JPH0751592B2 - シクロトリフォスファゼン誘導体 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は、新規なシクロトリフォスファゼン誘導体に関
する。更に詳しくは本発明は新規な、治療用生理活性物
質，水親和性高分子シクロトリフォスファゼン誘導体に
関する。

〈従来の技術〉 疾患の治療に有効でありうる生理活性物質を生体（人や
動物）に投与する場合に、往々にして種々の障害のため
に期待した効果がみられないことがある。

例えば、経口投与された場合に、腸管からの吸収が不良
で期待した効果が現れないことがある。又、生体内に吸
収されるか、あるいは注射等の方法で直接生体内に投与
されても、生体内の分解酵素等の作用により急速に分解
され、効果が持続しないことがある。更には生理活性物
質がペプチドホルモン等の場合には、時に抗体が産生さ
れ重篤な副作用をおこすことがある。

これらの障害に対して多くの回避方法が考案されてきた
が、治療用生理活性物質を適当な水親和性高分子に結合
させる方法が有効であることが近年知られてきた。

例えばデキストランにBrCNを用いて結合されたヘモグロ
ビンは、代用血液として身体中に適当な期間滞留するこ
とが開示されている（特開昭52-51016号公報参照）。更
に、ポリエチレングリコールで直接修飾されたペプチド
ホルモン類は、その抗原性が低下することが開示されて
いる（特開昭61-178926号公報参照）。

しかるに、これら治療用生理活性物質を直接水親和性高
分子と結合させる方法は、その反応の際に副生成物の生
成が多いこと、反応収率が低いこと、結合された生理活
性物質の結合物からの放出速度のコントロールが難しい
こと等の欠点を有している。

これらの問題を解決するために多くの方法が提案された
が、それらの中でも水親和性高分子と治療用生理活性物
質との間に塩化シアヌルを導入する方法が優れていると
いわれ、多くの治療用生理活性物質と塩化シアヌルを導
入したポリエチレングリコール（活性化ポリエチレング
リコールといわれている）との反応生成物が開示されて
いる（例えば、特公昭60-23084号公報では活性化ポリエ
チレングリコール化ヘモグロビンの例が、又、特開昭62
-55079号公報では活性化ポリエチレングリコール化ウリ
カーゼが、更には特開昭62-115280号公報では活性化ポ
リエチレングリコール化スーパオキシドディスムターゼ
（SOD）が開示されている）。

〈発明が解決しようとする問題点〉 しかし、塩化シアヌルで活性化されたポリエチレングリ
コール等の水親和性高分子により治療用生理活性物質を
修飾する方法は、第一に、塩化シアヌル基自体の安全性
が不明で、かつ生体内における代謝，分解過程も不明で
あること、分解生成物の安全性についても未解明である
こと等のため、その使用には慎重を期す必要がある。第
二に、塩化シアヌルを用いる治療用生理活性物質、特に
酵素の活性が大幅に低下してしまうという問題点があ
る。

〈問題を解決するための手段〉 本発明者らは、上記のような従来技術の問題点に鑑みて
鋭意検討の結果、ポリエチレングリコール等の水親和性
高分子により治療用生理活性物質を修飾する場合に、水
親和性高分子と治療用生理活性物質との間に塩化シアヌ
ルを導入するかわりにシクロトリフォスファゼンを導入
することにより安全性が高く、治療用生理活性物質の活
性が低下せず、更に生体内での治療用生理活性物質の動
態を制御しうる治療用生理活性物質の水親和性高分子誘
導体を製造しうることを知見し、本発明に到達したもの
である。

本発明によって、安全性が高い生理活性の高い及び
／又は生体内での動態が制御可能な新規な治療用生理
活性物質，水親和性高分子誘導体のシクロトリフォスフ
ァゼン類が提供される。

シクロトリフォスファゼンは無機高分子物質ポリフォス
ファゼンの最小構成単位である。このシクロトリフォス
ファゼンは窒素とリンとからできているため生体内での
安全性が高いことから既にこれに治療用生理活性物質を
結合させる試みが知られている。

例えば、アルキル化剤と結合したシクロトリフォスファ
ゼンとしてシクロトリフォスファゼンのアジリゼン誘導
体が知られている（Labrre,J.F.ら,Eur.J.Cancer 1979,
15（５）637-43）。しかしながら、これらの化合物のリ
ン原子に水親和性高分子が結合した誘導体は知られてい
ない。

又、例えば、USP 4,239,755号明細書には下記式［II］
で表わされるステロイド化シクロトリフォスファゼン類
が開示されている。

上記式［II］でR₁は３又は17−ヒドロキシステロイド残
基でありR₂はアルキル基である。しかしながら同明細書
には、ステロイド残基が結合しているリン原子以外のリ
ン原子の置換基として水親和性高分子を結合させる概念
は全く開示されていない。

又、USP 4,495,174号明細書には局所麻酔剤を結合した
シクロトリフォスファゼンあるいはポリフォスファゼン
が開示されている。しかしながら、同明細書にはアミノ
基を有する局所麻酔剤でシクロトリフォスファゼンの塩
素基を置換する方法は開示されてはいるものの、未置換
の塩素基の取扱いについては何ら記載されておらず、ま
してそこに水親和性高分子を結合させることについては
何の記載も示唆もされていない。

更に、特開昭56-30432号公報には、エトフィリン化ホス
フォスファゼンポリマー及びその製法が開示されてい
る。同明細書には、エトフィリン以外の置換基としては
炭素数１〜３個のアルコキシ基，プロピルアミノ基又は
フェノキシ基が記載されているのみであり、水親和性高
分子については何らの記載はない。

すなわち、これらの先行技術に記載されている治療用生
理活性物質は何れも低分子であり、酵素類，ポリペプチ
ド類，蛋白質類については全く開示されておらず、又水
親和性高分子類を結合することについては何の記載も示
唆もなされていないのである。

一方、USP 3,674,509号明細書には、反すう動物用の蛋
白質飼料として、シクロトリフォスファゼンでクロスリ
ンクさせた蛋白質が開示されている。同明細書の蛋白質
シクロトリフォスファゼン誘導体は、蛋白質をシクロト
リフォスファゼンでクロスリンクさせて反すう動物の前
胃での消化に対し抵抗性をもたせているもので、蛋白質
の生体内動態をかえるものではあっても、本発明の蛋白
質をシクロトリフォスファゼン類を介して水親和性高分
子類と結合した誘導体とは全く異なるものである。

しかして、本発明は下記式［Ｉ］ で表わされるシクロトリフォスファゼン誘導体である。

本発明の水親和性高分子とは、シクロトリフォスファゼ
ン環に結合しうるものであればいずれでもよく、なかで
もその分子内に存する官能基、例えば水酸基，アミノ基
等を介して直接シクロトリフォスファゼン環のリン原子
と結合し得るような水親和性高分子残基が好ましく、又
その誘導体とは、これらの基を有していなくても、例え
ばアミド化等によってこれらの基を含むようにせしめら
れたような、あるいは架橋剤を水親和性高分子に結合せ
しめることによって、シクロトリフォスファゼン環と結
合し得るような水親和性高分子の誘導体をいう。

かかる水親和性高分子としては、ポリエチレングリコー
ル，モノメトキシポリエチレングリコール，及びデキス
トランをいう。

又、前述の水親和性高分子の誘導体に水親和性高分子と
しては、例えばスチレン−マレイン酸共重合体，ジビニ
ルエーテル−無水マレイン酸共重合体等の水親和性高分
子が挙げられる。これらの水親和性高分子は単独で用い
られてもよいし、二種以上が混合されていてもよい。

これらの水親和性高分子類とシクロトリフォスファゼン
環とは、ポリエチレングリコール，モノメトキシポリエ
チレングリコール，デキストラン等の水酸基をもつ水親
和性高分子化合物（一般式Ｘ−OH）ではシクロトリフォ
スファゼン環のＰ原子と、Ｐ−Ｏ−Ｘなるエーテル結合
を形成する。

これらの水親和性高分子類の分子量は、水親和性高分子
の種類により異なるので一概に規定することはできな
い。

ポリエチレングリコール，モノメトキシポリエチレング
リコール，ポリプロピレングリコール等では300〜30,00
0,デキストラン，イヌリン，コンドロイチン，ヒアウロ
ン酸等では1,000〜3,000,000,ポリ乳酸，ポリグリコー
ル酸等では1,000〜50,000が通常用いられる。

これらの中でもポリエチレングリコール，モノメトキシ
ポリエチレングリコール，ポリプロピレングリコールで
は分子量300〜10,000のものが好ましい。又デキストラ
ンでは分子量5,000〜100,000のものが好ましい。

本発明の治療用生理活性物質とは、人間あるいは動物の
疾病の治療を目的として投与される生理活性物質であ
り、アミノ酸，糖類等のような栄養補給に用いられるよ
うな物質は含まれない。本発明の治療用生理活性物質
は、分子内に水酸基、アミノ基、イミノ基、及びチオー
ル基からなる群より選ばれる一種又は二種以上の基を有
し、且つペプチドホルモン類、酵素類、蛋白質類、制癌
剤及びステロイド剤からなる群より選ばれる治療用生理
活性物質又はその誘導体をいう。ペプチドホルモン類と
しては、２個以上のアミノ酸がペプチド結合によって結
合したもので、ヒトを含む各種動物由来のもの，合成
品，遺伝子工学産物等何れでもよく、更にこれらと類似
構造を有し、同様の生理活性を有する物質をも包含す
る。具体的には、インスリン,ACTH,ガストリン，カルシ
トニン，エンドルフィン，グルカーゴン，ソマトスタチ
ン，ウロガストロン，成長ホルモン放出因子（GRF），
コンチコトロピン放出因子（CRF），ナトリウム利尿ペ
プチド,FSH,LHRH,バソプレシン，エンケファリン，イン
ターフェロン，インターロイキン類,TNF,プロティンＣ
等が挙げられる。

酵素類としては、ヒトを含む各動物由来のもの，合成
品，遺伝子工学産物等何れでもよく、更にこれらと類似
構造を有し、同様の生理活性を有する物質をも包含す
る。具体的には、スーパーオキシドディスムターゼ，ペ
ルオキシダーゼ，アスパラギナーゼ，グルタマーゼ，ア
ルギナーゼ，アルギニンデアミナーゼ,RNアーゼ，ヘキ
ソサミンダーゼA,ヘキソサミンダーゼB,アルファグルコ
シダーゼ，スフィンゴミエリナーゼ，アリルスルフェタ
ーゼ，ウリカーゼ，バトロキソビン，ストレプトキナー
ゼ，エラスターゼ，β−グルクロニダーゼ，β−グルコ
シダーゼ，アデノシンデアミナーゼ，ウロキナーゼ，ビ
リルビンオキシダーゼ等が挙げられる。

蛋白質類としては、ヒトを含む各種動物由来のもの，合
成品，遺伝子工学産物等何れでもよく、更にこれらと類
似構造を有し、同様の生理活性を有する物質をも包含す
る。具体的には、アルブミン，ヘモグロビン，フィブリ
ノーゲン，プラスミノーゲン,TPA（組織型プラスミノー
ゲンアクチベーター），免疫グロブリンG,α₂−マクロ
グロブリン，ラクトフェリン，ブタクサ花粉等が挙げら
れる。

制癌剤としては、メルファラン,p−フェニレンジアミン
マスタード，クロラムブシル,Ara−C,メトトレキサー
ト，メルカプトプリン，マイトマイシンC,ペプレオマイ
シン，ダウノルビシン，ドキソルビシン,5−FU等が挙げ
られる。

ステロイド剤としては、３位あるいは17位が水酸基であ
るステロイドである、デソキソエストロン、エストロ
ン、プレグナノロン、エストラジオール−３−メチルエ
ーテルやテストステロン、エチニルエストラジオール、
プレドニゾロン、トリアムシノロン、トリアムシノロン
アセトニド等が挙げられる。

本発明で用いられる、シクロトリフォスファゼン環の、
水親和性高分子類と治療用生理活性物質を除いた部分
は、−OR₇（R₇がC₁〜C₂₄のアルキル基であるアルコキシ
基）及び−NHR₈（R₈がグリシンエチルエステル基である
アミノ酸残基）から選ばれる１種又は２種以上であれば
よいが、具体的にはメトキシ基（−OCH₃）、グリシンエ
チルエステル残基（-NHCH₂-COOC₂H₅）等が挙げられ、中
でもグリシンエチルエステル残基が好ましい。

本発明の化合物は、例えば以下の方法で製造することが
できる。先ず、水親和性高分子とヘキサハロゲン化シク
ロトリフォスファゼンとを溶媒中で反応させ、再結晶後
ケル過して、水親和性高分子置換シクロトリフォスフ
ァゼン類を製造する。用いる水親和性高分子とヘキサハ
ロゲン化シクロトリフォスファゼンの量比は、シクロト
リフォスファゼン環に導入しようとする水親和性高分子
量による。通常シクロトリフォスファゼン環の６個のハ
ロゲン原子の１〜３個を置換するに足る量の水親和性高
分子が用いられる。反応性の差により置換個数の当量よ
りも大過剰の水親和性高分子が用いられることもある。
水親和性高分子類としては、水酸基をもつ水親和性高分
子類として、ポリエチレングリコール，モノメトキシポ
リエチレングリコール，デキストラン及びこれらの誘導
体等が挙げられる。

水酸基をもつ水親和性高分子類は水酸基の水素原子をア
ルカリ金属原子に置換したアルコラートにした方が望ま
しい場合もある。

ヘキサハロゲン化シクロトリフォスファゼンとしては、
ヘキサクロロシクロトリフォスファゼン，ヘキサフルオ
ロトリフォスファゼン，ヘキサブロモシクロトリフォス
ファゼン等が挙げられる。なかでもヘキサクロロシクロ
トリフォスファゼンが望ましい。

使用する有機溶媒としては、ベンゼン，トルエン，テト
ラハイドロフラン，ジオキサン，ジメチルホルムアミド
等の非水溶媒あるいはジメチルホルムアミド−水混合溶
媒が挙げられる。使用される水親和性高分子類の脂溶性
が高い場合においては非水溶媒を、又水親和性高分子類
の脂溶性が低い場合においてはジメチルホルムアミド−
水混合溶媒が用いられる。

反応温度は０℃〜還流温度であり、反応時間は反応物質
によって異なるが通常１〜24時間である。反応が脱塩酸
反応である場合は、塩基の添加が望ましい。用いられる
塩基としては炭酸ナトリウム，トリエチルアミン，ピリ
ジン，ジメチルアミノピリジン等が挙げられる。

ゲル過にはセファデックスLH-20,LH-60,G−100等の通
常用いられるゲルが使用される。ゲル過によって、シ
クロトリフォスファゼン環が所望の個数水親和性高分子
によって置換された水親和性高分子置換シクロトリフォ
スファゼンが分離される。水親和性高分子の置換個数は
１〜３個が望ましい。

次に、こうして製造された水親和性高分子置換シクロト
リフォスファゼン類と治療用生理活性物質とを溶媒中で
反応させ、水親和性高分子及び治療用生理活性物質両置
換シクロトリフォスファゼン類を製造する。

用いる水親和性高分子置換シクロトリフォスファゼン類
と治療用生理活性物質の量比は治療用生理活性物質によ
って大きく異なる。治療用生理活性物質が高分子量のペ
プチドホルモン類，酵素類及び蛋白質類である場合は、
シクロトリフォスファゼン環と反応するアミノ基を１分
子内に複数個持つので、それらの治療用生理活性物質１
分子につき複数個の水親和性高分子置換シクロトリフォ
スファゼンが結合しうる。従って、そのような場合通常
治療用生理活性物質の遊離アミノ基１個に対し、１〜1,
000倍、好ましくは５〜200倍当量の水親和性高分子置換
シクロトリフォスファゼンが使用される。

一方、治療用生理活性物質が低分子量のペプチドホルモ
ン類やその他の低分子化合物である場合は、水親和性高
分子置換シクロトリフォスファゼン１分子につき複数個
の治療用生理活性物質が結合しうる。従って、そのよう
な場合、通常水親和性高分子置換シクロトリフォスファ
ゼンに対し１〜100倍、好ましくは１〜50倍当量の治療
用生理活性物質が使用される。

反応は基本的には前期の水親和性高分子置換シクロトリ
フォスファゼン類の製造方法と同様である。治療用生理
活性物質の脂溶性が高い場合は非水溶媒で、又、治療用
生理活性物質の脂溶性が低い場合は含水溶媒で反応され
る。用いられる含水溶媒としては、例えば水,0.1Mホウ
酸緩衝溶液（pH10.0），ジメチルホルムアミド−0.1Mホ
ウ酸緩衝溶液混合溶液が挙げられる。

反応温度は０℃〜還流温度であるが、治療用生理活性物
質がペプチドホルモン類，酵素類，蛋白質類の場合は失
活を防ぐためになるべく低温、望ましくは０〜40℃で行
うのが好ましい。反応時間は反応物質によって異なるが
１〜24時間である。

反応後、ゲル過及び限外過を行い、反応生成物であ
る所望の個数治療用生理活性物質が導入された水親和性
高分子，治療用生理活性物質両置換シクロトリフォスフ
ァゼン類を単離する。

好ましくは、最後にこうして製造された水親和性高分
子，治療用生理活性物質両置換シクトロリフォスファゼ
ン環の未置換ハロゲン原子をアルコキシ基，二級アミノ
基，二級アミノ基，アルキル基等で置換する。

アルコキシ基で置換する場合は、該両置換シクロトリフ
ォスファゼン類とナトリウムアルコキシド、例えばナト
リウムメチラートとを有機溶媒中で反応させる。又、二
級アミノ基で置換する場合は該両置換シクロトリフォス
ファゼンと一級アミン、例えばメチルアミン，エチルア
ミン，グリシンエチルエステル等とを有機溶媒中でトリ
エチルアミンの存在下反応させる。又、三級アミノ基で
置換する場合は該両置換シクロトリフォスファゼンと二
級アミン、例えばジメチルアミン等とを有機溶媒中でト
リエチルアミンの存在下反応させる。又、アルキル基で
置換する場合はグリニヤール試薬で反応させる。

反応後ゲル過及び限外過を行い、本発明の治療用生
理活性物質のシクロトリフォスファゼン誘導体を得る。

上述の方法は、シクロトリフォスファゼン環に対し、最
初に水親和性高分子を、次に治療用生理活性物質を、最
後にアルコキシ基等のその他を導入する方法であるが、
治療用生理活性物質とアルコキシ基等のその他との順序
をかえて導入する方法であってもよい。

本発明の化合物は通常公知の担体，希釈剤を用い適宜医
薬組成物として経口的又は非経口的に哺乳動物（サル，
イヌ，ブタ，ウサギ，マウス，ヒト等）に投与すること
ができる。

経口的に投与する場合には錠剤，顆粒剤，硬カプセル
剤，軟カプセル剤，液剤，散剤等の通常の剤型に製剤化
される。その場合、賦形剤，結合剤，崩壊剤，滑沢剤等
の添加剤とともに製剤化される。

非経口的に投与する倍には、注射剤，外用剤（軟膏剤，
クリーム剤，テープ剤，坐剤，経鼻剤，口腔用剤）等の
通常の剤型に製剤化される。その場合、賦形剤，溶剤，
分散剤，滑沢剤等の添加物とともに製剤化される。

〈発明の効果〉 本発明により、第一に治療用生理活性物質の生体への吸
収率が増加した、第二に生体内半減期が延長された、第
三に抗原性等の副作用が軽減された、第四に疾病部位に
貯留性が増強された、第五に安全性の高い、第六に活性
が保持された等の優れた特徴を有する治療用生理活性物
質，水親和性高分子シクロトリフォスファゼン誘導体が
提供される。

上述のような特徴は、治療用生理活性物質の有効性，安
全性を向上させることになり、かような治療用生理活性
物質のシクロトリフォスファゼン誘導体を提供すること
は医療上極めて意義が大きい。

本発明の特徴について具体的に説明する。

第一に、本発明の化合物の安全性についてであるが、本
発明の化合物を構成する部分の内、水親和性高分子，治
療用生理活性物質が安全であることはいうまでもない。
又、その他のシクロトリフォスファゼンを置換する残基
は、通常のアルコキシ基，アミノ基，アミノ基，イミノ
基，アルキル基から選ばれており、特にアミノ酸残基を
用いれば安全であることはいうまでもない。従って安全
性が問題となるのはシクロトリフォスファゼン環そのも
のである。しかし、これについては、H.R.Allcockらの
文献（Inorg.Chem.1982,21,515-521）により、水性溶媒
中でアンモニアとリン酸に分解されることが示されてい
る。従って、本発明の化合物も生体内で代謝を受けてい
く過程で最後にはシクロトリフォスファゼン環が加水分
解されてアンモニアとリン酸に分解されるのは明らかで
ある。そして、アンモニアとリン酸が通常の濃度で安全
であることはいうまでもない。従来の塩化シアヌルを用
いた水親和性高分子の各種治療用生理活性物質誘導体に
おいては塩化シアヌルの代謝過程が全く不明であるのに
対し、本化合物の安全性がこのように優れていることは
容易に理解できよう。

第二に、本発明の治療用生理活性物質誘導体の生理活性
が従来の塩化シアヌルを用いた治療用生理活性物質誘導
体の生理活性より高い点については、以下に述べる実施
例に明らかなように、本発明によるSOD誘導体のSOD活性
を従来法と比較した結果、従来法よりも高い活性を保持
していたことから理解できよう。

第三に、実施例に詳細に述べられているように、本発明
の生体内での動態の制御については、マイトマイシンＣ
の場合について調べた。すなわち、シクロトリフォスフ
ァゼンの６置換基をモノメトキシポリエチレングリコー
ル1,グリシンエイチルエステル3,マイトマイシンC1で置
換し、残りの１個をアルキル基の長さが異なるアルコキ
シ基で置換したシクロトリフォスファゼン誘導体を製造
し、水中でそれから遊離されるマイトマイシンＣの遊離
速度を測定した。その結果アルキル基の長さが長い程マ
イトマイシンＣの遊離速度は小さいことが明らかとなっ
た。この結果は本発明の化合物を生体内に投与した時の
治療用生理活性物質の放出速度を自由に制御できうるこ
とを示している。

〈実施例〉 以下に本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本
発明はこれらに限定されるものではない。

実施例１ モノメトキシポリエチレングリコール（PEG），グリシ
ンエチルエステル化シクロトリフォスファゼン−SODの
製造 （ｉ） モノメトキシPEGのナトリウムアルコラートの
製造 モノメトキシPEG（平均分子量5,000）50gをテトラハイ
ドロフラン（THF）300ml中に溶解し、水素化ナトリウム
0.24gを加えて還流する。水素の発生が止むまで反応を
続けた。

（ii） モノメトキシPEG−シクロトリフォスファゼン
の製造 続いて、上記の反応液に、ヘキサクロロシクロトリフォ
スファゼン3.5gをTHF100ml中に溶解した溶液を加え室温
で２時間反応した。反応終了後生成したNaClを過して
取り除いた。

（iii） モノメトキシPEG,グリシンエチルエステル−
シクロトリフォスファゼンの製造 続いて上記の液を５℃に冷却し、そこへグリシンエチ
ルエステル（NH₂-CH₂-COOC₂H₅）6.18gをTHF100mlに溶解
した溶液を加え、更にトリエチルアミン6.00gを添加し
て３時間反応させた。反応後生成した沈澱物（トリエチ
ルアミン塩酸塩）を過して除き、液を濃縮し、残渣
をクロロホルム−ヘキサン（1:1）溶液200mlに溶解し
た。この溶液をセファデックスLH-20（ファルマシア社
製）のカラム（５×73cm）のゲル過によって精製して
主成分を分離し溶媒を留去して乾固物約35gを得た。本
生成物中のClを定量したところシクロトリフォスファゼ
ン環１つに対し１原子の割合であった。

（iv） モノメトキシPEG,グリシンエチルエステル−シ
クロトリフォスファゼンのSOD誘導体の製造 上記で得られた乾固物1.5g,及びSOD（日本ケミカルリサ
ーチ（株）製）15mgを0.1Mホウ酸緩衝液,pH9.0の5.0ml
中で、４℃,2時間反応させた後0.1Mリン酸緩衝液,pH7.0
を30ml加え反応を停止させ、限外過（アミコン社製，
膜YM-10）で未反応のPEG化シクロトリフォスファゼン類
を除去し、濃縮液2.0mlをセファクリルＳ−100（ファル
マシア社製）のカラム（５×73cm）のゲル過によって
精製し、モノメトキシPEG,グリシンエチルエステル化−
シクロトリフォスファゼン−SODとして約15mgを得た。
得られた生成物は元素分析,nmrスペクトル,massスペク
トルの測定により、シクロトリフォスファゼン環の６ケ
所の置換基の内１つがモノメトキシPEG,1つがSOD,残り
の４つがグリシンエチルエステルであることが確かめら
れた。得られたモノメトキシPEG−シクロトリフォスフ
ァゼン−SODはSODの７−12残基のアミノ基が修飾されて
おり、SOD活性はもとの約70％程度になった（詳細は下
記の検討を参照）。

得られたSOD誘導体について次の実験を行った。

SOD活性の測定 得られた本化合物のSOD活性をチトクロームＣの還元を
利用する方法（生化学工業（株）Enzyme Data Seet Lib
rary No.68に記載の方法）で測定し未修飾のSODの活性
と比較した。

同時に対照例として塩化シアヌルを用いたSODのPEG誘導
体のSOD活性を比較した。塩化シアヌルを用いたSODのPE
G誘導体は下記の方法で製造した。

モノメトキシPEG（平均分子量5,000）40gと塩化シアヌ
ル0.73gをベンゼン150ml中でモレキュラーシーブ3A 7g
と炭酸ナトリウム15gの存在下80℃で20時間反応させ
た。反応終了後沈澱物を過して除き、次いで石油エー
テルを加えてモノメトキシPEG化塩化シアヌルを沈澱さ
せた。これを石油エーテルでよく洗浄後乾燥して生成物
10gを得た。

得られた生成物1.5g,及びSOD（日本ケミカルリサーチ
（株）製）15mgを0.1Mホウ酸緩衝液pH9.0の5.0ml中で４
℃２時間反応させた後、0.1Mリン酸緩衝液pH7.0を30ml
加え反応を停止させ、限外過（アミコン社製，膜7M-1
0）で未反応のモノメトキシPEG−塩化シアヌルを除去
し、濃縮液2.0mlをセファクリルＳ−100（ファルマシア
社製）のカラム（５×73cm）のゲル過によって精製
し、凍結乾燥してモノメトキシPEG−塩化シアヌル−SOD
として約15mgを得た。得られた化合物はSODの７−に残
基のアミノ基が修飾された。

上記で得られた実施例１と対象令について、SOD活性の
相対比較結果を第１表に示した。

第１表より本発明のSOD誘導体の方が従来の塩化シアヌ
ルを用いた誘導体よりもSOD活性が高いことがわかる。

血中半減期の測定 本発明の化合物と未修飾のSODの血中半減期をラット
（各３匹）に静注し、経時的に尾静脈より採血して血漿
中のSOD活性を上記の方法により測定することにより比
較した。

得られた結果を第２表に示す。

第２表に示す如く本発明の化合物の血中半減期が著しく
延長していることがわかる。

免疫原性 本発明の化合物（実施例１）と未修飾SODとの各々SODと
して20μｇ量をフロイント完全補助液（Freund′s comp
lete adjuvant）（FCA）で乳濁化したのちA/Jマウスの
腹腔内へ投与（0.2ml）し、その後更に、14日目,28日目
に追加投与を行った。最初の投与日から７日目毎にマウ
ス眼窩静脈から採血し、その血清について、ラットを用
いて、予め希釈しておいた血清を皮内注射（0.1ml）を
しておき、その４時間後にSOD0.5mgとエバンスブル−20
mgの混液2mlを静脈注射し、色素の血管透過性をもって
判定する受身皮膚アナフィラキシー（Passive Anaphyla
xis,PCA）反応による抗体産生の評価を行った。

結果を第３表に示す。表中の数値はPCA反応が陽性であ
った血清の最大希釈倍数で表示した。

第３表の結果より、未修飾SODに対しては抗体産生が認
められたが、本発明の化合物に対しては全く認められな
かった。

十二指腸からの吸収性 本発明の化合物及び未修飾SODを各々SOD活性として100m
g/Kgを20時間絶食したラット（S.D.雄性,6週令）に十二
指腸投与し、投与後の血漿中SOD活性を測定した。

結果を第４表に示す。

第４表の結果は、本発明の化合物によりSODが経口投与
で吸収される可能性を示唆するものである。

実施例２ モノメトキシPEG,グリシンエチルエステル−シクロトリ
フォスファゼン−SODの製造 実施例１と同じ化合物を別法で製造した例を以下に示
す。

（ｉ） モノメトキシPEG−シクロトリフォスファゼン
の製造 モノメトキシPEG（平均分子量5,000）50gとヘキサクロ
ロシクロトリフォスファゼン3.5gをベンゼン200ml中で
モレキュラーシーブ3A 10gと炭酸ナトリウム20gの存在
下80℃で40時間反応させた。反応終了後沈澱物を過し
て除き、次いで石油エーテルを加えてモノメトキシPEG
化シクロトリフォスファゼンを沈澱させた。これを石油
エーテルでよく洗浄後乾燥して生成物52gを得た。本化
合物１分子中、Cl原子が５個ついていることがCl分析よ
り確認された。

（ii） モノメトキシPEG−シクロトリフォスファゼン
−SODの製造 上記で得られた生成物1.5g,及びSOD（日本ケミカルリサ
ーチ（株））15mgを0.1Mホウ酸緩衝液pH9.0の5.0ml中で
37℃,1時間反応させた後0.1Mリン酸緩衝液pH7.0を30ml
加えて反応を停止させ限外過（アミコン社製，膜7M-1
0）で未反応のモノメトキシPEG−シクロトリフォスファ
ゼンを除去し、濃縮液2.0mlをセファクリルＳ−100（フ
ァルマシア社製）のカラム（５×73cm）のゲル過によ
って精製し、凍結乾燥して、モノメトキシPEG−シクロ
トリフォスファゼン−SODとして約15mgを得た。

（iii） モノメトキシPEG,グリシンエチルエステル−
シクロトリフォスファゼン−SODの製造 上記で得たモノメトキシPEG−シクロトリフォスファゼ
ン−SOD15mgを水に溶解し、これにグリシンエチルエス
テル10mgをトリエチルアミン10mgとともに加え、40℃で
２時間反応させた。反応終了後透析して低分子を除き、
凍結乾燥して得た反応生成物をセファクリルＳ−100
（ファルマシア社製）のカラム（５×73cm）のゲル過
によって精製し、凍結乾燥して実施例１の最終生成物と
同一の化合物を約5mg得た。

実施例３ モノメトキシPEG,グリシンエチルエステル化シクロトリ
フォスファゼン−インシュリンの製造 （ｉ） 実施例１の（ｉ）〜（iii）と同様にしてモノ
メトキシPEG,グリシンエチルエステル化シクロトリフォ
スファゼンを得た。

（ii） モノメトキシPEG,グリシンエチルエステル化シ
クロトリフォスファゼンのインシュリン誘導体の製造 上記で得られた乾固物1.5g,及びブタインシュリン150mg
を0.1Mホウ酸緩衝液,pH9.0の5.0ml中で、４℃,2時間反
応させた後0.1Mリン酸緩衝液pH7.0を30ml加え反応を停
止させ、限外過（アミコン社製，膜YM-10）で未反応
のPEG化シクロトリフォスファゼン類を除去し、濃縮液
2.0mlをバイオゲルＰ−30のカラム（５×73cm）のゲル
過によって精製し、主溶出部分を凍結乾燥したモノメ
トキシPEG,グリシンエチルエステル化シクロトリフォス
ファゼン−インシュリンとして約130mgを得た。

実施例４ 実施例３と同様の方法で、モノメトキシPEGの平均分子
量が350,750,1,900のものについても各々モノメトキシP
EG,グリシンエチルエステル化シクロトリフォスファゼ
ン−インシュリンを製造した（実施例４−（ａ）〜
（ｃ））。実施例３の化合物及びこれらのインシュリン
誘導体のグルコース低下作用を文献（Z.Anal.Chemie.25
2,224（1970））の方法で測定した。

その結果を第５表に示す。

実施例５ モノメトキシPEG,グリシンエチルエステル−シクロトリ
フォスファゼン−アルパラギナーゼの製造 （ｉ） モノメトキシPEG−シクロトリフォスファゼン
の製造 実施例２と同様にしてモノメトキシPEG−シクロトリフ
ォスファゼンを得た。

（ii） モノメトキシPEG−シクロトリフォスファゼン
−アルパラギナーゼの製造 上記で得られた生成物1.5g,及びアスパラギナーゼ（E.C
ol由来，協和醗酵）150mgを0.1Mホウ酸緩衝液pH9.0の5.
0ml中で37℃,1時間反応させた後、0.1Mリン酸緩衝液pH
7.0を30ml加えて反応を停止させ限外過（アミコン社
製，膜7M-10）で未反応のモノメトキシPEG−シクロトリ
フォスファゼンを除去し、濃縮液2.0mlをセファクリル
Ｓ−100（ファルマシア社製）のカラム（５×73cm）の
ゲル過によって精製し、凍結乾燥してモノメトキシPE
G−シクロトリフォスファゼン−アルパラギナーゼとし
て約300mgを得た。これらの化合物中、Cl原子は４個で
あることが確認された。

（iii） モノメトキシPEG,メチルアミン−シクロトリ
フォスファゼン−アルパラギナーゼの製造 上記で得たモノメトキシPEG−シクロトリフォスファゼ
ン−アスパラギナーゼ100mgを水に溶解し４℃に保った
後、そこへメチルアミンをガス状で吹き込んだ。30分後
吹込をやめ、減圧してメチルアミンを除去した後透析し
て低分子を除き、凍結乾燥して得た反応生成物をセファ
クリルＳ−100（ファルファシア社製）のカラム（５×7
3cm）のゲル過によって精製し、凍結乾燥してモノメ
トキシPEG−メチルアミン−シクロトリフォスファゼン
−アルパラギナーゼを約70mg得た。得られた生成物中に
はCl原子がないことが確認された。

実施例６ モノメトキシPEG,グリシンエチルエステル化シクロトリ
フォスファゼン−ヘモグロビンの製造 （ｉ） 実施例１の（ｉ）〜（iii）と同様にしてモノ
メトキシPEG,グリシンエチルエステル化シクロトリフォ
スファゼンを製造した。

（ii） モノメトキシPEG,グリシンエチルエステル化シ
クロトリフォスファゼンのヘモグロビン誘導体の製造 上記で得られた乾固物1.8g及びヘモグロビン0.5mgを0.1
Mホウ酸緩衝液,pH9.0の150ml中で氷冷下,2時間反応させ
た後0.1Mリン酸緩衝液,pH7.0を30ml加え反応を停止さ
せ、限外過（分子量10万阻止メンブラン）で未反応の
原料等を除去し、凍結乾燥してモノメトキシPEG,グリシ
ンエチルエステル化シクロトリフォスファゼン−ヘモグ
ロビンとして約2gを得た。

実施例７ モノメトキシPEG,グリシンエチルエステル−シクロトリ
フォスファゼン−マイトマイシンＣの製造 （ｉ） モノメトキシPEG−シクロトリフォスファゼン
の製造 実施例２と同様にしてモノメトキシPEG−シクロトリフ
ォスファゼンを得た。

（ii） モノメトキシPEG−シクロトリフォスファゼン
−マイトマイシンＣの製造 上記で得られた生成物1.5g及びマイトマイシンC200mgを
アセトンに溶解し、炭酸カリウム100mgを添加し５時間
還流した。沈澱物を過後アセトンを留去し、残渣をセ
ファデックスLH-20ゲル過で精製し、モノメトキシPEG
−シクロトリフォスファゼン−マイトマイシンＣを1.0g
得た。

（iii） モノメトキシPEG,グリシンエチルエステル−
シクロトリフォスファゼン−マイトマイシンＣの製造 上記で得たモノメトキシPEG−シクロトリフォスファゼ
ン−マイトマイシンC500mgをTHFに溶解し、これにグリ
シンエチルエステル100mgをトリエチルアミン100mgとと
もに加え４℃で２時間反応させた。反応終了後、沈澱物
を過して除き、THFを留去して得た反応生成物をセフ
ァデックスLH-20（ファルマシア社製）のカラム（５×7
3cm）のゲル過によって精製し、モノメトキシPEG,グ
リシンエチルエステル−シクロトリフォスファゼン−マ
イトマイシンＣを320mg得た。本生成物中にCl原子は検
出されなかった。又、nmrよりグリシンエチルエステル
が４個シクロトリフォスファゼン環についていることが
確認された。

実施例８ モノメトキシPEG,グリシンエチルエステルアルコキシ−
シクロトリフォスファゼン−マイトマイシンＣの製造 実施例７と同様の方法を用い、（iii）の工程でグリシ
ンエチルエステルをシクロトリフォスファゼンの４倍当
量仕込むかわりに３倍当量として反応させて、ヘキサク
ロロシクロトリフォスファゼンのCl原子１個分が残った
化合物を製造した。これを原料としてTHF中で、CH₃ONa,
C₆H₁₃ONa,C₁₂H₂₅ONa,C₁₈H₃₇ONaとを各々室温で10時間反
応させ、残ったCl原子が各々-OCH₃,-OC₆H₁₃,-OC₁₂H₂₅,-
OC₁₈H₃₇に置換された化合物を製造した。これらの化合
物をマイトマイシンＣに換算して同じ量となるように水
中に溶解し、37℃で攪拌した時のマイトマイシンＣの放
出率を第６表に示す。

これらの結果からシクロトリフォスファゼン環に結合し
たマイトマイシンＣの遊離は、同じ環に置換された基の
性質をかえると自由に制御できることがわかる。

実施例９ モノメトキシPEG,グリシンエチルエステル−シクロトリ
フォスファゼン−ドキソルビシンの製造 実施例７のマイトマイシンＣのかわりにドキソルビシン
200mgを用いて同様の反応を行い、、モノメトキシPEG,
グリシンエチルエステル−シクロトリフォスファゼン−
ドキソルビシンを290mg得た。

反応生成物のnmrスペクトルによりドキソルビシンのア
ミノ基がシクロトリフォスファゼン環と結合しているこ
とが確認された。

実施例10 モノメトキシPEG,メトキシ−シクロトリフォスファゼン
−タウノマイシンの製造 （ｉ） モノメトキシPEG−シクロトリフォスファゼン
の製造 実施例２と同様にしてモノメトキシPEG−シクロトリフ
ォスファゼンを得た。

（ii） モノメトキシPEG−シクロトリフォスファゼン
−ダウノマイシンの製造 上記で得られた生成物1.5g,及びダウノマイシン200mgを
アセトンに加え、炭酸カリウム100mgを添加し５時間還
流した。沈澱物を過で除いた後、アセトンを留去し、
残渣をセファデックスLH−20ゲル過で精製し、モノメ
トキシPEG−シクロトリフォスファゼン−ダウノマイシ
ンを1.3g得た。

（iii） モノメトキシPEG,メトキシ−シクロトリフォ
スファゼン−ダウノマイシンの製造 上記で得たモノメトキシPEG−シクロトリフォスファゼ
ン−ダウノマイシン500mgをメタノールに溶解し、そこ
へナトリウムメチラート200mgを加え、４℃で２時間反
応させた。反応終了後沈澱物を過して除き、メタノー
ルを留去して得た反応生成物をセファデックスLH−20
（ファルマシア社製）のカラム（５×73cm）のゲル過
によって精製し、モノメトキシPEG,メトキシ−シクロト
リフォスファゼン−ダウノマイシン330mg得た。本生成
物中にCl原子は検出されなかった。又、nmrよりメトキ
シ基が４個シクロトリフォスファゼン環についているこ
とが確認された。

実施例11 モノメトキシPEG,グリシンエチルエステル化シクロトリ
フォスファゼン−エストラジオール３−メチルエーテル
の製造 （ｉ） 実施例１の（ｉ）〜（ii）と同様にしてモノメ
トキシPEG−シクロトリフォスファゼンを得た。

（ii） モノメトキシPEG−シクロトリフォスファゼン
−エストラジオール３−メチルエーテルの製造 エストラジオール３−メチルエーテル2.86gをTHF100ml
中に溶解し、水素化ナトリウム0.24gを加えて５時間還
流した。反応後、反応液を室温に冷却し、次いで（ｉ）
で得た液を加え室温で５時間反応した。反応終了後生
成したNaClを過して取り除いた。THFを留去してモノ
メトキシPEG−シクロトリフォスファゼン−エストラジ
オール３−メチルエーテル52gを得た。

（iii） モノメトキシPEG,グリシンエチルエステル−
シクロトリフォスファゼン−エストラジオール３−メチ
ルエーテルの製造 （ii）で得たモノメトキシPEG−シクロトリフォスファ
ゼン−エストラジオール３−メチルエーテル10gをTHF30
ml中に溶解し、そこへグリシンエチルエステル1gをTHF5
0mlに溶解した溶液を加え、更にトリエチルアミン1gを
添加して５時間反応した。反応後生成した沈澱物（トリ
エチルアミン塩酸塩）を過して除き、液を濃縮し、
残渣をクロロホルム−ヘキサン（1:1）溶液20mlに溶解
した。この溶液をセファデックスLH−20（ファルマシア
社製）のカラム（５×73cm）のゲル過によって精製
し、溶媒を留去してモノメトキシPEG,グリシンエチルエ
ステル−シクロトリフォスファゼン−エストラジオール
３−メチルエーテル15gを得た。

実施例12 デキストラン，グリシンエチルエステル−シクロトリフ
ォスファゼン−SODの製造 （ｉ） デキストラン−シクロトリフォスファゼン−SO
Dの製造 デキストラン（平均分子量40,000）10gをH₂O 100mlに溶
解した液にヘキサクロロシクロトリフォスファゼン3.5g
を水10mlとアセトン40mlの混合溶媒に溶解した溶液を滴
下した。この間2Nカセイソーダ水溶液によりpHを10-11
に保った。滴下終了後2N塩酸によりpHを３にした。生成
したデキストラン化シクロトリフォスファゼンはアセト
ンを加えることにより沈澱させ精製した。

（ii） デキストラン−シクロトリフォスファゼン−SO
Dの製造 上記で得られた生成物5.0g,及びSOD（日本ケミカルリサ
ーチ（株））15mgを0.1Mホウ酸緩衝液pH9.0の5.0ml中で
37℃,1時間反応させた後、0.1Mリン酸緩衝液pH7.0を30m
l加えて反応を停止させ、限外過（アミコン社製，膜7
M-10）で未反応のデキストラン−シクロトリフォスファ
ゼンを除去し、濃縮液2.0mlをセファクリルＳ−100（フ
ァルマシア社製）のカラム（５×73cm）のゲル過によ
って精製し、凍結乾燥して、デキストラン−シクロトリ
フォスファゼン−SODとして約100mgを得た。

（iii） デキストラン，グリシンエチルエステル−シ
クロトリフォスファゼン−SODの製造 上記で得たデキストラン−シクロトリフォスファゼン−
SOD80mgを水に溶解し、これにグリシンエチルエステル1
0mgをトリエチルアミン10mgとともに加え、４℃で２時
間反応させた。反応終了後透析して低分子を除き、凍結
乾燥して得た反応生成物をセファクリルＳ−100（ファ
ルマシア社製）のカラム（５×73cm）のゲル過によっ
て精製し、凍結乾燥してデキストラン，グリシンエチル
エステル−シクロトリフォスファゼン−SODを60mg得
た。得られたSOD誘導体はSODの７−12残基のアミノ基が
修飾されており、SOD活性はもとの約60％程度であっ
た。

実施例13 デキストラン，グリシンエチルエステル−シクロトリフ
ォスファゼン−インシュリンの製造 （ｉ） デキストラン−シクロトリフォスファゼンの製
造 実施例12と同様にしてデキストラン−シクロトリフォス
ファゼンを得た。

（ii） デキストラン−シクロトリフォスファゼン−イ
ンシュリンの製造 上記で得られた生成物4.0g,及びブタインシュイン150mg
を0.1Mホウ酸緩衝液pH9.0の5.0ml中で37℃,1時間反応さ
せた後、0.1Mリン酸緩衝液pH7.0を30ml加えて反応を停
止させ、限外過（アミコン社製，膜7M-10）で未反応
のデキストラン−シクロトリフォスファゼンを除去し、
濃縮液2.0mlをバイオゲルＰ−30のカラム（５×73cm）
のゲル過によって精製し、凍結乾燥してデキストラン
−シクロトリフォスファゼン−インシュリンとして約15
0mgを得た。

（iii） デキストラン，グリシンエチルエステル−シ
クロトリフォスファゼン−インシュリンの製造 上記で得たデキストラン−シクロトリフォスファゼン−
インシュリン50mgを水に溶解し、そこへグリシンエチル
エステル10mgをトリエチルアミン10mgとともに、４℃で
２時間反応させた。反応終了後透析して低分子を除き、
凍結乾燥して得た反応生成物をバイオゲルＰ−30のカラ
ム（５×73cm）のゲル過によって精製し、凍結乾燥し
てデキストラン，グリシンエチルエステル−シクロトリ
フォスファゼン−インシュリンを33mg得た。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 38/43 47/30 Ｊ Ｃ０７Ｋ 1/113 8318−4Ｈ Ａ６１Ｋ 37/48

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】下記式［Ｉ］ で表わされるシクロトリフォスファゼン誘導体。
2. 【請求項２】モノメトキシポリエチレングリコールの分
   子量が300〜30,000である特許請求の範囲第１項記載の
   シクロトリフォスファゼン誘導体。
3. 【請求項３】デキストランの分子量が1,000〜3,000,000
   である特許請求の範囲第１項記載のシクロトリフォスフ
   ァゼン誘導体。
4. 【請求項４】ペプチドホルモン類がインシュリン，カル
   シトニン，又はナトリウム利尿ペプチドである特許請求
   の範囲第１項記載のシクロトリフォスファゼン誘導体。
5. 【請求項５】酵素類がスーパーオキシドディスムター
   ゼ，アスパラギナーゼ，又はビリルビンオキシダーゼで
   ある特許請求の範囲第１項記載のシクロトリフォスファ
   ゼン誘導体。
6. 【請求項６】蛋白質類がヘモグロビン,TPA又はインター
   フェロンである特許請求の範囲第１項記載のシクロトリ
   フォスファゼン誘導体。
7. 【請求項７】制癌剤がマイトマイシンC,ダウノルビシ
   ン，又はドキソルビシンである特許請求の範囲第１項記
   載のシクロトリフォスファゼン誘導体。
8. 【請求項８】ステロイド類がエストラジオール−３−メ
   チルエーテル，テストステロン又はトリアムシノロンア
   セトニドである特許請求の範囲第１項記載のシクロトリ
   フォスファゼン誘導体。
9. 【請求項９】R₁〜R₆のうち水親和性高分子又はその誘導
   体と治療用生理活性物質又はその誘導体の合計が５以下
   の場合には、残りのシクロトリフォスファゼンの置換基
   がグリシンエチルエステル残基である特許請求の範囲第
   １項〜第８項のいずれか１項に記載のシクロトリフォス
   ファゼン誘導体。
10. 【請求項１０】（ａ） 有効量の下記式［Ｉ］ で表わされるシクロトリフォスファゼン誘導体と （ｂ） 薬学的に許容される担体 とからなる医薬品組成物。