JPH0772199B2 - 組み換えｄｎａ産物発現の増大 - Google Patents
組み換えｄｎａ産物発現の増大Info
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- JPH0772199B2 JPH0772199B2 JP61185005A JP18500586A JPH0772199B2 JP H0772199 B2 JPH0772199 B2 JP H0772199B2 JP 61185005 A JP61185005 A JP 61185005A JP 18500586 A JP18500586 A JP 18500586A JP H0772199 B2 JPH0772199 B2 JP H0772199B2
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- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
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- C07K14/535—Granulocyte CSF; Granulocyte-macrophage CSF
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Description
【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、多重塩基性アミノ酸残基で切断するプロテア
ーゼを発現する宿主での組み換えDNAの発現を増大させ
る方法、および、コロニー刺激因子（Colony stimulati
ng factor、以後“CSF"）およびより詳細にはヒト顆粒
球−マクロファージコロニー刺激因子（human granuloc
yte-macrophage colony stimulating factor、以後“GM
-CSF"）に関連した上記方法の使用に関するものであ
る。
ーゼを発現する宿主での組み換えDNAの発現を増大させ
る方法、および、コロニー刺激因子（Colony stimulati
ng factor、以後“CSF"）およびより詳細にはヒト顆粒
球−マクロファージコロニー刺激因子（human granuloc
yte-macrophage colony stimulating factor、以後“GM
-CSF"）に関連した上記方法の使用に関するものであ
る。
［従来技術］ CSFは、骨髄中に見られる前駆細胞を、成熟血液細胞の
特異的系統に分化させるリンホカインの一群に属するも
のである。前駆細胞に由来する成熟血液細胞の特異的系
統は、存在するCSFの型に依存する。例えば、エリトロ
ポエチン（erythropoietin）は、前駆細胞の赤血球への
成熟を誘導すると考えられており、また、トロンボポエ
チン（thrombopoietin）は前駆細胞を血小板系統へ分化
させると考えられている。同様に、顆粒球−マクロファ
ージコロニー形成は、GM-CSFの存在に依存する。本発明
は、ヒトGM−CSFの類似物質に関するものである。
特異的系統に分化させるリンホカインの一群に属するも
のである。前駆細胞に由来する成熟血液細胞の特異的系
統は、存在するCSFの型に依存する。例えば、エリトロ
ポエチン（erythropoietin）は、前駆細胞の赤血球への
成熟を誘導すると考えられており、また、トロンボポエ
チン（thrombopoietin）は前駆細胞を血小板系統へ分化
させると考えられている。同様に、顆粒球−マクロファ
ージコロニー形成は、GM-CSFの存在に依存する。本発明
は、ヒトGM−CSFの類似物質に関するものである。
ヒトGM-CSFを含むCSFは、in vivoで微量にしか生成され
ない。CSF様因子は生体組織から抽出され〔シェリダン
（Sheridan）およびスタンレー（Stanley），J.Cell.Ph
ysiol. 78:451-459（1971）〕、また、血清中および尿
中に検出されている〔ロビンソン（Robinson）他、J.Ce
ll.Physiol. 69:83-92（1967）；スタンレー他、J.Lab.
Clin.Med. 79:657-668（1972）〕。マクロファージある
いは単球であるヒト末梢血液細胞から、低力価のCSF様
因子の単離を、複数の研究者が報告している〔ムーア
（Moore）およびウィリアムス（Williams），J.Cell.Ph
ysiol. 80:195-206（1972）；コールデ（Golde）および
クライン（Kline），J.Clin.Invest. 51:2981-2983（19
72）；ムーア他，J.Natl.Cancer Inst. 50:591-601（19
73）〕。
ない。CSF様因子は生体組織から抽出され〔シェリダン
（Sheridan）およびスタンレー（Stanley），J.Cell.Ph
ysiol. 78:451-459（1971）〕、また、血清中および尿
中に検出されている〔ロビンソン（Robinson）他、J.Ce
ll.Physiol. 69:83-92（1967）；スタンレー他、J.Lab.
Clin.Med. 79:657-668（1972）〕。マクロファージある
いは単球であるヒト末梢血液細胞から、低力価のCSF様
因子の単離を、複数の研究者が報告している〔ムーア
（Moore）およびウィリアムス（Williams），J.Cell.Ph
ysiol. 80:195-206（1972）；コールデ（Golde）および
クライン（Kline），J.Clin.Invest. 51:2981-2983（19
72）；ムーア他，J.Natl.Cancer Inst. 50:591-601（19
73）〕。
上記研究者らによって単離された因子はCSFであると報
告されてきたが、その生化学的性質および生物学的性質
を完全に研究するに足る、均質なヒトCSF（GM-CSFを含
む）を充分量得ることは、今まで不可能だった。均質な
ヒトGM-CSFを充分量得られることは、研究およびある種
の白血病や貧血症のような、増殖性血液疾患の可能な治
療に有効であろう。また、ヒトGM−CSFをこれまで可能
だった以上に、高純度で多量に得られることにより、ガ
ン化学療法後の骨髄移植を有効に行なうのにヒトGM-CSF
が有効なことがわかるであろう。
告されてきたが、その生化学的性質および生物学的性質
を完全に研究するに足る、均質なヒトCSF（GM-CSFを含
む）を充分量得ることは、今まで不可能だった。均質な
ヒトGM-CSFを充分量得られることは、研究およびある種
の白血病や貧血症のような、増殖性血液疾患の可能な治
療に有効であろう。また、ヒトGM−CSFをこれまで可能
だった以上に、高純度で多量に得られることにより、ガ
ン化学療法後の骨髄移植を有効に行なうのにヒトGM-CSF
が有効なことがわかるであろう。
ヒトGM-CSFを含む均質なポリペプチド鎖をこれまで可能
であった以上に多量に生成させる、可能な方法の一つ
は、組み換えDNA技術による。組み換えDNA技術は、コー
ドする遺伝子が単離され同定されている、要求するタン
パク質を経済的に生産するために発達してきた。上記タ
ンパク質合成のための組み換えDNA技術についての論考
は、ScienceのVol.196（1977年４月）に論説および擁護
論文として述べられている。
であった以上に多量に生成させる、可能な方法の一つ
は、組み換えDNA技術による。組み換えDNA技術は、コー
ドする遺伝子が単離され同定されている、要求するタン
パク質を経済的に生産するために発達してきた。上記タ
ンパク質合成のための組み換えDNA技術についての論考
は、ScienceのVol.196（1977年４月）に論説および擁護
論文として述べられている。
［発明が解決しようとする問題点］ 多種のタンパク質物産のコードする多くの遺伝子が単離
され、酵母プレプロα接合因子（yeast pre-pro-α mat
ing factor,“α−factor"）のプロモーターおよびリー
ダー配列を用いた、酵母発現系で、機能的タンパク質産
物を発現させるためにクローン化されてきた。これらの
酵母発現系によって従来よりも多量に成熟した均質なタ
ンパク質物産が得られたが、出願人らは、取得されるタ
ンパク質物産の量は、おそらく酵母サッカロミセス・セ
レビシエ（Saccharomyces cerevisiae, “S.cerevisia
e”）のKEX2遺伝子にコードされるプロテアーゼが切断
する潜在性切断部位の存在によって、幾分制限されてい
ると仮定した。上記分泌経路プロセッシング酵素（secr
etory parhway processing enzyme）は、“二重塩基性
アミノ酸残基”すなわち、タンパク質産物のアミノ酸配
列中の二つの隣接した塩基性アミノ酸残基の部位で切断
することが見いだされた。酵母系において取得られる成
熟タンパク質産生量を増大するための試みとして、出願
人らは、多重塩基性残基をコードするコドンの置換ある
いは除去により、野生型遺伝子を改変して、“多重塩基
性アミノ酸残基”、すなわち、タンパク質産物のアミノ
酸配列で、二個以上隣接している塩基性残基を除去する
ことを試みた。
され、酵母プレプロα接合因子（yeast pre-pro-α mat
ing factor,“α−factor"）のプロモーターおよびリー
ダー配列を用いた、酵母発現系で、機能的タンパク質産
物を発現させるためにクローン化されてきた。これらの
酵母発現系によって従来よりも多量に成熟した均質なタ
ンパク質物産が得られたが、出願人らは、取得されるタ
ンパク質物産の量は、おそらく酵母サッカロミセス・セ
レビシエ（Saccharomyces cerevisiae, “S.cerevisia
e”）のKEX2遺伝子にコードされるプロテアーゼが切断
する潜在性切断部位の存在によって、幾分制限されてい
ると仮定した。上記分泌経路プロセッシング酵素（secr
etory parhway processing enzyme）は、“二重塩基性
アミノ酸残基”すなわち、タンパク質産物のアミノ酸配
列中の二つの隣接した塩基性アミノ酸残基の部位で切断
することが見いだされた。酵母系において取得られる成
熟タンパク質産生量を増大するための試みとして、出願
人らは、多重塩基性残基をコードするコドンの置換ある
いは除去により、野生型遺伝子を改変して、“多重塩基
性アミノ酸残基”、すなわち、タンパク質産物のアミノ
酸配列で、二個以上隣接している塩基性残基を除去する
ことを試みた。
［問題点解決のための手段］ 本発明は、GM-CSFに関して行なった。GM-CSFを含む、異
なる型のCSFについては、上に述べた。本出願で後述の
実質的部分では、本発明はGM-CSFに関連して論じられて
いるが、本発明はGM-CSFに制限されるものではなく、天
然に多重塩基性アミノ酸を含む、実質的に全てのタンパ
ク質産物について使用可能である。さらに、本発明にお
いて宿主は酵母細胞の使用に制限されるものではなく、
発現過程において二重塩基性アミノ酸残基部位でタンパ
ク質産物前駆体を切断するプロテアーゼを発現する、あ
らゆる宿主に適用しうる。
なる型のCSFについては、上に述べた。本出願で後述の
実質的部分では、本発明はGM-CSFに関連して論じられて
いるが、本発明はGM-CSFに制限されるものではなく、天
然に多重塩基性アミノ酸を含む、実質的に全てのタンパ
ク質産物について使用可能である。さらに、本発明にお
いて宿主は酵母細胞の使用に制限されるものではなく、
発現過程において二重塩基性アミノ酸残基部位でタンパ
ク質産物前駆体を切断するプロテアーゼを発現する、あ
らゆる宿主に適用しうる。
GM-CSF類似物質は、塩基性アミノ酸をコードする適当な
コドンを置換して、多重塩基性アミノ酸を除去すること
によって、GM-CSFの野生型遺伝子を改変させることによ
り産生した。上記置換を行なうための可能な、望ましい
手法の一つは、クレイク（Craik）著、Biotechniques,
Jan.1985,12-19に述べられているような、部位特異的in
vitroミュータジェネシス（site-specific in vitro
mutagenesis）による。上記手法では、ヒトGM-CSFをコ
ードする遺伝子をM13単鎖直鎖状ファージベクターに挿
入し、次に同ファージベクターで適当な宿主を形質転換
し、複製された鋳型単鎖DNAを産生させる。鋳型単鎖DNA
は、M13の相補的部分とアニーリングさせ、ギャップの
あるヘテロ二重鎖を形成させる。改変／置換コドンから
成る合成ミュータジェネシス オリゴヌクレオチドを、
ギャップのあるヘテロ二重鎖の単鎖部分中にある野生型
GM-CSF遺伝子に相当する部分とアニーリングさせる。変
異オリゴヌクレオチドの末端と、M13相補鎖との間のギ
ャップは、酵素的に修復し、二重鎖構造を形成させ、適
当な宿主の形質転換に使用する。適切にミュータジェネ
シスが行なわれた遺伝子は、ミュータジェネシス オリ
ゴヌクレオチドと同一の構造を有する放射性標識を施し
たオリゴヌクレオチド プローブの使用によって検出さ
れる。
コドンを置換して、多重塩基性アミノ酸を除去すること
によって、GM-CSFの野生型遺伝子を改変させることによ
り産生した。上記置換を行なうための可能な、望ましい
手法の一つは、クレイク（Craik）著、Biotechniques,
Jan.1985,12-19に述べられているような、部位特異的in
vitroミュータジェネシス（site-specific in vitro
mutagenesis）による。上記手法では、ヒトGM-CSFをコ
ードする遺伝子をM13単鎖直鎖状ファージベクターに挿
入し、次に同ファージベクターで適当な宿主を形質転換
し、複製された鋳型単鎖DNAを産生させる。鋳型単鎖DNA
は、M13の相補的部分とアニーリングさせ、ギャップの
あるヘテロ二重鎖を形成させる。改変／置換コドンから
成る合成ミュータジェネシス オリゴヌクレオチドを、
ギャップのあるヘテロ二重鎖の単鎖部分中にある野生型
GM-CSF遺伝子に相当する部分とアニーリングさせる。変
異オリゴヌクレオチドの末端と、M13相補鎖との間のギ
ャップは、酵素的に修復し、二重鎖構造を形成させ、適
当な宿主の形質転換に使用する。適切にミュータジェネ
シスが行なわれた遺伝子は、ミュータジェネシス オリ
ゴヌクレオチドと同一の構造を有する放射性標識を施し
たオリゴヌクレオチド プローブの使用によって検出さ
れる。
次に、放射性標識されたプローブで同定された候補とな
る遺伝子のヌクレオチド配列を決定し、望んだ遺伝子構
造が得られたことを確認する。続いて、改変された遺伝
子をM13ベクターから酵母発現ベクターに移し、S.cerev
isiaeに成熟したGM-CSF類似物質を発現させるための形
質転換に使用する。生物学的アッセイは、GM-CSF類似物
質が天然GM-CSF産物と実質的に同等の活性を示すことを
確認するために行なった。
る遺伝子のヌクレオチド配列を決定し、望んだ遺伝子構
造が得られたことを確認する。続いて、改変された遺伝
子をM13ベクターから酵母発現ベクターに移し、S.cerev
isiaeに成熟したGM-CSF類似物質を発現させるための形
質転換に使用する。生物学的アッセイは、GM-CSF類似物
質が天然GM-CSF産物と実質的に同等の活性を示すことを
確認するために行なった。
塩基性アミノ酸をコードしている適当なコドンを除去
し、多重塩基性アミノ酸残基が生じないようにすること
によりGM-CSFをコードする野生型遺伝子を改変すること
によってもGM-CSF類似物質を得られる。制限を与えるも
のではない実例として、塩基性アミノ酸残基をコードす
るコードの置換に関して上で述べたと同様な、部位特異
性in vitroミュータジェネシス技術によって野生型遺伝
子から適当なコドンを除去できる。上記手法において、
合成ミュータジェネシス オリゴヌクレオチドの構造
は、野生型遺伝子の対応する部分と同等だが、塩基性ア
ミノ酸をコードする、一つ以上の適当なコドンを除去し
たものである。GM-CSF類似物質をコードする組み変えDN
Aの調製法以外の点では、類似物質の発現、GM-CSF類似
物質の機能性を確認するための生物学的アッセイに関し
ては上記と同様である。
し、多重塩基性アミノ酸残基が生じないようにすること
によりGM-CSFをコードする野生型遺伝子を改変すること
によってもGM-CSF類似物質を得られる。制限を与えるも
のではない実例として、塩基性アミノ酸残基をコードす
るコードの置換に関して上で述べたと同様な、部位特異
性in vitroミュータジェネシス技術によって野生型遺伝
子から適当なコドンを除去できる。上記手法において、
合成ミュータジェネシス オリゴヌクレオチドの構造
は、野生型遺伝子の対応する部分と同等だが、塩基性ア
ミノ酸をコードする、一つ以上の適当なコドンを除去し
たものである。GM-CSF類似物質をコードする組み変えDN
Aの調製法以外の点では、類似物質の発現、GM-CSF類似
物質の機能性を確認するための生物学的アッセイに関し
ては上記と同様である。
野生型ヒトGM-CSF遺伝子の単離 ヒトGM-CSFをコードする野生型遺伝子を単離し、塩基配
列決定を行なった。そのヌクレオチド塩基配列を第1A図
の上段に示し、対応するアミノ酸配列を下段に示した
（成熟タンパク質は＊印から開始する）。pHG23と呼ば
れるクローニングプラスミドに挿入し、大腸菌（E.col
i）に形質転換した野生型遺伝子は、アメリカン・タイ
プ・カルチャー・コレクション（“ATCC"12301 Parklaw
n Drive,Rockville,Maryland 20852,USA）に受託番号39
900として寄託している。また、第２図に示した、pYαf
GM-2と命名された酵母発現プラスミドに挿入された野生
型遺伝子は、ATCCに受託番号53157として寄託してい
る。
列決定を行なった。そのヌクレオチド塩基配列を第1A図
の上段に示し、対応するアミノ酸配列を下段に示した
（成熟タンパク質は＊印から開始する）。pHG23と呼ば
れるクローニングプラスミドに挿入し、大腸菌（E.col
i）に形質転換した野生型遺伝子は、アメリカン・タイ
プ・カルチャー・コレクション（“ATCC"12301 Parklaw
n Drive,Rockville,Maryland 20852,USA）に受託番号39
900として寄託している。また、第２図に示した、pYαf
GM-2と命名された酵母発現プラスミドに挿入された野生
型遺伝子は、ATCCに受託番号53157として寄託してい
る。
簡潔に要約すると、野生型ヒトGM-CSF遺伝子をコードす
る遺伝子は、cDNAライブラリーから、ニックトランスレ
ーションを行なったcDNAプローブを用いて単離した。プ
ローブは、マウスGM-CSF cDNAライブラリーからマウスG
M-CSFのヌクレオチド配設部分に対応する合成オリゴヌ
クレオチド プローブの使用により単離した。ヒトの全
RNAは、HUT-102リンフォマＴ細胞系（lymphoma T−cell
line）および末梢血液Ｔ−リンフォマ細胞から抽出
し、次にポリアデニル化されたmRNAを全RNA抽出物から
単離した。cDNAライブラリーは、逆転写酵素を用いてポ
リアデニル化されたmRNAの逆転写を行なうことによって
調製した。DNAは、DNAポリメラーゼＩによって二本鎖に
した後、適当なクローニングベクターに挿入した。組み
換えクローニングベクターは、適当な宿主を形質転換す
るのに使用した。
る遺伝子は、cDNAライブラリーから、ニックトランスレ
ーションを行なったcDNAプローブを用いて単離した。プ
ローブは、マウスGM-CSF cDNAライブラリーからマウスG
M-CSFのヌクレオチド配設部分に対応する合成オリゴヌ
クレオチド プローブの使用により単離した。ヒトの全
RNAは、HUT-102リンフォマＴ細胞系（lymphoma T−cell
line）および末梢血液Ｔ−リンフォマ細胞から抽出
し、次にポリアデニル化されたmRNAを全RNA抽出物から
単離した。cDNAライブラリーは、逆転写酵素を用いてポ
リアデニル化されたmRNAの逆転写を行なうことによって
調製した。DNAは、DNAポリメラーゼＩによって二本鎖に
した後、適当なクローニングベクターに挿入した。組み
換えクローニングベクターは、適当な宿主を形質転換す
るのに使用した。
形質転換された宿主は単離され、プールにグループ化さ
れた。これらのプールから調製したプラスミドは、放射
性標識を施したマウスcDNAプローブとハイブリッド形成
を行なった。プローブに対してポジティブなシグナルを
与えたクローンを含むプールを単離し、次に、候補とな
るプールを再分割し、ハイブリッド形成スクリーニング
を繰り返した。最終的に、野生型ヒトGM-CSF遺伝子に対
応する単一の形質転換体が同定された。同形質転換体か
らプラスミドDNAを調製し、DNA塩基配列を決定した。野
生型ヒトGM-CSF遺伝子のコード領域は、第２図に示され
る。pYαfGM-2と命名される発現プラスミドの作製に使
用し、酵母宿主系内で成熟GM-CSFを発現させるのに使用
した。効果的なプロモーターとして酵母プレプロα接合
因子（the yeast pre-pro-α mating factor,“α‐fac
tor"）をリーダー配列とともに、酵母内でGM-CSFの合成
と分泌を行なわせるために発現プラスミドの作製に使用
した。第２図に示した、５′付着端およびα因子第２プ
ロセッシング部位を含む合成オリゴヌクレオチドを、プ
ラスミド生成を促進させ、発現レベルを増大させるため
にGM-CSF遺伝子の５′末端と結合させた。その後、発現
されたタンパク質産物がGM-CSFであることを確認するた
めの、生物学的アッセイを行なった。アッセイにより、
上記GM-CSFが顆粒球型およびマクロファージ型の混在し
たコロニーをヒト骨髄細胞から形成させる能力を有する
ことが、確証された。骨髄コロニーアッセイから、上記
GM-CSFは、1ml培養液上清あたり約1.25×106コロニー形
成単位（colony forming units,“CFU"）の水準のGM-CS
F活性の合成を誘導することが見いだされた。
れた。これらのプールから調製したプラスミドは、放射
性標識を施したマウスcDNAプローブとハイブリッド形成
を行なった。プローブに対してポジティブなシグナルを
与えたクローンを含むプールを単離し、次に、候補とな
るプールを再分割し、ハイブリッド形成スクリーニング
を繰り返した。最終的に、野生型ヒトGM-CSF遺伝子に対
応する単一の形質転換体が同定された。同形質転換体か
らプラスミドDNAを調製し、DNA塩基配列を決定した。野
生型ヒトGM-CSF遺伝子のコード領域は、第２図に示され
る。pYαfGM-2と命名される発現プラスミドの作製に使
用し、酵母宿主系内で成熟GM-CSFを発現させるのに使用
した。効果的なプロモーターとして酵母プレプロα接合
因子（the yeast pre-pro-α mating factor,“α‐fac
tor"）をリーダー配列とともに、酵母内でGM-CSFの合成
と分泌を行なわせるために発現プラスミドの作製に使用
した。第２図に示した、５′付着端およびα因子第２プ
ロセッシング部位を含む合成オリゴヌクレオチドを、プ
ラスミド生成を促進させ、発現レベルを増大させるため
にGM-CSF遺伝子の５′末端と結合させた。その後、発現
されたタンパク質産物がGM-CSFであることを確認するた
めの、生物学的アッセイを行なった。アッセイにより、
上記GM-CSFが顆粒球型およびマクロファージ型の混在し
たコロニーをヒト骨髄細胞から形成させる能力を有する
ことが、確証された。骨髄コロニーアッセイから、上記
GM-CSFは、1ml培養液上清あたり約1.25×106コロニー形
成単位（colony forming units,“CFU"）の水準のGM-CS
F活性の合成を誘導することが見いだされた。
コドン置換によって変異させたGM-CSF遺伝子のクローニ
ング 本発明の一つの見解に従えば、変異ヒトGM-CSF遺伝子
は、塩基性アミノ酸残基をコードするコドンを非塩基性
アミノ酸残基をコードするコドンに置換することによっ
て調製される。変異させた遺伝子は、多重塩基性アミノ
酸残基の全くないGM-CSF類似物質の発現に使用するた
め、クローン化する。本発明のひとつの特定な例におい
ては、野生型遺伝子のアミノ酸残基No.23、アルギニン
をコードしているコドンを、非塩基性アミノ酸をコード
するコドンに置換し、それによって、GM-CSFのアミノ酸
残基No.23および24の多重塩基性配列アルギニン−アル
ギニン（第1A図）を除いた。置換する残基は任意の非塩
基性アミノ酸残基で構成され得る；しかしながら、置換
残基は、GM-CSF発現産物の望ましくない切断を行なわせ
る酵素切断部位を作らないように選ばねばならない。置
換アミノ酸残基は、ロイシンあるいは、リシンを除くあ
らゆる他のアミノ酸を使用することが望ましい。置換ア
ミノ酸残基はロイシンから成ることが理想的である。
ング 本発明の一つの見解に従えば、変異ヒトGM-CSF遺伝子
は、塩基性アミノ酸残基をコードするコドンを非塩基性
アミノ酸残基をコードするコドンに置換することによっ
て調製される。変異させた遺伝子は、多重塩基性アミノ
酸残基の全くないGM-CSF類似物質の発現に使用するた
め、クローン化する。本発明のひとつの特定な例におい
ては、野生型遺伝子のアミノ酸残基No.23、アルギニン
をコードしているコドンを、非塩基性アミノ酸をコード
するコドンに置換し、それによって、GM-CSFのアミノ酸
残基No.23および24の多重塩基性配列アルギニン−アル
ギニン（第1A図）を除いた。置換する残基は任意の非塩
基性アミノ酸残基で構成され得る；しかしながら、置換
残基は、GM-CSF発現産物の望ましくない切断を行なわせ
る酵素切断部位を作らないように選ばねばならない。置
換アミノ酸残基は、ロイシンあるいは、リシンを除くあ
らゆる他のアミノ酸を使用することが望ましい。置換ア
ミノ酸残基はロイシンから成ることが理想的である。
アミノ酸残基No.23のアルギニンを非塩基性アミノ酸に
置換するのではなく、代わりとしてアミノ酸残基No.24
のアルギニンを適当な非塩基性アミノ酸、例えば上記の
アミノ酸の一つと置換することも、本発明の範囲内であ
ることは理解されるべきである。さらに、No.23および2
4のアルギニン残基を両方、非塩基性アミノ酸残基と置
換することもできる。置換される特有のアミノ酸残基に
ついての必須の規準は、置換によって多重塩基性アミノ
酸は除去されるがGM-CSFの生物学的活性は実質的に維持
されることである。
置換するのではなく、代わりとしてアミノ酸残基No.24
のアルギニンを適当な非塩基性アミノ酸、例えば上記の
アミノ酸の一つと置換することも、本発明の範囲内であ
ることは理解されるべきである。さらに、No.23および2
4のアルギニン残基を両方、非塩基性アミノ酸残基と置
換することもできる。置換される特有のアミノ酸残基に
ついての必須の規準は、置換によって多重塩基性アミノ
酸は除去されるがGM-CSFの生物学的活性は実質的に維持
されることである。
理想的には、非塩基性アミノ酸残基をコードするコドン
は、宿主細胞によって最も多く遺伝子発現されるものを
選択するのがよい。S.cerevisiae では、特異的なコドン構成から成る遺伝子
にコードされた産物の方が、ある特定のアミノ酸残基に
関して異なったコドン構成を有する同じ遺伝子にコード
された産物より、はるかに高頻度で発現することが知ら
れている。特異的な例として、S.cerevisiae中で高頻度
で発現している遺伝子では、ロイシン残基をコードして
いるコドンのうち、92％がTTGコドンを含み、ロイシン
をコードする他の５個のコドンは８％しか含まれていな
い。上述のように、GM-CSFでもし置換する残基がロイシ
ンならば、コドンTTGを使用することが理想的である。
は、宿主細胞によって最も多く遺伝子発現されるものを
選択するのがよい。S.cerevisiae では、特異的なコドン構成から成る遺伝子
にコードされた産物の方が、ある特定のアミノ酸残基に
関して異なったコドン構成を有する同じ遺伝子にコード
された産物より、はるかに高頻度で発現することが知ら
れている。特異的な例として、S.cerevisiae中で高頻度
で発現している遺伝子では、ロイシン残基をコードして
いるコドンのうち、92％がTTGコドンを含み、ロイシン
をコードする他の５個のコドンは８％しか含まれていな
い。上述のように、GM-CSFでもし置換する残基がロイシ
ンならば、コドンTTGを使用することが理想的である。
本発明のGM-CSF類似物質は、類似タンパク質産物をコー
ドする、変異GM-CSF遺伝子を使用して組み換えDNA技術
によって産生させることが望ましい。本発明の望ましい
形のひとつは、要求される非塩基性アミノ酸残基をコー
ドするコドンを、目的の塩基性アミノ酸残基をコードす
るコドンの代わりに置換することによって、変異遺伝子
を作製することである。上記置換を行なうには、クレイ
ク（Craik）が概略を記述した（前出）、オリゴヌクレ
オチドで誘導される部位特異性ミュータジェネシス技術
を含む、多種の部位特異性ミュータジェネシス法が使用
可能である。一つの手法では、１個から数個の要求する
ヌクレオチド不適正塩基対を除いては、クローン化した
DNA分子領域と相補的である合成オリゴヌクレオチドに
よって規定された配列を利用する。上記合成ヌクレオチ
ドを、ファージベクター中に取り込ませた、原型となる
（野生型）DNA分子の一本鎖鋳型クローン（＋）とアニ
ーリングさせる。合成オリゴヌクレオチドは一本鎖鋳型
クローンと完全には対応していないが、適当な（厳しく
ない）ハイブリッド形成条件下、特に、不適合塩基対が
オリゴヌクレオチドの末端でなく、中央部付近であれ
ば、アニーリングするであろう。不適合オリゴヌクレオ
チドは、DNAポリメラーザが相補（−）鎖の残余部を合
成する際のプライマーとして働き、適当な宿主を形質転
換し、不適合塩基対を修復させ、野生型および変異型遺
伝子を産生することに使用される、二本鎖分子が形成さ
れる。
ドする、変異GM-CSF遺伝子を使用して組み換えDNA技術
によって産生させることが望ましい。本発明の望ましい
形のひとつは、要求される非塩基性アミノ酸残基をコー
ドするコドンを、目的の塩基性アミノ酸残基をコードす
るコドンの代わりに置換することによって、変異遺伝子
を作製することである。上記置換を行なうには、クレイ
ク（Craik）が概略を記述した（前出）、オリゴヌクレ
オチドで誘導される部位特異性ミュータジェネシス技術
を含む、多種の部位特異性ミュータジェネシス法が使用
可能である。一つの手法では、１個から数個の要求する
ヌクレオチド不適正塩基対を除いては、クローン化した
DNA分子領域と相補的である合成オリゴヌクレオチドに
よって規定された配列を利用する。上記合成ヌクレオチ
ドを、ファージベクター中に取り込ませた、原型となる
（野生型）DNA分子の一本鎖鋳型クローン（＋）とアニ
ーリングさせる。合成オリゴヌクレオチドは一本鎖鋳型
クローンと完全には対応していないが、適当な（厳しく
ない）ハイブリッド形成条件下、特に、不適合塩基対が
オリゴヌクレオチドの末端でなく、中央部付近であれ
ば、アニーリングするであろう。不適合オリゴヌクレオ
チドは、DNAポリメラーザが相補（−）鎖の残余部を合
成する際のプライマーとして働き、適当な宿主を形質転
換し、不適合塩基対を修復させ、野生型および変異型遺
伝子を産生することに使用される、二本鎖分子が形成さ
れる。
幾分改良された、望ましい手法として、単鎖鋳型DNA
（＋）をファージ相補鎖（−）の部分とともに、合成ミ
ュータジェネシス オリゴヌクレオチドとアニーリング
させ、それによって、オリゴヌクレオチドの末端と相補
鎖（−）フラグメントとの間のギャップを残すことがで
きる。上記ギャップを酵素的に埋めて、次にこのギャッ
プを埋められた二重鎖DNAで、適当な宿主の形質転換を
行ない、変異型遺伝子の複製を行なわせる。
（＋）をファージ相補鎖（−）の部分とともに、合成ミ
ュータジェネシス オリゴヌクレオチドとアニーリング
させ、それによって、オリゴヌクレオチドの末端と相補
鎖（−）フラグメントとの間のギャップを残すことがで
きる。上記ギャップを酵素的に埋めて、次にこのギャッ
プを埋められた二重鎖DNAで、適当な宿主の形質転換を
行ない、変異型遺伝子の複製を行なわせる。
別の部位特異性ミュータジェネシス技術も、本発明に関
連してGM-CSF遺伝子中の多重塩基性アミノ酸をコードす
るコドンの置換に使用できる。例えば、要望する塩基配
列と変異をおこさせるオリゴヌクレオチドとをアニーリ
ングさせるために、二本鎖DNA分子に一本鎖部分を生じ
させるための技術が開発された。上記の技術の一例で
は、プラスミドDNAに、エチジウムブロマイド存在下で
制限エンドヌクレアーゼで一本鎖ニックを生じさせ、次
に、上記ニックを、ミクロコカス・ルテウス（Micrococ
cus luteus）DNAポリメラーゼで、ギャップに広げる。
ショートル（Shortle）他、Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)
79:1588−1592（1982）。変異型オリゴヌクレオチド
は、次に上記プラスミドの一重鎖部分とアニーリングさ
せ、オリゴヌクレオチド末端のギャップは酵素的に修復
させる。
連してGM-CSF遺伝子中の多重塩基性アミノ酸をコードす
るコドンの置換に使用できる。例えば、要望する塩基配
列と変異をおこさせるオリゴヌクレオチドとをアニーリ
ングさせるために、二本鎖DNA分子に一本鎖部分を生じ
させるための技術が開発された。上記の技術の一例で
は、プラスミドDNAに、エチジウムブロマイド存在下で
制限エンドヌクレアーゼで一本鎖ニックを生じさせ、次
に、上記ニックを、ミクロコカス・ルテウス（Micrococ
cus luteus）DNAポリメラーゼで、ギャップに広げる。
ショートル（Shortle）他、Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)
79:1588−1592（1982）。変異型オリゴヌクレオチド
は、次に上記プラスミドの一重鎖部分とアニーリングさ
せ、オリゴヌクレオチド末端のギャップは酵素的に修復
させる。
さらに、別の“ギャップのある二重鎖”は、ニックのあ
るプラスミド、あるいは、直鎖状プラスミドをエキソヌ
クレアーゼIIIを用いて制御下で消化を行なうことによ
り、二重鎖DNA分子から調製することができる。ワレス
（Wallace）他、Nucl.Acods Res. 9:3647-3658（198
1）；およびダルバディー‐マクファ−ランド（Dalbadi
e-McFarland）他、Proc.Nat.Acad.Sci.(USA) 79:6409-6
413（1982）。
るプラスミド、あるいは、直鎖状プラスミドをエキソヌ
クレアーゼIIIを用いて制御下で消化を行なうことによ
り、二重鎖DNA分子から調製することができる。ワレス
（Wallace）他、Nucl.Acods Res. 9:3647-3658（198
1）；およびダルバディー‐マクファ−ランド（Dalbadi
e-McFarland）他、Proc.Nat.Acad.Sci.(USA) 79:6409-6
413（1982）。
単鎖鋳型DNAの調製 野生型GM-CSF遺伝子に対応する単鎖鋳型DNAは、複製型
二重鎖DNAをクローニングベクターとして使用すれば、
単鎖DNA分子産物を生成可能なファージベクター中で野
生型遺伝子をクローン化することによって調製される。
上記のようなファージ株の一つは、M13である。フー（H
u）およびメシング（Messing），Gene,17:271-277;およ
び、メシング，Methods In Enzymology, 101:20-78（19
83）参照。以下に述べるように、変異型GM-CSF遺伝子を
発現させるのに使用する発現プラスミドに含まれる、α
因子プロモーターおよびリーダー配列と変異型GM-CSF遺
伝子との結合に使用するため、GM-CSF遺伝子の５′末端
に付着した二重鎖オリゴヌクレオチドで複製型DNAファ
ージクローニングベクターが構成されていることが望ま
しい。上記二重鎖オリゴヌクレオチドの例を、第３図に
示した。発現レベルを増大させるには、二重鎖オリゴヌ
クレオチドはともに、GM-CSF遺伝子の５′末端に隣接し
た、オリゴヌクレオチド３′末端で、２番目のα−因子
プロセッシング部位を形成していることが、理想的であ
る。
二重鎖DNAをクローニングベクターとして使用すれば、
単鎖DNA分子産物を生成可能なファージベクター中で野
生型遺伝子をクローン化することによって調製される。
上記のようなファージ株の一つは、M13である。フー（H
u）およびメシング（Messing），Gene,17:271-277;およ
び、メシング，Methods In Enzymology, 101:20-78（19
83）参照。以下に述べるように、変異型GM-CSF遺伝子を
発現させるのに使用する発現プラスミドに含まれる、α
因子プロモーターおよびリーダー配列と変異型GM-CSF遺
伝子との結合に使用するため、GM-CSF遺伝子の５′末端
に付着した二重鎖オリゴヌクレオチドで複製型DNAファ
ージクローニングベクターが構成されていることが望ま
しい。上記二重鎖オリゴヌクレオチドの例を、第３図に
示した。発現レベルを増大させるには、二重鎖オリゴヌ
クレオチドはともに、GM-CSF遺伝子の５′末端に隣接し
た、オリゴヌクレオチド３′末端で、２番目のα−因子
プロセッシング部位を形成していることが、理想的であ
る。
二重鎖オリゴヌクレオチドと結合し、その中に野生型GM
-CSF遺伝子が挿入されているファージベクターは、大腸
菌（E.coli）の種々の株のような、適当な細菌宿主のト
ランスフェクシヨンに使用する。本発明に関連して使用
され得る代表的な大腸菌（E.coli）株には、E.coli K12
のJM101、JM103、JM105、及びJM107の各株がある（ベセ
スダ・リサーチ・ラボラトリーズ，メアリーランド州ベ
セスダ）。
-CSF遺伝子が挿入されているファージベクターは、大腸
菌（E.coli）の種々の株のような、適当な細菌宿主のト
ランスフェクシヨンに使用する。本発明に関連して使用
され得る代表的な大腸菌（E.coli）株には、E.coli K12
のJM101、JM103、JM105、及びJM107の各株がある（ベセ
スダ・リサーチ・ラボラトリーズ，メアリーランド州ベ
セスダ）。
オリゴヌクレオチドの調製 野生型GM-CSF遺伝子から置換した、要求するコドンを含
むオリゴヌクレオチドは、ホスホジエステルあるいはホ
スホトリエステル法のような、既知の技術で容易に合成
される。トリエステル合成法の詳細は、例えば、スード
（Sood）他、Nucl.Acid Res.4:2557（1977）；およびヒ
ロセ（Hirose）他、Tet.Lett. 28:2449（1978）に記述
されている。
むオリゴヌクレオチドは、ホスホジエステルあるいはホ
スホトリエステル法のような、既知の技術で容易に合成
される。トリエステル合成法の詳細は、例えば、スード
（Sood）他、Nucl.Acid Res.4:2557（1977）；およびヒ
ロセ（Hirose）他、Tet.Lett. 28:2449（1978）に記述
されている。
置換されたコドンは、オリゴヌクレオチドのほぼ中央に
位置し、オリゴヌクレオチドは上述のように調製した単
鎖DNAと容易にハイブリッド形成する程度に十分長く、
一方、比較的容易に合成される程度に短いことが望まし
い。制限を与えない実例として、上述のように、野生型
GM-CSF遺伝子のアミノ酸残基番号23のアルギニンをロイ
シンと置換したとすれば、MCD5-27と命名されたオリゴ
ヌクレオチドは、以下の構造を有する:5′−CATCCAGGAG
GCCTTGCGTCTCCTGAA−３′。上記オリゴヌクレオチド構
造中で、下線で示した、ロイシンに対応するコドン、TT
Gは、オリゴヌクレオチドの中央近傍に位置する。上述
のように、ロイシンをコードするコドンの、上記の特有
の構造は、GM-CSF類似物質の発現を最大にするために選
択された。近接した、より短い、あるいは、より長いヌ
クレオチドも使用可能であり、置換コドンはオリゴヌク
レオチド中の上記の部位に位置する必要性はない、とい
うことは理解されるべきである。
位置し、オリゴヌクレオチドは上述のように調製した単
鎖DNAと容易にハイブリッド形成する程度に十分長く、
一方、比較的容易に合成される程度に短いことが望まし
い。制限を与えない実例として、上述のように、野生型
GM-CSF遺伝子のアミノ酸残基番号23のアルギニンをロイ
シンと置換したとすれば、MCD5-27と命名されたオリゴ
ヌクレオチドは、以下の構造を有する:5′−CATCCAGGAG
GCCTTGCGTCTCCTGAA−３′。上記オリゴヌクレオチド構
造中で、下線で示した、ロイシンに対応するコドン、TT
Gは、オリゴヌクレオチドの中央近傍に位置する。上述
のように、ロイシンをコードするコドンの、上記の特有
の構造は、GM-CSF類似物質の発現を最大にするために選
択された。近接した、より短い、あるいは、より長いヌ
クレオチドも使用可能であり、置換コドンはオリゴヌク
レオチド中の上記の部位に位置する必要性はない、とい
うことは理解されるべきである。
変異遺伝子のクローニング 第３図に示したように、ヘテロ二重鎖DNAの形成に使用
するため、必須ではないが理想的には二重鎖野生型M13
DNAを、単鎖鋳型の作製に使用するものと同株から調製
する。二重鎖DNAは、置換コドンの領域を除いて、実質
的に全鋳型鎖（＋）と重なることが望ましい。
するため、必須ではないが理想的には二重鎖野生型M13
DNAを、単鎖鋳型の作製に使用するものと同株から調製
する。二重鎖DNAは、置換コドンの領域を除いて、実質
的に全鋳型鎖（＋）と重なることが望ましい。
野生型M13 DNA部分と、オリゴヌクレオチドは、既知の
一般的方法によって鋳型鎖（＋）とアニーリングさせ、
ギャップのある二重鎖構造を形成させる。オリゴヌクレ
オチドの末端と相補鎖（−）は対応する末端との間のギ
ャップは大腸菌（E.Coli）DNAポリメラーゼ（“クレノ
ー”フラグメント）およびT4 DNAガーゼを用いた一般的
手法によって埋める。その後、上記共有結合的に閉じた
ヘテロ二重鎖は、大腸菌（E.coli株のような、適当な宿
主の形質転換に使用される。宿主のトランスフェクショ
ンおよびヘテロ二重鎖の複製の際には、GM-CSF遺伝子の
野生型あるいは変異型コピーのいずれかを含む、混合し
た子孫が産生される。
一般的方法によって鋳型鎖（＋）とアニーリングさせ、
ギャップのある二重鎖構造を形成させる。オリゴヌクレ
オチドの末端と相補鎖（−）は対応する末端との間のギ
ャップは大腸菌（E.Coli）DNAポリメラーゼ（“クレノ
ー”フラグメント）およびT4 DNAガーゼを用いた一般的
手法によって埋める。その後、上記共有結合的に閉じた
ヘテロ二重鎖は、大腸菌（E.coli株のような、適当な宿
主の形質転換に使用される。宿主のトランスフェクショ
ンおよびヘテロ二重鎖の複製の際には、GM-CSF遺伝子の
野生型あるいは変異型コピーのいずれかを含む、混合し
た子孫が産生される。
クローン化したDNA分子のスクリーニング 宿主のトランスフェクションから得られたプラークは、
理想的には変異オリゴヌクレオチドと同じ構造を有する
放射性標識を施したオリゴヌクレオチドプローブを用い
て、オリゴヌクレオチド誘導体変異型DNA分子をスクリ
ーニングする。オリゴヌクレオチドプローブは、多種の
異なるアイソトープを用いて、多種の異なる手法で放射
性標識しうるが、T4ポリヌクレオチドキナーゼおよび32
P-ATPを用いてプローブを放射性標識することが望まし
い。標識法に関する標準的な方法は、マニアティス（Ma
niatis）他、Molecular Cloning,a Laboratory Manual,
コールド・スプリング・ハーバー・研究所、ニューヨー
ク州コールドスプリング（1982）に述べられている。
理想的には変異オリゴヌクレオチドと同じ構造を有する
放射性標識を施したオリゴヌクレオチドプローブを用い
て、オリゴヌクレオチド誘導体変異型DNA分子をスクリ
ーニングする。オリゴヌクレオチドプローブは、多種の
異なるアイソトープを用いて、多種の異なる手法で放射
性標識しうるが、T4ポリヌクレオチドキナーゼおよび32
P-ATPを用いてプローブを放射性標識することが望まし
い。標識法に関する標準的な方法は、マニアティス（Ma
niatis）他、Molecular Cloning,a Laboratory Manual,
コールド・スプリング・ハーバー・研究所、ニューヨー
ク州コールドスプリング（1982）に述べられている。
候補となるプラークは選択し、32Pで標識したオリゴヌ
クレオチドプローブでスクリーニングを行なう。選択し
たプラークは、YT培地を含む、ミクロタイターウェル
（microtiter wells）での培養に使用する。適当な培養
期間の後、候補となる培養液を、YTプレート上にのせた
ニトロセルロースフィルター上にスポットする。さらに
培養した後、DNAを遊離させ、ニトロセルロースフィル
ターに結合させる。結合したDNAは、次に、標識を施し
たオリゴヌクレオチドプローブとハイブリッド形成させ
る。プローブとハイブリッド形成した、特異的DNAフラ
グメントは、オートラジオグラフィーで同定する。上記
手法によって部位特異性変異を含む候補が同定される。
M13HuGMLeu23と命名される、部位特異性変異を含む、単
鎖ファージおよび二重鎖複製型DNAが調製される。
クレオチドプローブでスクリーニングを行なう。選択し
たプラークは、YT培地を含む、ミクロタイターウェル
（microtiter wells）での培養に使用する。適当な培養
期間の後、候補となる培養液を、YTプレート上にのせた
ニトロセルロースフィルター上にスポットする。さらに
培養した後、DNAを遊離させ、ニトロセルロースフィル
ターに結合させる。結合したDNAは、次に、標識を施し
たオリゴヌクレオチドプローブとハイブリッド形成させ
る。プローブとハイブリッド形成した、特異的DNAフラ
グメントは、オートラジオグラフィーで同定する。上記
手法によって部位特異性変異を含む候補が同定される。
M13HuGMLeu23と命名される、部位特異性変異を含む、単
鎖ファージおよび二重鎖複製型DNAが調製される。
スクリーニングされたGM-CSF変異の塩基配列決定 上述のように調製された単鎖ファージDNAは、標準的な
チェインターミネーション法で塩基配列決定を行なう。
上記ヌクレオチド塩基配列決定法は、サンガー（Sange
r）他，proc.Natl.Acad.Sci.(USA) 70:5463（1977）に
よって開発された。米国特許No.4,322,499参照。チェイ
ンターミネーション塩基配列決定法は、以下の文献参
照：M13 Cloning and Sequencingと題するアマーシャム
・ハンドブック，ブレンハイム・クレセント，ロンドン
（1983）（以後“アマーシャム・ハンドブック";メシン
グ（Messing）著，Recombinant DNA Technical Bulleti
n,NIH Publication No.79-99, 2,43-48（1979）：ノラ
ンダー（Norrander）他著，Gene 26:101（1983）；セレ
ッティ（Cerretti）他著，Nucl,Acids Res, 11:2599（1
983）；および、ビギン（Biggin）他著，Proc,Natl.Aca
d.Sci.(USA)80:3963（1983）。
チェインターミネーション法で塩基配列決定を行なう。
上記ヌクレオチド塩基配列決定法は、サンガー（Sange
r）他，proc.Natl.Acad.Sci.(USA) 70:5463（1977）に
よって開発された。米国特許No.4,322,499参照。チェイ
ンターミネーション塩基配列決定法は、以下の文献参
照：M13 Cloning and Sequencingと題するアマーシャム
・ハンドブック，ブレンハイム・クレセント，ロンドン
（1983）（以後“アマーシャム・ハンドブック";メシン
グ（Messing）著，Recombinant DNA Technical Bulleti
n,NIH Publication No.79-99, 2,43-48（1979）：ノラ
ンダー（Norrander）他著，Gene 26:101（1983）；セレ
ッティ（Cerretti）他著，Nucl,Acids Res, 11:2599（1
983）；および、ビギン（Biggin）他著，Proc,Natl.Aca
d.Sci.(USA)80:3963（1983）。
チェインターミネーション法では、単鎖鋳型分子は、遊
離３′水酸基を有する短いユニバーサルプライマー鎖で
反応を開始させ、４種のデオキシリボヌクレオチド３リ
ン酸、すなわち、dATP,dCTP,dGTP、およびdTTP（総括し
て“dNTPs"と呼ぶ）全てを、一種は放射性標識を施して
用い、DNAポリメラーゼ（クレノーフラグメント）の使
用により、伸長反応によって鋳型鎖を複製する。合成反
応において、３′−水酸基末端を欠いたヌクレオチド特
異性チェインターミネーター、例えば、２′,3′−ジデ
オキシヌクレオチド３リン酸（“ddNTP"）を用いて、一
連の、異なる鎖長の伸長反応をおこす。ターミネーター
は、通常の５′末端を有するので、DNA鎖の伸長に寄与
しうるが、３′−水酸基端末を欠く。一旦、ターミネー
ターがDNA鎖に結合すると、それ以上デオキシヌクレオ
チド３リン酸が付加できないため、DNA鎖の伸長は停止
する。４種のヌクレオチドdNTP、すなわち、dATP,dCTP,
dGTPおよびdTTPのうち一種が、ddNTPを含む、４種の独
立した合成反応を行なう。通常のdNTPのうち一種は放射
性標識し、ポリアクリルアミドゲルで鎖長によって分離
した後、合成DNA鎖をオートラジオグラフィーを行なえ
るようにする。４種の反応によるDNA鎖伸長の結果は、
独立のゲルレーンに隣接して電気泳動を行ない、オート
ラジオグラフィーによるフラグメントのパターンを、ク
ローン化したDNAの核酸塩基配列と反応させる。
離３′水酸基を有する短いユニバーサルプライマー鎖で
反応を開始させ、４種のデオキシリボヌクレオチド３リ
ン酸、すなわち、dATP,dCTP,dGTP、およびdTTP（総括し
て“dNTPs"と呼ぶ）全てを、一種は放射性標識を施して
用い、DNAポリメラーゼ（クレノーフラグメント）の使
用により、伸長反応によって鋳型鎖を複製する。合成反
応において、３′−水酸基末端を欠いたヌクレオチド特
異性チェインターミネーター、例えば、２′,3′−ジデ
オキシヌクレオチド３リン酸（“ddNTP"）を用いて、一
連の、異なる鎖長の伸長反応をおこす。ターミネーター
は、通常の５′末端を有するので、DNA鎖の伸長に寄与
しうるが、３′−水酸基端末を欠く。一旦、ターミネー
ターがDNA鎖に結合すると、それ以上デオキシヌクレオ
チド３リン酸が付加できないため、DNA鎖の伸長は停止
する。４種のヌクレオチドdNTP、すなわち、dATP,dCTP,
dGTPおよびdTTPのうち一種が、ddNTPを含む、４種の独
立した合成反応を行なう。通常のdNTPのうち一種は放射
性標識し、ポリアクリルアミドゲルで鎖長によって分離
した後、合成DNA鎖をオートラジオグラフィーを行なえ
るようにする。４種の反応によるDNA鎖伸長の結果は、
独立のゲルレーンに隣接して電気泳動を行ない、オート
ラジオグラフィーによるフラグメントのパターンを、ク
ローン化したDNAの核酸塩基配列と反応させる。
第1B図は、M13HuGMLeu23プラスミドDNAに含まれる変異
型ヒトGM-CSF遺伝子のヌクレオチド塩基配列を示したも
のである。変異型遺伝子のコード領域の、対応するアミ
ノ酸配列も、No.1アラニン残基（ヌクレオチドNo.14）
からNo.127グルタミン酸残基（ヌクレオチドNo.394）ま
で第1B図に示されている。予想されるように、M13HuGML
eu23変異体は、野生型遺伝子（第1A図）と、23番目のコ
ドンのみが異なり、改変された遺伝子では、CCG（Arg）
のかわりにTTG（Leu）という配列になっている。第1B図
において、変異型遺伝子のコード領域の５′側のヌクレ
オチドは、α−因子第２プロセッシング部位およびHind
III5′付着端（ヌクレオチドNo.−６からNo.13）を構成
する。
型ヒトGM-CSF遺伝子のヌクレオチド塩基配列を示したも
のである。変異型遺伝子のコード領域の、対応するアミ
ノ酸配列も、No.1アラニン残基（ヌクレオチドNo.14）
からNo.127グルタミン酸残基（ヌクレオチドNo.394）ま
で第1B図に示されている。予想されるように、M13HuGML
eu23変異体は、野生型遺伝子（第1A図）と、23番目のコ
ドンのみが異なり、改変された遺伝子では、CCG（Arg）
のかわりにTTG（Leu）という配列になっている。第1B図
において、変異型遺伝子のコード領域の５′側のヌクレ
オチドは、α−因子第２プロセッシング部位およびHind
III5′付着端（ヌクレオチドNo.−６からNo.13）を構成
する。
上に概略を述べたチェインターミネーション技術を使わ
ずに、他の既知の方法で、クローン化されたヒトcDNA挿
入物の塩基配列決定を行なっても、本発明の意図および
範囲からはずれないことは、理解されるべきである。例
えば、Proc,Natl.Acad.Sci.(USA) 74:560（1977）に記
述されているマクサム（Maxam）とギルバート（Gilber
t）の化学的分解法も使用できる。
ずに、他の既知の方法で、クローン化されたヒトcDNA挿
入物の塩基配列決定を行なっても、本発明の意図および
範囲からはずれないことは、理解されるべきである。例
えば、Proc,Natl.Acad.Sci.(USA) 74:560（1977）に記
述されているマクサム（Maxam）とギルバート（Gilber
t）の化学的分解法も使用できる。
GM-CSF類似物質の発現 HindIII切断部位（核酸No.−６）からNco I切断部位
（核酸No.502）までの、第1B図に示したM13HuGMLeu23 c
DNAフラグメントを、酵母宿主細胞から成熟型GM-CSF類
似物質の合成および分泌を誘導するように考案された発
現ベクター（第４図参照）に挿入する。発現ベクター、
例えば、pYαfHuGMLeu23は、複製起点およびアンピシリ
ン抵抗性遺伝子（Ampr）（第４図の太線部）を含むプラ
スミドpBR322由来の塩基配列を含むことが望ましい。ま
た、発現ベクターは、例えば選択マーカーとしてトリプ
トファン−１遺伝子（Trp−１）および酵母２μ複製起
点（第４図細線部）のような、酵母由来の塩基配列を含
むことが望ましい。さらに、発現ベクターは、酵母宿主
中でGM-CSFの合成および分泌を誘導する有効なプロモー
ターおよびリーダー配列として、酵母α−因子（例え
ば、点描部）を含み、続いて、二重鎖にし、結合させた
オリゴヌクレオチド由来のα−因子第２プロセッシング
部位（白ヌキ部分）、および、次に、GM-CSFのコード領
域の塩基配列（斜線部）を含んでいることが理想的であ
る。αー因子遺伝子の構造は、クルジャン（Kurjan）お
よびヘルスコウィッツ（Herslowitz），Cell 30:933-94
3（1982）に述べられている。
（核酸No.502）までの、第1B図に示したM13HuGMLeu23 c
DNAフラグメントを、酵母宿主細胞から成熟型GM-CSF類
似物質の合成および分泌を誘導するように考案された発
現ベクター（第４図参照）に挿入する。発現ベクター、
例えば、pYαfHuGMLeu23は、複製起点およびアンピシリ
ン抵抗性遺伝子（Ampr）（第４図の太線部）を含むプラ
スミドpBR322由来の塩基配列を含むことが望ましい。ま
た、発現ベクターは、例えば選択マーカーとしてトリプ
トファン−１遺伝子（Trp−１）および酵母２μ複製起
点（第４図細線部）のような、酵母由来の塩基配列を含
むことが望ましい。さらに、発現ベクターは、酵母宿主
中でGM-CSFの合成および分泌を誘導する有効なプロモー
ターおよびリーダー配列として、酵母α−因子（例え
ば、点描部）を含み、続いて、二重鎖にし、結合させた
オリゴヌクレオチド由来のα−因子第２プロセッシング
部位（白ヌキ部分）、および、次に、GM-CSFのコード領
域の塩基配列（斜線部）を含んでいることが理想的であ
る。αー因子遺伝子の構造は、クルジャン（Kurjan）お
よびヘルスコウィッツ（Herslowitz），Cell 30:933-94
3（1982）に述べられている。
pYαfHuGMLeu23発現プラスミドは、S.セレビシエ（S.ce
revisiae）の適当な株で形質転換を行なう。限定するも
のではないが、望ましい株は酵母79,X2181-1B,DBY746,Y
NN282,20B-12などである。上記の株は、α−因子プロモ
ーターと適合し、Trp+形質転換体の選択のため、全て
α,Trp−１である。上記各株は、広く入手可能で、例え
ば、79株は米国カリフォルニア州バークレーのカリフォ
ルニア大学生物物理および医学物理学部イースト・ジェ
ネティック・ストック・センター（the Yeast Genetic
Stock Center,Department of Biophysics and Medical
Physics,Universiry of California,Barkeley,Californ
ia,94702）から入手可能である。
revisiae）の適当な株で形質転換を行なう。限定するも
のではないが、望ましい株は酵母79,X2181-1B,DBY746,Y
NN282,20B-12などである。上記の株は、α−因子プロモ
ーターと適合し、Trp+形質転換体の選択のため、全て
α,Trp−１である。上記各株は、広く入手可能で、例え
ば、79株は米国カリフォルニア州バークレーのカリフォ
ルニア大学生物物理および医学物理学部イースト・ジェ
ネティック・ストック・センター（the Yeast Genetic
Stock Center,Department of Biophysics and Medical
Physics,Universiry of California,Barkeley,Californ
ia,94702）から入手可能である。
変異型GM-CSF遺伝子を含む組み換え発現プラスミドで酵
母宿主を形質転換する際には、スフェロプラストを形成
させ、プラスミド取り込みに先立ち洗浄するという既知
の手法に従って行なう。上記手法の標準的な方法は、確
立されている。ベッグス（Beggs）他著，Nature(Londo
n) 275:104（1978）；ヒンネン（Hinnen）他著，Proc.N
atl.Acad.Sci.(USA) 75:1929（1978）参照。
母宿主を形質転換する際には、スフェロプラストを形成
させ、プラスミド取り込みに先立ち洗浄するという既知
の手法に従って行なう。上記手法の標準的な方法は、確
立されている。ベッグス（Beggs）他著，Nature(Londo
n) 275:104（1978）；ヒンネン（Hinnen）他著，Proc.N
atl.Acad.Sci.(USA) 75:1929（1978）参照。
酵母培養液上清は、ヒト骨髄細胞から、顆粒球およびマ
イクロファージ型混合コロニーの形成の誘導能によっ
て、生物学的活性をアッセイする。対照実験として、GM
-CSF塩基配列を欠く以外は、pYαfHuGMLeu23と同じ構造
を持つ、プラスミドpYαｆでも酵母宿主の形質転換を行
ない、培養液上清を生物学的活性のアッセイに使用す
る。
イクロファージ型混合コロニーの形成の誘導能によっ
て、生物学的活性をアッセイする。対照実験として、GM
-CSF塩基配列を欠く以外は、pYαfHuGMLeu23と同じ構造
を持つ、プラスミドpYαｆでも酵母宿主の形質転換を行
ない、培養液上清を生物学的活性のアッセイに使用す
る。
pYαfHuGMLeu23上清は、骨髄コロニーアッセイにおい
て、GM-CSF活性の高水準の合成を誘導することが見いだ
された（7.2×106CFU−C/ml）：それに対して、pYαｆ
対照プラスミド由来の上清からは活性は検出されなかっ
た。
て、GM-CSF活性の高水準の合成を誘導することが見いだ
された（7.2×106CFU−C/ml）：それに対して、pYαｆ
対照プラスミド由来の上清からは活性は検出されなかっ
た。
コドン除去によって変異させたGM-CSF遺伝子のクローニ
ング、スクリーニング、および塩基配列決定、および変
異型遺伝子を用いてのGM-CSF類似物質の発現 本発明の異なる見解に従えば、変異型ヒトGM-CSF遺伝子
は、塩基性アミノ酸残基をコードするコドンの除去によ
って調製し、同変異型遺伝子はクローン化し、多重塩基
性アミノ酸残基を欠いたGM-CSF類似物質を発現させる。
本発明の上記見解の一つの特別な形において、野生型遺
伝子のアミノ酸残基No.23、アルギニンをコードするコ
ドンを除去し、それによってGM-CSFのアミノ酸残基No.2
3およびNo.24のアルギニン−アルギニン多重塩基性配列
（第1A図）を除く。アミノ酸残基No.23のアルギニンを
除去するのではなく、アミノ酸残基No.24のアルギニン
の除去、あるいは、残基No.23およびNo.24のアルギニン
残基を双方ともに除去することも、本発明の範囲内であ
ることは理解されねばならない。除去される個々のアミ
ノ酸残基に関して必須の基準は、除去によてGM-CSFの生
物学的活性は維持したまま多重塩基性アミノ酸をなくす
ことである。
ング、スクリーニング、および塩基配列決定、および変
異型遺伝子を用いてのGM-CSF類似物質の発現 本発明の異なる見解に従えば、変異型ヒトGM-CSF遺伝子
は、塩基性アミノ酸残基をコードするコドンの除去によ
って調製し、同変異型遺伝子はクローン化し、多重塩基
性アミノ酸残基を欠いたGM-CSF類似物質を発現させる。
本発明の上記見解の一つの特別な形において、野生型遺
伝子のアミノ酸残基No.23、アルギニンをコードするコ
ドンを除去し、それによってGM-CSFのアミノ酸残基No.2
3およびNo.24のアルギニン−アルギニン多重塩基性配列
（第1A図）を除く。アミノ酸残基No.23のアルギニンを
除去するのではなく、アミノ酸残基No.24のアルギニン
の除去、あるいは、残基No.23およびNo.24のアルギニン
残基を双方ともに除去することも、本発明の範囲内であ
ることは理解されねばならない。除去される個々のアミ
ノ酸残基に関して必須の基準は、除去によてGM-CSFの生
物学的活性は維持したまま多重塩基性アミノ酸をなくす
ことである。
上述の、コドン置換によって変異させたGM-CSF遺伝子と
同様に、コドン除去によって変異させたGM-CSF遺伝子を
使用したGM-CSF類似物質は、組み換えDNA技術によって
産生することが望ましい。本発明の一つの推奨される形
においては、オリゴヌクレオチドを置換された非塩基性
アミノ酸コドンで合成するかわりに、除去される塩基性
アミノ酸残基をコードする１個以上の標的となるコドン
の除去によってオリゴヌクレオチドを調製する点を除い
ては、コドンを除去した変異遺伝子は、上述のコドン置
換によって変異させたGM-CSF遺伝子で使用したものと同
様の部位特異性ミュータジェネシス法によって産生され
た。上記の例外を除いては、コドン除去による変異型遺
伝子の調製には、コドン置換による変異型遺伝子の調製
に関して既に述べたものと同じ手法を用いた。上記手法
では、二重鎖複製型DNAをクローニングベクターとして
使用する場合、野生型GM-CSF遺伝子に対応する単鎖鋳型
DNA（＋）は、単鎖DNA産物を産生できるファージベクタ
ー中の野生型遺伝子をクローニングすることによって調
製する。単鎖鋳型DNAは、ファージ相補鎖部分（−）お
よびコドン除去合成ミュータジェネシスオリゴヌクレオ
チド部分とアニーリングさせ、それによってオリゴヌク
レオチド末端と相補鎖フラグメント（−）との間のギャ
ップが残る。上記ギャップは、酵素的に埋め、次に、ギ
ャップを埋めた二重鎖DNAで、適当な宿主の形質転換を
行ない、コドン除去による変異遺伝子を複製させる。
同様に、コドン除去によって変異させたGM-CSF遺伝子を
使用したGM-CSF類似物質は、組み換えDNA技術によって
産生することが望ましい。本発明の一つの推奨される形
においては、オリゴヌクレオチドを置換された非塩基性
アミノ酸コドンで合成するかわりに、除去される塩基性
アミノ酸残基をコードする１個以上の標的となるコドン
の除去によってオリゴヌクレオチドを調製する点を除い
ては、コドンを除去した変異遺伝子は、上述のコドン置
換によって変異させたGM-CSF遺伝子で使用したものと同
様の部位特異性ミュータジェネシス法によって産生され
た。上記の例外を除いては、コドン除去による変異型遺
伝子の調製には、コドン置換による変異型遺伝子の調製
に関して既に述べたものと同じ手法を用いた。上記手法
では、二重鎖複製型DNAをクローニングベクターとして
使用する場合、野生型GM-CSF遺伝子に対応する単鎖鋳型
DNA（＋）は、単鎖DNA産物を産生できるファージベクタ
ー中の野生型遺伝子をクローニングすることによって調
製する。単鎖鋳型DNAは、ファージ相補鎖部分（−）お
よびコドン除去合成ミュータジェネシスオリゴヌクレオ
チド部分とアニーリングさせ、それによってオリゴヌク
レオチド末端と相補鎖フラグメント（−）との間のギャ
ップが残る。上記ギャップは、酵素的に埋め、次に、ギ
ャップを埋めた二重鎖DNAで、適当な宿主の形質転換を
行ない、コドン除去による変異遺伝子を複製させる。
上述のように、野生型GM-CSF遺伝子から望むコドンを欠
失させたものを含むオリゴヌクレオチドは、ホスホジエ
ステルあるいはトリエステル法のような既知の方法で合
成する。コドン除去は、オリゴヌクレオチドのほぼ中央
に位置することが望ましく、オリゴヌクレオチドは、単
鎖鋳型DNAと容易にハイブリッド形成する程度に十分長
く、比較的容易に合成できる程度に短いことが望まし
い。制限を与えない実例として、上述のように、野生型
GM-CSF遺伝子のアミノ酸残基No.23アルギニンを除去し
たとすれば、MCD5-24と命名されたオリゴヌクレオチド
は、以下の構造を持ちうる:5′−CATCCAGGAGGCCCGTCTCC
TGAA−３′。除去されたコドンのいずれの側でも、より
短い、あるいは、より長い隣接するヌクレオチドが使用
可能であることは、理解されるべきである。
失させたものを含むオリゴヌクレオチドは、ホスホジエ
ステルあるいはトリエステル法のような既知の方法で合
成する。コドン除去は、オリゴヌクレオチドのほぼ中央
に位置することが望ましく、オリゴヌクレオチドは、単
鎖鋳型DNAと容易にハイブリッド形成する程度に十分長
く、比較的容易に合成できる程度に短いことが望まし
い。制限を与えない実例として、上述のように、野生型
GM-CSF遺伝子のアミノ酸残基No.23アルギニンを除去し
たとすれば、MCD5-24と命名されたオリゴヌクレオチド
は、以下の構造を持ちうる:5′−CATCCAGGAGGCCCGTCTCC
TGAA−３′。除去されたコドンのいずれの側でも、より
短い、あるいは、より長い隣接するヌクレオチドが使用
可能であることは、理解されるべきである。
コドン除去によって変異させたGM-CSF遺伝子は、上述の
コドン置換によって変異させた遺伝子と同様の方法でク
ローン化し、スクリーニングを行なう。また、アミノ酸
残基No.23のアルギニン残基を除去した、M13HuGMΔArg2
3と命名されたプラスミドDNAは、前に述べた標準的なチ
ェインターミネーション法を用いて塩基配列を決定し
た。第1C図は、M13HuGMΔArg23プラスミドDNAに含まれ
る。変異型GM-CSF遺伝子のヌクレオチド塩基配列を示し
たものである。変異型遺伝子のコード領域に対応するア
ミノ酸構造も、アラニン残基（No.1）（ヌクレオチドN
o.14）からグルタニミン酸残基（No.126）（ヌクレオチ
ドNo.391）まで第1C図に示した。第1C図に示されるよう
に、M13HuGMΔArg23は、改変された遺伝子では23番目の
コドンが欠失している点でのみ、第1A図の野生型遺伝子
と異なる。第1C図で示したように、変異型遺伝子のコー
ド領域の５′側のヌクレオチドは、α−因子プロセッシ
ング部位およびHindIII5′付着端から成る（ヌクレオチ
ドNo.−６からNo.13）。
コドン置換によって変異させた遺伝子と同様の方法でク
ローン化し、スクリーニングを行なう。また、アミノ酸
残基No.23のアルギニン残基を除去した、M13HuGMΔArg2
3と命名されたプラスミドDNAは、前に述べた標準的なチ
ェインターミネーション法を用いて塩基配列を決定し
た。第1C図は、M13HuGMΔArg23プラスミドDNAに含まれ
る。変異型GM-CSF遺伝子のヌクレオチド塩基配列を示し
たものである。変異型遺伝子のコード領域に対応するア
ミノ酸構造も、アラニン残基（No.1）（ヌクレオチドN
o.14）からグルタニミン酸残基（No.126）（ヌクレオチ
ドNo.391）まで第1C図に示した。第1C図に示されるよう
に、M13HuGMΔArg23は、改変された遺伝子では23番目の
コドンが欠失している点でのみ、第1A図の野生型遺伝子
と異なる。第1C図で示したように、変異型遺伝子のコー
ド領域の５′側のヌクレオチドは、α−因子プロセッシ
ング部位およびHindIII5′付着端から成る（ヌクレオチ
ドNo.−６からNo.13）。
GM-CSF類似物質は、既に記載したM13HuGMLeu23変異型遺
伝子を用いてGM-CSF類似物質を発現させるのに使用した
手法と同じ手法を用いて、変異型遺伝子M13HuGMΔArg23
で発現させる。発現されたタンパク質産物も、上述と同
様の骨髄アッセイで生物学的活性を調べる。
伝子を用いてGM-CSF類似物質を発現させるのに使用した
手法と同じ手法を用いて、変異型遺伝子M13HuGMΔArg23
で発現させる。発現されたタンパク質産物も、上述と同
様の骨髄アッセイで生物学的活性を調べる。
〔実施例 １〕 単鎖鋳型DNAの調製 本発明の過程および産物は、さらに、以下の例によって
示す。
示す。
第３図に示したように、ヒトGM-CSF遺伝子のコード領域
および、３′端に隣接する領域を含む487塩基対のDNAフ
ラグメント（第1A図中ヌクレオチドNo.16からヌクレオ
チドNo.502）が、制限酵素Sfa NIおよびNco Iでの消化
によって、pHG23プラスミドから単離された。T4 DNAポ
リメラーゼで、遺伝子フラグメントのNco I切断部位を
ブラント末端にする。Sfa NIによるpHG23プラスミドの
切断により、GM-CSF遺伝子のコード領域の最初の２ヌク
レオチドは欠失する。下の表１に示した、二重鎖連結オ
リゴヌクレオチドの構造は、最初のアミノ酸アラニンの
２つのヌクレオチドを回復させるために合成したもので
あり、同時に、実施例６でより詳細に述べる如く酵母宿
主中で変異型GM-CSF遺伝子を後に高水準で発現させるた
めに、α−因子第２プロセッシング部位も与える。表１
に示されるように、二重鎖オリゴヌクレオチドは、Hind
III5′付着端を有する。
および、３′端に隣接する領域を含む487塩基対のDNAフ
ラグメント（第1A図中ヌクレオチドNo.16からヌクレオ
チドNo.502）が、制限酵素Sfa NIおよびNco Iでの消化
によって、pHG23プラスミドから単離された。T4 DNAポ
リメラーゼで、遺伝子フラグメントのNco I切断部位を
ブラント末端にする。Sfa NIによるpHG23プラスミドの
切断により、GM-CSF遺伝子のコード領域の最初の２ヌク
レオチドは欠失する。下の表１に示した、二重鎖連結オ
リゴヌクレオチドの構造は、最初のアミノ酸アラニンの
２つのヌクレオチドを回復させるために合成したもので
あり、同時に、実施例６でより詳細に述べる如く酵母宿
主中で変異型GM-CSF遺伝子を後に高水準で発現させるた
めに、α−因子第２プロセッシング部位も与える。表１
に示されるように、二重鎖オリゴヌクレオチドは、Hind
III5′付着端を有する。
単離したGM-CSF遺伝子フラグメントは、表１で示した二
重鎖から成る単一のオリゴヌクレオチドとともに、あら
かじめ制限酵素HindIIIおよびSma Iで切断した、M13フ
ァージベクターのmp10株（アマーシャム社，イリノイ州
アーリントン・ハイツ）に連結させる。連結反応は、20
ナノグラム（ng）の直鎖状mp10M13,50ngの変異型GM-CSF
遺伝子フラグメント、5ngの合成オリゴヌクレオチド、
１ユニットのT4 DNAリガーゼおよび十分量のT4リガーゼ
バッファー（0.4Mトリス〔pH7.4〕,0.1MMgCl2,0.1Mジチ
オスレイトール,10mMスペルミジン,10mM ATPおよび1mg/
マイクロリットル（μｌ）BSA）で20μｌの反応液量に
した反応混合液中で行なった。反応は、25℃で15時間イ
ンキュベートして行なった。
重鎖から成る単一のオリゴヌクレオチドとともに、あら
かじめ制限酵素HindIIIおよびSma Iで切断した、M13フ
ァージベクターのmp10株（アマーシャム社，イリノイ州
アーリントン・ハイツ）に連結させる。連結反応は、20
ナノグラム（ng）の直鎖状mp10M13,50ngの変異型GM-CSF
遺伝子フラグメント、5ngの合成オリゴヌクレオチド、
１ユニットのT4 DNAリガーゼおよび十分量のT4リガーゼ
バッファー（0.4Mトリス〔pH7.4〕,0.1MMgCl2,0.1Mジチ
オスレイトール,10mMスペルミジン,10mM ATPおよび1mg/
マイクロリットル（μｌ）BSA）で20μｌの反応液量に
した反応混合液中で行なった。反応は、25℃で15時間イ
ンキュベートして行なった。
M13HuGMと命名された、上記DNAフラグメントを挿入した
M13mp10ベクターは、標準的方法によって、大腸菌（E.C
oli）K12株のJM103（ベセスダ・リサーチ・ラボラトリ
ーズ（Bethesda Research Laboratories），メアリーラ
ンド州ベセスダ）のトランスフェクションに使用し、大
腸菌の一つの株に端鎖DNAを含むM13HuGMファージを活発
に分泌させるようにした。ファージは、４時間37℃で増
殖させた後、ポリエチレングリコールで沈澱させて、培
養液上清から回収した。端鎖DNAは、アマーシャムハン
ドブックに詳述されている標準的手法に従って、フェノ
ール：クロロホルムによる抽出によってファージから単
離した。
M13mp10ベクターは、標準的方法によって、大腸菌（E.C
oli）K12株のJM103（ベセスダ・リサーチ・ラボラトリ
ーズ（Bethesda Research Laboratories），メアリーラ
ンド州ベセスダ）のトランスフェクションに使用し、大
腸菌の一つの株に端鎖DNAを含むM13HuGMファージを活発
に分泌させるようにした。ファージは、４時間37℃で増
殖させた後、ポリエチレングリコールで沈澱させて、培
養液上清から回収した。端鎖DNAは、アマーシャムハン
ドブックに詳述されている標準的手法に従って、フェノ
ール：クロロホルムによる抽出によってファージから単
離した。
〔実施例 ２〕 オリゴヌクレオチド合成および放射性標識 コドン置換によるGM-CSF遺伝子の部位特異性ミュータジ
ェネシスに使用するオリゴヌクレオチドは、スード（So
od）他、（前掲）、およびヒロセ（Hirose）他（前掲）
に詳述された、標準的方法によって化学的に合成され
た。MCD5-27と命名されたオリゴヌクレオチドは、以下
の構造から成る:5′−CATCCAGGAGGCCTTGCGTCCTGAA−
３′。オリゴヌクレオチドは保護基をとり除き、セファ
デックスＧ−50クロマトグラフィー（ファルマシア・フ
ァイン・ケミカルズ社）に続いて分離用ゲル電気泳動に
よって精製した。
ェネシスに使用するオリゴヌクレオチドは、スード（So
od）他、（前掲）、およびヒロセ（Hirose）他（前掲）
に詳述された、標準的方法によって化学的に合成され
た。MCD5-27と命名されたオリゴヌクレオチドは、以下
の構造から成る:5′−CATCCAGGAGGCCTTGCGTCCTGAA−
３′。オリゴヌクレオチドは保護基をとり除き、セファ
デックスＧ−50クロマトグラフィー（ファルマシア・フ
ァイン・ケミカルズ社）に続いて分離用ゲル電気泳動に
よって精製した。
オリゴヌクレオチドは、スクリーニングプローブとして
使用するため、末端を32Pで放射性標識した。放射性標
識を促進させるため、オリゴヌクレオチドの５′末端を
OH末端として合成し、それによってDNAフラグメントを
標識する際に典型的に行なわれるリン酸処理を省いた。
標識法には、体積１μｌ中100ngの合成ヌクレオチド
に、16μｌの32P‐ATP（7000Ci/mM）,1μｌ（10U）のT4
ポリヌクレオチドキナーゼおよび２μｌの10×キナーゼ
バッファＩ（0.5Mトリス−Cl〔pH7.0〕,0.1mM MgCl2,50
mM ジチオスレイトール、1mMスペルミジンおよび1mM E
DTA）を加えることを含む。反応は37℃で30分間行な
い、その後32Pで標識されたオリゴヌクレオチドと、結
合していない32P‐ATPとをセファデックスＧ−50クロマ
トグラフィー（ファルマシア・ファイン・ケミカルズ
社）で分離した。
使用するため、末端を32Pで放射性標識した。放射性標
識を促進させるため、オリゴヌクレオチドの５′末端を
OH末端として合成し、それによってDNAフラグメントを
標識する際に典型的に行なわれるリン酸処理を省いた。
標識法には、体積１μｌ中100ngの合成ヌクレオチド
に、16μｌの32P‐ATP（7000Ci/mM）,1μｌ（10U）のT4
ポリヌクレオチドキナーゼおよび２μｌの10×キナーゼ
バッファＩ（0.5Mトリス−Cl〔pH7.0〕,0.1mM MgCl2,50
mM ジチオスレイトール、1mMスペルミジンおよび1mM E
DTA）を加えることを含む。反応は37℃で30分間行な
い、その後32Pで標識されたオリゴヌクレオチドと、結
合していない32P‐ATPとをセファデックスＧ−50クロマ
トグラフィー（ファルマシア・ファイン・ケミカルズ
社）で分離した。
〔実施例 ３〕 コドン置換によるGM-CSFの部位特異性ミュータジェネシ
ス 第３図に示したように、ギャップのあるヘテロ二重鎖構
造を形成させるため、M13ファージベクターのmp18株
を、標準的手法に従い、制限酵素EcoRIおよびHindIIIで
切断した。得られた主要なフラグメントおよびオリゴヌ
クレオチドMCD5-27は、野生型GM-CSF遺伝子を含む単鎖
鋳型M13HuGMと以下の方法でアニーリングさせた。二重
鋳型の切断したM13mp18の１マイクログラム（“μg"）
を、30μｌの100mM NaCl,40mM Tris-HCl（pH7.5）,20mM
MgCl2,2.0mM β−メルカプトエタノール中の、0.5μ
ｇの単鎖鋳型DNA M13HuGMと混合した。単鎖鋳型−二重
鋳型M13mp18フラグメント混合液は、100℃で３分間加熱
変性させ、65℃で20分間冷却した。５′−リン酸を有す
るオリゴヌクレオチドMCD5-27（50.0pmole）を加え、混
合液を緩やかに30℃に冷却し、次に氷上に15分間置い
た。その後、上記混合液に以下のものを加えた:7μｌの
22mM トリス−HCl（pH7.5）,11mM MgCl2,1.0mM β−メ
ルカプトエタノール,0.83mM dATP,0.83mM dCTP,0.83mM
dGTP,0.83mM dTTP,0.4mM rATP,0.5ユニットの大腸菌
（E.Coli）DNAポリメラーゼ（クレノーフラグメント）
（ベーリンガー・マンハイム・バイオケミカルズ社）、
および0.5ユニットのT4 DNAリガーゼ（ベセスダ・リサ
ーチ・ラボラトリーズ）。さらに30分間０℃に置いた
後、上記最初の伸長混合液を14.5℃で20時間インキュベ
ートした。
ス 第３図に示したように、ギャップのあるヘテロ二重鎖構
造を形成させるため、M13ファージベクターのmp18株
を、標準的手法に従い、制限酵素EcoRIおよびHindIIIで
切断した。得られた主要なフラグメントおよびオリゴヌ
クレオチドMCD5-27は、野生型GM-CSF遺伝子を含む単鎖
鋳型M13HuGMと以下の方法でアニーリングさせた。二重
鋳型の切断したM13mp18の１マイクログラム（“μg"）
を、30μｌの100mM NaCl,40mM Tris-HCl（pH7.5）,20mM
MgCl2,2.0mM β−メルカプトエタノール中の、0.5μ
ｇの単鎖鋳型DNA M13HuGMと混合した。単鎖鋳型−二重
鋳型M13mp18フラグメント混合液は、100℃で３分間加熱
変性させ、65℃で20分間冷却した。５′−リン酸を有す
るオリゴヌクレオチドMCD5-27（50.0pmole）を加え、混
合液を緩やかに30℃に冷却し、次に氷上に15分間置い
た。その後、上記混合液に以下のものを加えた:7μｌの
22mM トリス−HCl（pH7.5）,11mM MgCl2,1.0mM β−メ
ルカプトエタノール,0.83mM dATP,0.83mM dCTP,0.83mM
dGTP,0.83mM dTTP,0.4mM rATP,0.5ユニットの大腸菌
（E.Coli）DNAポリメラーゼ（クレノーフラグメント）
（ベーリンガー・マンハイム・バイオケミカルズ社）、
および0.5ユニットのT4 DNAリガーゼ（ベセスダ・リサ
ーチ・ラボラトリーズ）。さらに30分間０℃に置いた
後、上記最初の伸長混合液を14.5℃で20時間インキュベ
ートした。
〔実施例 ４〕 変異型遺伝子のスクリーニング 実施例３から得られた、ギャップを埋めた二重鎖構造
は、アマーシャムハンドブック（前掲）に述べられるよ
うな、標準的技術によって、使用に適した大腸菌（E.Co
li）JM105細胞（ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ
社）、メアリーランド州ベセスダ）のトランスフェクシ
ョンに使用した。トランスフェクションを行なったJM10
5細胞は、ヒートショック後ただちに、新しいYTプレー
ト上に、トップアガーでプレートした。
は、アマーシャムハンドブック（前掲）に述べられるよ
うな、標準的技術によって、使用に適した大腸菌（E.Co
li）JM105細胞（ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ
社）、メアリーランド州ベセスダ）のトランスフェクシ
ョンに使用した。トランスフェクションを行なったJM10
5細胞は、ヒートショック後ただちに、新しいYTプレー
ト上に、トップアガーでプレートした。
得られたプラークのうち94個を選択し、実施例２で調製
した、放射性標識したMCD5-27オリゴヌクレオチドプロ
ーブでスクリーニングを行なった。組み換えの起きたプ
ラーク（白）は、殺菌した白金耳で拾い取り、100μｌ
のYT培地を含む微小力価ディッシュウェル（microtiter
dish well）での培養に使用した。約５〜７時間37℃で
培養後、96のウェルレプリケーターを用いて、YTプレー
ト上に重ねたニトロセルロースフィルター上に候補とな
る培養液をスポットした。この操作は二回行なった。一
晩37℃で培養後、フィルターをペトリ皿から除いた。DN
Aは、マニアティス他著、前掲に詳述された一般的手法
に従い、アルカリ溶液および中和溶液を用いて遊離させ
た。転写過程後、フィルターは空気中で乾燥させ、約80
℃で２時間焼き、単鎖DNAをニトロセルロースに結合さ
せた。
した、放射性標識したMCD5-27オリゴヌクレオチドプロ
ーブでスクリーニングを行なった。組み換えの起きたプ
ラーク（白）は、殺菌した白金耳で拾い取り、100μｌ
のYT培地を含む微小力価ディッシュウェル（microtiter
dish well）での培養に使用した。約５〜７時間37℃で
培養後、96のウェルレプリケーターを用いて、YTプレー
ト上に重ねたニトロセルロースフィルター上に候補とな
る培養液をスポットした。この操作は二回行なった。一
晩37℃で培養後、フィルターをペトリ皿から除いた。DN
Aは、マニアティス他著、前掲に詳述された一般的手法
に従い、アルカリ溶液および中和溶液を用いて遊離させ
た。転写過程後、フィルターは空気中で乾燥させ、約80
℃で２時間焼き、単鎖DNAをニトロセルロースに結合さ
せた。
結合したDNAは次に標識したオリゴヌクレオチドプロー
ブとハイブリッド形成させた。略述すると、焼いたニト
ロセルロースは、次の組成のプレハイブリッド形成バッ
ファー中で２〜４時間68℃でインキュベートした:6×標
準整理的食塩水−クエン酸溶液（standard saline-citr
ate,“SSC"）（１×SSCは、0.15M NaCl,0.015Mクエン酸
ナトリウム,pH7.0）；および、５×デルハルト溶液（De
nhardt's solution）（0.02％フィコール,0.02％ポリビ
ニルピロリドン,0.2％ウシ血清アルブミン）。次に、フ
ィルターを上記ハイブリッド形成バッファー中で32Pで
標識したオリゴヌクレオチドプローブ（106cpm/ml,実施
例２より）とともに55℃で16時間インキュベートした。
ハイブリッド形成後、フィルターはまず、室温で６×SS
Cを用いて、高度に厳しい条件下で広範囲にわたって洗
浄し、次に、68℃で１時間0.6×SSCで洗浄した。空気乾
燥後、フィルターは、−70℃でオートラジオグラフィー
を行なった。上記手法により、変異型GM-CSF遺伝子を含
む候補は純粋に同定され、M13HuGMLEU23と命名された。
ブとハイブリッド形成させた。略述すると、焼いたニト
ロセルロースは、次の組成のプレハイブリッド形成バッ
ファー中で２〜４時間68℃でインキュベートした:6×標
準整理的食塩水−クエン酸溶液（standard saline-citr
ate,“SSC"）（１×SSCは、0.15M NaCl,0.015Mクエン酸
ナトリウム,pH7.0）；および、５×デルハルト溶液（De
nhardt's solution）（0.02％フィコール,0.02％ポリビ
ニルピロリドン,0.2％ウシ血清アルブミン）。次に、フ
ィルターを上記ハイブリッド形成バッファー中で32Pで
標識したオリゴヌクレオチドプローブ（106cpm/ml,実施
例２より）とともに55℃で16時間インキュベートした。
ハイブリッド形成後、フィルターはまず、室温で６×SS
Cを用いて、高度に厳しい条件下で広範囲にわたって洗
浄し、次に、68℃で１時間0.6×SSCで洗浄した。空気乾
燥後、フィルターは、−70℃でオートラジオグラフィー
を行なった。上記手法により、変異型GM-CSF遺伝子を含
む候補は純粋に同定され、M13HuGMLEU23と命名された。
〔実施例 ５〕 スクリーニングした、ミュータジェネシスを行なった遺
伝子の塩基配列決定 鋳型DNAは、実施例４で同定した候補から調製し、アマ
ーシャムハンドブック（前掲）に述べられている、標準
的チェーンターミネーション法で塩基配列を決定した。
合成ユニバーサルプライマー:5′−CCCAGTCACGACGTT−
３′（Ｐ−ｌバイオケミカルズ社，ウィスコンシン州ミ
ルウォーキー）を、単鎖鋳型DNAとアニーリングさせ、
前述したようにしてDNA合成の開始に使用した。その
後、伸長させたフラグメントは、ゲル電気泳動によって
鎖長で分離し、オートラジオグラフィーを行ない、その
結果から上記フラグメントのヌクレオチド塩基配列を推
定した。
伝子の塩基配列決定 鋳型DNAは、実施例４で同定した候補から調製し、アマ
ーシャムハンドブック（前掲）に述べられている、標準
的チェーンターミネーション法で塩基配列を決定した。
合成ユニバーサルプライマー:5′−CCCAGTCACGACGTT−
３′（Ｐ−ｌバイオケミカルズ社，ウィスコンシン州ミ
ルウォーキー）を、単鎖鋳型DNAとアニーリングさせ、
前述したようにしてDNA合成の開始に使用した。その
後、伸長させたフラグメントは、ゲル電気泳動によって
鎖長で分離し、オートラジオグラフィーを行ない、その
結果から上記フラグメントのヌクレオチド塩基配列を推
定した。
デオキシアデノシン５′（α〔35S〕チオ）３リン酸
（以後“dATP"〔α−35S〕″）を、ジデオキシ塩基配列
決定反応において、放射性活性標識として使用した。ま
た、アマーシャムハンドブック36ページに述べられたゲ
ルは使用せず、６％ポリアクリルアミドゲルを使用した
（６％ポリアクリルアミドゲル，厚さ0.4mm,7M尿素,100
mMトリス−ホウ酸〔pH8.1｝、および2mM EDTAを含
む。） 上述のように、変異型GM-CSF遺伝子M13HuGMLeu23のヌク
レオチド塩基配列は、第1B図に、成熟したタンパク質は
星印（＊）から示している。成熟タンパク質に対応する
アミノ酸構造は、対応するコドンの下段にAla残基、No.
1（ヌクレオチドNo.14）からGlu残基、No.127（ヌクレ
オチドNo.394）まで示した。予想されるように、上記変
異型遺伝子は、野生型遺伝子と23番目のコドンのみが異
なり、変異型遺伝子では、アルギニンをコードする塩基
配列CGTのかわりに、ロイシンをコードする塩基配列TTG
を含んでいた。成熟遺伝子の５′側ヌクレオチドは、第
３図で示すように、α−因子第２プロセッシング部位お
よび、HindIII5′付着端を構成する。
（以後“dATP"〔α−35S〕″）を、ジデオキシ塩基配列
決定反応において、放射性活性標識として使用した。ま
た、アマーシャムハンドブック36ページに述べられたゲ
ルは使用せず、６％ポリアクリルアミドゲルを使用した
（６％ポリアクリルアミドゲル，厚さ0.4mm,7M尿素,100
mMトリス−ホウ酸〔pH8.1｝、および2mM EDTAを含
む。） 上述のように、変異型GM-CSF遺伝子M13HuGMLeu23のヌク
レオチド塩基配列は、第1B図に、成熟したタンパク質は
星印（＊）から示している。成熟タンパク質に対応する
アミノ酸構造は、対応するコドンの下段にAla残基、No.
1（ヌクレオチドNo.14）からGlu残基、No.127（ヌクレ
オチドNo.394）まで示した。予想されるように、上記変
異型遺伝子は、野生型遺伝子と23番目のコドンのみが異
なり、変異型遺伝子では、アルギニンをコードする塩基
配列CGTのかわりに、ロイシンをコードする塩基配列TTG
を含んでいた。成熟遺伝子の５′側ヌクレオチドは、第
３図で示すように、α−因子第２プロセッシング部位お
よび、HindIII5′付着端を構成する。
〔実施例 ６〕 GM-CSF類似物質の発現 第1B図に示した、変異型GM-CSF遺伝子のコード領域およ
び３′側に隣接する領域（ヌクレオチドNo.14からNo.50
2）は、GM-CSF類似物質遺伝子５′末端と連結した、α
−因子第２プロセッシング部位および５′HindIII付着
末端とともに、ミュータジェネシスベクターから除き、
酵母宿主細胞内でGM-CSF類似物質の発現を誘導させる、
pYαfHuGMLeu23と命名された組み換え発現プラスミドの
形成に使用した。第４図に示したように、発現プラスミ
ドpYαfHuGMLeu23は、pBR322由来の複製起点およびアン
ピシリン抵抗遺伝子（太線部）を有する。また、発現プ
ラスミドは、酵母２μ環状複製起点および、形質転換さ
れた酵母宿主の選択に使用するTrP遺伝子（TRP-〔Trp−
栄養要求株（Trp−auxotrophs）〕，第４図中細線部）
発現プラスミドは、さらに、GM-CSF類似物質の転写およ
び分泌の誘導に使用される。α−因子プロモーターおよ
びリーダー配列を含む（点描部）。GM-CSF類似物質塩基
配列は、第４図の斜線部で示し、一方、α−因子プロセ
ッシング部位として機能するカテプシンＢ様成熟部位
（Cathepsin B-like maturation site）は、第４図の白
ヌキ部分で示し、その塩基配列も第４図に示した。
び３′側に隣接する領域（ヌクレオチドNo.14からNo.50
2）は、GM-CSF類似物質遺伝子５′末端と連結した、α
−因子第２プロセッシング部位および５′HindIII付着
末端とともに、ミュータジェネシスベクターから除き、
酵母宿主細胞内でGM-CSF類似物質の発現を誘導させる、
pYαfHuGMLeu23と命名された組み換え発現プラスミドの
形成に使用した。第４図に示したように、発現プラスミ
ドpYαfHuGMLeu23は、pBR322由来の複製起点およびアン
ピシリン抵抗遺伝子（太線部）を有する。また、発現プ
ラスミドは、酵母２μ環状複製起点および、形質転換さ
れた酵母宿主の選択に使用するTrP遺伝子（TRP-〔Trp−
栄養要求株（Trp−auxotrophs）〕，第４図中細線部）
発現プラスミドは、さらに、GM-CSF類似物質の転写およ
び分泌の誘導に使用される。α−因子プロモーターおよ
びリーダー配列を含む（点描部）。GM-CSF類似物質塩基
配列は、第４図の斜線部で示し、一方、α−因子プロセ
ッシング部位として機能するカテプシンＢ様成熟部位
（Cathepsin B-like maturation site）は、第４図の白
ヌキ部分で示し、その塩基配列も第４図に示した。
変異型GM-CSF遺伝子ヌクレオチドNo.−６からNo.502ま
での、５′リーダー配列、コード領域、および３′隣接
領域は、制限酵素Nco Iでの切断後、Nco I切断部位の凹
凸のある３′末端をデオキシヌクレオチドで埋めるた
め、T4 DNAポリメラーゼで処理することによって、ミュ
ータジェネシスベクターM13HuGMLeu23から除去し、発現
ベクターpYαfHuGMLeu23に挿入した。次に、切断したベ
クターをHindIIIで処理し、５′リーダー配列を結合さ
せた、上で得られた508bp M13HuGMLeu23 DNAフラグメン
トを、ゲル電気泳動で単離した。上記DNAフラグメント
は、標準的手法に従いpYαfGM−２発現プラスミド（第
２図）（ATCC No.53157）からHindIII-Stu I/Nco I部分
の除去によりあらかじめ調製したpYαｆベクターに、連
結させた。
での、５′リーダー配列、コード領域、および３′隣接
領域は、制限酵素Nco Iでの切断後、Nco I切断部位の凹
凸のある３′末端をデオキシヌクレオチドで埋めるた
め、T4 DNAポリメラーゼで処理することによって、ミュ
ータジェネシスベクターM13HuGMLeu23から除去し、発現
ベクターpYαfHuGMLeu23に挿入した。次に、切断したベ
クターをHindIIIで処理し、５′リーダー配列を結合さ
せた、上で得られた508bp M13HuGMLeu23 DNAフラグメン
トを、ゲル電気泳動で単離した。上記DNAフラグメント
は、標準的手法に従いpYαfGM−２発現プラスミド（第
２図）（ATCC No.53157）からHindIII-Stu I/Nco I部分
の除去によりあらかじめ調製したpYαｆベクターに、連
結させた。
上記pYαfHuGMLeu23発現プラスミドで、標準的技術によ
ってTrp+形質転換体を選択するため、S.セレビジェ（S.
cerevisiae）の酵母79株（α,Trp1−1,Leu2−１）を形
質転換した。形質転換に先立ち、79株はTEPD培地（１％
〔wt/vol.〕酵母抽出物,2％〔wt/vol.〕ペプトン,2％
〔wt/vol.〕グリコース）中で、２×107細胞/mlになる
まで培養した。細胞は、22℃で1000×g5分間の遠心によ
って回収し、得られたペレットは無菌蒸留水で洗浄し
た。
ってTrp+形質転換体を選択するため、S.セレビジェ（S.
cerevisiae）の酵母79株（α,Trp1−1,Leu2−１）を形
質転換した。形質転換に先立ち、79株はTEPD培地（１％
〔wt/vol.〕酵母抽出物,2％〔wt/vol.〕ペプトン,2％
〔wt/vol.〕グリコース）中で、２×107細胞/mlになる
まで培養した。細胞は、22℃で1000×g5分間の遠心によ
って回収し、得られたペレットは無菌蒸留水で洗浄し
た。
次に、酵母細胞は1/10量のSED（IMソルビトール、25mM
EDTA〔pH8.0〕、および50mMジチオスレイトール）に再
懸濁して濃縮し、30℃で10分間インキュベートした。続
いて、細胞−バッファー混合液を300×ｇで５分間遠心
した。ペレットは、１度1/10量の1Mソルビトールで洗浄
し、細胞は20ミリリットルのSCE（1Mソルビトール,0.1M
クエン酸ナトリウム〔pH5.8〕,0.01M EDTA）に再懸濁し
た。細胞壁を破壊するため、溶液にグルスラーゼを10-3
量加え、断続的に穏やかな振とうをしながら30℃で39分
間インキュベートした。スフェロプラストの存在は、顕
微鏡スライド上の１滴の５％SDS〔wt/vol.〕で10マイク
ロリットルの酵母細胞を稀釈し、400×位相差顕微鏡で
“ゴースト”を観察することによってアッセイした。次
に、細胞混合液を300×ｇで３分間遠心した。得られた
ペレットは、1/10量の1Mソルビトールで２回洗浄した。
続いて、ペレットをCaS（1Mソルビトール,10mM CaCl2）
で１回洗浄した。
EDTA〔pH8.0〕、および50mMジチオスレイトール）に再
懸濁して濃縮し、30℃で10分間インキュベートした。続
いて、細胞−バッファー混合液を300×ｇで５分間遠心
した。ペレットは、１度1/10量の1Mソルビトールで洗浄
し、細胞は20ミリリットルのSCE（1Mソルビトール,0.1M
クエン酸ナトリウム〔pH5.8〕,0.01M EDTA）に再懸濁し
た。細胞壁を破壊するため、溶液にグルスラーゼを10-3
量加え、断続的に穏やかな振とうをしながら30℃で39分
間インキュベートした。スフェロプラストの存在は、顕
微鏡スライド上の１滴の５％SDS〔wt/vol.〕で10マイク
ロリットルの酵母細胞を稀釈し、400×位相差顕微鏡で
“ゴースト”を観察することによってアッセイした。次
に、細胞混合液を300×ｇで３分間遠心した。得られた
ペレットは、1/10量の1Mソルビトールで２回洗浄した。
続いて、ペレットをCaS（1Mソルビトール,10mM CaCl2）
で１回洗浄した。
次に、酵母スフェロプラストは、ベッグス（Beggs）、
前掲の方法で、あらかじめ調製した発現ベクターを用い
て形質転換を行なった。ペレット化したスフェロプラス
トは、1/200量のCaSに懸濁し、1.5mlエッペンドルフチ
ューブに100マイクロリットルずつ分注した。続いて、
１μｌから10μｌのプラスミドDNAを各分注したチュー
ブに加えた（0.5μｇから５μｇ）。混合液を室温で10
分間インキュベートし、DNAの取り込みを促進するた
め、各分注液に1mlのPEG（20％ PEG 4000,10mM CaCl2,1
0mM トリス−HCl〔pH7.4〕）を加えた。室温で10分間
置いた後、混合液を、350×ｇで５分間遠心した。得ら
れたペレットは、150μｌのSOS（10mlの2Mソルビトー
ル,6.7mlのYEPD培地,0.13mlの1M CaCl2,27μｌの１％ト
リプトファンおよび3.7mlの水）で再懸濁した。上記混
合液は30℃で20分間インキュベートした。次に、細胞を
プレートした。
前掲の方法で、あらかじめ調製した発現ベクターを用い
て形質転換を行なった。ペレット化したスフェロプラス
トは、1/200量のCaSに懸濁し、1.5mlエッペンドルフチ
ューブに100マイクロリットルずつ分注した。続いて、
１μｌから10μｌのプラスミドDNAを各分注したチュー
ブに加えた（0.5μｇから５μｇ）。混合液を室温で10
分間インキュベートし、DNAの取り込みを促進するた
め、各分注液に1mlのPEG（20％ PEG 4000,10mM CaCl2,1
0mM トリス−HCl〔pH7.4〕）を加えた。室温で10分間
置いた後、混合液を、350×ｇで５分間遠心した。得ら
れたペレットは、150μｌのSOS（10mlの2Mソルビトー
ル,6.7mlのYEPD培地,0.13mlの1M CaCl2,27μｌの１％ト
リプトファンおよび3.7mlの水）で再懸濁した。上記混
合液は30℃で20分間インキュベートした。次に、細胞を
プレートした。
プロトプラスト/DNA混合液をプレートするのに先立ち、
選択用プレートを37℃でプレインキュベートした。18.2
mlのソルビトール、2mg寒天、0.6mgディフコ酵母窒素ベ
ース（アミノ酸含まず）、2mgグルコース、0.1mlの１％
アデニン、0.4mlの１％ウラシル、および要求されるア
ミノ酸の組成を有する、融解したトップアガー3ml（45
℃）を、形質転換細胞の各分注液に加え、チューブ内容
物を選択用培地に注いだ。プレートは30℃で２日から４
日間インキュベートした。Trpマイナス培地で増殖した
コロニーは、Trp 1遺伝子を有するプラスミドを含む、
すなわち、形質転換されたものである。
選択用プレートを37℃でプレインキュベートした。18.2
mlのソルビトール、2mg寒天、0.6mgディフコ酵母窒素ベ
ース（アミノ酸含まず）、2mgグルコース、0.1mlの１％
アデニン、0.4mlの１％ウラシル、および要求されるア
ミノ酸の組成を有する、融解したトップアガー3ml（45
℃）を、形質転換細胞の各分注液に加え、チューブ内容
物を選択用培地に注いだ。プレートは30℃で２日から４
日間インキュベートした。Trpマイナス培地で増殖した
コロニーは、Trp 1遺伝子を有するプラスミドを含む、
すなわち、形質転換されたものである。
生物学的アッセイに先立ち、形質転換体は静置した状態
で、30℃、20〜50mlのYEPD中で培養した。回収時に、プ
ロテアーゼインヒビターの、フェニルメチルスルフォニ
ルフルオライド（PMSF）およびペプスタチンＡを、それ
ぞれ最終濃度が1mMおよび10μＭとなるように加えた。
次に、細胞を400×ｇの遠心で除去し、培地は0.45ミク
ロン酢酸セルロースフィルターで過した。
で、30℃、20〜50mlのYEPD中で培養した。回収時に、プ
ロテアーゼインヒビターの、フェニルメチルスルフォニ
ルフルオライド（PMSF）およびペプスタチンＡを、それ
ぞれ最終濃度が1mMおよび10μＭとなるように加えた。
次に、細胞を400×ｇの遠心で除去し、培地は0.45ミク
ロン酢酸セルロースフィルターで過した。
〔実施例 ７〕 コロニーアッセイ 実施例６で酵母培養液から回収した、GM-CSF類似物質の
存在は、上清が、寒天中でヒト骨髄コロニーの成長を刺
激する能力をアッセイすることにより確認した。アッセ
イに使用するため、健康な提供者の腸骨稜（iliac cres
t）由来のヒト骨髄をヘパリン化したシリンダに集め
た。骨髄は、室温で、リン酸で緩衝化した生理的食塩水
（phosphate buffered saline,PBS）で1:3に希釈し、54
％パーコール溶液（ファルマシア・ファイン・ケミカル
ズ）の上に載せた。室温で500×ｇで20分間の遠心後、
中間層を集め、20倍量のPBSで洗浄した。懸濁液は、次
に、室温で10分間、250×ｇで遠心した。続いて、細胞
数計測および存在性決定のため、細胞を10mlのヌクレオ
チドを含むα−最小必須培地（α−Minimal Essential
Medium,“α−Mem",ギブコ社）に再懸濁した。次に、FC
Sを加え、同裁縫懸濁液はアッセイを行なうまで、氷上
に保存した。
存在は、上清が、寒天中でヒト骨髄コロニーの成長を刺
激する能力をアッセイすることにより確認した。アッセ
イに使用するため、健康な提供者の腸骨稜（iliac cres
t）由来のヒト骨髄をヘパリン化したシリンダに集め
た。骨髄は、室温で、リン酸で緩衝化した生理的食塩水
（phosphate buffered saline,PBS）で1:3に希釈し、54
％パーコール溶液（ファルマシア・ファイン・ケミカル
ズ）の上に載せた。室温で500×ｇで20分間の遠心後、
中間層を集め、20倍量のPBSで洗浄した。懸濁液は、次
に、室温で10分間、250×ｇで遠心した。続いて、細胞
数計測および存在性決定のため、細胞を10mlのヌクレオ
チドを含むα−最小必須培地（α−Minimal Essential
Medium,“α−Mem",ギブコ社）に再懸濁した。次に、FC
Sを加え、同裁縫懸濁液はアッセイを行なうまで、氷上
に保存した。
アッセイにおいて、上述のように調製した骨髄細胞は、
以下の組成のインキュベーション培地に、最終濃度が１
×105/mlとなるように加えた：（ａ）28.1％FCS、0.7×
10-4M 2−メルカプトエタノール、0.12mg/mlアスパラギ
ン、0.7mg/mlグルタミン、150ユニットのペニシリン
Ｇ、150ユニットのストレプトマイシン、ヌクレオチド
を含む1.1×α−MEM、および2.2×ビタミン（ギブコ
社）を含む溶液を７割；および（ｂ）1.4％バクトーア
ガー溶液（ディフコ社）を３割。上記培養液は、５％の
CO2存在下、温度を保った空気中で、37℃にインキュベ
ートした。７日から14日の培養後、コロニーの数および
型、すなわち、顆粒球、マクロファージ、あるいは顆粒
球−マクロファージ混合型のいずれかを決定した。出願
人らは、pYαfHuGMLeu23クローン由来のGM-CSF類似物質
遺伝子が、GM-CSF活性を、１ミリリットルあたり、7.2
×106コロニー成形単位（“CFU"）という高水準で誘導
することを見いだした。上記活性水準は、最大コロニー
数の50％を与える希釈の逆数に、50を乗じて決定した。
出願人らは、１×105骨髄細胞から生じる、平均コロニ
ー数は、73±16であるという結果を得た。組み換えGM-C
SFによって形成された14日目のコロニーは、明確に分類
され、次の３つの型から成る；約1/3の類似球−マクロ
ファージ混合型コロニー；約1/3の密集した顆粒球コロ
ニー；および、約1/3の広く分散しているマクロファー
ジコロニー。
以下の組成のインキュベーション培地に、最終濃度が１
×105/mlとなるように加えた：（ａ）28.1％FCS、0.7×
10-4M 2−メルカプトエタノール、0.12mg/mlアスパラギ
ン、0.7mg/mlグルタミン、150ユニットのペニシリン
Ｇ、150ユニットのストレプトマイシン、ヌクレオチド
を含む1.1×α−MEM、および2.2×ビタミン（ギブコ
社）を含む溶液を７割；および（ｂ）1.4％バクトーア
ガー溶液（ディフコ社）を３割。上記培養液は、５％の
CO2存在下、温度を保った空気中で、37℃にインキュベ
ートした。７日から14日の培養後、コロニーの数および
型、すなわち、顆粒球、マクロファージ、あるいは顆粒
球−マクロファージ混合型のいずれかを決定した。出願
人らは、pYαfHuGMLeu23クローン由来のGM-CSF類似物質
遺伝子が、GM-CSF活性を、１ミリリットルあたり、7.2
×106コロニー成形単位（“CFU"）という高水準で誘導
することを見いだした。上記活性水準は、最大コロニー
数の50％を与える希釈の逆数に、50を乗じて決定した。
出願人らは、１×105骨髄細胞から生じる、平均コロニ
ー数は、73±16であるという結果を得た。組み換えGM-C
SFによって形成された14日目のコロニーは、明確に分類
され、次の３つの型から成る；約1/3の類似球−マクロ
ファージ混合型コロニー；約1/3の密集した顆粒球コロ
ニー；および、約1/3の広く分散しているマクロファー
ジコロニー。
本発明の発現系の対照実験として、GM-CSF塩基配列を欠
く以外はpYαfHuGMLeu23と同等のプラスミドでも酵母79
株を形質転換した。その酵母からの培養液上清は、骨髄
コロニーアッセイにおいて、GM-CSF活性を示さなかっ
た。
く以外はpYαfHuGMLeu23と同等のプラスミドでも酵母79
株を形質転換した。その酵母からの培養液上清は、骨髄
コロニーアッセイにおいて、GM-CSF活性を示さなかっ
た。
〔実施例 ８〕 コドン欠失によって変異させたGM-CSF遺伝子 コドン欠失によるGM-CSFの部位特異性ミュータジェネシ
スに使用するオリゴヌクレオチドは、スード（Sood）
他、前掲、およびヒロセ（Hirose）他、前掲に詳述され
ている、標準的なトリエステル法によって、化学的に合
成する。MCD5′‐24と命名されたオリゴヌクレオチド
は、以下の塩基配列を有する:5′−CATCCAGGAGGCCCGTCT
CCTGAA−３′。オリゴヌクレオチドは、保護基を取り除
きセファデックス G50 クロマトグラフィー（ファル
マシア・ファイン・ケミカルズ社）およびそれに続く、
分離用ゲル電気泳動によって精製した。その後、スクリ
ーニングプローブとして使用するため、実施例２で述べ
た手法を用いて、32Pで上記オリゴヌクレオチド末端を
放射性標識した。
スに使用するオリゴヌクレオチドは、スード（Sood）
他、前掲、およびヒロセ（Hirose）他、前掲に詳述され
ている、標準的なトリエステル法によって、化学的に合
成する。MCD5′‐24と命名されたオリゴヌクレオチド
は、以下の塩基配列を有する:5′−CATCCAGGAGGCCCGTCT
CCTGAA−３′。オリゴヌクレオチドは、保護基を取り除
きセファデックス G50 クロマトグラフィー（ファル
マシア・ファイン・ケミカルズ社）およびそれに続く、
分離用ゲル電気泳動によって精製した。その後、スクリ
ーニングプローブとして使用するため、実施例２で述べ
た手法を用いて、32Pで上記オリゴヌクレオチド末端を
放射性標識した。
第５図に示したように、MCD5-24オリゴヌクレオチド
は、実施例１で調製した野生型GM-CSF遺伝子を含む単鎖
鋳型、および、上記実施例３で調製したM13HuGMファー
ジベクターとともに、実施例３で述べた手法を用いて、
第３図に示したものと類似の、ギャップのあるヘテロ二
重鎖構造を形成させるのに使用した。その後、ギャップ
を埋めた二重鎖は、アマーシャム・ハンドブック、前掲
に述べられた標準的手法に従い、使用に適した大腸菌
（E.coli）JM105細胞（ベセスダ・リサーチ・ラボラト
リーズ社，メアリーランド州ベセスダ）のトランスフェ
クションに使用した。トランスフェクションを行なった
JM105細胞中の変異型遺伝子のスクリーニングは、実施
例４で延べた手法を用いて行ない、スクリーニングし、
M13HuGMΔArg23と命名された変異型遺伝子の、核酸塩基
配列は、実施例５で延べたチェインターミネーション法
を用いて確認した。
は、実施例１で調製した野生型GM-CSF遺伝子を含む単鎖
鋳型、および、上記実施例３で調製したM13HuGMファー
ジベクターとともに、実施例３で述べた手法を用いて、
第３図に示したものと類似の、ギャップのあるヘテロ二
重鎖構造を形成させるのに使用した。その後、ギャップ
を埋めた二重鎖は、アマーシャム・ハンドブック、前掲
に述べられた標準的手法に従い、使用に適した大腸菌
（E.coli）JM105細胞（ベセスダ・リサーチ・ラボラト
リーズ社，メアリーランド州ベセスダ）のトランスフェ
クションに使用した。トランスフェクションを行なった
JM105細胞中の変異型遺伝子のスクリーニングは、実施
例４で延べた手法を用いて行ない、スクリーニングし、
M13HuGMΔArg23と命名された変異型遺伝子の、核酸塩基
配列は、実施例５で延べたチェインターミネーション法
を用いて確認した。
GM-CSF類似物質は、実施例６で述べた手法を用いて発現
させる。変異型GM-CSF遺伝子の５′リーダー配列、コー
ド領域および３′端隣接領域（ヌクレオチドNo.橋６か
らNo.502）を、制限酵素Nco Iによる切断によってミュ
ータジェネシスベクターM13HuGMΔArg23から除去し、続
いて、T4 DNAポリメラーゼ処理、HindIIIによる切断を
行なう。上記処理で得られた、５′リーダー配列が結合
した。505bp M13HuGMΔArg23 DNAフラグメントは、ゲル
電気泳動によって単離し、pYαfGM−２発現プラスミド
からHindIII-Sfu I/Nco I部分を除去して調製したpYα
ｆベクター（第５図）（ATCC No.53157）に標準的手法
を用いて連結させる。得られたpYαfHuGMΔArg23発現プ
ラスミド（第６図）は、実施例で詳述したように酵母79
株を形質転換し、発現された組み換えGM-CSF産物は、実
施例７で述べた骨髄コロニーアッセイを用いて生物学的
活性を測定した。
させる。変異型GM-CSF遺伝子の５′リーダー配列、コー
ド領域および３′端隣接領域（ヌクレオチドNo.橋６か
らNo.502）を、制限酵素Nco Iによる切断によってミュ
ータジェネシスベクターM13HuGMΔArg23から除去し、続
いて、T4 DNAポリメラーゼ処理、HindIIIによる切断を
行なう。上記処理で得られた、５′リーダー配列が結合
した。505bp M13HuGMΔArg23 DNAフラグメントは、ゲル
電気泳動によって単離し、pYαfGM−２発現プラスミド
からHindIII-Sfu I/Nco I部分を除去して調製したpYα
ｆベクター（第５図）（ATCC No.53157）に標準的手法
を用いて連結させる。得られたpYαfHuGMΔArg23発現プ
ラスミド（第６図）は、実施例で詳述したように酵母79
株を形質転換し、発現された組み換えGM-CSF産物は、実
施例７で述べた骨髄コロニーアッセイを用いて生物学的
活性を測定した。
本発明に関連する技術に習熟した人には明らかなよう
に、本発明は、発明の本質および必須の特徴から離脱す
ることなく、上記の限定された例以外の態様として具体
化されうる。上記の特定の具体例は、従って、全ての点
で限定的ではなく、例示的なものと考えられるべきであ
る。本発明の範囲は、上述の実施例に限定されるもので
はなく、前述の特許請求の範囲で述べたものである。
に、本発明は、発明の本質および必須の特徴から離脱す
ることなく、上記の限定された例以外の態様として具体
化されうる。上記の特定の具体例は、従って、全ての点
で限定的ではなく、例示的なものと考えられるべきであ
る。本発明の範囲は、上述の実施例に限定されるもので
はなく、前述の特許請求の範囲で述べたものである。
第1A図は、３′端非コード領域の一部を含む、野生型ヒ
トGM-CSF遺伝子のアミノ酸配列およびヌクレオチド塩基
配列を示したものである； 第1B図は、変異させた遺伝子にコードされたGM-CSF類似
物質が、多重塩基性アミノ酸残基を持たないようにする
ため、少なくとも１つの塩基性アミノ酸残基をコードす
るコドンを、非塩基性アミノ酸をコードするコドンで置
換した、変異型ヒトGM-CSF遺伝子のアミノ酸配列および
ヌクレオチド塩基配列を示したものである； 第1C図は、変異させた遺伝子にコードされるGM-CSF類似
物質が多重塩基性アミノ酸残基を持たないようにするた
め、少なくとも１個の塩基性アミノ酸残基を欠失させ
た、変異型ヒトGM-CSF遺伝子のアミノ酸配列およびヌク
レオチド塩基配列を示したものである； 第２図は、酵母宿主中で野生型GM-CSFの発現を誘導させ
るのに使用したプラスミドpYαfGM-2を示したものであ
る； 第３図は、ヒトGM-CSF類似物質をコードする、コドン置
換によって変異をおこした遺伝子、M13HuGMLeu23を生成
させるのに使用した手法を示したものである； 第４図は、機能的なヒトGM-CSF類似物質の発現を増大さ
せる目的で宿主細胞の形質転換に使用するため、変異型
GM-CSF遺伝子、M13HuGMLeu23のコード領域を挿入した、
発現プラスミドpYαfHuGMLeu23を示したものである； 第５図は、GM-CSF類似物質をコードする、コドン欠失さ
せて変異をおこした遺伝子、M13HuGMΔArg23を生成する
手法を示したものである；そして、 第６図は、機能的なヒトGM-CSF類似物質の発現を増大さ
せる目的で宿主細胞の形質転換に使用するため、変異型
GM-CSF遺伝子、M13HuGMΔArg23のコード領域を挿入し
た、発現プラスミドpYαfHuGMΔArg23を示したものであ
る。
トGM-CSF遺伝子のアミノ酸配列およびヌクレオチド塩基
配列を示したものである； 第1B図は、変異させた遺伝子にコードされたGM-CSF類似
物質が、多重塩基性アミノ酸残基を持たないようにする
ため、少なくとも１つの塩基性アミノ酸残基をコードす
るコドンを、非塩基性アミノ酸をコードするコドンで置
換した、変異型ヒトGM-CSF遺伝子のアミノ酸配列および
ヌクレオチド塩基配列を示したものである； 第1C図は、変異させた遺伝子にコードされるGM-CSF類似
物質が多重塩基性アミノ酸残基を持たないようにするた
め、少なくとも１個の塩基性アミノ酸残基を欠失させ
た、変異型ヒトGM-CSF遺伝子のアミノ酸配列およびヌク
レオチド塩基配列を示したものである； 第２図は、酵母宿主中で野生型GM-CSFの発現を誘導させ
るのに使用したプラスミドpYαfGM-2を示したものであ
る； 第３図は、ヒトGM-CSF類似物質をコードする、コドン置
換によって変異をおこした遺伝子、M13HuGMLeu23を生成
させるのに使用した手法を示したものである； 第４図は、機能的なヒトGM-CSF類似物質の発現を増大さ
せる目的で宿主細胞の形質転換に使用するため、変異型
GM-CSF遺伝子、M13HuGMLeu23のコード領域を挿入した、
発現プラスミドpYαfHuGMLeu23を示したものである； 第５図は、GM-CSF類似物質をコードする、コドン欠失さ
せて変異をおこした遺伝子、M13HuGMΔArg23を生成する
手法を示したものである；そして、 第６図は、機能的なヒトGM-CSF類似物質の発現を増大さ
せる目的で宿主細胞の形質転換に使用するため、変異型
GM-CSF遺伝子、M13HuGMΔArg23のコード領域を挿入し
た、発現プラスミドpYαfHuGMΔArg23を示したものであ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:865） (72)発明者 ヴァージニア・エル・プライス アメリカ合衆国ワシントン州98102，シア トル，ボイアー・アベニュー・イースト 2617
Claims (5)
- 【請求項１】以下のアミノ酸配列： AlaProAlaArgSerProSerProSerThrGlnProTrpGluHis 15 ValAsnAlaIleGlnGluAlaArgArgLeuLeuAsnLeuSerArg 30 AspThrAlaAlaGluMetAsnGluThrValGluValIleSerGlu 45 MetPheAspLeuGlnGluProThrCysLeuGlnThrArgLeuGlu 60 LeuTyrLysGlnGlyLeuArgGlySerLeuThrLysLeuLysGly 75 ProLeuThrMetMetAlaSerHisTyrLysGlnHisCysProPro 90 ThrProGluThrSerCysAlaThrGlnIleIleThrPheGluSer 105 PheLysGluAsnLeuLysAspPheLeuLeuValIleProPheAsp 120 CysTrpGluProValGlnGlu 127 を有する天然に存在するヒト顆粒球−マクロファージコ
ロニー刺激因子からの変異体であり、該変異により塩基
性アミノ酸残基が２つ以上並ばないようにしたことを特
徴とする、ヒト顆粒球−マクロファージコロニー刺激因
子の活性を有するポリペプチド。 - 【請求項２】請求項１の配列の23位および24位のアルギ
ニン残基のうち少なくとも１つが非塩基性アミノ酸残基
で置換されたアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の
ポリペプチド。 - 【請求項３】非塩基性アミノ酸残基が、リジン残基、ヒ
スチジン残基およびアルギニン残基からなる群の残基以
外の任意のアミノ酸残基である、請求項２に記載のポリ
ペプチド。 - 【請求項４】非塩基性アミノ酸残基がロイシン残基であ
る、請求項３に記載のポリペプチド。 - 【請求項５】以下のアミノ酸配列： AlaProAlaArgSerProSerProSerThrGlnProTrpGluHis 15 ValAsnAlaIleGlnGluAlaLeuArgLeuLeuAsnLeuSerArg 30 AspThrAlaAlaGluMetAsnGluThrValGluValIleSerGlu 45 MetPheAspLeuGlnGluProThrCysLeuGlnThrArgLeuGlu 60 LeuTyrLysGlnGlyLeuArgGlySerLeuThrLysLeuLysGly 75 ProLeuThrMetMetAlaSerHisTyrLysGlnHisCysProPro 90 ThrProGluThrSerCysAlaThrGlnIleIleThrPheGluSer 105 PheLysGluAsnLeuLysAspPheLeuLeuValIleProPheAsp 120 CysTrpGluProValGlnGlu 127 を有する、請求項４に記載のポリペプチド。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/763,130 US5391485A (en) | 1985-08-06 | 1985-08-06 | DNAs encoding analog GM-CSF molecules displaying resistance to proteases which cleave at adjacent dibasic residues |
| US763130 | 1985-08-06 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6259298A JPS6259298A (ja) | 1987-03-14 |
| JPH0772199B2 true JPH0772199B2 (ja) | 1995-08-02 |
Family
ID=25066962
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61185005A Expired - Lifetime JPH0772199B2 (ja) | 1985-08-06 | 1986-08-06 | 組み換えｄｎａ産物発現の増大 |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US5391485A (ja) |
| EP (1) | EP0212914B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0772199B2 (ja) |
| AT (1) | ATE72836T1 (ja) |
| AU (1) | AU586697B2 (ja) |
| CA (1) | CA1341150C (ja) |
| DE (1) | DE3683973D1 (ja) |
| DK (1) | DK175181B1 (ja) |
| ES (1) | ES2000388A6 (ja) |
| MX (1) | MX9203814A (ja) |
| ZA (1) | ZA865651B (ja) |
Families Citing this family (155)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3682233D1 (de) * | 1985-06-12 | 1991-12-05 | Lubrizol Genetics Inc | Modifiziertes zein. |
| EP0238655A4 (en) * | 1985-10-03 | 1989-09-11 | Biogen Nv | POLYPEPTIDES LIKE THE GRANULOCYTE-MACROPHOUS COLONY STIMULATION FACTORS (GM-CSF) AND THEIR METHODS OF PRODUCING LARGE QUANTITIES IN MICROBIAL CELLS. |
| DE3851117T2 (de) * | 1987-10-16 | 1995-03-30 | Genencor Int | Sequenzspezifische saure E.coli-Protease. |
| US5714585A (en) * | 1987-10-26 | 1998-02-03 | Sterling Winthrop, Inc. | Antibodies that are immunoreactive with interleukin-7 |
| US5328988A (en) * | 1987-10-26 | 1994-07-12 | Immunex Corporation | Interleukin-7 |
| JPH03502322A (ja) * | 1987-10-30 | 1991-05-30 | イミュネックス・コーポレーション | ヒトコロニー形成刺激因子の非グリコシル化類似体 |
| EP0413721A4 (en) * | 1988-04-21 | 1991-11-13 | Medvet Science Pty. Ltd. | Human gm-csf variants |
| AU3532289A (en) * | 1988-05-06 | 1989-11-29 | Genentech Inc. | Novel bovine granulocyte-macrophage colony stimulating factor variant |
| AU627477B2 (en) * | 1988-07-05 | 1992-08-27 | Amgen, Inc. | Interleukin ii analogs |
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| ATE157703T1 (de) * | 1991-12-16 | 1997-09-15 | Ciba Geigy Ag | Endoplasmatisches retikulum-ständige rekombinante dibasische endoprotease und deren verwendungen |
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| RO120579B1 (ro) | 1995-10-04 | 2006-04-28 | Immunex Corporation | Utilizarea ligandului flt3 |
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| US7153943B2 (en) * | 1997-07-14 | 2006-12-26 | Bolder Biotechnology, Inc. | Derivatives of growth hormone and related proteins, and methods of use thereof |
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