JPH0751079B2 - ミクロペルオキシダーゼを用いる尿酸診断アッセイ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はアツセイに関し更に詳しくは過酸化水素を用い
そしてミクロペルオキシダーゼが試薬として酵素の代り
に有利に用いられる尿酸診断アツセイに関する。

〔従来の技術及びその欠点〕

試薬として酵素の使用は現在広く認められており、特に
生物学的液体例えば血液の血清、血漿，全血液、尿、脊
髄液、羊水中の種々の関心がありしかも臨床上重要な分
析物の存在及び／又は濃度の臨床上の測定に認められて
いる。本明細書では「酵素」は、約10,000ダルトンより
大きい分子量を有ししかも触媒活性を示すポリペプチド
として定義される。一般に、２種の基本的なアプローチ
が、このような酵素アツセイに関する技術において用い
られてきた。その一つでは、臨床上重要な前駆物質又は
基質が酵素により検出しうる化合物又は検出されるシグ
ナル例えば色又はけい光に転換される。第二では、酵素
それ自体は分析物とカツプルされて酵素活性が存在する
分析物の度合として求められる。しかしどのようなアプ
ローチが用いられても酵素試薬は一般に良好な安定性を
有しそして容易に入手されさらに当業者のいう「高いタ
ーンオーバー数」を有することが要求される。さらに、
酵素は、容易に入手され比較的安定でありその上安価で
ありそして検出しうる生成物又はシグナルを容易に生成
する基質に関して活性であることが望ましい。

前述した如きアツセイに通常用いられる酵素の代表例は
レドツクス酵素、キナーゼ及びエステラーゼである。臨
床上の化学アツセイにおける酵素の従来の使用の一つの
例は尿酸のアツセイであり、そのやり方は、代表的なは
セイヨウワサビ（horseradish）ペルオキシダーゼ（HRP
O）を用いる。その分析において、尿酸はウリカーゼ酵
素とともにHRPOを用いて求められる。代表的な臨床テス
トのサンプルは1d当り約12mg（mg/d）以下の濃度で
尿酸を含み、このような定量では細菌ウリカーゼと接触
して、尿酸をアラントイン及び過酸化水素に転換する。
形成された過酸化水素は用いられてHRPOにより触媒化さ
れる色原体基質を酸化し、その基質はサンプル中の尿酸
の存在及び／又は濃度の度合として色を発する。色の発
生は次に肉眼により、分光光度的に又は他の測定器によ
り測定され、そしてその強度は、サンプル中の尿酸の量
と相関する。

しかし、このような従来のアツセイにおけるHRPO又は他
の酵素の使用は、問題がある。例えば、酵素例えばHRPO
及びウリカーゼの最適の活性のpH値は全く異り、それ故
このようなアツセイにおいて有効に用いられない。ウリ
カーゼは高価な酵素であるので、このようなアツセイの
反応条件は元来調節されてウリカーゼの最も有効な使用
を助け、このような調節は、次に急速な反応応答を達成
するために、高濃度のHRPOの使用を必要とする。さら
に、HRPOは貯蔵中に活性を失うことが知られており、そ
れ故制限された貯蔵寿命を有する。

HRPOの他の従来の使用はイムノアツセイにおける酵素の
ラベルである。例えば、多数の周知の酵素イムノアツセ
イは、関心のある抗原を含むと思われるサンプルと、不
動化され、吸着され又は共有的にカツプルされた抗体
（抗原に対して特異的）により被覆された又は含む固相
支持体とを接触させることを含む。インキュベーション
及び固相の洗滌後、HRPOによりラベルされた抗原に対す
る特異的抗体よりなるコンジュゲートを加え、そして固
相とともにインキュベーションさされる。固相を再び洗
い、そしてコンジュゲートにより固相に結合するように
なつたHRPOの活性を、通常分光光度計により、色原体又
は他の基質よりなる指示基質の添加により求められる。
HRPOと接触すると、もし色原体ならば、指示薬は分光光
度計により検出しうる色を発生する。分光光度計の読み
は、次に抗原の周知の濃度から得られらた同様な読みと
相関させられ、それによりサンプル中の抗原の濃度を求
める。

セイヨウワサビペルオキシダーゼは、又前述のタイプの
酵素イムノアツセイにおいて不利である。例えば、抗体
−HRPOコンジュゲートを生成するのに元来用いられてい
る、当業者に周知のカツプリング条件は、抗体及びHRPO
の両者を不活性化する傾向を有する。その上、このよう
なカツプリング条件は、通常それぞれの特定のアツセイ
について充分な精製及び注意深い最適化を必要とする不
均質な生成物を生成し勝ちである。又、生成されたコン
ジュゲートは、その貯蔵寿命を制限する、貯蔵中不安定
になる顕著な傾向を有する。

〔発明の概要〕

本発明によれば、従来用いられている酵素の前述の不利
を克服する診断アツセイを行う方法が見い出された。こ
の方法を用いると、生物学的液体例えば血液の血清、全
血液、血漿、尿、骨髄液及び羊水などの中の種々の分析
物を測定するのに特別な利点を有する。本方法は、非酵
素的触媒としてミクロペルオキシダーゼを利用して、こ
のような定量に有利な安定性をもたらし、そして分析物
に急速な速度応答をもたらす酵素により有効に用いられ
る能力をもたらす。

本発明は、サンプルをウリカーゼと接触させてサンプル
が尿酸を含むときに過酸化水素を生成させ、次いで該過
酸化水素をサンプルに存在する尿酸の基準として検出し
うる応答を生成しうる物質とミクロペルオキシダーゼの
存在下に反応させること及び該サンプルが生物学的流体
であり上記の方法をウリカーゼの効率的使用に最適のpH
範囲で行なうことからなるサンプル中の尿酸の量を求め
る方法を提供するものである。ここでウリカーゼの効率
的使用に最適のpH範囲とはミクロペルオキシダーゼ触媒
反応の動力学を犠牲にすることなくウリカーゼ酵素反応
に対するpHを最適化することを意味する。本発明の改良
は、ペルオキシダーゼとしてミクロペルオキシダーゼを
用いることよりなる。

本発明の概念は、テストサンプル例えば血液の血清又は
血漿中の分析物の存在を測定する改良したアツセイにあ
り、その方法では過酸化的に活性な物質は、サンプル中
の分析物又はその誘導体と接触して、サンプル中の分析
物の存在及び／又は量の度合として求められうる反応生
成物を生成する。特に、本発明の方法の実施において、
ミクロペルオキシダーゼは、このようなアツセイの代表
的な例における従来用いられるHRPO又は他の酵素に対し
て同様に機能し、それ故ミクロペルオキシダーゼは、こ
のようなアツセイにおいてさもなければ用いられうるこ
のような酵素と直接置換され、その上本明細書に記載さ
れるこのような酵素の使用よりも種々の利点を有するこ
とが分つた。

ミクロペルオキシダーゼは非酵素的且触媒的な物質であ
り、本発明によれば、前述の如き定量において過酸化活
性をもたらすことが分つた。その上、ミクロペルオキシ
ダーゼがミクロペルオキシダーゼとともにアツセイに用
いられる酵素又は試薬（例えば尿酸アツセイにおけるウ
リカーゼ）の最適のpH又はその付近で用いられるとき、
比較的高価なウリカーゼ又は他の酵素又は試薬の一層有
効な使用が達成されうる。さらに、中程度の濃度で、ミ
クロペルオキシダーゼの使用は、急速な反応応答をもた
らすことが分り、そしてミクロペルオキシダーゼは、又
臨床のアツセイ条件下で極めて安定なことが分つた。そ
の上、ミクロペルオキシダーゼは、容易に抗原及び抗体
にカツプされて不均一そして均一のイムノアツセイシス
テムに用いられる安定なコンジュゲートを有利にもたら
すことが分つた。本発明によれば、ミクロペルオキシダ
ーゼは、又ペルオキシダーゼが従来用いられてきた非イ
ムノアツセイシステムにおいて有利な性能をもたらすこ
とが分つた。

当業者に周知の如く、ミクロペルオキシダーゼは、蛋白
質の酵素的開裂により生成されるチトクロームＣのフラ
グメントである。このような開裂は、ペプチドにチオエ
ーテル結合により共有的に結合したそのヘム基ととも
に、元のチトクロームＣのアミノ酸鎖の小さな部分を残
す。ミクロペルオキシダーゼとして特徴付けられる化合
物の構造は一般に下記に示される。

種々のミクロペルオキシダーゼは、市販されており、本
発明の使用に適している。例えば、分子量1502のMP−８
と呼ばれるミクロペルオキシダーゼそしてそれそれ分子
量1630及び1857のミクロペルオキシダーゼMP−９及びMP
−11は、すべて適しておりさらに本発明の使用に実質的
に同等であつて例えばシグマ・ケミカル・カンパニー
（Sigma Chemical Company）から市販されている。

本発明によればミクロペルオキシダーゼは、尿酸アツセ
イにおいてHRPOの代りに用いられるのに特に適してい
る。下記に詳しく示さえるように、本発明の好ましい態
様において、通常1d当り12mg（mg/d）以下の濃度の
尿酸を含む臨床テストサンプルは、酸化して発色する１
種以上の酸化される又は色原体の基質の存在下ウリカー
ゼ酵素及びミクロペルオキシダーゼの混合物と接触され
る。他の分析物と同じく尿酸の分析について本発明で有
用なこのような基質は、当業者に周知であり、そして例
えばＯ−フエニレンジアミン（OPD）、2,2′−アジノ−
ジー（３−エチルベンゾチアジレン硫酸）（ABTS）、3,
3′,5,5′−テトラメチルベンジジン（TMB）、４−アミ
ノアンチピリン（4AAP）及び２−ヒドロキシ−3,5−ジ
クロロベンゼンスルホン酸を含む。このような化合物
は、ミクロペルオキシダーゼの存在下過酸化物と反応し
て、存在する過酸化物の度合として、そしてサンプルに
存在する尿酸の基準として、酸化による発色の如き検出
しうる応答を生じさせる。本発明の実施において、この
ような発色は、好都合には従来の技術で測定され、そし
て好ましくは従来の分析機器を用いて分光光度的に測定
されてテストサンプル中の分析物の定量的数値をもたら
す。又、色の応答は、例えば、分析物の存在のためのセ
ミアツセイスクリーンテストとしてアツセイを用いるこ
とが望ましいときの如く、肉眼により測定される。

さらに、例えばルミノール又はその異性体は、化学ルミ
ネセンス検出の基質として用いられるか、又は種々のけ
い光化合物例えばフルオレセン又はその誘導体が、もし
所望ならば基質として用いられて、分析中のサンプルの
中の分析物の存在及び／又は量と相関される測定しうる
けい光応答を生じさせる。

尿酸の測定に用いられるのに加えて、本発明によれば、
ミクロペルオキシダーゼは、又多数の他の化合物（主と
してグルコース、コレステロール及びトリグリセリドを
含む）による、酵素的反応により形成された過酸化水素
の転換用の触媒ユニットとして用いられることは理解さ
れよう。従つて、これらの化合物は、種々の周知の酵素
及び試薬の作用の下で過酸化水素を生じさせ、そして形
成された過酸化水素は、尿酸について前述したのと同様
な比色定量又は他のアツセイにおいて、ミクロペルオキ
シダーゼを用いて測定される。

さらに、ミクロペルオキシダーゼは、本発明によれば、
抗体とカツプルされてミクロペルオキシダーゼを含むコ
ンジュゲートを形成する。この技術の例は、抗原を含む
サンプルが、抗原に対する抗体によりコーテイングされ
た固相例えばポリスチレンビーズと接触して、抗原がビ
ーズに不動化される方法である。インキュベーションと
ビーズの洗滌との後に、ミクロペルオキシダーゼにより
ラベルされた抗原に対する特異的抗体がビーズと接触
し、インキュベートされ、次に洗滌される。ミクロペル
オキシダーゼの活性は、例えば前述の如き酸化しうる色
原体基質の使用により、サンプル中の抗原の濃度の度合
として分光光度的に又は他の装置により測定される。

数多くの抗体は、ホモ及びヘテロ二官能性カツプリング
試薬を用いて、ミクロペルオキシダーゼとカツプルされ
る。このような抗体は、例えば、カルシノ・エンブリオ
ニツク（Carcino Embryonic）抗原（CEA）に対するモノ
クローナル抗体を含む。さらに、ミクロペルオキシダー
ゼは、又例えば均一イムホアツセイにおける如き抗原の
ラベルにおける本発明に用いられ、そしてミクロペルオ
キシダーゼは、従来の技術を用いて用いられて、周知の
技術に従つて種々の他の抗体及び抗原と同じく医薬品例
えばテオフイリンをラベルする。

本発明によれば、ミクロペルオキシダーゼを用いるアツ
セイの感度は、重合体分子（例えばデキストラン又はポ
リアミノ酸を含む）へミクロペルオキシダーゼを共有的
にカツプリングさせることにより、増大することが分つ
た。又、ミクロペルオキシダーゼは、それ自体カツプル
される。このようなコンジュゲート及びマルチプルミク
ロペルオキシダーゼ分子は、次にカツプルされて前述の
如くアツセイに用いられる。

〔実施例〕

本発明の基本的な概念を記述したが、下記に実施例を示
す。それらは本発明の実施の説明であつて、それを限定
するものではない。

実施例 1. 本実施例は、尿酸アツセイにおける触媒としてのミクロ
ペルオキシダーゼの使用を説明する。試薬組成物は、下
記の如く処方される。

ミクロペルオキシダーゼ 10mg ウリカーゼ 260国際単位 ４−アミノアンチピリン 270mg ２−ヒドロキシ−3,5−ジ−クロロベンゼンスルホン酸
1.33g カリウムフエロシアニド 2.1mg エリスロマイシン 1g 0.1Mボレート緩衝液（pH8.2） 900ml 25mlのグリセロールを次に加えそして追加の緩衝液を加
えて試薬溶液を１とした。

12.5μの血清のサンプルを1mlの前述の試薬溶液に加
え、混合物を５分間37℃でインキュベートした。12.5μ
の血清又はボレート緩衝液を1mlの試薬に加えそして
５分間37℃でインキュベートすることによりブランクを
作つた。５分間のインキュベーション後、515nmの吸収
をブランクについて測定し、その値をサンプルの吸収か
ら引いた。尿酸の濃度の増大に対する応答を下記の表に
示す。 尿酸（mg/） 吸収（515nmにおける） 10 0.025 30 0.076 60 0.155 90 0.215 120 0.285 本発明のこれらのアツセイで用いられるとき、ミクロペ
ルオキシダーゼの発色の速度は、ミクロペルオキシダー
ゼよりむしろHRPOが用いられた従来のアツセイのそれら
よりも、同量の尿酸について実質的により早いことが分
つた。本発明によりミクロペルオキシダーゼを用いるア
ツセイにおいて、ミクロペルオキシダーゼの代りにHRPO
を用いる本発明に従つて行われた同様なアツセイにおけ
る９〜10分に比べて、発色は約２〜３分で最大に達し
た。

さらに、ミクロペルオキシダーゼ及びHRPOの溶液が80℃
で別々に加えられるとき、HRPOが１時間以内で完全に不
活性化されるのに対して、ミクロペルオキシダーゼは、
その温度で３時間後もその元の活性の約90％を保持し
た。

実施例 2. 本実施例は、ミクロペルオキシダーゼをラベルした抗体
の製造を示す。

ミクロペルオキシダーゼ（11.5mg）をpH6.8の0.1Mホス
フエート緩衝液2mlに溶解し、そしてグルタールアルデ
ヒドを加えて1.25％とした。溶液を１晩振とうし、生成
物を0.15m NaCl中のバイオ・ゲル（Bio−Gel）Ｐ−２の
クロマトグラフイにかけ、褐色の画分を集めた。グルタ
ールアルデヒド処理ミクロペルオキシダーゼの集めた画
分は、402nmの吸収分光度計により測定して、0.718mg/m
lの濃度でミクロペルオキシダーゼを含んだ。

カルシノ・エンブリオニツク抗原（CEA）に対するモノ
クローナル抗体（2.11mg）をpH9.5の50mM炭酸ナトリウ
ム／重炭酸ナトリウム緩衝液3mlに溶解した。700μの
量のミクロペルオキシダーゼ溶液を次に抗体溶液に加え
て、混合物を１晩攪拌した。

次の朝、100μの10％グリシン溶液を加え、１時間攪
拌した。生成物を次に0.15M NaCl中のセフアデツクス
（Sephadex）Ｇ−50−40のクロマトグラフイにかけた。
個々の画分を吸収分光器により調べた。初めの３個の褐
色画分を集め、pH7.0の10mMホスフエート緩衝液により
充分に透析した。ミクロペルオキシダーゼ対抗体の比
は、4.8であつた。

ラベルした抗体を10mMほう酸ナトリウムに投じて希釈
し、次にpH9.0の10mMくえん酸ナトリウムに投じて10倍
の希釈をした。100μのこの溶液に10μの1.3mMルミ
ノール溶液を加えた。サンプルを、ジグナル「カウン
ト」（シグナル密度の相対的指示をもたらす、度合の予
め選択された個有の単位）により示されるような、化学
ルミネセンスの量を測定しうる光度計に入れた。シグナ
ルは、0.185M過酸化水素溶液をボレート／くえん酸塩緩
衝液に注入することにより、開始された。結果を下記に
示す。

実施例 3. 本実施例は、ミクロペルオキシダーゼをラベルした抗原
の製造及び使用を示す。

234mgの８−カルボキシメチルテオフイリン及び125mgの
Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド（NHS）のサンプルを、3
mlの乾燥ジメチルホルムアミドに懸濁した。ジシクロヘ
キシルカルボジイミド（227mg）を5mlの乾燥ジメチルホ
ルムアミドに溶解させ、そして攪拌しつつ混合物へ加え
た。黄色の溶液が得られ、それは１時間で濁つた。混合
物を15分間超音波処理し、そして大量の沈でんを去し
た。テオフイリンNHS−エステルを含む溶液を精製する
ことなく用いた。

ミクロペルオキシダーゼ（1mg/ml）及び過剰のテオフイ
リンNHS−エステルを混合しそして週末を室温で放置し
た。この物質を次に水（5ml）により希釈し有機モデイ
フアイアーとしてのアセトニトリル（アセトニトリルの
相対的含量を毎分2.5％の速度で０％から25％へ増大さ
せた）並に水中の0.1％トリフルオロ酢酸とともにC18逆
相カラム〔マグナム（Magnum）9,4,6×25cm〕の高速液
体クロマトグラフイを用いて精製した。毎分1mlの流体
で、４個のピークが398nmで、18.6分、22.8分、24.9分
及び30.2分において検出された24.9分の画分をその高い
過酸化活性並に抗テオフイリン域により阻害されるべき
その能力について選んだ。

試薬 （１） 0.01％ウシガンマ−グロブリン（BGG緩衝液）
を有する0.1Mりん酸ナトリウム緩衝液（pH7.4）。

（２） テオフイリン標準溶液。テオフイリン標準溶液
の２倍の連続した希釈物。BGG緩衝液中のテオフイリン
の２倍の連続した希釈物（20mM 70μＭ）。

（３） BGG緩衝液中で希釈されたミクロペルオキシダ
ーゼ・テオフイリンコンジュゲート（前述の如く製
造）。

（４） ウシ血清アルブミンへカツプルされたテオフイ
リンの注射の繰返しにより得られた、テオフイリンに対
するウサギ抗血清。

（５） 0.1M酢酸ナトリウム及び0.0015Mくえん酸（pH
6.0）中の0.01％3,3′,5,5′−テトラメチルベンジジ
ン、0.0044％過酸化水素の新しく作られた色原体基質の
溶液。

50μの量のテオフイリンの標準溶液を、30分間室温で
抗血清の215倍希釈物50μとインキュベートした。ミ
クロペルオキシダーゼ・テオフイリンコンジュゲートの
0.48μ溶液50μを加え、室温で30分間インキュベー
トした。1mlの色原体基質溶液を加え、そして混合物を3
0分間室温でインキュベートした。反応を次に0.25mlの2
M硫酸の添加により停止し、450nmの吸収を測定した。結
果を次に示す。テオフイリン（mM） 吸収（450nm） 20 0.135 10 0.123 ５ 0.180 2.5 0.196 1.25 0.203 0.265 0.235 0.313 0.225 0.156 0.234 0.078 0.233 0 0.196 このデータは、ミクロペルオキシダーゼは分離工程の必
要なしに、液体中の抗原を計量するこのタイプの競争ア
ツセイに用いられることを示す。テオフイリン及びミク
ロペルオキシダーゼにより形成されたコンジュゲートに
代りに、他の抗原がテオフイリンを置換しそして本発明
の前述の技術に従つて、同様なやり方で用いられること
は理解されるべきである。

実施例 4. 本実施例は、デキストランへのミクロペルオキシダーゼ
のカツプリングを示す。

4mgの量のデキストラン（平均分子量40,000ダルトン）
を0.05M炭酸ナトリウム溶液（pH12.0）0.1mlに溶解し
た。５μのアセトニトリル中の臭化シアノゲン10mgを
加えた。氷上で、30分後、0.5M炭酸ナトリウム（pH9.）
中のミクロペルオキシダーゼ10mgを加え、そして混合物
を１晩インキュベートした。エタノールアミン（30μ
）を加え、そして溶液を２時間室温で貯蔵した。サン
プルを、定量前に0.01Mりん酸ナトリウム及び0.15M塩化
ナトリウムの緩衝液（pH7.4）により充分に透析した。

実施例 5. 本実施例は、ポリリシン及びミクロペルオキシダーゼの
コンジュゲートの製造を示す。

ミクロペルオキシダーゼ（2mg）及び1.5mgのポリリシン
（平均分子量200,000）を0.1Mりん酸ナトリウム（pH7.
0）0.5mlに溶解した。この溶液に、緩く振とうしつつ１
時間かけて水中の21mMグルタールアルデヒド溶液0.25M
を滴下した。サンプルを１晩室温でインキュベートし、
次にPBSにより充分に透析した。

実施例 6. 本実施例は、ミクロペルオキシダーゼ自体の共役化を示
す。

0.68mgの量のミクロペルオキシダーゼを、0.362ミクロ
モルのグルタールアルデヒドを含む0.1Mホスフエート緩
衝液（pH7.0）に溶解した。グルタールアルデヒド対ミ
クロペルオキシダーゼの比は1.04であつた。反応物を１
晩45℃に置き、次に水中のグリシンの1M溶液100μを
加え、１時間室温においた。生成物をセフアクリル（Se
phasryl）Ｓ−300のクロマトグラフイにかけ、見掛け分
子量14,400のピークを集めた。

実施例 7. 本実施例は、実施例４〜６で製造されたミクロペルオキ
シダーゼコンジュゲートの活性の比較を示す。

ミクロペルオキシダーゼ（MP）のコンジュゲートの活性
を、色原体基質及び過酸化水素を用いてテストし、結果
を次の表に示す。コンジュゲート活性 MP/分子 相対的活性 MP 1.0 1.0 デキストラン−MP 3.9 3.9^＊ ポリリシン−MP 2.4 2.5^＊ ポリ−MP 7.3 2.81^＊＊ ＊ 50μのミクロペルオキシダーゼ溶液を1mlの0.01
％TMB並びに0.1M酢酸ナトリウム中の0.0044％過酸化水
素（pH6.0）へ加えた。30分のインキュベーシヨン後、
反応を0.25mlの2M硫酸により停止し、450nmの吸収を測
定した。

＊＊ミクロペルオキシダーゼ溶液をpH7.5でPBS中で希釈
し；溶液1mlへ0.2M DHBS及び0.54M 4AAPを含む溶液25
μを加えた。反応を10μの0.1％過酸化水素の添加
により開始した。512nmの吸収をモニターした。

前述からミクロペルオキシダーゼは、それ自体又は他の
分子例えば前述のものへカツプルしてその元の活性の全
て又は実質的な量を保つことが分る。従つて、このよう
な分子へのそのカツプリングは、従来の技術（セイヨウ
ワサビ又は他の酵素が用いられる）との比較により、酵
素イムノアツセイなどにおける分析物の検出の感度を増
大させる。

前述した如き本発明の方法、処方及び実施の詳細におけ
る種々の変化は、本発明の範囲から離れることなくなさ
れうることは、理解されよう。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】サンプルをウリカーゼと接触させてサンプ
   ルが尿酸を含むときに過酸化水素を生成させ、次いで該
   過酸化水素をサンプルに存在する尿酸の基準として検出
   しうる応答を生成しうる物質とミクロペルオキシダーゼ
   の存在下に反応させること及び該サンプルが生物学的流
   体であり上記の方法をウリカーゼの効率的使用に最適の
   pH範囲で行なうことを特徴とするサンプル中の尿酸の量
   を求める方法。
2. 【請求項２】検出しうる応答を生成しうる物質が色原体
   である特許請求の範囲第１項記載の方法。
3. 【請求項３】検出しうる応答を生成しうる物質が化学ル
   ミネセンス化合物である特許請求の範囲第１項記載の方
   法。
4. 【請求項４】サンプルの生物学的流体が血液の血清であ
   る特許請求の範囲第１項記載の方法。
5. 【請求項５】ミクロペルオキシダーゼが抗原または抗体
   に結合している特許請求の範囲第１項記載の方法。
6. 【請求項６】サンプルを、 約10mgのミクロペルオキシダーゼ 約260国際単位のウリカーゼ 約270mgの４−アミノアンチピリン 約1.33mgの２−ヒドロキシ−3,5−ジクロロベンゼンス
   ルホン酸 約2.1mgのカリウムフェロシアニド 約1mgのエリスロマイシン 約25mlのグリセロール 約900〜1,000mlの0.1μＭボレート緩衝液 から成る試薬溶液に加え、そしてサンプル中に存在する
   尿酸の基準である検出しうる応答を測定することを特徴
   とする生物学的流体のサンプル中の尿酸の量を求める方
   法。