JPH0752177B2 - Ethanol sensor - Google Patents
Ethanol sensorInfo
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- JPH0752177B2 JPH0752177B2 JP2181583A JP18158390A JPH0752177B2 JP H0752177 B2 JPH0752177 B2 JP H0752177B2 JP 2181583 A JP2181583 A JP 2181583A JP 18158390 A JP18158390 A JP 18158390A JP H0752177 B2 JPH0752177 B2 JP H0752177B2
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- ethanol
- electron acceptor
- enzyme
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
本発明は、液体試料中のエタノール濃度を測定するエタ
ノールセンサーに関する。The present invention relates to an ethanol sensor that measures the concentration of ethanol in a liquid sample.
溶液中のエタノールを測定するセンサーとしては、ガス
透過性チューブにキャリャーガスを流し、チューブ内に
透過したエタノールをガスクロマトグラフ、赤外線ガス
検出器などで検知する装置が知られている。このものは
オンライン計測が可能であるが、装置が大型で複雑であ
るためエタノール測定を簡便に行えないという欠点を有
していた。 これに対して、小型のアルコールセンサーとしては、ア
ルコールに作用する種々の酵素を利用したものが開発さ
れている。これらは、構成が簡単であり比較的容易に作
成できることから実用に供されている。 これらのうち、アルコールオキシダーゼを使用したもの
は、この酵素の基質特異性が低く、メタノールにもエタ
ノールと同様に反応するという欠点を有している。 また、ニコチンアミドアデニンヌクレオチド（NAD）依
存のアルコール脱水素酵素を用いるセンサーは、メタノ
ールに反応しないという点で特異性には優れているが、
高価なNADを使用しなければならず、またNADHからNADへ
の再生も困難であるため実用的でなかった。 これらの欠点を克服するために、酢酸菌に存在する細胞
膜結合性アルコール脱水素酵素（ADH）を利用したセン
サーが開発されている。この酵素は補酵素ピロロキノリ
ンキノン（PQQ）関与で、エタノールに選択的に反応す
る。PQQはADHと強く結合しているため特別に固定化する
必要がなく、NADを使用する必要もないという優れた特
徴を有している。 従来、酢酸菌に存在する膜結合型ADHを利用したセンサ
ーに関する公開特許としては、特開昭61−265560号、
特開昭61−281961号、特開昭62−277548号、特開
平１−96552号、特開平１−97851号がある。 これらのうち、、は測定系に電子受容体を使用し
ていない、従って、エタノールが酵素により酸化される
と同時に還元型へ変化したPQQを酸化型へ戻す系が弱い
ため応答に時間がかかる。 、は測定液中に酸化型の電子受容体を溶解してい
る。従って、測定時には電子受容体が酵素反応と共役
し、PQQを酸化型へ復帰させ、自身は還元される。さら
に、これを電極で酸化する方法をとっているので短時間
で測定が可能である。As a sensor for measuring ethanol in a solution, a device is known in which a carrier gas is passed through a gas permeable tube and the ethanol permeated in the tube is detected by a gas chromatograph, an infrared gas detector or the like. Although this device can be used for online measurement, it has the drawback that ethanol measurement cannot be performed easily because the device is large and complicated. On the other hand, small-sized alcohol sensors that use various enzymes that act on alcohol have been developed. These are put to practical use because they have a simple structure and can be produced relatively easily. Among these, the one using alcohol oxidase has a drawback that the enzyme has a low substrate specificity and reacts with methanol similarly to ethanol. In addition, a sensor that uses a nicotinamide adenine nucleotide (NAD) -dependent alcohol dehydrogenase has excellent specificity in that it does not react with methanol,
It is not practical because expensive NAD must be used and regeneration from NADH to NAD is difficult. To overcome these drawbacks, a sensor utilizing cell membrane-bound alcohol dehydrogenase (ADH) present in acetic acid bacteria has been developed. This enzyme participates in the coenzyme pyrroloquinoline quinone (PQQ) and selectively reacts with ethanol. Since PQQ is strongly bound to ADH, it does not require special immobilization and does not need to use NAD. Conventionally, as a published patent relating to a sensor using a membrane-bound ADH present in acetic acid bacteria, JP-A-61-265560,
There are JP-A-61-281961, JP-A-62-277548, JP-A-1-96552, and JP-A-1-97851. Of these, since no electron acceptor is used in the measurement system, therefore, it takes a long time to respond because ethanol is oxidized by an enzyme and at the same time, the system that returns PQQ converted to the reduced form to the oxidized form is weak. , Dissolves an oxidized electron acceptor in the measurement solution. Therefore, at the time of measurement, the electron acceptor is coupled with the enzymatic reaction to restore PQQ to the oxidized form, and is itself reduced. Furthermore, since the method of oxidizing this with an electrode is adopted, measurement can be performed in a short time.
上記、においては、電子受容体としてフェリシアン
化カリウムやフェナジンメトサルフェート（PMS）等を
測定液もしくは電解液に溶解して使用している。この測
定液は、センサーを長時間使用した場合にはかなりの量
に達する。特に、フローセル方式の測定法では液量が多
くなる。その場合、電子受容体を測定液や電解液に溶解
して利用することは作業性が悪く、フェリシアン化カリ
ウムを使用する場合は特にシアンイオンの廃液処理の問
題が生じる。また、PMSを使用する場合は、特にランニ
ングコストが高くなる。 また、測定時間としては、は数分、は１〜２分を必
要としており、多くの試料を測定する場合にはさらに短
時間で測定可能であることが望ましい。In the above, potassium ferricyanide, phenazine methosulfate (PMS) or the like is used as an electron acceptor after being dissolved in a measurement solution or an electrolytic solution. This measurement liquid reaches a considerable amount when the sensor is used for a long time. In particular, the amount of liquid increases in the flow cell method. In this case, it is difficult to use the electron acceptor after dissolving it in the measuring solution or the electrolytic solution, and particularly when potassium ferricyanide is used, a problem of waste liquid treatment of cyan ions occurs. In addition, when using PMS, running costs are particularly high. Further, the measurement time requires several minutes and 1-2 minutes, and it is desirable that the measurement can be performed in a shorter time when many samples are measured.
本発明者らは上記の点に鑑みて鋭意研究の結果、電子受
容体を電解液中から排除し、また、短時間で測定が可能
なエタノールセンサーを開発した。 すなわち本発明は、水溶性フェリシアン酸塩と陽イオン
界面活性剤、両性界面活性剤又は非イオン界面活性剤か
ら合成される疎水性化合物を電子受容体として、酢酸菌
膜結合性アルコール脱水素酵素とともに電極剤として混
在せしめた酵素及び電極受容体修飾電極と参照電極とを
組み合わせてなるエタノールセンサーである。 上記に本発明において、水溶性フェリシアン酸塩として
は、フェリシアン化カリウム、フェリシアン化ナトリウ
ム、その他水溶性のフェリシアン化物が挙げられる。 また、陽イオン界面活性剤としては長鎖第４級アンモニ
ウム塩、長鎖アルキルビリジニウム塩等が、両性界面活
性剤としては例えばアルキルジアミノエチルグリシン形
のものが、そして非イオン界面活性剤としては例えばポ
リオキシエチレン系のもの等が挙げられる。 水溶性フェリシアン酸塩、例えばフェリシアン化カリウ
ムとこれらの界面活性剤とは、水溶液中で反応を起こし
黄色沈でんを生じる。この沈澱物質は本発明における電
子受容体として用いられる。以下に反応式の一例を示
す。 ３［C16H33N（CH3）３］Br＋K3Fe（CN）６ →［C16H33（CH3）３］３［Fe（CN）６］３＋3KBr 得られた化合物は疎水性であるので、濾過、水洗して簡
単に精製することができる。 過去にこのような化合物を電子受容体としてセンサーに
利用した例はない。 また、本発明において使用する細胞膜結合型ADHを産生
する酢酸菌としては、アセトバクター属（Acetobacte
r）グルコノバクター属（Gluconobacter）に属するいず
れの酢酸菌の菌体でもよい。 酵素はフレンチプレス法や超音波法等の常法により細胞
膜画分を分離し、さらに界面活性剤で細胞膜画分から抽
出し、種々のクロマトグラフィーにより精製単離して得
ることができる。また、精製単離を行わなくとも酢酸菌
の菌体そのままあるいは細胞膜画分といった粗標品でも
酵素源として利用できる。 なお、本発明の場合も常法と同様に、電極剤にはグラフ
ァイト等の導電性材料粉末を混合して、エタノールセン
サー表面から得られる電流を容易に電極棒へ導くように
することが好ましい。 さらに、本発明のエタノールセンサーの電極剤には、有
機結合剤、例えば流動パラフィンを混合することが好ま
しい。その理由は、酵素と電子受容体が、測定時にエタ
ノール含有試料液と接触して、流出、崩壊するのを防止
するため、また電極表面への接着による上記電極剤修飾
を確実化するためである。 修飾電極を製作するには、まず上記のようにして得られ
たADH含有物と電子受容体とを導電性材料粉末（例えば
グラファイト粉末）と有機結合剤（例えば流動パラフィ
ン）とよく混合してペースト状に練り上げる。次に、第
１図に示すごとく、該ペーストをグラファイト固結物13
の端面に塗布し、硬化させて電極剤10とすることによ
り、膜結合性ADHと電子受容体とを電極剤に含む酵素及
び電子受容体修飾電極１が製作できる。 修飾電極１の構成は、フランジ付きテフロン製筒体15と
それに頭部が突出して螺入されている銅製ネジ付きボル
ト12とその前方部に着設されたグラファイト固結物13
と、更にその前方端面に接合された前記電極剤10とから
なる。なお、銅製ネジ付きボルト12の中腹には取付用ナ
ット14が螺合されている。 次に、第２図に示すごとく、上記修飾電極１を反応セル
３に取り付ける。反応セル３内には、更に参照電極２を
検知部が位置するように取り付け、また、反応セル３の
中央には磁気攪拌子４を回転自由に枢支する。そして、
上部には試料供給口33が、下方左端には電解液導入口31
が、また上方右端には測定排液導出口32が設けられてい
る。 試料中のエタノール濃度を測定するには、第３図に概要
図を例示するエタノール濃度測定装置を使用する。 すなわち、該測定装置の、電解液槽６内の測定用電解液
（例えばpH調整用バッファーと電解質（例えばKCI）を
含む）をポンプ８で反応セル３中に注入し、測定装置の
定電圧電源部より修飾電極１と参照電極２間に加電す
る。その結果、両電極間に発生する酸化電流を電流電圧
変換回路を用いて、電流値を電圧値に変換した後増幅
し、レコーダーでチャートに記録する。なお、増幅され
た電圧値をA/D変換した後、コンピュータで処理するこ
ともできる。図中、７は測定済み廃液槽である。 電圧が安定した後、エタノールを含んだ試料水溶液の一
定量をマイクロシリンジで前記反応セル３中に注入供給
し、上記と同様にして酸化電流を電圧として測定し、電
圧の増加量を求める。 この増加量とエタノール濃度が比例することからエタノ
ール濃度が求められる。測定中において、スターラ５を
起動して、反応セル３中の磁気攪拌子４を回転させてお
けば、試料と電解液との混合が均一に行えるので、バラ
つきのない正確な測定値が得られる。 ところで、電解液は酵素反応を円滑に進めるためにpHを
４から７の間に調製することが望ましく、また例えばKC
I等の強電解質を含んでいる必要がある。さらに、電解
液を反応セルの導入口31に一定流速で注入し、またその
導出口32から排出させながら測定するフローインジェク
ション法によっても測定が可能である。 以上、述べてきたエタノールセンサーによれば、酢酸菌
の細胞膜結合性ADHによるエタノールの酸化反応及びPQ
Q、電子受容体を介して電子伝達系によって生じる酸化
電流を直接アンペロメトリックに測定することができる
ため、応答時間が速く直線性に優れている。 さらに、本発明に係る電子受容体は水溶液中で簡単に合
成、単離することができる。また、この電子受容体及び
酵素はいずれも疎水性であるので、特別な処理を行わな
くとも有機結合剤と混合するだけで電極剤として固定化
され、測定用電解液中に溶出することもないため、酵素
固定膜を有する他のバイオセンサー等に比較して、電極
の作成が容易である。そして、本発明に係る電子受容体
をも修飾しており、新規なものである。 本発明のエタノールセンサーを使用して測定する場合に
は、測定用電解液中にフェリシアン化カリウム等の電子
受容体を溶解する必要がないため、作業性が良くなり、
シアン等の廃水処理をする必要がない。 なお、種々の大きさの反応セルを使用したり、フローイ
ンジェクション方式を採ることにより定量範囲を広くす
ることも可能である。As a result of earnest research in view of the above points, the present inventors have developed an ethanol sensor that eliminates an electron acceptor from an electrolytic solution and can measure in a short time. That is, the present invention provides an acetic acid membrane-bound alcohol dehydrogenase using a hydrophobic compound synthesized from a water-soluble ferricyanate and a cationic surfactant, an amphoteric surfactant or a nonionic surfactant as an electron acceptor. In addition, the ethanol sensor is a combination of a reference electrode and an enzyme / electrode receptor modified electrode mixed as an electrode agent. In the above, in the present invention, examples of the water-soluble ferricyanate include potassium ferricyanide, sodium ferricyanide, and other water-soluble ferricyanides. Further, as the cationic surfactant, a long-chain quaternary ammonium salt, a long-chain alkyl viridinium salt, etc., as the amphoteric surfactant, for example, an alkyldiaminoethylglycine type, and as the nonionic surfactant, Examples thereof include polyoxyethylene type. Water-soluble ferricyanates, such as potassium ferricyanide, and these surfactants react in an aqueous solution to produce yellow precipitates. This precipitated substance is used as an electron acceptor in the present invention. An example of the reaction formula is shown below. 3 [C 16 H 33 N ( CH 3) 3] Br + K 3 Fe (CN) 6 → [C 16 H 33 (CH 3) 3] 3 [Fe (CN) 6] 3 + 3KBr resulting compound with a hydrophobic Therefore, it can be easily purified by filtration and washing with water. In the past, there has been no example of using such a compound as an electron acceptor in a sensor. Further, the acetic acid bacterium producing the cell membrane-bound ADH used in the present invention includes the genus Acetobacte.
r) Any acetic acid bacterium belonging to the genus Gluconobacter may be used. The enzyme can be obtained by separating the cell membrane fraction by a conventional method such as French press method or ultrasonic method, further extracting from the cell membrane fraction with a surfactant, and purifying and isolating by various chromatography. In addition, a crude product such as a cell of acetic acid bacteria or a cell membrane fraction can be used as an enzyme source without purification and isolation. Also in the case of the present invention, it is preferable that a conductive material powder such as graphite is mixed with the electrode material so that an electric current obtained from the surface of the ethanol sensor is easily guided to the electrode rod as in the conventional method. Furthermore, it is preferable to mix an organic binder such as liquid paraffin with the electrode material of the ethanol sensor of the present invention. The reason is to prevent the enzyme and the electron acceptor from coming into contact with the ethanol-containing sample solution at the time of measurement, flowing out and collapsing, and ensuring the above electrode agent modification by adhesion to the electrode surface. . In order to fabricate a modified electrode, first, the ADH-containing material and electron acceptor obtained as described above are thoroughly mixed with a conductive material powder (eg graphite powder) and an organic binder (eg liquid paraffin) and paste. Knead into a shape. Next, as shown in FIG.
The enzyme and electron acceptor-modified electrode 1 containing the membrane-bound ADH and the electron acceptor in the electrode agent can be manufactured by applying it to the end face of and curing it to form the electrode agent 10. The modified electrode 1 is composed of a Teflon cylinder 15 with a flange, a copper threaded bolt 12 having a head projectingly screwed into it, and a graphite solidified material 13 attached to the front thereof.
And the electrode material 10 further bonded to the front end surface thereof. A mounting nut 14 is screwed into the middle of the copper screw bolt 12. Next, as shown in FIG. 2, the modified electrode 1 is attached to the reaction cell 3. In the reaction cell 3, the reference electrode 2 is further attached so that the detection part is located, and the magnetic stirrer 4 is rotatably supported at the center of the reaction cell 3. And
The sample supply port 33 is on the upper part, and the electrolyte inlet port 31 is on the lower left end.
However, a measurement drainage outlet 32 is provided at the upper right end. To measure the ethanol concentration in the sample, an ethanol concentration measuring apparatus whose schematic diagram is illustrated in FIG. 3 is used. That is, a measuring electrolytic solution (for example, containing a pH adjusting buffer and an electrolyte (for example, KCI)) in the electrolytic solution tank 6 of the measuring device is injected into the reaction cell 3 by the pump 8, and a constant voltage power supply of the measuring device is supplied. Part is applied between the modified electrode 1 and the reference electrode 2. As a result, the oxidation current generated between the two electrodes is converted into a voltage value using a current-voltage conversion circuit, amplified, and recorded on a chart by a recorder. The amplified voltage value may be A / D converted and then processed by a computer. In the figure, 7 is a measured waste liquid tank. After the voltage is stabilized, a fixed amount of a sample aqueous solution containing ethanol is injected and supplied into the reaction cell 3 with a microsyringe, and the oxidation current is measured as the voltage in the same manner as above to obtain the increase amount of the voltage. Since the amount of increase and the ethanol concentration are proportional, the ethanol concentration can be obtained. If the stirrer 5 is started during the measurement and the magnetic stirrer 4 in the reaction cell 3 is rotated, the sample and the electrolytic solution can be uniformly mixed, so that an accurate measured value without variation can be obtained. . By the way, it is desirable to adjust the pH of the electrolytic solution to between 4 and 7 in order to promote the enzymatic reaction smoothly.
It must contain a strong electrolyte such as I. Further, the measurement can be performed by a flow injection method in which the electrolytic solution is injected into the inlet 31 of the reaction cell at a constant flow rate and is discharged from the outlet 32. According to the ethanol sensor described above, the oxidation reaction of ethanol and PQ by the cell membrane-bound ADH of acetic acid bacteria
Since the oxidation current generated by the electron transfer system can be directly measured amperometrically via Q and the electron acceptor, the response time is fast and the linearity is excellent. Furthermore, the electron acceptor according to the present invention can be easily synthesized and isolated in an aqueous solution. In addition, since both the electron acceptor and the enzyme are hydrophobic, they are immobilized as an electrode agent by mixing with an organic binder without any special treatment and do not elute in the measuring electrolyte. Therefore, as compared with other biosensors having an enzyme-immobilized membrane and the like, it is easier to create an electrode. The electron acceptor according to the present invention is also modified and is novel. When the measurement is performed using the ethanol sensor of the present invention, it is not necessary to dissolve an electron acceptor such as potassium ferricyanide in the measurement electrolyte, which improves workability,
There is no need to treat wastewater such as cyanide. In addition, it is also possible to widen the quantification range by using reaction cells of various sizes or by adopting a flow injection method.
次に本発明を実施例により具体的に説明する。 （１）細胞膜結合型ADHの調製 培養したGluconobactor soboxydans（IFO12528）の菌体
を遠心分離して集菌し、得られた菌体をフレンチプレス
により破砕した。この破砕物を超遠心分離（100,000×
g,60分）して得られた沈でん（膜画分）をそのまま膜結
合性ADHとして用いた。 （２）電子受容体の合成 陽イオン界面活性剤の１種である臭化ｎ−ヘキサデシル
トリメチルアンモニウムの0.1M水溶液に、0.05Mフェリ
シアン化カリウム水溶液を同量添加する。すると瞬時に
反応が起こり、黄緑色の疎水性化合物が懸濁生成され
た。 この化合物をろ紙でろ過し、充分水洗した後、減圧乾燥
し、電子受容体として使用した。この物質は水に不溶で
あり有機液相にわずかに溶解した。 （３）酵素及び電子受容体修飾電極の製作 上記（１）で得られたADH含有膜画分（Ａ）、上記
（２）で得られた電子受容体（Ｂ）、グラファイト粉末
（Ｃ）及び流動パラフィン（Ｄ）を、A:B:C:D＝10:1:1
2:10の比率（重量比）で混合し、ペースト状に練り上げ
たものを第１図図示のごとく、電極のグラファイト固結
物13の先端部分に少量塗り込んで固結させた後、その表
面を硫酸紙でこすって平滑にし、酵素及び電子受容体保
有する修飾電極１を製作した。 （４）エタノール濃度の測定 （ａ）エタノール濃度検量線図の作成： 上記（３）で製作された修飾電極１を、第３図に図示す
るごとく、反応セル３に取り付け、0.1Mリン酸バッファ
ー（pH6.0）に0.1M塩化カリウム、20mM塩化マグネシウ
ムを含有した電解液をポンプ８で反応セル３中に導入口
31から注入し、スターラー５を起動して磁気攪拌子４を
回転させて撹拌した。 次いで定電圧電源部より修飾電極１と参照電極（塩化銀
電極）２に＋0.6V加電し、両電極1,2間に発生する電流
を電圧電流変換回路により電圧に変換した後、これを増
幅し、レコーダーでチャートに記録した。 電圧が安定したところで電圧値Voを測定し、次に既知の
濃度のエタノール試料水溶液５μｌを反応セル３内にマ
イクロシリンジで注入した。エタノール試料水溶液の添
加とともに直ちに電圧が変化し30〜60秒で出力が安定す
るので、この時の電圧値Ｖｓを測定しＶｏとＶｓとの差
ΔＶを算出した。 さらに、反応セル３にポンプ８で電解液をセル容量の５
倍量程度注入しセル３内を洗浄した後、再びＶｏを測定
した。電解液で洗浄した場合のベースライン復帰も30〜
60秒であった。このようにセルの洗浄、電圧測定、試料
の注入、電圧測定の操作を繰り返し、種々の濃度のエタ
ノールに対する△Ｖを測定し、第４図に示す検量線を作
成した。 （ｂ）試料のエタノール濃度測定： アルコール発酵の発酵液やビールについて、（ａ）と全
く同じ方法で△Ｖを測定し、先に作成した検量線と比較
してエタノール濃度を算出した。 この値は、ガスクロマトグラフで測定した値とよく一致
していた。Next, the present invention will be specifically described with reference to examples. (1) Preparation of cell membrane-bound ADH The cultured cells of Gluconobactor soboxydans (IFO12528) were collected by centrifugation, and the obtained cells were crushed by a French press. This crushed material was ultracentrifuged (100,000 x
The precipitate (membrane fraction) obtained by (g, 60 minutes) was directly used as membrane-bound ADH. (2) Synthesis of electron acceptor To a 0.1 M aqueous solution of n-hexadecyltrimethylammonium bromide, which is one kind of cationic surfactant, is added the same amount of 0.05 M potassium ferricyanide aqueous solution. Then, a reaction occurred instantaneously, and a yellow-green hydrophobic compound was suspended and produced. This compound was filtered with filter paper, washed thoroughly with water, dried under reduced pressure, and used as an electron acceptor. This material was insoluble in water and slightly soluble in the organic liquid phase. (3) Production of enzyme and electron acceptor modified electrode ADH-containing membrane fraction (A) obtained in (1) above, electron acceptor (B) obtained in above (2), graphite powder (C) and Liquid paraffin (D), A: B: C: D = 10: 1: 1
The mixture was mixed at a ratio of 2:10 (weight ratio) and kneaded into a paste, and a small amount was applied to the tip portion of the graphite solidified material 13 of the electrode to solidify, and then the surface of the solidified material. Was rubbed with sulfuric acid paper to make it smooth, and a modified electrode 1 having an enzyme and an electron acceptor was prepared. (4) Measurement of ethanol concentration (a) Preparation of ethanol concentration calibration curve: The modified electrode 1 produced in (3) above was attached to the reaction cell 3 as shown in FIG. An inlet for introducing an electrolytic solution containing 0.1 M potassium chloride and 20 mM magnesium chloride (pH 6.0) into the reaction cell 3 by the pump 8.
It was injected from 31, and the stirrer 5 was activated to rotate the magnetic stirrer 4 to stir it. Next, +0.6 V is applied to the modification electrode 1 and the reference electrode (silver chloride electrode) 2 from the constant voltage power supply unit, and the current generated between both electrodes 1 and 2 is converted into a voltage by the voltage-current conversion circuit. It was amplified and recorded on a chart with a recorder. When the voltage became stable, the voltage value V o was measured, and then 5 μl of an ethanol sample aqueous solution having a known concentration was injected into the reaction cell 3 with a microsyringe. Since immediately output voltage change to 30-60 seconds with addition of ethanol aqueous sample solution is stabilized, it was calculated difference ΔV between V o and V s to measure the voltage value V s of this time. Further, the reaction cell 3 is pumped with an electrolyte solution to a volume of 5
After washing the times about implanted in the cell 3 was measured V o again. Baseline return after washing with electrolyte is 30 ~
It was 60 seconds. In this manner, the cell washing, voltage measurement, sample injection, and voltage measurement operations were repeated to measure ΔV for various concentrations of ethanol, and the calibration curve shown in FIG. 4 was prepared. (B) Measurement of ethanol concentration of sample: ΔV of the fermentation liquid or beer of alcohol fermentation was measured by the same method as in (a), and the ethanol concentration was calculated by comparing with the previously prepared calibration curve. This value was in good agreement with the value measured by gas chromatography.
以上のとおり、本発明のエタノールセンサーによれば、
酢酸菌の細胞膜結合性ADHによるエタノールの酸化反応
及びPQQ、電子受容体を介した電子伝達系によって生じ
る酸化電流を直接アンベロメトリックに測定することが
できるため、反応時間が速く直線性に優れている。 また、本発明に係る電子受容体は水溶液中で簡単に合成
・単離することができ、そしてこの電子受容体及び酵素
はいずれも疎水性であるので、特別な処理を行わなくと
も有機結合剤と混合するだけで電極剤として固定化さ
れ、測定用電解液中に溶出することもない。このため、
酵素固定膜を有する従来のエタノールセンサーに比較し
て、電極の作成が容易である。 さらに、本発明のエタノールセンサーを使用して測定す
る場合には、測定用電解液中にフェリシアン化カリウム
等の電子受容体を溶解する必要がないため、作業性が良
くなり、シアン等の廃水処理をする必要がない。As described above, according to the ethanol sensor of the present invention,
Since the oxidation reaction of ethanol by cell membrane-bound ADH of acetic acid bacterium and the oxidation current generated by PQQ and electron transfer system via electron acceptor can be directly measured amberlymetrically, the reaction time is fast and the linearity is excellent. There is. Further, the electron acceptor according to the present invention can be easily synthesized and isolated in an aqueous solution, and since both the electron acceptor and the enzyme are hydrophobic, the organic binder can be treated without special treatment. It is immobilized as an electrode agent only by mixing with and does not elute in the measuring electrolyte. For this reason,
Compared to the conventional ethanol sensor having an enzyme-immobilized membrane, it is easier to make an electrode. Further, when the measurement is performed using the ethanol sensor of the present invention, it is not necessary to dissolve an electron acceptor such as potassium ferricyanide in the measurement electrolytic solution, which improves workability and treats wastewater such as cyanide. You don't have to.
第１図は本発明実施例の酵素及び電子受容体修飾電極の
構造図、第２図は反応セルの構造図、第３図はエタノー
ル濃度測定装置の概要図、第４図はエタノールセンサー
を用いた検量線図をそれぞれ示す。 図中 1:修飾電極,2:参照電極,3:反応セル， 4:磁気攪拌子,5:スターラ,6:電解槽， 7:排液槽,8:ポンプ,10:電極剤， 11:フランジ付きテフロン製筒体， 12:銅製ネジ付きボルト， 13:グラファイト固結物,14:ナット， 31:電解液導入口,32:測定液排出口， 33:試料供給口，FIG. 1 is a structural diagram of an enzyme and electron acceptor modified electrode of an embodiment of the present invention, FIG. 2 is a structural diagram of a reaction cell, FIG. 3 is a schematic diagram of an ethanol concentration measuring device, and FIG. 4 uses an ethanol sensor. The respective calibration curves are shown below. In the figure 1: Modified electrode, 2: Reference electrode, 3: Reaction cell, 4: Magnetic stirrer, 5: Stirrer, 6: Electrolyzer, 7: Drainage tank, 8: Pump, 10: Electrode agent, 11: Flange With Teflon cylinder, 12: Bolt with copper screw, 13: Solidified graphite, 14: Nut, 31: Electrolyte inlet, 32: Measurement liquid outlet, 33: Sample inlet,
Claims (4)
性剤、両性界面活性剤又は非イオン界面活性剤から合成
される疎水性化合物を電子受容体として、酢酸菌膜結合
性アルコール脱水素酵素とともに電極剤として混在せし
めた酵素及び電極受容体修飾電極と、参照電極とを組み
合わせてなることを特徴とするエタノールセンサー。1. An acetic acid bacterium membrane-bound alcohol dehydrogenase using a hydrophobic compound synthesized from a water-soluble ferricyanate and a cationic surfactant, amphoteric surfactant or nonionic surfactant as an electron acceptor. An ethanol sensor comprising an enzyme and electrode receptor modified electrode mixed as an electrode agent together with a reference electrode.
ものであることを特徴とする請求項１記載のエタノール
センサー。2. The ethanol sensor according to claim 1, wherein the electrode material is a mixture of conductive material powder.
化カリウムであることを特徴とする請求項１又は２記載
のエタノールセンサー。3. The ethanol sensor according to claim 1 or 2, wherein the water-soluble ferricyanate is potassium ferricyanide.
との混合物からなるものであることを特徴とする請求項
１ないし３のいずれかに記載のエタノールセンサー。4. The ethanol sensor according to claim 1, wherein the electrode material is a mixture of an enzyme, an electron acceptor and an organic binder.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2181583A JPH0752177B2 (en) | 1990-07-11 | 1990-07-11 | Ethanol sensor |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2181583A JPH0752177B2 (en) | 1990-07-11 | 1990-07-11 | Ethanol sensor |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0470558A JPH0470558A (en) | 1992-03-05 |
| JPH0752177B2 true JPH0752177B2 (en) | 1995-06-05 |
Family
ID=16103347
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2181583A Expired - Lifetime JPH0752177B2 (en) | 1990-07-11 | 1990-07-11 | Ethanol sensor |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0752177B2 (en) |
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-
1990
- 1990-07-11 JP JP2181583A patent/JPH0752177B2/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0470558A (en) | 1992-03-05 |
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