JPH0751513B2 - Ａ型肝炎ワクチン - Google Patents
Ａ型肝炎ワクチンInfo
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- JPH0751513B2 JPH0751513B2 JP63106750A JP10675088A JPH0751513B2 JP H0751513 B2 JPH0751513 B2 JP H0751513B2 JP 63106750 A JP63106750 A JP 63106750A JP 10675088 A JP10675088 A JP 10675088A JP H0751513 B2 JPH0751513 B2 JP H0751513B2
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- virus
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/32011—Picornaviridae
- C12N2770/32411—Hepatovirus, i.e. hepatitis A virus
- C12N2770/32434—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
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- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の背景と目的 Ａ型肝炎は、Ａ型肝炎ウイルス（以下、HAVと略称す
る）によって起こり、疫学的にも臨床的にも非常に重要
な感染症であるがいまだ有効な治療対策が見いだされて
いない。そのため、このようなＡ型肝炎に対してもっぱ
ら予防法が検討されており、現在はグロブリン製剤を２
〜３カ月おきに投与することがおこなわれている。しか
しながら、グロブリン製剤中の坑HAV抗体力価の低下の
問題や頻回投与を余儀なくされることなどから、ワクチ
ンの開発が望まれてきたがまだ実用化までには至ってい
ない。
る）によって起こり、疫学的にも臨床的にも非常に重要
な感染症であるがいまだ有効な治療対策が見いだされて
いない。そのため、このようなＡ型肝炎に対してもっぱ
ら予防法が検討されており、現在はグロブリン製剤を２
〜３カ月おきに投与することがおこなわれている。しか
しながら、グロブリン製剤中の坑HAV抗体力価の低下の
問題や頻回投与を余儀なくされることなどから、ワクチ
ンの開発が望まれてきたがまだ実用化までには至ってい
ない。
組織培養細胞を使ったHAVの実験的増殖は1979年にProvo
sとHillemanによって初めて可能となり、（Provost.P.
J.,Hilleman.M.R.,Proc.Soc.Exp.Biol.Med.,160,213,
（1979））その後世界各地で数種類の培養細胞を用いて
HAVの増殖が確かめられた。本願発明者らもアフリカミ
ドリザル初代腎細胞を用いてコロニー培養法によるクロ
ーニングをおこない、HAVを高産生するGL 37細胞株を樹
立した。またウイルス株についてはＡ型肝炎患者の糞便
よりHAVを分離し、上記のGL 37細胞を使用して数多くの
継代をおこなうことによって増殖性の優れたKRM 003株
を樹立した。そして、このGL 37細胞とHAV KRM 003株を
使用することで大量のHAVの確保が本邦に於て初めて可
能となった。（第33回日本ウイルス学会抄録257ページ
（1985））しかしながら、上記の組織培養により得られ
るウイルス粒子のおよそ半量は未熟空粒子であることが
判明した。
sとHillemanによって初めて可能となり、（Provost.P.
J.,Hilleman.M.R.,Proc.Soc.Exp.Biol.Med.,160,213,
（1979））その後世界各地で数種類の培養細胞を用いて
HAVの増殖が確かめられた。本願発明者らもアフリカミ
ドリザル初代腎細胞を用いてコロニー培養法によるクロ
ーニングをおこない、HAVを高産生するGL 37細胞株を樹
立した。またウイルス株についてはＡ型肝炎患者の糞便
よりHAVを分離し、上記のGL 37細胞を使用して数多くの
継代をおこなうことによって増殖性の優れたKRM 003株
を樹立した。そして、このGL 37細胞とHAV KRM 003株を
使用することで大量のHAVの確保が本邦に於て初めて可
能となった。（第33回日本ウイルス学会抄録257ページ
（1985））しかしながら、上記の組織培養により得られ
るウイルス粒子のおよそ半量は未熟空粒子であることが
判明した。
ところで、ピコルナウイルスに属するウイルスは、細胞
内増殖過程でウイルスRNAを含む完全粒子とウイルスRNA
を含まない未熟空粒子を産生し、とりわけポリオウイル
スをはじめとする多くのエンテロウイルスにおいては上
記の２種類の粒子は異なる抗原性を持ち、ウイルスRNA
を含む完全粒子のみが生体内において中和抗体を産生す
ることが知られている。ところがHAVの場合には、免疫
電顕において未塾空粒子と成熟粒子が同じ凝集塊の中に
認められるなど、両者の共通の抗原性が示唆された。そ
こで、本願発明者らはこの未熟空粒子が感染防御のため
のワクチンとして利用できるのではないかと考え、各種
動物を用いて免疫原生を調べた結果、成熟粒子と同様に
中和抗体の産生が認められた。さらに、未熟空粒子で免
疫したマーモセットは、強毒HAVの攻撃に抵抗し、さら
にその血清グロブリン画分は受動免疫効果を示すことか
ら、未熟空粒子が成熟粒子と同様に不活化ワクチンの材
料として有用であることが証明された。（第35回日本ウ
イルス学会抄録、257ページ（1987）） かくして、本願発明者らは組織培養により得られるHAV
粒子を成熟粒子と未熟空粒子に分離することなくＡ型肝
炎ワクチンの原材料に提供しうることを見いだし本願発
明を完成した。
内増殖過程でウイルスRNAを含む完全粒子とウイルスRNA
を含まない未熟空粒子を産生し、とりわけポリオウイル
スをはじめとする多くのエンテロウイルスにおいては上
記の２種類の粒子は異なる抗原性を持ち、ウイルスRNA
を含む完全粒子のみが生体内において中和抗体を産生す
ることが知られている。ところがHAVの場合には、免疫
電顕において未塾空粒子と成熟粒子が同じ凝集塊の中に
認められるなど、両者の共通の抗原性が示唆された。そ
こで、本願発明者らはこの未熟空粒子が感染防御のため
のワクチンとして利用できるのではないかと考え、各種
動物を用いて免疫原生を調べた結果、成熟粒子と同様に
中和抗体の産生が認められた。さらに、未熟空粒子で免
疫したマーモセットは、強毒HAVの攻撃に抵抗し、さら
にその血清グロブリン画分は受動免疫効果を示すことか
ら、未熟空粒子が成熟粒子と同様に不活化ワクチンの材
料として有用であることが証明された。（第35回日本ウ
イルス学会抄録、257ページ（1987）） かくして、本願発明者らは組織培養により得られるHAV
粒子を成熟粒子と未熟空粒子に分離することなくＡ型肝
炎ワクチンの原材料に提供しうることを見いだし本願発
明を完成した。
本発明の目的はウイルスRNAを含まない未熟空粒子とウ
イルスRNAを含む完全粒子の両方からなるＡ型肝炎ワク
チンを提供するものである。
イルスRNAを含む完全粒子の両方からなるＡ型肝炎ワク
チンを提供するものである。
発明の構成及び効果 HAV抗原は、組織培養によって得られたHAVを使用する。
HAV感受性細胞に馴化されたHAVを接種し一定期間培養
後、感染細胞をデオキシコール酸、NP−40などの非イオ
ン系界面活性剤で可溶化し、細胞内に貯留しているHAV
を溶出させる。溶出されたＡ型肝炎ウイルス液はポリエ
チレングリコールを用いた方法、または超遠心分離法で
濃縮した後に、クロロホルムまたはブタノールのような
有機溶媒で抽出する。さらに、2.5Mリン酸バッファー
（pH7.5）で希釈し、エトキシブタノール、ブトキシブ
タノールを容量比で2:1の割合で混合した溶液を加え混
和し、その後遠心分離をおこない水層と有機溶媒層の境
界に沈澱したウイルス層を集め、Tween 80のような界面
活性剤を適当量（例えば、0.01〜0.001％）を含む中性
付近の適当なバッファー（例えば、リン酸バッファーま
たはトリス塩酸バッファーなどに溶解する。さらに、上
記の有機溶媒処理を数回おこなった後にショ糖密度勾配
遠心分離をおこなう。遠心分離後はショ糖密度勾配液を
一定量ずつ分画し、HAV抗原価をサンドイッチ酸素免疫
測定法（ELISA法）で測定した場合、抗原価は二峰性を
形成することが認められる。HAV抗原活性のピークを示
す二つの画分を、さらにゲルクロマトグラフィーなどで
ショ糖を除去し、分光光度計によって220〜350nmの範囲
で吸収スペクトルを求めると、遠心分離によって得られ
る沈降速度の速い画分から260nmに吸収ピークを持つウ
イルスRNAを含むHAV完全粒子が、もう一方の沈降速度の
遅い画分から280nmに吸収ピークを持ち、免疫電顕法に
よる観察で直径が27nm程度の中空粒子として観察される
ウイルスRNAを含まないHAV未熟空粒子が得られる。
HAV感受性細胞に馴化されたHAVを接種し一定期間培養
後、感染細胞をデオキシコール酸、NP−40などの非イオ
ン系界面活性剤で可溶化し、細胞内に貯留しているHAV
を溶出させる。溶出されたＡ型肝炎ウイルス液はポリエ
チレングリコールを用いた方法、または超遠心分離法で
濃縮した後に、クロロホルムまたはブタノールのような
有機溶媒で抽出する。さらに、2.5Mリン酸バッファー
（pH7.5）で希釈し、エトキシブタノール、ブトキシブ
タノールを容量比で2:1の割合で混合した溶液を加え混
和し、その後遠心分離をおこない水層と有機溶媒層の境
界に沈澱したウイルス層を集め、Tween 80のような界面
活性剤を適当量（例えば、0.01〜0.001％）を含む中性
付近の適当なバッファー（例えば、リン酸バッファーま
たはトリス塩酸バッファーなどに溶解する。さらに、上
記の有機溶媒処理を数回おこなった後にショ糖密度勾配
遠心分離をおこなう。遠心分離後はショ糖密度勾配液を
一定量ずつ分画し、HAV抗原価をサンドイッチ酸素免疫
測定法（ELISA法）で測定した場合、抗原価は二峰性を
形成することが認められる。HAV抗原活性のピークを示
す二つの画分を、さらにゲルクロマトグラフィーなどで
ショ糖を除去し、分光光度計によって220〜350nmの範囲
で吸収スペクトルを求めると、遠心分離によって得られ
る沈降速度の速い画分から260nmに吸収ピークを持つウ
イルスRNAを含むHAV完全粒子が、もう一方の沈降速度の
遅い画分から280nmに吸収ピークを持ち、免疫電顕法に
よる観察で直径が27nm程度の中空粒子として観察される
ウイルスRNAを含まないHAV未熟空粒子が得られる。
また、ショ糖密度勾配遠心分離をおこなわずにゲルクロ
マトグラフィーを実施することにより上記のウイルスRN
Aを含む完全粒子とウイルスRNAを含まない未熟空粒子が
混在したHAV粒子を得ることができる。
マトグラフィーを実施することにより上記のウイルスRN
Aを含む完全粒子とウイルスRNAを含まない未熟空粒子が
混在したHAV粒子を得ることができる。
上記のように生物学的活性物質の分離精製法を組み合わ
せることによって、高度に精製されたウイルスRNAを含
む完全粒子とウイルスRNAを含まない未熟空粒子の二種
類のHAV粒子を得ることが可能となり、本発明のワクチ
ンに供される。
せることによって、高度に精製されたウイルスRNAを含
む完全粒子とウイルスRNAを含まない未熟空粒子の二種
類のHAV粒子を得ることが可能となり、本発明のワクチ
ンに供される。
また、ウイルスRNAを含む完全粒子とウイルスRNAを含ま
ない未熟空粒子は1:1,000〜1:8,000に、さらに最適には
1:4,000に希釈したホルマリン（37％ホルムアルデヒド
溶液）によって35〜37℃に一定期間、最適には12日間か
ら14日間反応させることによってHAVの感染性を不活化
することができる。
ない未熟空粒子は1:1,000〜1:8,000に、さらに最適には
1:4,000に希釈したホルマリン（37％ホルムアルデヒド
溶液）によって35〜37℃に一定期間、最適には12日間か
ら14日間反応させることによってHAVの感染性を不活化
することができる。
不活化処理した未熟空粒子と成熟粒子を別々にウサギに
繰り返し免疫したところ、両者のウサギより得られた血
清は未熟空粒子と成熟粒子の両方に反応することが認め
られ、しかも共に感染性HAVに対して中和活性を示し
た。さらに、不活化処理した未熟空粒子でマーモセット
を免疫したところ、不活化処理した成熟粒子と同様に中
和抗体価の上昇がみられ、強毒HAVの攻撃に対して抵抗
することが判明した。すなわち、本発明におけるHAV抗
原に供するHAV完全粒子と該ウイルスを含まない未熟空
粒子は同じ抗原性を持ち、かつ強毒HAVに対する中和抗
体を生体内に誘起させる免疫原性も同一であることが判
明した。従って、上記の二種類のウイルス粒子を共にＡ
型肝炎を予防するワクチンとして使用することが充分に
可能である。
繰り返し免疫したところ、両者のウサギより得られた血
清は未熟空粒子と成熟粒子の両方に反応することが認め
られ、しかも共に感染性HAVに対して中和活性を示し
た。さらに、不活化処理した未熟空粒子でマーモセット
を免疫したところ、不活化処理した成熟粒子と同様に中
和抗体価の上昇がみられ、強毒HAVの攻撃に対して抵抗
することが判明した。すなわち、本発明におけるHAV抗
原に供するHAV完全粒子と該ウイルスを含まない未熟空
粒子は同じ抗原性を持ち、かつ強毒HAVに対する中和抗
体を生体内に誘起させる免疫原性も同一であることが判
明した。従って、上記の二種類のウイルス粒子を共にＡ
型肝炎を予防するワクチンとして使用することが充分に
可能である。
また、本発明におけるHAV抗原は受動免疫を付与する抗
Ａ型肝炎ウイルス免疫グロブリンを得る際の免疫原とし
ても使用され得る。
Ａ型肝炎ウイルス免疫グロブリンを得る際の免疫原とし
ても使用され得る。
以下の実施例によって本発明をさらに明らかにする。し
かし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではな
い。
かし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではな
い。
実施例１ HAVの培養と精製 組織培養によって馴化されたHAV（KRM003株）をHAVに対
して高いウイルス産生能を示すアフリカミドリザル腎細
胞由来GL 37細胞にM.O.I.0.1になるように感染させ、37
℃で１時間吸着後、８％牛胎児血清（以下、FCSと略称
する）を含むＥ−MEMを加え２〜３週間37℃で培養をお
こなった。この間、一週間に一度、２％のFCSを含むＥ
−MEMで培地交換をおこない、２週間または３週間後に
培地を吸収除去し、リン酸バッファー（pH 7.2〜7.6）
で感染細胞を洗浄後、0.4％デオキシコール酸、１％NP
−40（半井化学社製）、50mM EDTAを含むトリス塩酸バ
ッファー（pH 7.4）を用いて常温で２時間,HAV感染細胞
を溶解した。可溶化された感染GL 37細胞溶解液は最終
濃度が７％となるようにポリエチレングリコール6000
（和光純薬社製）を、2.3％となるように塩化ナトリウ
ムを加え、４℃で２〜３時間撹はんし、その後一夜静置
した。このウイルス液を8,000rpmで30分間遠心分離をお
こない、沈査に0.4％デオキシコール酸１％NP−40、50m
M EDTAを含むトリス塩酸バッファー（pH 7.4）を加えて
再溶解した。このHAV溶解液は25,000rpmで16時間以上遠
心分離処理を施し、上清を捨てて沈査に精製開始時のウ
イルス液の1/5〜1/10量のリン酸バッファー（pH 7.2〜
7.6）を加え、超音波処理をおこない沈査を完全に再溶
解した。さらに、10,000rpm、15分間遠心分離して上清
を集めた。この上清には通常10〜80μg/mlのHAV抗原が
含まれていた。さらに、このＡ型肝炎ウイルス液に等量
のクロロホルムを加えて30分間抽出し、2,000rpm、30分
間遠心分離をおこなった上層の水溶液を集め、軽く撹は
んしながら陰圧脱気をおこなって、溶液中に残存するク
ロロホルムを除去した。
して高いウイルス産生能を示すアフリカミドリザル腎細
胞由来GL 37細胞にM.O.I.0.1になるように感染させ、37
℃で１時間吸着後、８％牛胎児血清（以下、FCSと略称
する）を含むＥ−MEMを加え２〜３週間37℃で培養をお
こなった。この間、一週間に一度、２％のFCSを含むＥ
−MEMで培地交換をおこない、２週間または３週間後に
培地を吸収除去し、リン酸バッファー（pH 7.2〜7.6）
で感染細胞を洗浄後、0.4％デオキシコール酸、１％NP
−40（半井化学社製）、50mM EDTAを含むトリス塩酸バ
ッファー（pH 7.4）を用いて常温で２時間,HAV感染細胞
を溶解した。可溶化された感染GL 37細胞溶解液は最終
濃度が７％となるようにポリエチレングリコール6000
（和光純薬社製）を、2.3％となるように塩化ナトリウ
ムを加え、４℃で２〜３時間撹はんし、その後一夜静置
した。このウイルス液を8,000rpmで30分間遠心分離をお
こない、沈査に0.4％デオキシコール酸１％NP−40、50m
M EDTAを含むトリス塩酸バッファー（pH 7.4）を加えて
再溶解した。このHAV溶解液は25,000rpmで16時間以上遠
心分離処理を施し、上清を捨てて沈査に精製開始時のウ
イルス液の1/5〜1/10量のリン酸バッファー（pH 7.2〜
7.6）を加え、超音波処理をおこない沈査を完全に再溶
解した。さらに、10,000rpm、15分間遠心分離して上清
を集めた。この上清には通常10〜80μg/mlのHAV抗原が
含まれていた。さらに、このＡ型肝炎ウイルス液に等量
のクロロホルムを加えて30分間抽出し、2,000rpm、30分
間遠心分離をおこなった上層の水溶液を集め、軽く撹は
んしながら陰圧脱気をおこなって、溶液中に残存するク
ロロホルムを除去した。
次に、RNase A（シグマ社製）を最終濃度が20μg/mlに
なるように加え、37℃で１〜２時間処理し、さらに塩化
マグネシウムとDNase I（宝酒造社製）をそれぞれ5mM、
20〜40μg/mlになるように加え、37℃で３時間処理し
た。その後Proteinase K（メルク社製）を50μg/mlにな
るように加え、37℃で１時間処理した。酵素処理後は2.
5Mリン酸バッファー（pH 7.5）をＡ型肝炎ウイルス液と
等量加え、さらにエトキシエタノールとブトキシエタノ
ールの2:1混液をHAV液量の0.8容加え、軽く混和し10〜3
0分間静置後、2,000rpmで、10分間遠心分離をおこな
い、水層と有機溶媒層の境界に沈澱したHAV層を厚め、T
ween 40（和光純薬社製）を0.001〜0.1％含むリン酸バ
ッファー（pH 7.2〜7.6）でHAV抗原濃度が100〜400μg/
mlになるように溶解した。さらに、この有機溶媒処理を
もう一度繰り返した。得られたＡ型肝炎ウイルス液をシ
ョ糖濃度が10〜40％の連続濃度勾配液に重層し、25,000
rpm、４〜５時間遠心分離をおこなった後に一定量ずつ
分画した。分画されたフラクションはサンドイッチELIS
A法でHAV抗原価を測定し、沈降速度の違いによって、HA
V抗原活性のピークを示した二つのフラクションを選択
した。そして、それぞれのフラクションをセファクリル
S 300（ファルマシア社製）を用いてゲルクロマトグラ
フィーをおこない、ショ糖を除いた。得られた二種類の
Ａ型肝炎ウイルス液は分光光度計を用いて220〜350nmの
波長範囲で吸収スペクトルを測定した。その結果280nm
の波長に吸収ピークを持ち、ウイルスRNAを含まないHAV
未熟空粒子が得られ、また、もう一方は260nmの波長に
吸収ピークを持ちウイルスRNAを含むHAV完全粒子が得ら
れた。図１にショ糖密度勾配遠心の際のフラクションパ
ターンを示す。
なるように加え、37℃で１〜２時間処理し、さらに塩化
マグネシウムとDNase I（宝酒造社製）をそれぞれ5mM、
20〜40μg/mlになるように加え、37℃で３時間処理し
た。その後Proteinase K（メルク社製）を50μg/mlにな
るように加え、37℃で１時間処理した。酵素処理後は2.
5Mリン酸バッファー（pH 7.5）をＡ型肝炎ウイルス液と
等量加え、さらにエトキシエタノールとブトキシエタノ
ールの2:1混液をHAV液量の0.8容加え、軽く混和し10〜3
0分間静置後、2,000rpmで、10分間遠心分離をおこな
い、水層と有機溶媒層の境界に沈澱したHAV層を厚め、T
ween 40（和光純薬社製）を0.001〜0.1％含むリン酸バ
ッファー（pH 7.2〜7.6）でHAV抗原濃度が100〜400μg/
mlになるように溶解した。さらに、この有機溶媒処理を
もう一度繰り返した。得られたＡ型肝炎ウイルス液をシ
ョ糖濃度が10〜40％の連続濃度勾配液に重層し、25,000
rpm、４〜５時間遠心分離をおこなった後に一定量ずつ
分画した。分画されたフラクションはサンドイッチELIS
A法でHAV抗原価を測定し、沈降速度の違いによって、HA
V抗原活性のピークを示した二つのフラクションを選択
した。そして、それぞれのフラクションをセファクリル
S 300（ファルマシア社製）を用いてゲルクロマトグラ
フィーをおこない、ショ糖を除いた。得られた二種類の
Ａ型肝炎ウイルス液は分光光度計を用いて220〜350nmの
波長範囲で吸収スペクトルを測定した。その結果280nm
の波長に吸収ピークを持ち、ウイルスRNAを含まないHAV
未熟空粒子が得られ、また、もう一方は260nmの波長に
吸収ピークを持ちウイルスRNAを含むHAV完全粒子が得ら
れた。図１にショ糖密度勾配遠心の際のフラクションパ
ターンを示す。
さらに上記の有機溶媒処理後のＡ型肝炎ウイルス液をセ
ファクリルS 400 HR（ファルマシア社製）を用いたゲル
クロマトグラフィーをおこなうことによって、上記のウ
イルスRNAを含む完全粒子とウイルスRNAを含まない未熟
空粒子が混在した状態の精製Ａ型肝炎ウイルス液を得る
ことができた。
ファクリルS 400 HR（ファルマシア社製）を用いたゲル
クロマトグラフィーをおこなうことによって、上記のウ
イルスRNAを含む完全粒子とウイルスRNAを含まない未熟
空粒子が混在した状態の精製Ａ型肝炎ウイルス液を得る
ことができた。
実施例２ 不活化 実施例１によって得られたウイルスRNAを含むHAV完全粒
子、またはウイルスRNAを含まないHAV未熟空粒子、及び
その両方を含む精製Ａ型肝炎ウイルス液を孔径50〜200n
mのフィルターで過し、凝集物を除去した後に、0.002
％Tween 80を含むリン酸バッファー（pH 7.2〜7.6）を
用いて1:2,000倍に希釈されたホルマリン（37％ホルム
アルデヒド液）液と等量に混合して37℃で12〜14日間反
応させた。反応終了後に再度、孔径200nmのフィルター
で過してホルマリン処理Ａ型肝炎ウイルス液を得た。
得られた該ウイルス液は組織培養されたGL 37細胞やHAV
に感受性を持つ非ヒト霊長動物（例えばムネアカタマリ
ン、クチヒゲタマリン、コモンマーモセットなど）のい
ずれにも感染性を示さず、完全に不活化されたＡ型肝炎
ウイルス液を得ることができた。
子、またはウイルスRNAを含まないHAV未熟空粒子、及び
その両方を含む精製Ａ型肝炎ウイルス液を孔径50〜200n
mのフィルターで過し、凝集物を除去した後に、0.002
％Tween 80を含むリン酸バッファー（pH 7.2〜7.6）を
用いて1:2,000倍に希釈されたホルマリン（37％ホルム
アルデヒド液）液と等量に混合して37℃で12〜14日間反
応させた。反応終了後に再度、孔径200nmのフィルター
で過してホルマリン処理Ａ型肝炎ウイルス液を得た。
得られた該ウイルス液は組織培養されたGL 37細胞やHAV
に感受性を持つ非ヒト霊長動物（例えばムネアカタマリ
ン、クチヒゲタマリン、コモンマーモセットなど）のい
ずれにも感染性を示さず、完全に不活化されたＡ型肝炎
ウイルス液を得ることができた。
実施例３ 抗Ａ型肝炎ウイルス抗体との反応性 実施例２で調整されたホルマリン不活化未熟空粒子から
なるワクチンとホルマリン不活化完全粒子からなるワク
チンを、それぞれ単独でウサギの耳静脈に一回につきHA
V抗原蛋白量100μｇ以上を数回にわたって１〜２週間間
隔で接種し、初回接種から約60〜90日後に採血した。得
られた血清に対して、感染性HAVに対する中和抗体活性
を測定し、また、サンドイッチELISA法を用いてホルマ
リン不活化未熟空粒子とホルマリン不活化完全粒子に対
する反応性を調べた。結果は表１に示すように、ホルマ
リン不活化未熟空粒子からなるワクチンを接種したウサ
ギから得られた血清も、ホルマリン不活化完全粒子から
なるワクチンを接種したウサギより得られた血清も共
に、感染性HAVに対して中和活性を示した。さらに、両
者のウサギより得られた血清は共にホルマリン不活化未
熟空粒子とホルマリン不活化完全粒子の両方に反応する
ことが認められ、ホルマリン不活化未熟空粒子とホルマ
リン不活化完全粒子の抗原性が同一であることが示唆さ
れた。
なるワクチンとホルマリン不活化完全粒子からなるワク
チンを、それぞれ単独でウサギの耳静脈に一回につきHA
V抗原蛋白量100μｇ以上を数回にわたって１〜２週間間
隔で接種し、初回接種から約60〜90日後に採血した。得
られた血清に対して、感染性HAVに対する中和抗体活性
を測定し、また、サンドイッチELISA法を用いてホルマ
リン不活化未熟空粒子とホルマリン不活化完全粒子に対
する反応性を調べた。結果は表１に示すように、ホルマ
リン不活化未熟空粒子からなるワクチンを接種したウサ
ギから得られた血清も、ホルマリン不活化完全粒子から
なるワクチンを接種したウサギより得られた血清も共
に、感染性HAVに対して中和活性を示した。さらに、両
者のウサギより得られた血清は共にホルマリン不活化未
熟空粒子とホルマリン不活化完全粒子の両方に反応する
ことが認められ、ホルマリン不活化未熟空粒子とホルマ
リン不活化完全粒子の抗原性が同一であることが示唆さ
れた。
実施例４ 抗Ａ型肝炎ウイルス抗体産生能 実施例２によって調整されたホルマリン不活化完全粒子
からなるワクチンとホルマリン不活化未熟空粒子からな
るワクチンを、それぞれ生理食塩水を用いて４段階希釈
をおこない、５週齢のSD系ラットの皮下に1mlずつ接種
した。接種後６週間目に採血し、サンドイッチELISA法
で抗HAV抗体価を測定し、用量応答回帰式の分析をおこ
なったところ、両者のワクチンとも接種量と抗体価の間
に直線性が認められ、分散分析法による解析では両者の
平行性が認められた。また、未熟空粒子は完全粒子に対
して約1/5の相対力価を示した。図２に結果を示す。
からなるワクチンとホルマリン不活化未熟空粒子からな
るワクチンを、それぞれ生理食塩水を用いて４段階希釈
をおこない、５週齢のSD系ラットの皮下に1mlずつ接種
した。接種後６週間目に採血し、サンドイッチELISA法
で抗HAV抗体価を測定し、用量応答回帰式の分析をおこ
なったところ、両者のワクチンとも接種量と抗体価の間
に直線性が認められ、分散分析法による解析では両者の
平行性が認められた。また、未熟空粒子は完全粒子に対
して約1/5の相対力価を示した。図２に結果を示す。
実施例５ 非ヒト霊長動物における感染防御効果 実施例２によって調整されたホルマリン不活化未熟空粒
子からなるワクチンとホルマリン不活化完全粒子からな
るワクチンをそれぞれHAVに感染性を示す非ヒト霊長動
物に一度につきHAV抗原蛋白量140ngを４週間間隔で２回
皮下接種した。２回目の接種から14週後に1,000マーモ
セット感染量の強毒HAVを経口により攻撃投与した。攻
撃投与後は毎週１回採血して血清中の抗HAV抗体価を競
合ELISA法で測定し、また血清トランスアミナーゼ活性
（グルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ、グル
タミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ）も測定した。
加えて、毎日糞中に排泄されるHAV抗原量もサンドイッ
チELISA法で測定した。その結果、ホルマリン不活化未
熟空粒子からなるワクチンまたはホルマリン不活化完全
粒子からなるワクチンをそれぞれ接種した非ヒト霊長動
物は、初回のワクチンの接種から３週間後に抗HAV抗体
が出現したが、血清中のトランスアミナーゼ活性の上昇
は全ての動物において認められなかった。さらに、強毒
HAVを経口的に攻撃接種した後も、それぞれのワクチン
を接種した非ヒト霊長動物は血清中のトランスアミナー
ゼ活性の上昇は認められず、また血清中の抗HAV抗体の
上昇、糞中へのHAVの排泄も殆ど認められず、Ａ型肝炎
の感染を防御することができた。結果を表２に示す。
子からなるワクチンとホルマリン不活化完全粒子からな
るワクチンをそれぞれHAVに感染性を示す非ヒト霊長動
物に一度につきHAV抗原蛋白量140ngを４週間間隔で２回
皮下接種した。２回目の接種から14週後に1,000マーモ
セット感染量の強毒HAVを経口により攻撃投与した。攻
撃投与後は毎週１回採血して血清中の抗HAV抗体価を競
合ELISA法で測定し、また血清トランスアミナーゼ活性
（グルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ、グル
タミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ）も測定した。
加えて、毎日糞中に排泄されるHAV抗原量もサンドイッ
チELISA法で測定した。その結果、ホルマリン不活化未
熟空粒子からなるワクチンまたはホルマリン不活化完全
粒子からなるワクチンをそれぞれ接種した非ヒト霊長動
物は、初回のワクチンの接種から３週間後に抗HAV抗体
が出現したが、血清中のトランスアミナーゼ活性の上昇
は全ての動物において認められなかった。さらに、強毒
HAVを経口的に攻撃接種した後も、それぞれのワクチン
を接種した非ヒト霊長動物は血清中のトランスアミナー
ゼ活性の上昇は認められず、また血清中の抗HAV抗体の
上昇、糞中へのHAVの排泄も殆ど認められず、Ａ型肝炎
の感染を防御することができた。結果を表２に示す。
参考例１ 非ヒト霊長動物における受動免疫効果 実施例５に示したホルマリン不活化未熟空粒子からなる
ワクチン、またはホルマリン不活化完全粒子からなるワ
クチンをそれぞれ単独に接種した非ヒト霊長動物から採
血し、エタノール沈澱法または硫酸アンモニウム沈澱法
で免疫グロブリン画分を得た。得られた免疫グロブリン
画分は競合ELISA法を用いて抗HAV抗体価を測定した、米
国BOB参照免疫グロブリンG No.1を10IUと設定した場合
の相対力価で5IU相当量の各々の免疫グロブリン画分を
抗HAV抗体を持たない非ヒト霊長動物の大腿四頭筋肉内
にそれぞれ単独で接種した。該免疫グロブリン画分を接
種した非ヒト霊長動物に、免疫グロブリン画分の接種後
10日目に1,000マーモセット感染量の強毒Ａ型肝炎ウイ
ルス液を経口的に攻撃接種した。そして、強毒HAVの攻
撃接種後は血中の抗HAV抗体の変動、血清トランスアミ
ナーゼ活性及び糞中へのHAV抗原の排泄を測定し、Ａ型
肝炎の感染の有無を調べた。その結果、いずれの非ヒト
霊長動物もＡ型肝炎の感染を示す変化は観察されなかっ
た。従って、HAV感染回復期のマーモセット免疫グロブ
リン画分、及びホルマリン不活化完全粒子からなるワク
チンを接種したマーモセットから得られた免疫グロブリ
ン画分と同様に、ホルマリン不活化未熟空粒子からなる
ワクチンを接種したマーモセットから得られた免疫グロ
ブリン画分も、強毒HAVの攻撃接種に対してＡ型肝炎の
感染を防御することができ、顕著な受動免疫効果を示し
た。
ワクチン、またはホルマリン不活化完全粒子からなるワ
クチンをそれぞれ単独に接種した非ヒト霊長動物から採
血し、エタノール沈澱法または硫酸アンモニウム沈澱法
で免疫グロブリン画分を得た。得られた免疫グロブリン
画分は競合ELISA法を用いて抗HAV抗体価を測定した、米
国BOB参照免疫グロブリンG No.1を10IUと設定した場合
の相対力価で5IU相当量の各々の免疫グロブリン画分を
抗HAV抗体を持たない非ヒト霊長動物の大腿四頭筋肉内
にそれぞれ単独で接種した。該免疫グロブリン画分を接
種した非ヒト霊長動物に、免疫グロブリン画分の接種後
10日目に1,000マーモセット感染量の強毒Ａ型肝炎ウイ
ルス液を経口的に攻撃接種した。そして、強毒HAVの攻
撃接種後は血中の抗HAV抗体の変動、血清トランスアミ
ナーゼ活性及び糞中へのHAV抗原の排泄を測定し、Ａ型
肝炎の感染の有無を調べた。その結果、いずれの非ヒト
霊長動物もＡ型肝炎の感染を示す変化は観察されなかっ
た。従って、HAV感染回復期のマーモセット免疫グロブ
リン画分、及びホルマリン不活化完全粒子からなるワク
チンを接種したマーモセットから得られた免疫グロブリ
ン画分と同様に、ホルマリン不活化未熟空粒子からなる
ワクチンを接種したマーモセットから得られた免疫グロ
ブリン画分も、強毒HAVの攻撃接種に対してＡ型肝炎の
感染を防御することができ、顕著な受動免疫効果を示し
た。
図１はショ糖密度勾配遠心法によるＡ型肝炎ウイルスの
精製の分画パターンを示し、図２はホルマリン不活化完
全粒子からなるワクチンとホルマリン不活化未熟空粒子
からなるワクチンのSD系ラットにおける抗HAV抗体産生
の用量応答を示す図である。
精製の分画パターンを示し、図２はホルマリン不活化完
全粒子からなるワクチンとホルマリン不活化未熟空粒子
からなるワクチンのSD系ラットにおける抗HAV抗体産生
の用量応答を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 戸塚 敦子 東京都昭島市玉川町５―16―２―107 (72)発明者 佐藤 征他 新潟県新津市秋葉３―18―５ (72)発明者 森田 迪夫 千葉県千葉市千城台東１―10―４ (72)発明者 水野 喬介 熊本県熊本市龍田町上立田1725―１ (56)参考文献 Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔ ｓ，ｖｏｌ．96，ｎｏ．15，ａｂｓｔｒａ ｃｔ ｎｏ．118802ｙ
Claims (4)
- 【請求項１】Ａ型肝炎ウイルスRNAを含む完全粒子とＡ
型肝炎ウイルスRNAを含まない未熟空粒子の両方を含む
不活性化または弱毒化Ａ型肝炎ウイルス粒子からなるＡ
型肝炎ワクチン。 - 【請求項２】不活性化または弱毒化をホルムアルデヒド
によって行う特許請求の範囲第（１）項記載のＡ型肝炎
ワクチン。 - 【請求項３】組織培養によって増殖したＡ型肝炎ウイル
スをエトキシエタノールとブトキシエタノールで抽出
後、ショ糖密度勾配中で遠心分離を行い、260nmの波長
に吸収ピークを持つバンドと280nmの波長に吸収ピーク
を持つバンドの両方を選択することによって得られるウ
イルス粒子を含有する特許請求の範囲第（１）項記載の
Ａ型肝炎ワクチン。 - 【請求項４】組織培養によって増殖したＡ型肝炎ウイル
スをエトキシエタノールとブトキシエタノールで抽出
後、ゲルクロマトマトグラフィーを行うことによって得
られるウイルス粒子を含有する特許請求の範囲第（１）
項記載のＡ型肝炎ワクチン。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63106750A JPH0751513B2 (ja) | 1988-04-28 | 1988-04-28 | Ａ型肝炎ワクチン |
| EP89107763A EP0339668A3 (en) | 1988-04-28 | 1989-04-28 | Hepatitis a virus antigen |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63106750A JPH0751513B2 (ja) | 1988-04-28 | 1988-04-28 | Ａ型肝炎ワクチン |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01279844A JPH01279844A (ja) | 1989-11-10 |
| JPH0751513B2 true JPH0751513B2 (ja) | 1995-06-05 |
Family
ID=14441590
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63106750A Expired - Lifetime JPH0751513B2 (ja) | 1988-04-28 | 1988-04-28 | Ａ型肝炎ワクチン |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0339668A3 (ja) |
| JP (1) | JPH0751513B2 (ja) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2047041A1 (en) * | 1990-07-18 | 1992-01-19 | John A. Lewis | Process for purification of hepatitis-a virus capsids |
| DZ1706A1 (fr) * | 1992-08-07 | 2002-02-17 | Merck & Co Inc | Vaccin contre le virus de l'hepatite a. |
| HRP950097A2 (en) | 1994-03-08 | 1997-06-30 | Merck & Co Inc | Hepatitis a virus culture process |
| WO1999005282A1 (en) * | 1997-07-25 | 1999-02-04 | Tamura, Ryoji | Non-b non-c non-g hepatitis virus gene, polynucleotide, polypeptide, virion, method for separating virion, and method for detecting virus |
| US6849431B2 (en) | 1997-07-25 | 2005-02-01 | Ryoji Tamura | Non-B, non-C, non-G hepatitis virus gene, polynucleotide, polypeptide, virus particle, method for isolating virus particle, and method for detecting virus |
| PT1221968E (pt) * | 1999-10-13 | 2010-04-16 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Processo de obtenção de respostas imunes celulares de proteínas |
| US6825027B2 (en) | 2001-12-10 | 2004-11-30 | Baxter Healthcare S.A. | Method of production of purified hepatitis a virus particles and vaccine preparation |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4017601A (en) * | 1975-10-16 | 1977-04-12 | Merck & Co., Inc. | Hepatitis A antigen |
| FR2398504A1 (fr) * | 1977-07-29 | 1979-02-23 | Tours Inst Virologie | Culture de virus de l'hepatite a, in vitro. application a la production d'un antigene reactif, d'immunserums specifiques et de vaccins contre l'hepatite a |
| US4164566A (en) * | 1978-08-17 | 1979-08-14 | Merck & Co., Inc. | Hepatitis a virus cell culture in vitro |
| CA1164799A (en) * | 1979-09-04 | 1984-04-03 | Paula A. Giesa | Cell culture of hepatitis a virus |
| JPH085804B2 (ja) * | 1988-04-28 | 1996-01-24 | 財団法人化学及血清療法研究所 | Ａ型及びｂ型肝炎混合アジュバントワクチン |
-
1988
- 1988-04-28 JP JP63106750A patent/JPH0751513B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1989
- 1989-04-28 EP EP89107763A patent/EP0339668A3/en not_active Withdrawn
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ＣｈｅｍｉｃａｌＡｂｓｔｒａｃｔｓ，ｖｏｌ．９６，ｎｏ．１５，ａｂｓｔｒａｃｔｎｏ．１１８８０２ｙ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0339668A2 (en) | 1989-11-02 |
| EP0339668A3 (en) | 1990-05-09 |
| JPH01279844A (ja) | 1989-11-10 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
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