JPH075640B2 - タンパク質の固定方法 - Google Patents
タンパク質の固定方法Info
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- JPH075640B2 JPH075640B2 JP2260569A JP26056990A JPH075640B2 JP H075640 B2 JPH075640 B2 JP H075640B2 JP 2260569 A JP2260569 A JP 2260569A JP 26056990 A JP26056990 A JP 26056990A JP H075640 B2 JPH075640 B2 JP H075640B2
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- hapten
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、抗ハプテンモノクローナル抗体とタンパク質
−ハプテン結合体との反応を利用して、タンパク質を固
定及び回収する方法に関する。
−ハプテン結合体との反応を利用して、タンパク質を固
定及び回収する方法に関する。
タンパク質を特異的に担体に固定できれば、固定したタ
ンパク質を回収することにより、目的とするタンパク質
を効率良く得ることができる。また、タンパク質を固定
化することにより、タンパク質が酵素であれば固定化酵
素として繰返し利用することが可能である。
ンパク質を回収することにより、目的とするタンパク質
を効率良く得ることができる。また、タンパク質を固定
化することにより、タンパク質が酵素であれば固定化酵
素として繰返し利用することが可能である。
タンパク質の固定には、官能基を作用する群特異的
吸着体を利用する抗体を利用するといった方法があ
る。
吸着体を利用する抗体を利用するといった方法があ
る。
は、アミノ基(-NH2)、カルボキシル基（−COOH）、水
酸基（−OH）、チオール基（−SH）などの、タンパク質
を構成するアミノ酸の側鎖との結合を利用した固定方法
である。これらの官能基を持つアミノ酸はタンパク質に
共通に含まれる。従って、目的とするタクパク質を特異
的に固定できない欠点がある。の群特異的吸着体と
は、ある種のタクパク質に共通な構造を認識する物質の
ことで、免疫グロブリンＧ（IgG:Immunoglobulin G）の
Fc部分と特異的に結合するプロテインＡや、糖タンパク
質の糖鎖と特異的に結合するレクチン、コンカナバリン
Ａ等のことである。しかし、群特異的吸着体は少数の限
られたタクパク質にのみ見出されており、更にIgGのサ
ブクラス（IgG1,IgG2等）の混合試料から、一つのサブ
クラス（例えばIgG1）を精製するときなどには、より特
異性の高い固定方法が必要になる。は、タンパク質を
抗原として作製した抗体を用いたタンパク質の固定方
法、あるいは逆に、抗原を用いた抗体タンパク質の固定
方法である。この方法はに比べ、目的とするタンパ
ク質を特異的に固定できること、方法の汎用性の点で優
れている。すなわち、モノクローナル抗体を用いること
により、目的とするタンパク質を極めて特異的に固定す
ることが可能である。また、すべてのタンパク質に対し
て抗体を得ることは可能であり、汎用性の高い方法と言
える。
酸基（−OH）、チオール基（−SH）などの、タンパク質
を構成するアミノ酸の側鎖との結合を利用した固定方法
である。これらの官能基を持つアミノ酸はタンパク質に
共通に含まれる。従って、目的とするタクパク質を特異
的に固定できない欠点がある。の群特異的吸着体と
は、ある種のタクパク質に共通な構造を認識する物質の
ことで、免疫グロブリンＧ（IgG:Immunoglobulin G）の
Fc部分と特異的に結合するプロテインＡや、糖タンパク
質の糖鎖と特異的に結合するレクチン、コンカナバリン
Ａ等のことである。しかし、群特異的吸着体は少数の限
られたタクパク質にのみ見出されており、更にIgGのサ
ブクラス（IgG1,IgG2等）の混合試料から、一つのサブ
クラス（例えばIgG1）を精製するときなどには、より特
異性の高い固定方法が必要になる。は、タンパク質を
抗原として作製した抗体を用いたタンパク質の固定方
法、あるいは逆に、抗原を用いた抗体タンパク質の固定
方法である。この方法はに比べ、目的とするタンパ
ク質を特異的に固定できること、方法の汎用性の点で優
れている。すなわち、モノクローナル抗体を用いること
により、目的とするタンパク質を極めて特異的に固定す
ることが可能である。また、すべてのタンパク質に対し
て抗体を得ることは可能であり、汎用性の高い方法と言
える。
上記従来技術のうちモノクローナル抗体を用いる方法は
広く一般に用いられているが、モノクローナル抗体を作
製するために数カ月或いはそれ以上の期間を要する点、
抗原の種類による免疫原性の差や免疫する動物の個体差
等の感作条件を考慮しなければならない点、また、抗原
との親和性の様々なモノクローナル抗体が生じる点、更
には、抗体が複数の抗原と交差反応することも考慮しな
ければならない点において問題があった。
広く一般に用いられているが、モノクローナル抗体を作
製するために数カ月或いはそれ以上の期間を要する点、
抗原の種類による免疫原性の差や免疫する動物の個体差
等の感作条件を考慮しなければならない点、また、抗原
との親和性の様々なモノクローナル抗体が生じる点、更
には、抗体が複数の抗原と交差反応することも考慮しな
ければならない点において問題があった。
本発明の目的は、上記従来技術の欠点を解消したタンパ
ク質の固定化方法を提供することにある。
ク質の固定化方法を提供することにある。
本発明は上記目的を達成するために、抗ハプテンモノク
ローナル抗体を作製し、ハプテンを結合させたタンパク
質を、固定化抗ハプテンモノクローナル抗体と反応さ
せ、タンパク質を固定あるいは回収することを特徴とす
るものである。
ローナル抗体を作製し、ハプテンを結合させたタンパク
質を、固定化抗ハプテンモノクローナル抗体と反応さ
せ、タンパク質を固定あるいは回収することを特徴とす
るものである。
ハプテンとは、高分子と結合させることにより、初めて
抗原となる低分子のことである。ジニトロフェニル（DN
P:Dinitrophenyl）、トリニトロフェニル（TNP:Trinitr
ophenyl）、ニトロフェニル（NP:Nitrophenyl）、ステ
ロイドホルモン等が挙げられる。本発明に用いるハプテ
ンは、タンパク質と容易に結合するものが望ましい。例
えば、DNPは、Ｎ未満のアミノ基、リジンのε−アミノ
基、チロシンの水酸基、ヒスチジンのイミダゾール基、
システインのチオール基と容易に結合する。
抗原となる低分子のことである。ジニトロフェニル（DN
P:Dinitrophenyl）、トリニトロフェニル（TNP:Trinitr
ophenyl）、ニトロフェニル（NP:Nitrophenyl）、ステ
ロイドホルモン等が挙げられる。本発明に用いるハプテ
ンは、タンパク質と容易に結合するものが望ましい。例
えば、DNPは、Ｎ未満のアミノ基、リジンのε−アミノ
基、チロシンの水酸基、ヒスチジンのイミダゾール基、
システインのチオール基と容易に結合する。
本発明においては、モノクローナル抗体を個々のタンパ
ク質に対して作製する必要はない。すなわち、ハプテン
をタンパク質に結合させれば、一種類の抗ハプテンモノ
クローナル抗体を用いて、タクパク質−ハプテン結合体
を固定できるからである。
ク質に対して作製する必要はない。すなわち、ハプテン
をタンパク質に結合させれば、一種類の抗ハプテンモノ
クローナル抗体を用いて、タクパク質−ハプテン結合体
を固定できるからである。
モノクローナル抗体とは、生体内に無数にある抗体の中
から選び出した、単一の抗体のことである。モノクロー
ナル抗体の作製技術は、1975年にケーラーとミルシュタ
インによって初めて報告された。モノクローナル抗体
は、抗体の有用性を高め、バイオテクノロジーの分野に
大きく貢献した。現在では、医学、生物学等広い分野で
モノクローナル抗体は利用されている。［ジー．ケーラ
ー及びシー．ミルシュタイン，ネイチャー（ロンド
ン）.256,495（1975）．］ モノクローナル抗体を得るための一般的な方法を次に述
べる。マウスやラット等の哺乳動物に対し、動物にとっ
て異物となる物質（抗原）を、非経口的に投与する。す
なわち、静脈、筋肉、あるい腹腔内に抗原を注射する。
このようにして、抗原と特異的に反応する抗体を産生す
るリンパ球Ｂ細胞の増殖を促することができる。次に、
抗原を免疫した哺乳動物の脾臓を摘出する。脾臓はリン
パ球Ｂ細胞を多く含む器官である。従って、脾臓細胞を
培養すれば、抗体産生細胞を多量に得ることができる。
ところが、Ｂ細胞を生体外で長く維持することはできな
い。そこで、増殖能の高い骨髄腫細胞（ミエローマ）と
融合し、ハイブリドーマと呼ばれる融合細胞とする。ハ
イプリドーマは、Ｂ細胞とミエローマの遺伝子を併せ持
つため、抗体を産生しながら増殖を続けることができ
る。細胞融合はポリエチレングリコール、HJVウィル
ス、あるいは電流等を用いて行う。ミエローマは、核酸
合成に必要な酵素である、ヒポキサンチン−グアニン−
フォスフォリボシルトランスフェラーゼ、あるいはチミ
ジンキナーゼを欠損させてある。細胞融合はランダムな
組合せで起こるが、融合細胞をハット培地と呼ばれる培
地中で培養すると、Ｂ細胞の持つ酵素遺伝子を獲得した
ハイブリドーマのみが生き残ることができる。
から選び出した、単一の抗体のことである。モノクロー
ナル抗体の作製技術は、1975年にケーラーとミルシュタ
インによって初めて報告された。モノクローナル抗体
は、抗体の有用性を高め、バイオテクノロジーの分野に
大きく貢献した。現在では、医学、生物学等広い分野で
モノクローナル抗体は利用されている。［ジー．ケーラ
ー及びシー．ミルシュタイン，ネイチャー（ロンド
ン）.256,495（1975）．］ モノクローナル抗体を得るための一般的な方法を次に述
べる。マウスやラット等の哺乳動物に対し、動物にとっ
て異物となる物質（抗原）を、非経口的に投与する。す
なわち、静脈、筋肉、あるい腹腔内に抗原を注射する。
このようにして、抗原と特異的に反応する抗体を産生す
るリンパ球Ｂ細胞の増殖を促することができる。次に、
抗原を免疫した哺乳動物の脾臓を摘出する。脾臓はリン
パ球Ｂ細胞を多く含む器官である。従って、脾臓細胞を
培養すれば、抗体産生細胞を多量に得ることができる。
ところが、Ｂ細胞を生体外で長く維持することはできな
い。そこで、増殖能の高い骨髄腫細胞（ミエローマ）と
融合し、ハイブリドーマと呼ばれる融合細胞とする。ハ
イプリドーマは、Ｂ細胞とミエローマの遺伝子を併せ持
つため、抗体を産生しながら増殖を続けることができ
る。細胞融合はポリエチレングリコール、HJVウィル
ス、あるいは電流等を用いて行う。ミエローマは、核酸
合成に必要な酵素である、ヒポキサンチン−グアニン−
フォスフォリボシルトランスフェラーゼ、あるいはチミ
ジンキナーゼを欠損させてある。細胞融合はランダムな
組合せで起こるが、融合細胞をハット培地と呼ばれる培
地中で培養すると、Ｂ細胞の持つ酵素遺伝子を獲得した
ハイブリドーマのみが生き残ることができる。
ハイブリドーマの中から、目的の抗原を認識する抗体を
産生するものを選択するためスクリーニングを行う（一
次スクリーニング）。スクリーニングには、酵素免疫測
定法（ELISA:Enzyme Linked Immunosorbent Assay）と
呼ばれる検定方法を適用する。この方法は、抗原抗体反
応の有無を基質の発色で検知するものである。
産生するものを選択するためスクリーニングを行う（一
次スクリーニング）。スクリーニングには、酵素免疫測
定法（ELISA:Enzyme Linked Immunosorbent Assay）と
呼ばれる検定方法を適用する。この方法は、抗原抗体反
応の有無を基質の発色で検知するものである。
一つの抗原に対しては複数種の抗体が反応する。従っ
て、スクリーニングによって、複数種のハイブリドーマ
が得られてしまう。そこで、一次スクリーニングで得た
ハイブリドーマを、１個の細胞にまで希釈し増殖させ、
単一の細胞集団（クローン）とする。ハイブリドーマを
クローン化する操作をクローニングと呼ぶ。そして、再
びELISAによるスクリーニングを行い、目的の抗体を生
産するハイブリドーマのクローンを選別する。
て、スクリーニングによって、複数種のハイブリドーマ
が得られてしまう。そこで、一次スクリーニングで得た
ハイブリドーマを、１個の細胞にまで希釈し増殖させ、
単一の細胞集団（クローン）とする。ハイブリドーマを
クローン化する操作をクローニングと呼ぶ。そして、再
びELISAによるスクリーニングを行い、目的の抗体を生
産するハイブリドーマのクローンを選別する。
ここで得られたクローンに対し、抗体産生能、抗体の抗
原との親和性、抗体の交差反応等を検討して、目的のハ
イブリドーマを培養し、培養上清を回収する。培養上清
から抗体を精製すれば、目的のモノクローナル抗体を得
ることができる。抗体の精製は、限外濾過、硫安塩析、
透析、及びクロマトグラフィー等の公知の方法を組み合
わせて行う。
原との親和性、抗体の交差反応等を検討して、目的のハ
イブリドーマを培養し、培養上清を回収する。培養上清
から抗体を精製すれば、目的のモノクローナル抗体を得
ることができる。抗体の精製は、限外濾過、硫安塩析、
透析、及びクロマトグラフィー等の公知の方法を組み合
わせて行う。
抗ハプテンモノクローナル抗を作製するためには、まず
ハプテンを牛血清アルブミン（BSA:Bovine Serum Album
in）、キーホールリンペットヘモシアニン（Keyhole Li
mpet Hemocyanin）、オバルブミン（OVA:Ovalbumin）等
の高分子に結合させる。ハプテンと結合させる高分子と
してタンパク質を用いれば、結合体を作製し易い。
ハプテンを牛血清アルブミン（BSA:Bovine Serum Album
in）、キーホールリンペットヘモシアニン（Keyhole Li
mpet Hemocyanin）、オバルブミン（OVA:Ovalbumin）等
の高分子に結合させる。ハプテンと結合させる高分子と
してタンパク質を用いれば、結合体を作製し易い。
作製したタンパク質−ハプテン結合体を抗原として、マ
ウスやラット等の哺乳動物を免疫する。免疫は一般的な
方法に従い、例えば、腹腔内に抗原を注射し、その後10
日〜２週間の周期で数回注射して行う。その結果、抗ハ
プテン抗体を産生するリンパ球Ｂ細胞の増殖を促すこと
ができる。
ウスやラット等の哺乳動物を免疫する。免疫は一般的な
方法に従い、例えば、腹腔内に抗原を注射し、その後10
日〜２週間の周期で数回注射して行う。その結果、抗ハ
プテン抗体を産生するリンパ球Ｂ細胞の増殖を促すこと
ができる。
次に、上記哺乳動物の脾臓を摘出し、ミエローマと融合
してハイブリドーマを作製する。ハイブリドーマの中か
ら、抗ハプテン抗体を産生するものを選択するため、EL
ISAによる一次スクリーニングを行う。得られた抗ハプ
テン抗体産生ハイブリドーマに対して、二次スクリーニ
ングを行い、抗ハプテンモノクローナル抗体産生ハイブ
リドーマのクローンを得る。
してハイブリドーマを作製する。ハイブリドーマの中か
ら、抗ハプテン抗体を産生するものを選択するため、EL
ISAによる一次スクリーニングを行う。得られた抗ハプ
テン抗体産生ハイブリドーマに対して、二次スクリーニ
ングを行い、抗ハプテンモノクローナル抗体産生ハイブ
リドーマのクローンを得る。
クローン化した抗ハプテン抗体産生ハイブリドーマを培
養し、培養上清を回収する。培養上清から抗体を精製す
れば、抗ハプテンモノクローナル抗体を得ることができ
る。抗体の精製は、限外濾過、硫安塩析、透析、及びク
ロマトグラフィー等の公知の方法を組み合わせて行う。
養し、培養上清を回収する。培養上清から抗体を精製す
れば、抗ハプテンモノクローナル抗体を得ることができ
る。抗体の精製は、限外濾過、硫安塩析、透析、及びク
ロマトグラフィー等の公知の方法を組み合わせて行う。
タクパク質−ハプテン結合体を固定するためには、まず
ハプテンモノクローナル抗体を担体に固定しなければな
らない。抗体の固定方法には、抗体の側鎖の官能基を
利用する群特異的吸着体を利用する二次抗体を利用
する、といった方法が考えられる。
ハプテンモノクローナル抗体を担体に固定しなければな
らない。抗体の固定方法には、抗体の側鎖の官能基を
利用する群特異的吸着体を利用する二次抗体を利用
する、といった方法が考えられる。
は、抗体分子を構成するアミノ酸の側鎖であるアミノ
基、カルボキシル基、水酸基、チオール基等を結合に利
用する方法である。例えば、グルタルアルデヒドを架橋
剤として用いれば、ガラス表面上に抗体を固定すること
ができる に関しては、抗体（特にIgG）を固定する際に、IgGと
特異的に結合するプロテインＡを不溶化したプロテイン
Ａ結合担体を用いれば、IgGを固定することができる。
基、カルボキシル基、水酸基、チオール基等を結合に利
用する方法である。例えば、グルタルアルデヒドを架橋
剤として用いれば、ガラス表面上に抗体を固定すること
ができる に関しては、抗体（特にIgG）を固定する際に、IgGと
特異的に結合するプロテインＡを不溶化したプロテイン
Ａ結合担体を用いれば、IgGを固定することができる。
は、抗ハプテンモノクローナル抗体と結合する二次抗
体を、上記，の方法により固定した後、固定化二次
抗体を介して抗ハプテンモノクローナル抗体を固定する
ものである。
体を、上記，の方法により固定した後、固定化二次
抗体を介して抗ハプテンモノクローナル抗体を固定する
ものである。
上記の方法により、抗ハプテンモノクローナル抗体を、
ゲル、ガラス表面等の担体に固定すれば、固定化抗ハプ
テンモノクローナル抗体との抗原抗体反応を利用して、
タクパク質−ハプテン結合体を固定することができる。
ゲル、ガラス表面等の担体に固定すれば、固定化抗ハプ
テンモノクローナル抗体との抗原抗体反応を利用して、
タクパク質−ハプテン結合体を固定することができる。
固定化したタクパク質−ハプテン結合体は、pHを１〜４
程度に下げて抗ハプテンモノクローナル抗体からハプテ
ンを解離することで回収することができる。
程度に下げて抗ハプテンモノクローナル抗体からハプテ
ンを解離することで回収することができる。
目的とするタンパク質を固定、あるいは回収するために
モノクローナル抗体を用いるのは有効な手段である。し
かし、目的のモノクローナル抗体を作製することは容易
ではない。そこで、タンパク質−ハプテン結合体を作製
し、固定化抗ハプテンモノクローナル抗体を用いれば、
それぞれのタンパク質に対するモノクローナル抗体を作
製することなく、目的のタンパク質を固定できる。
モノクローナル抗体を用いるのは有効な手段である。し
かし、目的のモノクローナル抗体を作製することは容易
ではない。そこで、タンパク質−ハプテン結合体を作製
し、固定化抗ハプテンモノクローナル抗体を用いれば、
それぞれのタンパク質に対するモノクローナル抗体を作
製することなく、目的のタンパク質を固定できる。
以下、本発明の実施例について第１図に基づいて説明す
るが、本発明はこれら実施例に限定されるものではな
い。
るが、本発明はこれら実施例に限定されるものではな
い。
第１図は、ガラスビーズ／上に抗DNP抗体２を固定化
し、これにパパイン４−DNP3結合体を結合させ、パパイ
ン４を固定したところを示している。抗DNP抗体を固定
化する担体は、ガラス基板、プラスチツク基板、あるい
は高分子樹脂でも良い。また、パパインの代りに他の酵
素を用いても良い。
し、これにパパイン４−DNP3結合体を結合させ、パパイ
ン４を固定したところを示している。抗DNP抗体を固定
化する担体は、ガラス基板、プラスチツク基板、あるい
は高分子樹脂でも良い。また、パパインの代りに他の酵
素を用いても良い。
本実施例では、DNPのようなハプテンを酵素に結合させ
ることにより、抗ハプテンモノクローナル抗を介して容
易に固定化酵素を作製できるところに特徴がある。
ることにより、抗ハプテンモノクローナル抗を介して容
易に固定化酵素を作製できるところに特徴がある。
更に、酵素を再利用できるため、高価な酵素を用いる際
に有利である。
に有利である。
（１）抗DNPモノクローナル抗体の作製 a.BSA-DNP結合体の作製 １−フルオロ−2,4−ジニトロベンゼン（FDNB:1-fluoro
-2,4-dinitrobenzene）10mlとジオキサン2mlを混合し、
これを重炭酸塩緩衝液（pH9.0）に溶解した0.75％BSA
（20ml）溶液に添加して、暗闇下、室温で24時間インキ
ュベートした。反応液を限外濾過し、保持液を限外濾過
によって0.1Mリン酸塩緩衝液（pH7.4）に置換し、これ
を抗原とした。抗原中のタンパク質濃度は6mg/mlであっ
た。DNPの吸収極大値（360nm）より求めた、BSAとFDNB
の反応効率は79％であった。
-2,4-dinitrobenzene）10mlとジオキサン2mlを混合し、
これを重炭酸塩緩衝液（pH9.0）に溶解した0.75％BSA
（20ml）溶液に添加して、暗闇下、室温で24時間インキ
ュベートした。反応液を限外濾過し、保持液を限外濾過
によって0.1Mリン酸塩緩衝液（pH7.4）に置換し、これ
を抗原とした。抗原中のタンパク質濃度は6mg/mlであっ
た。DNPの吸収極大値（360nm）より求めた、BSAとFDNB
の反応効率は79％であった。
b.BSA-DNP結合体によるマウスの免疫BSA-DNP結合体（10
0μｇ、２回目以降は40μｇ）を90μｇのフロイント完
全アジュバンドと共に、3mlの0.1Mリン酸塩緩衝液（pH
7.4）に溶解し、この混合液を500μｌずつマウス（BALB
/c、９週齢）に、腹腔内投与し、その後２週間の周期で
３〜７回続けた。
0μｇ、２回目以降は40μｇ）を90μｇのフロイント完
全アジュバンドと共に、3mlの0.1Mリン酸塩緩衝液（pH
7.4）に溶解し、この混合液を500μｌずつマウス（BALB
/c、９週齢）に、腹腔内投与し、その後２週間の周期で
３〜７回続けた。
c.抗DNP抗体産生ハイブリドーマの作製 BSA-DNP結合体を免疫したマウスの脾臓を摘出し、ポリ
エチレングリコール（分子量1500）を用いてミエローマ
と融合、ハット培地中でハイブリドーマを選別した。こ
こで得られたハイブリドーマには、DNP、BSA及びBSAとD
NPを同時に認識する抗体を産生する３種類の細胞が含ま
れている。そこで、抗DNP抗体産生細胞のスクリーニン
グに際しては、BSA-DNP結合体、BSA及びポリ−Ｌ−リジ
ン−DNP結合体の３種類の抗原を用いてELISAを行い、BS
A-DNP結合体とポリ−Ｌ−リジン−DNP結合体に対して陽
性、BSAに対して陰性の抗体を分泌するものを抗DNP抗体
産生ハイブリドーマとして選別した。続いて、クローニ
ング、スクリーニングを行い、抗DNPモノクローナル抗
体産生ハイブリドーマのクローンを５株得た。表１に細
胞株と産生する抗体の種類を示す。
エチレングリコール（分子量1500）を用いてミエローマ
と融合、ハット培地中でハイブリドーマを選別した。こ
こで得られたハイブリドーマには、DNP、BSA及びBSAとD
NPを同時に認識する抗体を産生する３種類の細胞が含ま
れている。そこで、抗DNP抗体産生細胞のスクリーニン
グに際しては、BSA-DNP結合体、BSA及びポリ−Ｌ−リジ
ン−DNP結合体の３種類の抗原を用いてELISAを行い、BS
A-DNP結合体とポリ−Ｌ−リジン−DNP結合体に対して陽
性、BSAに対して陰性の抗体を分泌するものを抗DNP抗体
産生ハイブリドーマとして選別した。続いて、クローニ
ング、スクリーニングを行い、抗DNPモノクローナル抗
体産生ハイブリドーマのクローンを５株得た。表１に細
胞株と産生する抗体の種類を示す。
d.抗DNPモノクローナル抗体の精製 抗DNP抗体産生ハイブリドーマ（4-38-10株）を無血清培
地中で培養し、培養上清１を濾過滅菌した後、限外濾
過、硫安塩析を行った。更に、ハイドロキシルアパタイ
トカラム（バイオラッド社製）を用いて、抗DNPモノク
ローナル抗体を精製した。この結果、517μg/mlのIgG溶
液を得た。
地中で培養し、培養上清１を濾過滅菌した後、限外濾
過、硫安塩析を行った。更に、ハイドロキシルアパタイ
トカラム（バイオラッド社製）を用いて、抗DNPモノク
ローナル抗体を精製した。この結果、517μg/mlのIgG溶
液を得た。
（２）パパインの固定化 a.パパイン−DNP結合体の作製 0.1M重炭酸塩緩衝液（pH9.0）に溶解した0.38％パパイ
ン（20ml）をFDNBと混合し、パパイン−DNP結合体を得
た。反応液の未反応のFDNBを限外濾過により除去した
後、保持液に0.1Mリン酸塩緩衝液（pH7.4）を加え、再
び限外濾過を行い、パパイン−DNP結合体を含む溶液を
得た。
ン（20ml）をFDNBと混合し、パパイン−DNP結合体を得
た。反応液の未反応のFDNBを限外濾過により除去した
後、保持液に0.1Mリン酸塩緩衝液（pH7.4）を加え、再
び限外濾過を行い、パパイン−DNP結合体を含む溶液を
得た。
b.固定化パパインの作製 ガラスビーズ（φ6.4mm）の表面を、36mM N−β（アミ
ノエチル）−γ−アミノプロピルトリメソキシシラン溶
液（チッソ製）を用いてアミノシラン化した。洗浄した
後、2.5％グルタルアルデヒド溶液で処理し、抗DNPモノ
クローナル抗体溶液を0.1Mリン酸塩緩衝液（pH7.4）中
で反応させ抗体結合体を得た。ここにパパパイン−DNP
結合体を加え、37℃、１時間、同様に0.1Mリン酸塩緩衝
液（pH7.4）中でインキュベートすることにより、固定
化パパインを作製した。
ノエチル）−γ−アミノプロピルトリメソキシシラン溶
液（チッソ製）を用いてアミノシラン化した。洗浄した
後、2.5％グルタルアルデヒド溶液で処理し、抗DNPモノ
クローナル抗体溶液を0.1Mリン酸塩緩衝液（pH7.4）中
で反応させ抗体結合体を得た。ここにパパパイン−DNP
結合体を加え、37℃、１時間、同様に0.1Mリン酸塩緩衝
液（pH7.4）中でインキュベートすることにより、固定
化パパインを作製した。
第２図は上述の実施例で得た固定化パパインによるマウ
スIgGの消化を模式的に示すものである。マウスIgG5
は、第１図に示す固定化パパインによりFab6とFc7とに
分解される。この具体例を示すと次のようである。
スIgGの消化を模式的に示すものである。マウスIgG5
は、第１図に示す固定化パパインによりFab6とFc7とに
分解される。この具体例を示すと次のようである。
ポーターの方法に従いマウスIgGをパパイン消化した。
マウスIgG1mgはパパイン−DNP結合体を固定したガラス
ビーズ（パパイン10μｇを結合）を混合し、10mlの10mM
システイン−2mM EDTA-0.1Mリン酸塩緩衝液（pH7.0）
中、37℃で一晩反応させた。続いて、ヨードアセトアミ
ドを終濃度が10mMとなるよう添加し反応を停止させた。
マウスIgGはパパインの作用を受けてFabとFcに分解し
た。FabとFcの分解は、ハイドロキシルアパタイトカラ
ム（バイオラッド社製）を用いて行った。「アール・ア
ール・ポーター，バイオケミカル ジャーナル.73,119
（1959）．］ パパインを固定したガラスビーズは洗浄した後0.1Mリン
酸塩緩衝液（pH7.4）中、４℃にて保存した。
マウスIgG1mgはパパイン−DNP結合体を固定したガラス
ビーズ（パパイン10μｇを結合）を混合し、10mlの10mM
システイン−2mM EDTA-0.1Mリン酸塩緩衝液（pH7.0）
中、37℃で一晩反応させた。続いて、ヨードアセトアミ
ドを終濃度が10mMとなるよう添加し反応を停止させた。
マウスIgGはパパインの作用を受けてFabとFcに分解し
た。FabとFcの分解は、ハイドロキシルアパタイトカラ
ム（バイオラッド社製）を用いて行った。「アール・ア
ール・ポーター，バイオケミカル ジャーナル.73,119
（1959）．］ パパインを固定したガラスビーズは洗浄した後0.1Mリン
酸塩緩衝液（pH7.4）中、４℃にて保存した。
本発明により、特定のタンパク質にハプテンを結合させ
ることにより、抗ハプテンモノクローナル抗体を用いて
タンパク質を容易に固定することが出来るため、タンパ
ク質の機能の利用や回収が容易になる効果がある。
ることにより、抗ハプテンモノクローナル抗体を用いて
タンパク質を容易に固定することが出来るため、タンパ
ク質の機能の利用や回収が容易になる効果がある。
第１図は、本発明の一実施例に係る抗DNP抗体をガラス
ビーズ上に固定したところを示す模式図、第２図は、本
発明の一実施例に係る固定化パパインによる酵素反応を
示す模式図である。 １……ガラスビーズ、２……抗DNOモノクローナル抗
体、３……DNP、４……パパイン、５……マウスIgG、６
……Fab、７……Fc。
ビーズ上に固定したところを示す模式図、第２図は、本
発明の一実施例に係る固定化パパインによる酵素反応を
示す模式図である。 １……ガラスビーズ、２……抗DNOモノクローナル抗
体、３……DNP、４……パパイン、５……マウスIgG、６
……Fab、７……Fc。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 清水 範夫 埼玉県比企郡鳩山町赤沼2520番地 株式会 社日立製作所基礎研究所内 (56)参考文献 特公 昭57−28274（ＪＰ，Ｂ１)
Claims (4)
- 【請求項１】ハプテンを化学的にタンパク質に結合させ
た後、未反応のハプテンを除去したタンパク質溶液を得
る工程、抗ハプテンモノクロナール体を化学的に担体と
結合させる工程、および該タンパク質溶液と該担体とを
接触させ、ハプテンと該抗体との抗原抗体反応を行い、
同担体にタンパク質を固定化する工程からなることを特
徴とするタンパク質の固定方法。 - 【請求項２】ジニトロフェニル（DNP:Dinitrophenyl）
をハプテンとする特許請求の範囲第１項記載のタンパク
質の固定方法。 - 【請求項３】担体に固定した抗ハプテンモノクローナル
抗体を用いて、タンパク質−ハプテン結合体を回収する
ことを目的とするタンパク質の固定方法。 - 【請求項４】DNPをハプテンとする特許請求の範囲第３
項記載のタンパク質固定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2260569A JPH075640B2 (ja) | 1990-10-01 | 1990-10-01 | タンパク質の固定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2260569A JPH075640B2 (ja) | 1990-10-01 | 1990-10-01 | タンパク質の固定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04139200A JPH04139200A (ja) | 1992-05-13 |
| JPH075640B2 true JPH075640B2 (ja) | 1995-01-25 |
Family
ID=17349772
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2260569A Expired - Fee Related JPH075640B2 (ja) | 1990-10-01 | 1990-10-01 | タンパク質の固定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH075640B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP7601324B2 (ja) * | 2020-06-02 | 2024-12-17 | 公立大学法人福島県立医科大学 | 化合物を基板上に固定する方法および固定化した化合物の検出方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0240996B2 (ja) * | 1980-07-28 | 1990-09-14 | Aloka | Jidorimonitashisutemunokandohoseikairo |
-
1990
- 1990-10-01 JP JP2260569A patent/JPH075640B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH04139200A (ja) | 1992-05-13 |
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