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JPH0772198B2 - ペプチド組成物 - Google Patents
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JPH0772198B2 - ペプチド組成物 - Google Patents

ペプチド組成物

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JPH0772198B2
JPH0772198B2 JP61172932A JP17293286A JPH0772198B2 JP H0772198 B2 JPH0772198 B2 JP H0772198B2 JP 61172932 A JP61172932 A JP 61172932A JP 17293286 A JP17293286 A JP 17293286A JP H0772198 B2 JPH0772198 B2 JP H0772198B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、マラリアワクチンの製造及びマラリア診断用
キットの調製に使用される下記式（Ｉ）で表されるペプ
チド組成物に係る。
式（Ｉ） H-（Asn-Ala-Asn-Pro）n‐OH 式中 Asn:アスパラギン Ala:アラニン Pro:プロリン n :37〜41の数 プラズモジウム（Plasmodium）は、無脊椎動物宿主（こ
の宿主内では、有性生殖を行う）及び脊椎動物宿主（こ
の宿主内では、多数分裂により繁殖する）において互い
に異なったライフサイクルを有する住血寄生虫である。
ヒトの体内では、プラズモジウムは危険でかつ伝播力の
強いマラリアを起こす。
ヒトに対する病原体となりうるものは次の４種である。
すなわち、三日熱マラリア原虫（Plasmodium vivax）、
四日熱マラリア原虫（Plasmodium malariae）、卵形マ
ラリア原虫（Plasmodium ovalis）及び熱帯熱マラリア
原虫（Plasmodium falciparum）である。
これらの中でも、熱帯熱マラリア原虫は、最も危険な病
気、いわゆる悪性三日熱の病原体である。マラリア寄生
虫はアノフェレス蚊（無脊椎宿主である）によってヒト
体内に移され、網状内皮性及び肝系の細胞内で増殖す
る。このような第１段階につづいて、約１週間後には、
寄生虫が血流中に侵入し、赤血球を感染し、分裂を始め
る第２段階に達する。
上記寄生虫のうちいくつかのものは、多数分裂サイクル
を行なわず、生殖母体に変体する。
血流中にプラズモジウムを有するマラリア患者を刺すこ
とにより雌の蚊は、感染された血液と共に生殖母体を吸
入する。この生殖母体は、有性生殖によって、細くかつ
先細の形状のスポロゾイドを生成する。
かかるスポロゾイドは蚊により、再びヒト体内に移さ
れ、これらは新たな多数分裂サイクルを開始する。
このようなマラリアを起こすプラズモジウムのライフサ
イクルの各段階に応じたワクチンが開発されている。
ヒトに対して有効である場合、病気の発症への進行及び
病気に伝染を防止できるようなスポロゾイドに対するワ
クチンの開発が特に注目を集めている。
マラリア性スポロゾイドに対してヒト及び動物を免疫
し、保護する可能性についてはR.W.Nussenzweigにより
照射済スポロゾイドを使用して研究されている（「Mil.
Med」134、1376（1969））。
さらに、このような保護は、スポロゾイドの表面上に存
在するタンパク質（いわゆるスポロゾイド周囲（CS）タ
ンパク質）に関する特殊な抗体の生産に相関することが
わかっている。
最近、Dameらは熱帯熱マラリア原虫のCSタンパク質をコ
ードづけする遺伝子をクローン化し、配列を解明してい
る（「サイエンス（Science）」225,593-599（198
4））。
かかるタンパク質（アミノ酸412個でなる）は、配列Asn
-AlA-Asn-Proを有するテトラペプチド37個及び配列Asn-
Asp-Val-Proを有するテトラペプチド４個でなる中心繰
返し領域を有する。
CSタンパク質に対して特異的なモノクロナール抗体を使
用して行なわれた研究では、この領域に特異なエピトー
プが存在することが明らかにされ、これにより、この領
域の免疫優性特性及びマラリアに対するワクチンの調製
の基礎として使用できることが確認された。最近、W.Ri
pley Ballouらは、熱帯熱マラリア原虫のスポロゾイド
のCSタンパク質領域の１ないし３個のアミノ酸４分子体
でなるペプチドを合成した（「サイエンス」228,996-99
9（1985））。
著者らは、アミノ基末端システイン残基によりキャリヤ
ータンパク質に結合される際、これらペプチドは実験動
物に陽性の抗体応答を誘発しうることを見出した。
さらに、生産された抗体は本来のスポロゾイド周囲タン
パク質を認識し、インビトロで、ヒト肝臓細胞のスポロ
ゾイド感染を阻害する。
しかしながら、この合成ペプチドを熱帯熱スポロゾイド
に対するワクチンの製造に使用するには、いくつかの制
限がある。
これら制限の理由は主として次の点にある。
（１） キャリヤータンパク質に結合できるペプチドの
量が限られること。
（２） 宿主感作があり、急速なペプチド除去が生ずる
こと。
（３） エピトープ−特異的抑制があること。
（４） 熱帯熱マラリア原虫に対する免疫の期間が短か
く、繰返し接種することが必要であること。
J.F.Youngらによれば、32アミノ酸ペプチドセグメント
に融合された熱帯熱マラリア原虫のCSタンパク質中に存
在する領域の16、32又は48繰返しアミノ酸４分子体でな
るタンパク質が、大腸菌（E.Coli）内で発現される
（「サイエンス」228,958-962（1985））。
得られたタンパク質を実験動物でテストしたところ、か
かるタンパク質は高い抵抗力を示し、誘発された抗体は
本来のタンパク質を認識し、インビトロ検定において、
腫瘍肝臓細胞のスポロゾイド侵入を防御する。
しかしながら、上記文献のYoungらの方法に従って操作
する場合には、遺伝子操作を介して得られる生成物をヒ
トの治療に使用することに関連する可能な限りの危険を
予め正確に評価しておくことが必要であり、又所望のタ
ンパク質を生産し、これを精製するために各種の困難性
があることはあきらかである。
大腸菌（E.Coli）は病原菌であり、異質タンパク質生産
のための発酵法での使用では、正確な制御が必要であ
る。
さらに、E.Coli合成生成物が細胞中に残留するため、抽
出にあたっては、微生物の破壊又は分解が必要である。
抽出生成物はつづいて取出され、精製されなければなら
ない。
要するに、このような方法は、各種の工程が必要である
ため煩雑であり、収率も低く、工業的見地からこの方法
は必ずしも推奨されない。
発明者らは、マラリアの検知のための診断用キットの調
製と共に、マラリアワクチンの製造に使用されるペプチ
ド組成物（簡単かつ経済的な方法により、純粋な形で得
られる）を使用することにより、従来法の欠点を解消で
きることを新たに見出し、本発明に至った。
従って、本発明の目的は、マラリアワクチン及びマラリ
ア検地のための診断用キットの製造に使用されるペプチ
ド組成物を提供することにある。
本発明の他の目的は、かかるペプチド組成物の製法を提
供することにある。
本発明のさらに他の目的は、マラリアワクチン及びマラ
リア診断用キットの製造における前記ペプチド組成物の
使用にある。
本発明の他の目的は下記の記載及び実験例から明らかに
なるであろう。
さらに詳述すれば、本発明によるペプチド組成物は、下
記の式（Ｉ）で表されるペプチド混合物でなる。
式（１） H-（Asn-Ala-Asn-Pro）n‐OH 式中、Asn:アスパラギン Ala:アラニン Pro:プロリン n :37〜41の数 本発明によれば、上記ペプチド混合物は、下記の工程を
包含する方法により調製される。
ａ） 一般的（II） X-Asn-Ala-Asn-Pro-OH （式中、Ｘは酸不安定性（酸レイビル）保護基である）
を有するAsn末端アミノ基保護テトラペプチドを合成す
る工程。
ｂ） 前記テトラペプチド（II）をフェノールハロゲン
化誘導体との反応により活性化して、一般式（III） X-Asn-Ala-Asn-Pro-OH （式中、Ｘは前記と同意義であり、Ｙはフェノールハロ
ゲン化誘導体の残基である）を有するPro末端カルボキ
シ基部でエステス化されたテトラペプチドの活性エステ
ルを調製する工程。
ｃ） 前記テトラペプチド（III）から酸分解によりア
ミノ保護基を除去して、一般式（IV） HC1・H-Asn-Ala-Asn-Pro-OY を有するテトラペプチドを調製する工程。
ｄ） 塩基性有機触媒の存在下で、前記テトラペプチド
（IV）を重縮合せしめる工程。
ｅ） ペプチド混合物（Ｉ） H-（Asn-Ala-Asn-Pro）n‐OH （式中、ｎは37〜41の数である）を分離、回収する工
程。
本発明による方法の工程ａ）において、一般式 X-Asn-Ala-Asn-Pro-OH で表されるAsnの末端アミノ基部で保護されたテトラペ
プチドの生成は、ペプチド合成における公知の方法に従
って、均一相での縮合により行なわれる。
一般に、アミノ又はカルボキシル官能基部で適宜保護さ
れたアミノ酸を、公知のものの中から選ばれる縮合剤の
存在下、不活性（非反応性）溶媒中に溶解せしめる。
好適な有機溶媒は、塩素化芳香族炭化水素、脂肪族ケト
ン、アルキルエーテルである。これら溶媒の中で特に好
ましいものは、N,N′−ジメチルホルムアミド、クロロ
ホルム、酢酸エチル、テトラヒドロフランである。
アミノ保護基は、酸不安定性のもの（すなわち、酸加水
分解により除去されうるもの）の中から選ばれる。特
に、第３ブチルオキシカルボニル（Boc）が好適であ
る。
縮合の反応温度は一般式に−10℃ないし＋40℃であり、
これに対応する反応時間は、反応が完了され、又は実質
的に完了されるに必要なものでなければならない。
本考案による方法の工程ｂ）では、アミノ末端基で保護
されたテトラペプチド（II）を、フェノールハロゲン化
誘導体との反応によって活性化して、Proの末端カルボ
キシル基でエステル化された活性エステル（II） X-Asn-Ala-Asn-Pro-OY （式中、Ｘは前記と同意義であり、Ｙはフェノールハロ
ゲン化誘導体の残基である）を生成する。
本発明による方法で使用されるフェノールハロゲン化誘
導体はフッ素化又は塩素化誘導体である。特に、ペンタ
クロロフェノール、トリクロロフェノール及びペンタフ
ルオロフェノールが好適である。
Proカルボキシル基活性化反応は、Proカルボキシル基か
ら保護基を除去した後、テトラペプチド（II）をフェノ
ールハロゲン化誘導体とモル比約1:1で接触させること
により実施される。かかる反応は不活性有機溶媒中、温
度−10℃ないし＋40℃で行なわれる。さらに詳しくは、
反応は室温又はこれに近い温度で行なわれる。
適切な有機溶媒の例としては、酢酸エチル又は塩素化脂
肪族炭化水素の如き非プロトン性のものがある。
得られた溶液を温度約０℃に冷却し、縮合剤を、縮合剤
／他の原料のモル比1/1以上で添加する。
さらに詳しくは、縮合剤としてジシクロヘキシルカルボ
ジイミドが使用される。
ついで、得られた混合物を温度−10℃ないし＋40℃に15
分ないし４時間維持する。実際には、温度約０℃で１時
間、室温（20−25℃）又はこれに近い温度で約１時間操
作することが好適である。
好適な条件下で操作することにより、融点160-164℃及
び〔α〕D 22−74.8°（ｃ＝0.75、メタノール）を有す
るテトラペプチド（III）が得られる。
工程ｃ）では、アミノ保護基を酸加水分解によって活性
テトラペプチド（III）から除去する。この酸加水分解
は、トリフルオロ酢酸又は濃塩酸を使用して、室温にお
いて約１時間で行なわれる。
本発明による方法の工程ｄ）では、保護基の除去後、上
記活性化テロラペプチド（IV）を、過剰量の塩基性有機
触媒の存在下、重縮合せしめる。好適な有機触媒はアル
キル第３級アミン（アルキル基は炭酸数１ないし４を有
する）である。特に好適なアミンはトリエチルアミンで
ある。
本発明によれば、反応は不活性有機溶媒中、液相で行な
われる。好適な有機溶媒はジメチルスルホキシド、ジメ
チロールアミド、ヘキサメチルホスホルアミドである。
反応温度は−15℃ないし約＋40℃であり、相応する反応
時間は24時間ないし４日である。
実際、反応は室温又はこれに近い温度で行なわれる。こ
の場合、反応を完了し、又は実質的に完了させるに要す
る時間は概ね72時間である。
反応終了後、ペプチド組成物が得られ、これから、ゲル
クロマトグラフィーにより、式（Ｉ） H-（Asn-Ala-Asn-Pro）n‐OH （式中、ｎは37〜41の数である）で表されるペプチド混
合物を回収する。
このようにして得られた混合物は、そのままでマラリア
ワクチン又はマラリア診断用キットの製造に使用され
る。
本発明の他の具体例によれば、上記混合物を分別するこ
とにより、狭い分子量（MW）分布を有する混合物が得ら
れる。
分別は、Sephadex（登録商標）G 50を充填したカラム
（2.5×80cm）を使用し、温度20−25℃、流量0.5ml/分
の条件下、ゲルクロマトグラフィーにより行なわれる。
このように操作することにより、ｎが37-41である分子
量約16,000を有するフラクションが分別、回収される。
特に好適なものはMW約16,000及びn 37-41を有するペプ
チド混合物である。
全体の混合物及び単一フラクションのいずれも、マウス
において生物活性を示す。特に、n 37-41のペプチド混
合物が活性である。
従って、このような各種の混合物のいずれをも、マラリ
アワクチン及びマラリア診断用キットの製造に使用され
る。
下記の実施例は本発明を説明するためのものであり、本
発明を限定するものではない。
実施例１ ｉ） ブチロキシカルボニル−アスパラギニル−プロリ
ンのベンジルエステル （Boc-Asn-Pro-OBz）の合成 攪拌機を具備する反応フラスコ（250ml）に、HCl・H-Pr
o-OBz 10g（42.5ミリモル）及びN,N′−ジメチルホルム
アミド150mlを導入した。混合物を撹拌しながら、溶液
を得た。
撹拌しながら、この溶液にジイソプロピルエチルアミン
（DIPEA）7.1ml（45ミリモル）及びＮ−ヒドロキシベン
ゾトリアゾール（HOBt）8.4g（62ミリモル）を添加し、
溶液を０℃に冷却した。この冷却した溶液に、ジシクロ
ヘキシルカルボジイミド（DCl）9.37g（45ミリモル）を
添加した。溶液温度を０℃に維持して、縮合反応を90分
間行った。
その後、溶媒を反応混合物から留去し、残渣を酢酸エチ
ル（EtOAc）200mlで溶解し、５％（W/V）炭酸水素ナト
リウム溶液30ml、10％（W/V）クエン酸溶液30ml0及び塩
化ナトリウム飽和溶液30mlで順次洗浄した。
有機相を溶液から分離し、無水MgSO4 10gで乾燥した。
ついで、溶液から溶媒を留去し、EtOAc/n−ヘキサン（1
/1,V/V）100mlからの晶析により残渣を回収した。
融点105−106℃、〔α〕D 22−83.6°（ｃ＝1.2、メタノ
ール）を有する第３ブチロキシカルボニル−アスパラギ
ニル−プロリンのベンジルエステル12gが得られた。
ii） 第３ブチロキシカルボニル−アラニル−アルパラ
ギニル−プロリン （Boc-Ala-Asn-Pro-OBz）の合成 前記工程ｉ）に従って得られたBoc-Asn-Pro-OBz 117g
（28ミリモル）を、4N HClを含有するBtOAc溶液200mlに
添加した。
撹拌しながら、溶液を室温（20-25℃）に約１時間維持
した。
酸分解反応後、反応混合物から溶媒を留去し、残渣をジ
エチルエーテルと共に粉砕処理して、白色固状生成物を
得た。
Boc-Ala-OH 5.7g（30ミリモル）及びＮ−メチルモルホ
リン（NMM）3.08ml（30ミリモル）と共に、前記白色固
状物をDMF 100mlに添加した。溶液を０℃に冷却し、つ
いでこれにDCl 6,3g（30ミリモル）を添加した。反応を
０℃で90分間行った。
この時間の経過後、反応混合物から溶媒を完全に留去し
た。残渣をEtOAc 200ml中に溶解し、ついで前記工程
ｉ）と同様に、抽出、洗浄処理した。その後、有機相を
分離し、無水MgSO4で乾燥した。
有機相から溶媒を分離し、残渣をｎ−ヘキサンと共に粉
砕することによって回収した。融点71-72℃及び〔α〕D
22−94.7°（ｃ＝1.5、メタノール）を有する第３ブチ
ロキシカルボニル−アラニル−アスパラギニル−プロリ
ンのベンジルエステル10gが得られた（収率73％）。
iii） 第３ブチロキシカルボニル−アスパラギニル−
アラニル−アルパラギニル−プロリンのベンジルエステ
ル（Boc-Asn-Ala-Asn-Pro-OBz）の合成 前記工程ｉ）と同様にしてBoc-Ala-Asn-Pro-OBz 9.9g
（28ミリモル）を使用して合成を行った。
酸分解反応後、Boc-Asn-OH 5.1g（22ミリモル）を含有
するDMF 100mlに残渣を溶解した。
溶液を温度０℃に約２時間維持して縮合反応を行った。
ついで、工程ｉ）と同様に処理した。
融点153-154℃及び〔α〕D 22−91.1°（ｃ＝0.9、メタ
ノール）を有する第３ブチロキシカルボニル−アスパラ
ギニル−アラニル−アスパラギニル−プロリンのベンジ
ルエステル 6gが得られた（収率50％）。
実施例２ 第３ブチロキシカルボニル−アスパラギニル−アラニル
−アスパラギニル−プロリンのペンタクロロフェノール
エステル（Boc-Asn-Ala-Asn-Pro-OPCP）の合成 攪拌機を具備する反応容器（200ml）に、Boc-Asn-Ala-A
sn-Pro-OBz 1.5g（2.5ミリモル）及びギ酸アンモニウム
600ml（9.5ミリモル）と共に、メタノール50mlを導入し
た。
窒素雰囲気下で撹拌しながら、得られた溶液に、木炭に
担持した白金触媒（10％）1gを添加した。反応混合物を
撹拌して、懸濁液を得た。
撹拌しながら、懸濁液を窒素雰囲気下、室温に維持し、
プロリンのカルボキシル基から保護ベンジル基を完全に
除去した。反応終了後、濾過により懸濁液から触媒を除
去し、減圧下で溶媒を留去して乾固した。この残渣を、
ペンタクロロフェノール670mg（2.5ミリモル）を含有す
るEtOAc 50mlに溶解した。溶液を０℃に冷却し、これに
DCl 520mg（2.5ミリモル）を添加した。
撹拌しながら、溶液を０℃に１時間維持し、ついで室温
に約１時間維持した。
この時間の経過後、得られたジシクロヘキシル尿素を濾
過により回収し、溶媒を完全に留去した。
残基を70℃において、イソプロピルアルコール100mlで
処理し、ついで、これにジエチルエーテルを添加して晶
析を開始させる。このようにして、所望の生成物（融点
160-164℃及び〔α〕D 22−74.8°（ｃ＝0.75、メタノー
ル）を有する第３ブチロキシカルボニル−アスパラギニ
ル−アラニル−アスパラギニル−プロリンのペンタクロ
ロフェノールエステル）1gが得られた。
実施例３ ポリ（アスパラギニル−アラニル−アルパラギニル−プ
ロリン） 〔H-（Asn-Ala-Asn-Pro）n‐OH〕の合成 実施例２で得られたBoc−Asn−Ala−Asn−Pro−OPCP 50
0mg（0.65ミリモル）をトリフルオロ酢酸2.0mlに溶解し
た。溶液を撹拌し、室温に約１時間維持した。
反応終了後、減圧下で溶媒を留去し、油状残渣をジエチ
ルエーテルで処理して、白色固状物を得た。
生成物をジメチルスルホキシド2ml中に懸濁化し、混合
物を撹拌して溶液を得た。撹拌しながら、この溶液にト
リエチルアミン300μｌを少量ずつ添加した。
溶液を室温に24時間維持し、トリエチルアミン100μｌ
の添加後、さらに48時間維持した。
反応終了後、ゆっくりと撹拌した無水エタノール350ml
に、得られた溶液を約５分間で滴下した。
濾過により沈澱を回収し、減圧下で乾燥した。
生成物を約30mgのフラクションに分け、各フラクション
を0.1N酢酸1mlに溶解し、クロマトグラフィー分離処理
した。
Sephadex G25 FINE（Farmacia Upsala）カラム（2.5×8
0mm）を、温度20-25℃及び流量0.5ml/分の条件下で使用
した。
フラクションを12分間の等しい範囲で集めた26から39ま
でのフラクションを併わせ、凍結乾燥した。
H-（Asn-Ala-Asn-Pro）n‐OH（ここでｎは10以上であ
る）で表される混合物でなるポリマー115mgが得られた
（収率40％）。
Sephadex G50を充填したカラムを使用し、前記と同様に
してゲルクロマトグラフィーを行い、前記ポリマーを分
別した。
分別後、平均分子量約16,000（ｎ＝37-41に相当）を有
するポリマー30mgが、平均分子量16,000以下のポリマー
75mgと共に得られた。
ｎ＝37-41を有するフラクションの分子量を、内部算定
標準としてアルブミン（MW 45,000），ミオグロビン（M
W 18,000），トリプシン（MW 8,000）及びトリプトファ
ン（MW 200）を使用し、6M塩化グアニジニウム（guanid
inium chloride）で平衡化したBIOGEL（登録商標）Ａ−
5M（BIORAD）を充填したカラム（1.5×100cm）でのクロ
マトグラフィーにより確認した。
操作を室温で流量2.5ml/時間で行い、１時間毎にフラク
ションを集めた。
実施例４ 基質として合成ペプチドを使用して熱帯熱マラリア原虫
の抗スポロゾイドを検出するELISA検定 ｉ） 合成ペプチドでコーティングしたプレートの調製 ｎ＝37-41を有する合成ペプチドフラクションを蒸留水
に懸濁化し、ついで−70℃に維持した懸濁液の一定量を
リン酸塩緩衝化食塩水（PBS）（pH7.8）で希釈して最終
濃度１μg/lとした。
この溶液100μｌを、ELISA法で通常使用されるミクロ滴
定プレートに移した。このミクロ滴定プレートを、湿っ
た室内で、室温（20-25℃）において一夜培養した。
ii） テスト 培養終了後、プレートを、Tween 20 0.05％（重量）を
含有するPBS（PBS−Ｔ）で４回洗浄し、ついで脂質を除
去したミルク粉末５％（重量）を含有するPBS−T 200μ
ｌ（PBS−Ｔ−Ｍ）で飽和させた。プレートを室温に約
１時間静置した。
飽和溶液を除去した後、PBS−Ｔ−M 2.5％で適当に希釈
した検体の血清サンプル100μｌを各ミクロ滴定プレー
トのくぼみに滴加した。
プレートを室温で約１時間培養した。
ついで、プレーロをPBS−Ｔで４回洗浄し、1gG,1gM又は
ヒト又は動物の全免疫グロブリンフラクションに対する
ペルオキシダーゼ結合抗血清（やぎから採取した1gGフ
ラクション）100μｌを添加した。抗血清については2.5
％ PBS−Ｔ−Ｍで適当に希釈した。
室温で１時間培養した後、プレートをPBS−Ｔで４回洗
浄した。
ついで、0.1M クエン酸塩緩衝液中にH2O2 0.01％を含
有するオルト−フェニレンジアミンの溶液（0.4mg/ml）
100μｌを添加した。
20分後、2.5N H2SO4を添加して酵素反応を停止させた。
各プレートのくぼみにおける光学密度を、ミクロELISA
（Multiskan Titertek）を使用して、492nmにおける吸
光度を測定することにより定量した。
結果を、コーティングしたプレート及び非コーティング
プレートの光学密度の間の差として表示した（添加図面
参照）。
図において、横軸に検体の血清の希釈（比）を、縦軸に
492nmにおける吸光度をプロットしている。なお、各曲
線は下記の如く採取された各検体の種類を示す。
【図面の簡単な説明】
図面は本発明によるペプチド組成物を使用するマラリア
診断のためのELISA検定の結果を表わすグラフである。

Claims (16)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】マラリアワクチンの製造又はマラリア診断
    用キットの調製に使用される式（Ｉ） H-（Asn-Ala-Asn-Pro）n‐OH （式中、Asnはアスパラギンであり、Alaはアラニンであ
    り、Proはプロリンであり、ｎは37〜41の数である）で
    表されるペプチド組成物。
  2. 【請求項２】式（Ｉ） H-（Asn-Ala-Asn-Pro）n‐OH （式中、Asnはアスパラギンであり、Alaはアラニンであ
    り、Proはプロリンであり、ｎは37〜41の数である）で
    表されるペプチド組成物の製法において、 ａ） 一般式（II） X-Asn-Ala-Asn-Pro-OH （式中、Ｘは酸不安定性保護基である）を有するAsn末
    端アミノ基保護テトラペプチドを合成し、 ｂ） 前記テトラペプチド（II）をフェノールハロゲン
    化誘導体との反応により活性化して、一般式（III） X-Asn-Ala-Asn-Pro-OY （式中、Ｘは前記と同意義であり、Ｙはフェノールハロ
    ゲン化誘導体の残基である）を有するPro末端カルボキ
    シ基部でエステス化されたテトラペプチドの活性エステ
    ルを調製し、 ｃ） 前記テトラペプチド（III）から酸分解によりア
    ミノ保護基を除去して、一般式（IV） HC1・H-Asn-Ala-Asn-Pro-OY を有するテトラペプチドを調製し、 ｄ） 塩基性有機触媒の存在下で、前記テトラペプチド
    （IV）を重縮合せしめ、 ｅ） 前記式（Ｉ）で表されるペプチド混合物を分離、
    回収する、 ことを特徴とする、ペプチド組成物の製法。
  3. 【請求項３】特許請求の範囲第２項記載の製法におい
    て、前記工程ａ）におけるアミノ保護基がBocである、
    ペプチド組成物の製法。
  4. 【請求項４】特許請求の範囲第２項記載の製法におい
    て、前記工程ｂ）におけるフェノールハロゲン化誘導体
    が、フッ素化誘導体及び塩素化誘導体の中から選ばれ
    る、ペプチド組成物の製法。
  5. 【請求項５】特許請求の範囲第４項記載の製法におい
    て、前記フェノール誘導体が、ペンタクロロフェノー
    ル、トリクロロフェノール又はペンタフルオロフェノー
    ルである、ペプチド組成物の製法。
  6. 【請求項６】特許請求の範囲第２項記載の製法におい
    て、前記工程ｂ）におけるテトラペプチド（II）とフェ
    ノール誘導体との間のモル比が1/1又は1/1に近い値であ
    り、不活性有機触媒中、温度−10℃ないし40℃において
    液相で反応を行う、ペプチド組成物の製法。
  7. 【請求項７】特許請求の範囲第６項記載の製法におい
    て、前記有機触媒が酢酸エチルである、ペプチド組成物
    の製法。
  8. 【請求項８】特許請求の範囲第６項記載の製法におい
    て、反応温度が０℃ないし25℃である、ペプチド組成物
    の製法
  9. 【請求項９】特許請求の範囲第２項記載の製法におい
    て、前記工程ｃ）に当たり、前記アミノ保護基を、トリ
    フルオ酢酸又は塩酸による酸分解によって除去する、ペ
    プチド組成物の製法。
  10. 【請求項１０】特許請求の範囲第９項記載の製法におい
    て、前記酸分解を、室温（20〜25℃）、１時間又はほぼ
    １時間の条件下で行う、ペプチド組成物の製法。
  11. 【請求項１１】特許請求の範囲第２項記載の製法におい
    て、前記工程ｄ）における塩基性有機触媒が、アルキル
    第３級アミン（ここでアルキル基は炭素原子１ないし４
    個でなる）の中から選ばれる、ペプチド組成物の製法。
  12. 【請求項１２】特許請求の範囲第11項記載の製法におい
    て、前記アルキル第３級アミンがトリエチルアミンであ
    る、ペプチド組成物の製法。
  13. 【請求項１３】特許請求の範囲第12項記載の製法におい
    て、前記工程ｄ）に当たり、反応を室温（20〜25℃）又
    はこれに近い温度で行う、ペプチド組成物の製法。
  14. 【請求項１４】特許請求の範囲第２項記載の製法におい
    て、前記工程ｅ）における分離をゲルクロマトグラフィ
    ーによって行う、ペプチド組成物の製法。
  15. 【請求項１５】式（Ｉ） H-（Asn-Ala-Asn-Pro）n‐OH （式中、Asnはアスパラギンであり、Alaはアラニンであ
    り、Proはプロリンであり、ｎは37〜41の数である）で
    表されるペプチド組成物をそのままで使用したことを特
    徴とする、マラリア診断用キット。
  16. 【請求項１６】式（Ｉ） H-（Asn-Ala-Asn-Pro）n‐OH （式中、Asnはアスパラギンであり、Alaはアラニンであ
    り、Proはプロリンであり、ｎは37〜41の数である）で
    表されるペプチド組成物を基質として使用するELISA検
    定によって行うことを特徴とする、ヒト血液中のマラリ
    ア抗体の検出法。
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