去は、常法に基づき、ローターリーエバポレー
ター等により行うことができる。得られた残渣をカラム
クロマトグラフィーにかけるにあたっては、残渣を７０
％（Ｖ／Ｖ）酸性アセトアニリルに溶解させてカラムに
注入することが好ましい。また、この第３の工程で用い
るカラムは、予め７０％（Ｖ／Ｖ）酸性アセトニトリル
（ｐＨは溶離剤のｐＨと同じ）で平衡化しておくことが
好ましい。カラムクロマトグラフィーとしては、液体ク
ロマトグラフィーが特に好ましく、液体クロマトグラフ
ィーを行う場合のカラムとしては、ＯＤＳ系カラム［例
えば、東ソー（株）製のＯＤＳ ８０ＴM ］等を用いる
ことが好ましい。酸性アセトアニリル濃度が７３〜７６
％（Ｖ／Ｖ）の範囲内の画分は、例えば液体クロマトグ
ラフィーの場合、オートマチックフラクションコレクタ
ー等を用いて常法により得ることができる。なお、第３
の工程で溶離剤として用いる７０〜８０％（Ｖ／Ｖ）酸
性メチアルコール、およびカラムの平衡化のために第３
の工程で用いられることがある７０％（Ｖ／Ｖ）酸性ア
セトニトリルとは、それぞれ、当該濃度（Ｖ／Ｖ）のア
セトニトリルに酢酸等の揮発性酸を加えてｐＨを３．４
〜３．６に調整した液を意味する。
述した第２の工程で得られた酸性メチルアルコール濃度
が８２〜８８％（Ｖ／Ｖ）の範囲内の画分から溶媒を蒸
散除去した後、得られた残渣をカラムクロマトグラフィ
ーにかけて、７０％から８０％（Ｖ／Ｖ）までの酸性ア
セトニトリル濃度勾配による溶出操作を行い、酸性アセ
トニトリル濃度が７３〜７６％（Ｖ／Ｖ）の範囲内の画
分を得る。この第３の工程における前記画分からの溶媒
の蒸散除去は、常法に基づき、ローターリーエバポレー
ター等により行うことができる。得られた残渣をカラム
クロマトグラフィーにかけるにあたっては、残渣を７０
％（Ｖ／Ｖ）酸性アセトアニリルに溶解させてカラムに
注入することが好ましい。また、この第３の工程で用い
るカラムは、予め７０％（Ｖ／Ｖ）酸性アセトニトリル
（ｐＨは溶離剤のｐＨと同じ）で平衡化しておくことが
好ましい。カラムクロマトグラフィーとしては、液体ク
ロマトグラフィーが特に好ましく、液体クロマトグラフ
ィーを行う場合のカラムとしては、ＯＤＳ系カラム［例
えば、東ソー（株）製のＯＤＳ ８０ＴM ］等を用いる
ことが好ましい。酸性アセトアニリル濃度が７３〜７６
％（Ｖ／Ｖ）の範囲内の画分は、例えば液体クロマトグ
ラフィーの場合、オートマチックフラクションコレクタ
ー等を用いて常法により得ることができる。なお、第３
の工程で溶離剤として用いる７０〜８０％（Ｖ／Ｖ）酸
性メチアルコール、およびカラムの平衡化のために第３
の工程で用いられることがある７０％（Ｖ／Ｖ）酸性ア
セトニトリルとは、それぞれ、当該濃度（Ｖ／Ｖ）のア
セトニトリルに酢酸等の揮発性酸を加えてｐＨを３．４
〜３．６に調整した液を意味する。
【００１１】本発明の方法では、第４の工程として、上
述した第３の工程で得られた、酸性アセトニトリル濃度
が７３〜７６％（Ｖ／Ｖ）の範囲内の画分の溶媒を蒸散
除去した後、得られた残渣をカラムクロマトグラフィー
にかけて、７５％から９０％（Ｖ／Ｖ）までのエチルア
ルコール濃度勾配による溶出操作を行い、エチルアルコ
ール濃度が８０〜８５％（Ｖ／Ｖ）の範囲内の画分を得
る。この第４の工程における前記画分からの溶媒の蒸散
除去は、常法に基づき、ローターリーエバポレーター等
により行うことができる。得られた残渣をカラムクロマ
トグラフィーにかけるにあたっては、残渣を７０％（Ｖ
／Ｖ）アセトニトリルに溶解させてカラムに注入するこ
とが好ましい。また、この第４の工程で用いるカラム
は、予め７５％（Ｖ／Ｖ）エチルアルコールで平衡化し
ておくことが好ましい。カラムクロマトグラフィーとし
ては、液体クロマトグラフィーが特に好ましく、液体ク
ロマトグラフィーを行う場合のカラムとしては、ＯＤＳ
系カラム［例えば、東ソー（株）製のＯＤＳ ８０
ＴM ］等を用いることが好ましい。エチルアルコール濃
度が８０〜８５％（Ｖ／Ｖ）の範囲内の画分は、例えば
液体クロマトグラフィーの場合、オートマチックフラク
ションコレクター等を用いて常法により得ることができ
る。紫外線（例えば波長２５４ｎｍ）の吸収を自動的に
測定、記録することにより画分の溶出を確認する。この
際、主画分が２つ得られた場合は、両方の主画分を得て
もよいが、エタノール濃度にして８２〜８３％（Ｖ／
Ｖ）近辺で溶出される後方の画分を得た方がより好まし
い。
述した第３の工程で得られた、酸性アセトニトリル濃度
が７３〜７６％（Ｖ／Ｖ）の範囲内の画分の溶媒を蒸散
除去した後、得られた残渣をカラムクロマトグラフィー
にかけて、７５％から９０％（Ｖ／Ｖ）までのエチルア
ルコール濃度勾配による溶出操作を行い、エチルアルコ
ール濃度が８０〜８５％（Ｖ／Ｖ）の範囲内の画分を得
る。この第４の工程における前記画分からの溶媒の蒸散
除去は、常法に基づき、ローターリーエバポレーター等
により行うことができる。得られた残渣をカラムクロマ
トグラフィーにかけるにあたっては、残渣を７０％（Ｖ
／Ｖ）アセトニトリルに溶解させてカラムに注入するこ
とが好ましい。また、この第４の工程で用いるカラム
は、予め７５％（Ｖ／Ｖ）エチルアルコールで平衡化し
ておくことが好ましい。カラムクロマトグラフィーとし
ては、液体クロマトグラフィーが特に好ましく、液体ク
ロマトグラフィーを行う場合のカラムとしては、ＯＤＳ
系カラム［例えば、東ソー（株）製のＯＤＳ ８０
ＴM ］等を用いることが好ましい。エチルアルコール濃
度が８０〜８５％（Ｖ／Ｖ）の範囲内の画分は、例えば
液体クロマトグラフィーの場合、オートマチックフラク
ションコレクター等を用いて常法により得ることができ
る。紫外線（例えば波長２５４ｎｍ）の吸収を自動的に
測定、記録することにより画分の溶出を確認する。この
際、主画分が２つ得られた場合は、両方の主画分を得て
もよいが、エタノール濃度にして８２〜８３％（Ｖ／
Ｖ）近辺で溶出される後方の画分を得た方がより好まし
い。
【００１２】このようにして得られる、エチルアルコー
ル濃度が８０〜８５％（Ｖ／Ｖ）の範囲内の画分中に
は、プロポリス中に含まれていた殺腫瘍細胞作用および
抗菌作用に優れた物質が高濃度で含まれている。したが
って、本発明の方法に基づいて得られた、上記エチルア
ルコール濃度が８０〜８５％（Ｖ／Ｖ）の範囲内の画分
を水、生理食塩水等により希釈したものを食することに
より、前述したエチルアルコール溶液やグリセリン懸濁
液等のかたちでプロポリスを食する場合よりも、プロポ
リスが有する殺腫瘍細胞作用および抗菌作用をより効率
的に利用することが可能となる。また本発明の方法は、
上述のようにして得た、エチルアルコール濃度が８０〜
８５％（Ｖ／Ｖ）の範囲内の画分の溶媒を蒸散除去して
残渣を得る工程を含んでいてもよい。そしてこの残渣そ
のもの、あるいは得られた残渣を食物に添加したものを
食することにより、プロポリスが有する殺腫瘍細胞作用
および抗菌作用をより効率的に利用することが可能とな
る。さらに、本発明の方法に基づいて得られたプロポリ
ス抽出物は、医薬品製造原料等として利用することもで
きる。
ル濃度が８０〜８５％（Ｖ／Ｖ）の範囲内の画分中に
は、プロポリス中に含まれていた殺腫瘍細胞作用および
抗菌作用に優れた物質が高濃度で含まれている。したが
って、本発明の方法に基づいて得られた、上記エチルア
ルコール濃度が８０〜８５％（Ｖ／Ｖ）の範囲内の画分
を水、生理食塩水等により希釈したものを食することに
より、前述したエチルアルコール溶液やグリセリン懸濁
液等のかたちでプロポリスを食する場合よりも、プロポ
リスが有する殺腫瘍細胞作用および抗菌作用をより効率
的に利用することが可能となる。また本発明の方法は、
上述のようにして得た、エチルアルコール濃度が８０〜
８５％（Ｖ／Ｖ）の範囲内の画分の溶媒を蒸散除去して
残渣を得る工程を含んでいてもよい。そしてこの残渣そ
のもの、あるいは得られた残渣を食物に添加したものを
食することにより、プロポリスが有する殺腫瘍細胞作用
および抗菌作用をより効率的に利用することが可能とな
る。さらに、本発明の方法に基づいて得られたプロポリ
ス抽出物は、医薬品製造原料等として利用することもで
きる。
【００１３】
【実施例】以下、本発明の実施例について説明する。 実施例１ (1) 第１の工程 まず、ブラジル産プロポリス１００ｇを１０倍量（Ｖ／
Ｖ）の９９．５％（Ｗ／Ｗ）エチルアルコールと混合
し、マグネチックスターラーを用いて室温下で撹拌し
た。得られた懸濁液をろ紙を通して減圧ろ過して、プロ
ポリスのエチルアルコール抽出液を得た。次いで、得ら
れたエチルアルコール抽出液の溶媒をローターリーエバ
ポレーターを用いて蒸散除去し、得られた残渣３０ｇを
水と酢酸エチルとの１：１混液に分散させ、上層の酢酸
エチル層を分取することによりプロポリスの酢酸エチル
抽出液を得た。この後、得られた酢酸エチル抽出液の溶
媒をローターリーエバポレーターにより蒸散除去し、得
られた残渣２０ｇを９９．５％（Ｗ／Ｗ）メチルアルコ
ールに分散させた後に不溶物を低速遠心により取除い
て、メチルアルコール抽出液を得た。
Ｖ）の９９．５％（Ｗ／Ｗ）エチルアルコールと混合
し、マグネチックスターラーを用いて室温下で撹拌し
た。得られた懸濁液をろ紙を通して減圧ろ過して、プロ
ポリスのエチルアルコール抽出液を得た。次いで、得ら
れたエチルアルコール抽出液の溶媒をローターリーエバ
ポレーターを用いて蒸散除去し、得られた残渣３０ｇを
水と酢酸エチルとの１：１混液に分散させ、上層の酢酸
エチル層を分取することによりプロポリスの酢酸エチル
抽出液を得た。この後、得られた酢酸エチル抽出液の溶
媒をローターリーエバポレーターにより蒸散除去し、得
られた残渣２０ｇを９９．５％（Ｗ／Ｗ）メチルアルコ
ールに分散させた後に不溶物を低速遠心により取除い
て、メチルアルコール抽出液を得た。
【００１４】(2) 第２の工程 上記(1) で得られたメチルアルコール抽出液を、７０％
（Ｖ／Ｖ）酸性メチルアルコール［７０％（Ｖ／Ｖ）メ
チルアルコールのｐＨを酢酸で３．５に調整したもの］
で平衡化した高速液体クロマトグラフィー用ＯＤＳ系カ
ラム［商品名：東ソーＯＤＳ ８０ＴM 、東ソー（株）
製］に注入し、７０％から１００％（Ｖ／Ｖ）までの酸
性メチルアルコール（ｐＨは酢酸で３．５に調整）濃度
勾配による傾斜溶離を行った。この後、酸性メチルアル
コール濃度８２〜８８％の画分をオートマチックフラク
ションコレクターを用いて分取した。
（Ｖ／Ｖ）酸性メチルアルコール［７０％（Ｖ／Ｖ）メ
チルアルコールのｐＨを酢酸で３．５に調整したもの］
で平衡化した高速液体クロマトグラフィー用ＯＤＳ系カ
ラム［商品名：東ソーＯＤＳ ８０ＴM 、東ソー（株）
製］に注入し、７０％から１００％（Ｖ／Ｖ）までの酸
性メチルアルコール（ｐＨは酢酸で３．５に調整）濃度
勾配による傾斜溶離を行った。この後、酸性メチルアル
コール濃度８２〜８８％の画分をオートマチックフラク
ションコレクターを用いて分取した。
【００１５】(3) 第３の工程 まず、上記(2) で得られた酸性メチルアルコール濃度８
２〜８８％の画分を１つに集め、溶媒をローターリーエ
バポレーターにより蒸散除去して、残渣２００ｍｇを得
た。次いで、得られた残渣を７０％（Ｖ／Ｖ）酸性アセ
トニトリル［７０％（Ｖ／Ｖ）アセトニトリルのｐＨを
酢酸で３．５に調整したもの］に溶解させ、得られた溶
液を、７０％酸性アセトニトリル［７０％（Ｖ／Ｖ）ア
セトニトリルのｐＨを酢酸で３．５に調整したもの］で
平衡化した高速液体クロマトグラフィー用ＯＤＳ系カラ
ム［商品名：東ソーＯＤＳ ８０ＴM 、東ソー（株）
製］に注入し、７０〜８０％（Ｖ／Ｖ）の酸性アセトニ
トリル（ｐＨは酢酸で３．５に調整）濃度勾配による傾
斜溶離を行った。この後、酸性アセトニトリル濃度７３
〜７６％の画分をオートマチックフラクションコレクタ
ーを用いて分取した。
２〜８８％の画分を１つに集め、溶媒をローターリーエ
バポレーターにより蒸散除去して、残渣２００ｍｇを得
た。次いで、得られた残渣を７０％（Ｖ／Ｖ）酸性アセ
トニトリル［７０％（Ｖ／Ｖ）アセトニトリルのｐＨを
酢酸で３．５に調整したもの］に溶解させ、得られた溶
液を、７０％酸性アセトニトリル［７０％（Ｖ／Ｖ）ア
セトニトリルのｐＨを酢酸で３．５に調整したもの］で
平衡化した高速液体クロマトグラフィー用ＯＤＳ系カラ
ム［商品名：東ソーＯＤＳ ８０ＴM 、東ソー（株）
製］に注入し、７０〜８０％（Ｖ／Ｖ）の酸性アセトニ
トリル（ｐＨは酢酸で３．５に調整）濃度勾配による傾
斜溶離を行った。この後、酸性アセトニトリル濃度７３
〜７６％の画分をオートマチックフラクションコレクタ
ーを用いて分取した。
【００１６】(4) 第４の工程 まず、上記(3) で得られた酸性アセトニトリル濃度７３
〜７６％の画分を１つに集め、溶媒をローターリーエバ
ポレーターにより蒸散除去して、残渣５０ｍｇを得た。
次いで、得られた残渣を７０％（Ｖ／Ｖ）アセトニトリ
ルに溶解させ、得られた溶液を、７５％（Ｖ／Ｖ）エチ
ルアルコールで平衡化した高速液体クロマトグラフィー
用ＯＤＳ系カラム［商品名：東ソーＯＤＳ ８０ＴM 、
東ソー（株）製］に注入し、７５〜９０％（Ｖ／Ｖ）の
エチルアルコール濃度勾配による傾斜溶離を行った。こ
の後、エチルアルコール濃度８０〜８５％の画分をオー
トマチックフラクションコレクターを用いて分取した。
紫外線（波長２５４ｎｍ）を吸収する主画分が２つ得ら
れたので、後方の画分を得た。得られた画分を１つに集
めて、本発明の目的物であるプロポリス抽出物（Ａ）を
得た。
〜７６％の画分を１つに集め、溶媒をローターリーエバ
ポレーターにより蒸散除去して、残渣５０ｍｇを得た。
次いで、得られた残渣を７０％（Ｖ／Ｖ）アセトニトリ
ルに溶解させ、得られた溶液を、７５％（Ｖ／Ｖ）エチ
ルアルコールで平衡化した高速液体クロマトグラフィー
用ＯＤＳ系カラム［商品名：東ソーＯＤＳ ８０ＴM 、
東ソー（株）製］に注入し、７５〜９０％（Ｖ／Ｖ）の
エチルアルコール濃度勾配による傾斜溶離を行った。こ
の後、エチルアルコール濃度８０〜８５％の画分をオー
トマチックフラクションコレクターを用いて分取した。
紫外線（波長２５４ｎｍ）を吸収する主画分が２つ得ら
れたので、後方の画分を得た。得られた画分を１つに集
めて、本発明の目的物であるプロポリス抽出物（Ａ）を
得た。
【００１７】実施例２ まず、界面活性剤でミセル化されたプロポリスのグリセ
リン懸濁液［商品名：ＥＳＴＡ ＰＲＯＮＴＯ、日本プ
ロポリス（株）製］１００ｍｌと１．５倍量（Ｖ／Ｖ）
のイソプロピルアルコールとを混合し、マグネチックス
ターラーで撹拌しながら前記グリセリン懸濁液に対して
７倍量（Ｖ／Ｖ）の１０％（Ｗ／Ｖ）食塩水と同じく２
倍量（Ｖ／Ｖ）の酢酸エチルとを加え、室温下で約５分
撹拌を続けた。撹拌後、静置して、上層の酢酸エチル層
を分取することによりプロポリスの酢酸エチル抽出液を
得た。次いで、得られた酢酸エチル抽出液の溶媒をロー
ターリーエバポレーターにより蒸散除去し、得られた残
渣１０ｇを９９．５％（Ｗ／Ｗ）メチルアルコールに分
散させた後に不溶物を低速遠心により取除いて、メチル
アルコール抽出液を得た。この後は実施例１(2) 〜(4)
と同様の操作を行ってエチルアルコール濃度８０〜８５
％の画分を分取し、得られた画分を１つに集めて、本発
明の目的物であるプロポリス抽出物（Ｂ）を得た。
リン懸濁液［商品名：ＥＳＴＡ ＰＲＯＮＴＯ、日本プ
ロポリス（株）製］１００ｍｌと１．５倍量（Ｖ／Ｖ）
のイソプロピルアルコールとを混合し、マグネチックス
ターラーで撹拌しながら前記グリセリン懸濁液に対して
７倍量（Ｖ／Ｖ）の１０％（Ｗ／Ｖ）食塩水と同じく２
倍量（Ｖ／Ｖ）の酢酸エチルとを加え、室温下で約５分
撹拌を続けた。撹拌後、静置して、上層の酢酸エチル層
を分取することによりプロポリスの酢酸エチル抽出液を
得た。次いで、得られた酢酸エチル抽出液の溶媒をロー
ターリーエバポレーターにより蒸散除去し、得られた残
渣１０ｇを９９．５％（Ｗ／Ｗ）メチルアルコールに分
散させた後に不溶物を低速遠心により取除いて、メチル
アルコール抽出液を得た。この後は実施例１(2) 〜(4)
と同様の操作を行ってエチルアルコール濃度８０〜８５
％の画分を分取し、得られた画分を１つに集めて、本発
明の目的物であるプロポリス抽出物（Ｂ）を得た。
【００１８】殺腫瘍細胞作用試験 実施例１(4) で得られたプロポリス抽出物（Ａ）から溶
媒をローターリーエバポレーターにより蒸散除去して残
渣（以下、これを残渣Ａというが、これも本発明の目的
物であるプロポリス抽出物に相当する）を得、この残渣
Ａを被験物質として用いて、以下のようにして殺癌細胞
作用の試験を行った。まず、ヒト肝癌ＨｕＨ１３株を液
体培地（１０％仔ウシ血清を含むイーグルＭＥＭ培地）
で培養した後、１×１０5 細胞／ｍｌのＨｕＨ１３株浮
游液に調製した。次いで、この浮游液に、被験物質のＤ
ＭＳＯ溶液を被験物質の濃度が所定濃度となるように添
加した後、この液をプラスチックプレートのウエルに
０．１ｍｌ分注して、５％炭酸ガスと９５％空気との通
気雰囲気下、３７℃で４８時間培養した。次に、プレー
ト壁に付着した細胞をトリプシンとＥＤＴＡ（エチレン
ジアミンテトラ酢酸）とで処理して剥離し、剥離した細
胞を新しい別のプラスチックプレートに移して、５％炭
酸ガスと９５％空気との通気雰囲気下、３７℃で培養し
た。このときの培養液としては、同上の血清を含むイー
グル培地を用いた。
媒をローターリーエバポレーターにより蒸散除去して残
渣（以下、これを残渣Ａというが、これも本発明の目的
物であるプロポリス抽出物に相当する）を得、この残渣
Ａを被験物質として用いて、以下のようにして殺癌細胞
作用の試験を行った。まず、ヒト肝癌ＨｕＨ１３株を液
体培地（１０％仔ウシ血清を含むイーグルＭＥＭ培地）
で培養した後、１×１０5 細胞／ｍｌのＨｕＨ１３株浮
游液に調製した。次いで、この浮游液に、被験物質のＤ
ＭＳＯ溶液を被験物質の濃度が所定濃度となるように添
加した後、この液をプラスチックプレートのウエルに
０．１ｍｌ分注して、５％炭酸ガスと９５％空気との通
気雰囲気下、３７℃で４８時間培養した。次に、プレー
ト壁に付着した細胞をトリプシンとＥＤＴＡ（エチレン
ジアミンテトラ酢酸）とで処理して剥離し、剥離した細
胞を新しい別のプラスチックプレートに移して、５％炭
酸ガスと９５％空気との通気雰囲気下、３７℃で培養し
た。このときの培養液としては、同上の血清を含むイー
グル培地を用いた。
【００１９】２４時間後、プレート壁に付着している生
細胞をＭＴＴ法｛Slater,T.F. ら、Biochim. Biophys.
Acta 77 (1963) 353〜393 。ＭＴＴ［３−（４，５−ジ
メチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテ
トラゾリウム ブロマイド］を細胞に取り込ませ、これ
を還元することにより生じるＭＴＴフォルマザンの呈色
反応を利用する方法｝により定量し、被験物質で処理し
た際の生細胞数と無処理対照生細胞数との割合を算定す
ることにより生存率を求めて、生存率の高低により殺癌
細胞作用の強弱を評価した。なお、コントロールでは被
験物質に代えて、被験物質を溶解するＤＭＳＯを用い
た。また、対照細胞としてはウサギ腎ＲＫ１３株と初代
ウサギ腎細胞とを用い、これらの細胞には、プラスチッ
クプレート中で単層培養して集密的になったときに、被
験物質のＤＭＳＯ溶液を被験物質の濃度が所定濃度とな
るように加え、以後はヒト肝癌ＨｕＨ１３株の場合と同
様にして、生存率を求めた。これらの結果を図１に示
す。
細胞をＭＴＴ法｛Slater,T.F. ら、Biochim. Biophys.
Acta 77 (1963) 353〜393 。ＭＴＴ［３−（４，５−ジ
メチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテ
トラゾリウム ブロマイド］を細胞に取り込ませ、これ
を還元することにより生じるＭＴＴフォルマザンの呈色
反応を利用する方法｝により定量し、被験物質で処理し
た際の生細胞数と無処理対照生細胞数との割合を算定す
ることにより生存率を求めて、生存率の高低により殺癌
細胞作用の強弱を評価した。なお、コントロールでは被
験物質に代えて、被験物質を溶解するＤＭＳＯを用い
た。また、対照細胞としてはウサギ腎ＲＫ１３株と初代
ウサギ腎細胞とを用い、これらの細胞には、プラスチッ
クプレート中で単層培養して集密的になったときに、被
験物質のＤＭＳＯ溶液を被験物質の濃度が所定濃度とな
るように加え、以後はヒト肝癌ＨｕＨ１３株の場合と同
様にして、生存率を求めた。これらの結果を図１に示
す。
【００２０】図１から明らかなように、本発明の方法に
より得られるプロポリス抽出物の１つである残渣Ａは、
ヒト肝癌ＨｕＨ１３株に対しては優れた殺傷作用を示
し、ウサギ腎ＲＫ１３株や初代ウサギ腎細胞に対しては
比較的低い殺傷作用しか示さない。このことから、残渣
Ａは殺癌細胞作用に優れているということがわかる。
より得られるプロポリス抽出物の１つである残渣Ａは、
ヒト肝癌ＨｕＨ１３株に対しては優れた殺傷作用を示
し、ウサギ腎ＲＫ１３株や初代ウサギ腎細胞に対しては
比較的低い殺傷作用しか示さない。このことから、残渣
Ａは殺癌細胞作用に優れているということがわかる。
【００２１】抗菌作用試験 上述した残渣Ａを被験物質として用いて、以下のように
して抗菌作用の試験を行った。まず、表１に示す被験菌
をそれぞれの培地で１００〜１０００個／ｍｌに希釈し
て、９６穴Ｕ底マイクロプレートのＡ列にはウエル当た
り１９６μl 、Ｂ列からＨ列までは１００μl 、それぞ
れ分注した。次いで、残渣Ａを２５mg／ｍl の濃度で含
有するＤＭＳＯ溶液４μl をＡ列ウエルに加え、撹拌
後、１００μl をＢ列ウエルに移して撹拌し、以下、Ｃ
〜Ｆ列まで順に希釈操作を繰返した。希釈操作終了後、
感圧フィルム（Pressure Sensitive Film 、商品名：Fa
lcon 3073 、Falcon社製）でＡ〜Ｆ列のウエルを封止
し、３７℃で培養して毎日観察した。抗菌作用の判定
は、残渣ＡのＤＭＳＯ溶液を添加しなかった培地中で被
験菌の増殖が認められた時点で行った。なお、被験菌の
うちのアルギニン分解マイコプラズマの培地としては
０．２５％アルギニン−ＨＣｌ添加ＳＰ−４培地（ｐＨ
７．２）を用い、グルコース分解マイコプラズマの培地
としては０．２５％グルコース添加ＳＰ−４培地（ｐＨ
７．８）を用い、培地の色調変化で増殖を判定した。ま
た、細菌の培地としてはBrain Heart Infusion培地（脳
肝浸出液培地、Difco 社製）を用い、菌塊の形成で増殖
を判定した。これらの結果を表１および表２に示す。
して抗菌作用の試験を行った。まず、表１に示す被験菌
をそれぞれの培地で１００〜１０００個／ｍｌに希釈し
て、９６穴Ｕ底マイクロプレートのＡ列にはウエル当た
り１９６μl 、Ｂ列からＨ列までは１００μl 、それぞ
れ分注した。次いで、残渣Ａを２５mg／ｍl の濃度で含
有するＤＭＳＯ溶液４μl をＡ列ウエルに加え、撹拌
後、１００μl をＢ列ウエルに移して撹拌し、以下、Ｃ
〜Ｆ列まで順に希釈操作を繰返した。希釈操作終了後、
感圧フィルム（Pressure Sensitive Film 、商品名：Fa
lcon 3073 、Falcon社製）でＡ〜Ｆ列のウエルを封止
し、３７℃で培養して毎日観察した。抗菌作用の判定
は、残渣ＡのＤＭＳＯ溶液を添加しなかった培地中で被
験菌の増殖が認められた時点で行った。なお、被験菌の
うちのアルギニン分解マイコプラズマの培地としては
０．２５％アルギニン−ＨＣｌ添加ＳＰ−４培地（ｐＨ
７．２）を用い、グルコース分解マイコプラズマの培地
としては０．２５％グルコース添加ＳＰ−４培地（ｐＨ
７．８）を用い、培地の色調変化で増殖を判定した。ま
た、細菌の培地としてはBrain Heart Infusion培地（脳
肝浸出液培地、Difco 社製）を用い、菌塊の形成で増殖
を判定した。これらの結果を表１および表２に示す。
【００２２】
【表１】
【００２３】
【表２】
【００２４】表１および表２から明らかなように、本発
明の方法により得られるプロポリス抽出物の１つである
残渣Ａは、特定のマイコプラズマおよび菌に対して優れ
た抗菌作用を示す。
明の方法により得られるプロポリス抽出物の１つである
残渣Ａは、特定のマイコプラズマおよび菌に対して優れ
た抗菌作用を示す。
【００２５】細胞周期およびＤＮＡ合成に及ぼす影響試
験 前述した殺癌細胞作用試験の場合と同様にして得た残渣
Ａがヒト肝癌ＨｕＨ１３株の細胞周期およびＤＮＡ合成
に及ぼす影響を、以下のようにして解析した。まず、１
０％仔ウシ血清を含むイーグルＭＥＭ培地中、３７℃、
５％炭酸ガスと９５％空気との通気雰囲気下で所定期間
培養した細胞株を７０％（Ｖ／Ｖ）エタノールで処理し
て、各細胞を固定化すると共に細胞膜の透過性を高め
た。次いで、各細胞を塩酸で処理して、ＤＮＡを変性さ
せた。次に、各細胞を３０分間ＢｒｄＵ（ブロモデオキ
シウリジン）で処理した後、ＰＩ（ヨウ化プロピジュウ
ム）を各細胞に取り込ませてＤＮＡと結合させた。ま
た、ＰＩを取り込ませるのと同時に、ＦＩＴＣ（フルオ
レッセント イソチオシアネート）で標識した抗Ｂｒｄ
Ｕモノクローナル抗体を各細胞に取り込ませた。この
後、ＤＮＡフローサイトメーター［商品名：ＦＡＣＳｃ
ａｎ、Becton Dickinson Immunocytometry Systems社
製］により、ＰＩを取り込んだ各細胞内ＤＮＡを定量し
て細胞株におけるＤＮＡ量の分布パターンを調べ、同時
に、ＤＮＡ中に取り込まれたＢｒｄＵの有無を調べた。
なお、残渣ＡはＤＭＳＯに溶解させて、最終濃度が２μ
ｇ／ｍｌとなるように培養開始時に上記培養液中に添加
した（以下、このときの細胞群を試験群という）。ま
た、コントロールでは残渣ＡのＤＭＳＯ溶液に代えてＤ
ＭＳＯを添加した。そして、１つの対照群では、残渣Ａ
のＤＭＳＯ溶液に代えてコルセミドのＤＭＳＯ溶液を、
コルセミドの最終濃度が１μｇ／ｍｌとなるように添加
し（以下、このときの細胞群を対照群１という）、他の
対照群では前記コルセミドのＤＭＳＯ溶液の添加と同時
に、前記残渣ＡのＤＭＳＯ溶液を添加した（以下、この
ときの細胞群を対照群２という）。
験 前述した殺癌細胞作用試験の場合と同様にして得た残渣
Ａがヒト肝癌ＨｕＨ１３株の細胞周期およびＤＮＡ合成
に及ぼす影響を、以下のようにして解析した。まず、１
０％仔ウシ血清を含むイーグルＭＥＭ培地中、３７℃、
５％炭酸ガスと９５％空気との通気雰囲気下で所定期間
培養した細胞株を７０％（Ｖ／Ｖ）エタノールで処理し
て、各細胞を固定化すると共に細胞膜の透過性を高め
た。次いで、各細胞を塩酸で処理して、ＤＮＡを変性さ
せた。次に、各細胞を３０分間ＢｒｄＵ（ブロモデオキ
シウリジン）で処理した後、ＰＩ（ヨウ化プロピジュウ
ム）を各細胞に取り込ませてＤＮＡと結合させた。ま
た、ＰＩを取り込ませるのと同時に、ＦＩＴＣ（フルオ
レッセント イソチオシアネート）で標識した抗Ｂｒｄ
Ｕモノクローナル抗体を各細胞に取り込ませた。この
後、ＤＮＡフローサイトメーター［商品名：ＦＡＣＳｃ
ａｎ、Becton Dickinson Immunocytometry Systems社
製］により、ＰＩを取り込んだ各細胞内ＤＮＡを定量し
て細胞株におけるＤＮＡ量の分布パターンを調べ、同時
に、ＤＮＡ中に取り込まれたＢｒｄＵの有無を調べた。
なお、残渣ＡはＤＭＳＯに溶解させて、最終濃度が２μ
ｇ／ｍｌとなるように培養開始時に上記培養液中に添加
した（以下、このときの細胞群を試験群という）。ま
た、コントロールでは残渣ＡのＤＭＳＯ溶液に代えてＤ
ＭＳＯを添加した。そして、１つの対照群では、残渣Ａ
のＤＭＳＯ溶液に代えてコルセミドのＤＭＳＯ溶液を、
コルセミドの最終濃度が１μｇ／ｍｌとなるように添加
し（以下、このときの細胞群を対照群１という）、他の
対照群では前記コルセミドのＤＭＳＯ溶液の添加と同時
に、前記残渣ＡのＤＭＳＯ溶液を添加した（以下、この
ときの細胞群を対照群２という）。
【００２６】この結果、残渣Ａを添加した試験群では、
Ｇ1 期（ＤＮＡ合成準備期）およびＭ期（分裂期）にあ
る細胞の割合よりもＳ期（ＤＮＡ合成期）にある細胞の
割合の方が相対的に高くなってた。一方、コントロール
では、Ｇ1 期にある細胞の割合が最も高く、次いで、Ｍ
期にある細胞、Ｓ期にある細胞が多く見られた。そし
て、対照群１ではＭ期にある細胞の割合が最も高く、対
照群２ではＳ期にある細胞の割合が圧倒的に高かった。
このことから、残渣Ａはヒト肝癌ＨｕＨ１３株の分裂を
Ｓ期で停止させる作用を有し、かつ、Ｇ1 期からＳ期へ
の移行およびＭ期からＧ1 期への移行に対しては特別な
影響は及ぼさないことがわかる。また、残渣Ａを添加し
た試験群および対照群２ではＤＮＡ中へのＢｒｄＵの取
り込みが確認されなかったのに対して、対照群１ではＤ
ＮＡ中へのＢｒｄＵの取り込みが確認された。このこと
から、残渣Ａは、ヒト肝癌ＨｕＨ１３株におけるＤＮＡ
合成を抑制していることがわかる。
Ｇ1 期（ＤＮＡ合成準備期）およびＭ期（分裂期）にあ
る細胞の割合よりもＳ期（ＤＮＡ合成期）にある細胞の
割合の方が相対的に高くなってた。一方、コントロール
では、Ｇ1 期にある細胞の割合が最も高く、次いで、Ｍ
期にある細胞、Ｓ期にある細胞が多く見られた。そし
て、対照群１ではＭ期にある細胞の割合が最も高く、対
照群２ではＳ期にある細胞の割合が圧倒的に高かった。
このことから、残渣Ａはヒト肝癌ＨｕＨ１３株の分裂を
Ｓ期で停止させる作用を有し、かつ、Ｇ1 期からＳ期へ
の移行およびＭ期からＧ1 期への移行に対しては特別な
影響は及ぼさないことがわかる。また、残渣Ａを添加し
た試験群および対照群２ではＤＮＡ中へのＢｒｄＵの取
り込みが確認されなかったのに対して、対照群１ではＤ
ＮＡ中へのＢｒｄＵの取り込みが確認された。このこと
から、残渣Ａは、ヒト肝癌ＨｕＨ１３株におけるＤＮＡ
合成を抑制していることがわかる。
【００２７】
【発明の効果】以上説明したように、本発明の方法によ
り得られるプロポリス抽出物は、殺腫瘍細胞作用および
抗菌作用に優れている。また、ＤＮＡ合成抑制作用等も
有している。したがって本発明によれば、プロポリスが
有する生物活性作用、特に殺腫瘍細胞作用および抗菌作
用を、飲食物、医薬品製造原料等のかたちでより効率的
に利用することが可能となる。
り得られるプロポリス抽出物は、殺腫瘍細胞作用および
抗菌作用に優れている。また、ＤＮＡ合成抑制作用等も
有している。したがって本発明によれば、プロポリスが
有する生物活性作用、特に殺腫瘍細胞作用および抗菌作
用を、飲食物、医薬品製造原料等のかたちでより効率的
に利用することが可能となる。
【図１】は、本発明の方法により得られたプロポリス抽
出物の殺腫瘍細胞作用の試験結果を示すグラフである。
出物の殺腫瘍細胞作用の試験結果を示すグラフである。
Claims (1)
- 【請求項１】 プロポリスの酢酸エチル抽出液から溶
媒を蒸散除去した後、得られた残渣をメチルアルコール
中に分散させ、不溶物を除去して、メチルアルコール抽
出液を得る工程、 前記メチルアルコール抽出液をカラムクロマトグラ
フィーにかけて、７０％から１００％（Ｖ／Ｖ）までの
酸性メチルアルコール濃度勾配による溶出操作を行い、
酸性メチルアルコール濃度が８２〜８８％（Ｖ／Ｖ）の
範囲内の画分を得る工程、 前記画分から溶媒を蒸散除去した後、得られた残渣
をカラムクロマトグラフィーにかけて、７０％から８０
％（Ｖ／Ｖ）までの酸性アセトニトリル濃度勾配による
溶出操作を行い、酸性アセトニトリル濃度が７３〜７６
％（Ｖ／Ｖ）の範囲内の画分を得る工程、 前記画分から溶媒を蒸散除去した後、得られた残渣
をカラムクロマトグラフィーにかけて、７５％から９０
％（Ｖ／Ｖ）までのエチルアルコール濃度勾配による溶
出操作を行い、エチルアルコール濃度が８０〜８５％
（Ｖ／Ｖ）の範囲内の画分を得る工程とを含むことを特
徴とする、プロポリス抽出物の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3162596A JPH0749365B2 (ja) | 1991-07-03 | 1991-07-03 | プロポリス抽出物の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3162596A JPH0749365B2 (ja) | 1991-07-03 | 1991-07-03 | プロポリス抽出物の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05271031A JPH05271031A (ja) | 1993-10-19 |
| JPH0749365B2 true JPH0749365B2 (ja) | 1995-05-31 |
Family
ID=15757603
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3162596A Expired - Lifetime JPH0749365B2 (ja) | 1991-07-03 | 1991-07-03 | プロポリス抽出物の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0749365B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109674730A (zh) * | 2019-02-12 | 2019-04-26 | 广州小蜜蜂生物科技有限公司 | 一种蜂蜜提取物及其制备方法和应用 |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH09143179A (ja) * | 1995-11-24 | 1997-06-03 | Eiken Chem Co Ltd | プロポリス由来のベンゾピラン誘導体 |
| JPH09183724A (ja) * | 1995-12-29 | 1997-07-15 | Eiken Chem Co Ltd | ナフタレンカルボン酸誘導体 |
| JP2002332257A (ja) * | 2001-05-11 | 2002-11-22 | Biomedeikusu:Kk | ３−［４−ヒドロキシ−３，５−ビス（３−メチル−２−ブテニル）フェニル］−２−プロペノイック酸をプロポリスから抽出・精製する方法 |
| KR100618497B1 (ko) * | 2005-02-28 | 2006-08-31 | 거창군 (관리부서 : 거창군 농업기술센터) | 프로폴리스에서 퀘르세틴을 추출하는 방법 |
| KR100841247B1 (ko) * | 2006-05-25 | 2008-06-26 | 김영생 | 봉교추출물을 함유한 식물영양제 |
-
1991
- 1991-07-03 JP JP3162596A patent/JPH0749365B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109674730A (zh) * | 2019-02-12 | 2019-04-26 | 广州小蜜蜂生物科技有限公司 | 一种蜂蜜提取物及其制备方法和应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH05271031A (ja) | 1993-10-19 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
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