JPH0774161B2 - 毒素のトキソイド化法 - Google Patents
毒素のトキソイド化法Info
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- JPH0774161B2 JPH0774161B2 JP31187486A JP31187486A JPH0774161B2 JP H0774161 B2 JPH0774161 B2 JP H0774161B2 JP 31187486 A JP31187486 A JP 31187486A JP 31187486 A JP31187486 A JP 31187486A JP H0774161 B2 JPH0774161 B2 JP H0774161B2
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、微生物が産生する毒素を抗原性は保持させな
がら毒性をなくするトキソイド化法に関し、特に、得ら
れたトキソイドが毒性復帰を起こさないようなトキソイ
ド化法に関する。
がら毒性をなくするトキソイド化法に関し、特に、得ら
れたトキソイドが毒性復帰を起こさないようなトキソイ
ド化法に関する。
従来技術 微生物が産生する毒素をトキソイド化（無毒化）するた
めには、従来より主としてホルマリン及びゲルタールア
ルデヒドで処理する方法が用いられている。
めには、従来より主としてホルマリン及びゲルタールア
ルデヒドで処理する方法が用いられている。
ホルマリンで無毒化したトキソノイドでは、トキソイド
を保持している間に毒性が復帰する現象が見られる例が
知られている。この毒性復帰を防止するために、例え
ば、ジフテリア毒素の場合にはＬ−リジン、コレラ毒素
の場合にはグリシン等のアミノ酸をホルマリンと一緒に
添加してトキソイド化する方法が開発されている。しか
しながら、アミノ酸を添加するトキソイド化法は、微生
物が産生する全ての種類の毒素に必ずしも有効ではな
い。例えば、緑膿菌のエクソトキシンＡや百日咳毒素の
場合では、アミノ酸を添加してトキソイド化すると、抗
原性が低下することが知られている。一方、グルタール
アルデヒドを用いてトキソイドを調製する方法は、実際
の産業では用いられていない。
を保持している間に毒性が復帰する現象が見られる例が
知られている。この毒性復帰を防止するために、例え
ば、ジフテリア毒素の場合にはＬ−リジン、コレラ毒素
の場合にはグリシン等のアミノ酸をホルマリンと一緒に
添加してトキソイド化する方法が開発されている。しか
しながら、アミノ酸を添加するトキソイド化法は、微生
物が産生する全ての種類の毒素に必ずしも有効ではな
い。例えば、緑膿菌のエクソトキシンＡや百日咳毒素の
場合では、アミノ酸を添加してトキソイド化すると、抗
原性が低下することが知られている。一方、グルタール
アルデヒドを用いてトキソイドを調製する方法は、実際
の産業では用いられていない。
本発明は、かかる技術的背景をもとに、微生物が産生す
る毒素をトキソイド化するに当たり、充分な抗原性を有
しながら毒性は全くなく、かつ毒性復帰も生じない新規
なトキソイド化法を提供することを目的とするものであ
る。
る毒素をトキソイド化するに当たり、充分な抗原性を有
しながら毒性は全くなく、かつ毒性復帰も生じない新規
なトキソイド化法を提供することを目的とするものであ
る。
発明の構成 本発明者らは、鋭意検討の結果、特定の化合物またはイ
オンの存在下に毒素を処理することにより上記の目的が
達成されることを見出した。かくして、本発明に従え
ば、微生物が産生する毒素に、尿素、マグネシウムイオ
ン、またはホフマイスター系列が塩素イオンより小さい
カオトロピックイオン、およびホルマリンを作用させる
ことを特徴とするトキソイド化法が提供される。
オンの存在下に毒素を処理することにより上記の目的が
達成されることを見出した。かくして、本発明に従え
ば、微生物が産生する毒素に、尿素、マグネシウムイオ
ン、またはホフマイスター系列が塩素イオンより小さい
カオトロピックイオン、およびホルマリンを作用させる
ことを特徴とするトキソイド化法が提供される。
本発明において用いられるホフマイスター系列が塩素イ
オンより小さいカオトロピックイオンの好適な例は、チ
オシアン酸イオン（SCN-）、ヨウ素イオン（I-）であ
り、これらのイオンは、一般に、ナトリウム塩として添
加される。なお、よく知られているように、カオトロピ
ックイオンとはイオン半径の大きな１価の陰イオンの総
称であり、また、ホフマイスター系列はそのようなイオ
ンが溶媒中において疎水性分子を解離させ疎水結合を弱
める効果に対応するものである。また、本発明のトキソ
イド化法は、マグネシウムイオンの存在下に毒素を処理
することによっても可能であり、マグネシウムイオン
は、一般に、塩化マグネシウムとして添加するのが好ま
しい。さらに、本発明に従えば、尿素によっても、毒性
復帰の起こらないトキソイドが得られる。
オンより小さいカオトロピックイオンの好適な例は、チ
オシアン酸イオン（SCN-）、ヨウ素イオン（I-）であ
り、これらのイオンは、一般に、ナトリウム塩として添
加される。なお、よく知られているように、カオトロピ
ックイオンとはイオン半径の大きな１価の陰イオンの総
称であり、また、ホフマイスター系列はそのようなイオ
ンが溶媒中において疎水性分子を解離させ疎水結合を弱
める効果に対応するものである。また、本発明のトキソ
イド化法は、マグネシウムイオンの存在下に毒素を処理
することによっても可能であり、マグネシウムイオン
は、一般に、塩化マグネシウムとして添加するのが好ま
しい。さらに、本発明に従えば、尿素によっても、毒性
復帰の起こらないトキソイドが得られる。
本発明に従い上記のごとき化合物またはイオンの存在下
に毒素を処理することにより毒性復帰の生じないトキソ
イドが得られるのは、ホルマリンによる減毒化作用に加
えて、それらの化合物またはイオンが変性剤ないしは解
離剤として作用し、毒素を変性させたり、サブユニット
に解離させてその立体構造の非可逆的な変化を起こし、
もとのネイティブな毒素に戻らないようにするためと理
解される。
に毒素を処理することにより毒性復帰の生じないトキソ
イドが得られるのは、ホルマリンによる減毒化作用に加
えて、それらの化合物またはイオンが変性剤ないしは解
離剤として作用し、毒素を変性させたり、サブユニット
に解離させてその立体構造の非可逆的な変化を起こし、
もとのネイティブな毒素に戻らないようにするためと理
解される。
本発明の方法を実施するには、毒素に上述のごとき特定
の化合物またはイオンを添加し作用させた後、ホルマリ
ンを作用させることが好ましいが、ホルマリンによる処
理と同時に、または、ホルマリンによる処理後にそれら
の化合物またはイオンを作用させることは可能である。
具体的には、微生物が産生する毒素を硫安塩析、遠心、
カラムクロマトグラフィー、ショ糖勾配遠心などの適当
な方法で精製あるいは部分精製し、この精製後の毒素
を、例えば、毒素50〜500μg/mlの濃度で透析チューブ
に入れ、変性剤あるいは解離剤として作用する上述の特
定化合物ないしはイオンを含有する緩衝液に透析する。
この透析は、毒素溶液１容に対し、例えば、１〜8M、好
ましくは8Mの尿素、１〜5M、好ましくは5Mの塩化マグネ
シウム、または0.5〜3M、好ましくは1Mのチオシア酸ナ
トリウムなどを含有するpH4〜11.0の緩衝溶液５〜1000
容に対して行なう。透析後、毒素溶液に、例えば、0.2
〜2.0％/vの濃度になるようにホルマリンを加え、０〜5
0℃の温度で１〜10日間毒素とホルマリンを反応させ
る。ホルマリン処理後、透析などの方法によってホルマ
リン及び変性剤あるいは解離剤を除去する。
の化合物またはイオンを添加し作用させた後、ホルマリ
ンを作用させることが好ましいが、ホルマリンによる処
理と同時に、または、ホルマリンによる処理後にそれら
の化合物またはイオンを作用させることは可能である。
具体的には、微生物が産生する毒素を硫安塩析、遠心、
カラムクロマトグラフィー、ショ糖勾配遠心などの適当
な方法で精製あるいは部分精製し、この精製後の毒素
を、例えば、毒素50〜500μg/mlの濃度で透析チューブ
に入れ、変性剤あるいは解離剤として作用する上述の特
定化合物ないしはイオンを含有する緩衝液に透析する。
この透析は、毒素溶液１容に対し、例えば、１〜8M、好
ましくは8Mの尿素、１〜5M、好ましくは5Mの塩化マグネ
シウム、または0.5〜3M、好ましくは1Mのチオシア酸ナ
トリウムなどを含有するpH4〜11.0の緩衝溶液５〜1000
容に対して行なう。透析後、毒素溶液に、例えば、0.2
〜2.0％/vの濃度になるようにホルマリンを加え、０〜5
0℃の温度で１〜10日間毒素とホルマリンを反応させ
る。ホルマリン処理後、透析などの方法によってホルマ
リン及び変性剤あるいは解離剤を除去する。
本発明に従えば、上記のごとき処理により微生物が産生
する毒素（蛋白性毒素）を無毒化させ、毒性復帰が起こ
らないトキソイドを得ることができる。
する毒素（蛋白性毒素）を無毒化させ、毒性復帰が起こ
らないトキソイドを得ることができる。
本発明のトキソイド化法は、上記したごとく簡便な操作
で原理的にほとんどの蛋白性毒素のトキソイド化に適用
できる産業上も有用なトキソイド化法である。
で原理的にほとんどの蛋白性毒素のトキソイド化に適用
できる産業上も有用なトキソイド化法である。
以下に本発明を実施例によりさらに具体的に説明する
が、これらは本発明を制限するものではない。
が、これらは本発明を制限するものではない。
実施例１ 百日咳Ｉ相菌（Bordetella pertussis phase I）東浜株
の培養液から精製した市販の百日咳毒素（科学及血清療
法研究所製）200μg/mlを5ml採取し、分子量のカットオ
フ値が3,500の透析膜チューブに入れ、100mlのpH7.2リ
ン酸塩緩衝生理食塩液0.01Mに透析した。透析外液（100
ml）は１日に１回計３回交換した３日間透析した。次
に、1Mチオシアン酸ナトリウムを含む0.01M、pH7.2リン
酸塩緩衝生理食塩液の緩衝液50mlに上記毒素溶液を室温
で２日間透析し毒素を解離変性させた。透析後、ゼラチ
ンを0.02w/v％、ホルマリンを0.6w/v％になるようにそ
れぞれ加え、よく混合して37℃５日間恒温器内でインキ
ュベートした。得られたトキソイド溶液を透析膜チュー
ブに入れ、pH7.2 0.01Mリン酸塩緩衝生理食塩液を外液
として透析した。透析は透析内液１容に対して透析外液
50容を用いて冷室（４℃）で行ない、透析外液は１日に
１回計３回交換し、３日間行なった。
の培養液から精製した市販の百日咳毒素（科学及血清療
法研究所製）200μg/mlを5ml採取し、分子量のカットオ
フ値が3,500の透析膜チューブに入れ、100mlのpH7.2リ
ン酸塩緩衝生理食塩液0.01Mに透析した。透析外液（100
ml）は１日に１回計３回交換した３日間透析した。次
に、1Mチオシアン酸ナトリウムを含む0.01M、pH7.2リン
酸塩緩衝生理食塩液の緩衝液50mlに上記毒素溶液を室温
で２日間透析し毒素を解離変性させた。透析後、ゼラチ
ンを0.02w/v％、ホルマリンを0.6w/v％になるようにそ
れぞれ加え、よく混合して37℃５日間恒温器内でインキ
ュベートした。得られたトキソイド溶液を透析膜チュー
ブに入れ、pH7.2 0.01Mリン酸塩緩衝生理食塩液を外液
として透析した。透析は透析内液１容に対して透析外液
50容を用いて冷室（４℃）で行ない、透析外液は１日に
１回計３回交換し、３日間行なった。
このようにして調製したトキソイドは、pH7.2の0.01Mリ
ン酸緩衝生理食塩液で蛋白窒素量20μg/ml以下になるよ
うに希釈し、毒性試験、力価試験及び中和試験を行な
い、さらに毒性復帰に関する試験を行なった。
ン酸緩衝生理食塩液で蛋白窒素量20μg/ml以下になるよ
うに希釈し、毒性試験、力価試験及び中和試験を行な
い、さらに毒性復帰に関する試験を行なった。
実施例２ 実施例１における1Mチオシアン酸ナトリウムを含有する
pH7.2の0.01Mリン酸緩衝生理食塩液に代えて、8M尿素を
含むpH7.2の0.01Mリン酸緩衝生理食塩液を用いた。他の
操作は実施例１と同様に行なった。
pH7.2の0.01Mリン酸緩衝生理食塩液に代えて、8M尿素を
含むpH7.2の0.01Mリン酸緩衝生理食塩液を用いた。他の
操作は実施例１と同様に行なった。
実施例３ 市販の百日咳毒素200μm/mlを5ml採取し、分子量のカッ
トオフ値が3500の透析膜チューブに入れ、100mlのpH8.
5、0.01Mリン酸緩衝液に透析した。透析外液は１日に１
回、計３回交換した。次に透析外液を5M塩化マグネシウ
ムを含むpH8.5 0.02Mグリシン緩衝溶液50mlに交換し、
室温で２日間透析を行ない毒素を解離変性させた。さら
に解離変性せしめた毒素は、5M塩化マグネシウムを含有
するpH8.5の0.02Mグリシン緩衝溶液に0.6w/v％のホルマ
リンを添加した緩衝液を外液として37℃で５日間透析す
ることによってトキソイド化した。なお、この透析は、
透析内液１容に対し透析外液50容で行なった。得られた
トキソイド溶液は冷室（４℃）で50倍量のpH8.5、0.02M
グリシン緩衝液に透析した。透析外液は１日に１回、計
３回交換し、３日間透析した。さらに透析外液をpH7.
2、0.01Mリン酸緩衝生理食塩液に交換し、透析外液を１
日に１回、計３回交換し、３日間透析を行なった。
トオフ値が3500の透析膜チューブに入れ、100mlのpH8.
5、0.01Mリン酸緩衝液に透析した。透析外液は１日に１
回、計３回交換した。次に透析外液を5M塩化マグネシウ
ムを含むpH8.5 0.02Mグリシン緩衝溶液50mlに交換し、
室温で２日間透析を行ない毒素を解離変性させた。さら
に解離変性せしめた毒素は、5M塩化マグネシウムを含有
するpH8.5の0.02Mグリシン緩衝溶液に0.6w/v％のホルマ
リンを添加した緩衝液を外液として37℃で５日間透析す
ることによってトキソイド化した。なお、この透析は、
透析内液１容に対し透析外液50容で行なった。得られた
トキソイド溶液は冷室（４℃）で50倍量のpH8.5、0.02M
グリシン緩衝液に透析した。透析外液は１日に１回、計
３回交換し、３日間透析した。さらに透析外液をpH7.
2、0.01Mリン酸緩衝生理食塩液に交換し、透析外液を１
日に１回、計３回交換し、３日間透析を行なった。
このようにして調製したトキソイドは、pH7.2の0.01Mリ
ン酸緩衝生理食塩液で蛋白窒素量20μg/ml以下になるよ
うに希釈し、毒性試験、力価試験及び中和試験を行な
い、さらに毒性復帰に関する試験を行なった。
ン酸緩衝生理食塩液で蛋白窒素量20μg/ml以下になるよ
うに希釈し、毒性試験、力価試験及び中和試験を行な
い、さらに毒性復帰に関する試験を行なった。
実施例４ 緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）PA103株の培養上清
から精製した市販の緑膿菌エキソトキシンＡ（化学及血
清療法研究所製）0.5mg/mlを2ml用い実施例３に記した
方法と全く同様にして緑膿菌毒素のトキソイドを調製し
た。
から精製した市販の緑膿菌エキソトキシンＡ（化学及血
清療法研究所製）0.5mg/mlを2ml用い実施例３に記した
方法と全く同様にして緑膿菌毒素のトキソイドを調製し
た。
実施例５ 市販の緑膿菌エキソトキシンＡ（化学及血清療法研究所
製）0.5mg/mlを2ml用い実施例３に記した方法と全く同
様にして緑膿菌毒素のトキソイドを調製した。
製）0.5mg/mlを2ml用い実施例３に記した方法と全く同
様にして緑膿菌毒素のトキソイドを調製した。
実施例６ 市販の緑膿菌エキソトキシンＡ（化血研製）0.5mg/mlを
2ml用い実施例３に記した方法と全く同様にして緑膿菌
毒素のトキソイドを調製した。
2ml用い実施例３に記した方法と全く同様にして緑膿菌
毒素のトキソイドを調製した。
実施例７ コレラ菌Vibrio cholerae（lnaba 569B株）の培養液か
ら精製した市販のコレラ毒素（化学及血清療法研究所
製）1mg/mlを1ml用いて実施例１に記した方法と全く同
様にしてコレラトキソイドを調製した。
ら精製した市販のコレラ毒素（化学及血清療法研究所
製）1mg/mlを1ml用いて実施例１に記した方法と全く同
様にしてコレラトキソイドを調製した。
実施例８ 市販のコレラ毒素（化学及血清療法研究所製）1mg/mlを
1ml用いて実施例２に記した方法と全く同様にしてコレ
ラトキソイドを調製した。
1ml用いて実施例２に記した方法と全く同様にしてコレ
ラトキソイドを調製した。
実施例９ 市販のコレラ毒素（化学及血清療法研究所製）1mg/mlを
1ml用いて実施例３に記した方法と全く同様にしてコレ
ラトキソイドを調製した。
1ml用いて実施例３に記した方法と全く同様にしてコレ
ラトキソイドを調製した。
上記した実施例によって得られたトキソイドの毒性試
験、毒性復帰試験及び力価試験の結果を表１に示す。本
発明に従い、チオシアン酸ナトリウム、尿素及び塩化マ
グネシウムなどの変性剤あるいは解離剤を作用させ、ホ
ルマリン処理して調製した百日咳トキソイド、緑膿菌エ
クソトキシンＡトキソイド及びコレラトキソイドは、い
づれも完全に無毒化されており、毒性が復帰する現象も
認められず、力価もコントロール以上の成果が得られ
た。
験、毒性復帰試験及び力価試験の結果を表１に示す。本
発明に従い、チオシアン酸ナトリウム、尿素及び塩化マ
グネシウムなどの変性剤あるいは解離剤を作用させ、ホ
ルマリン処理して調製した百日咳トキソイド、緑膿菌エ
クソトキシンＡトキソイド及びコレラトキソイドは、い
づれも完全に無毒化されており、毒性が復帰する現象も
認められず、力価もコントロール以上の成果が得られ
た。
表の説明 １） トキソイド：蛋白質50μg/mlで行なった。
２） トキソイドの毒性試験：百日咳トキソイドの場合
は、国家検定で定められているマウス白血球数増多試験
が0.5Unit/ml以下及びマウスヒスタミン増感試験が0.8U
nit/ml以下を両方ともに統計処理を行なって満足するも
のを合格と判定。緑膿菌エクソトキシンＡのトキソイド
の毒性試験はCHO細胞を用いたカラーチェンジを行な
い、カラーチェンジを起こさないものを合格とした。コ
レラトキソイドの毒性試験はPF活性がネガティブのもの
を合格とした。
は、国家検定で定められているマウス白血球数増多試験
が0.5Unit/ml以下及びマウスヒスタミン増感試験が0.8U
nit/ml以下を両方ともに統計処理を行なって満足するも
のを合格と判定。緑膿菌エクソトキシンＡのトキソイド
の毒性試験はCHO細胞を用いたカラーチェンジを行な
い、カラーチェンジを起こさないものを合格とした。コ
レラトキソイドの毒性試験はPF活性がネガティブのもの
を合格とした。
３） トキソイドの毒性復帰試験：トキソイドを37℃の
恒温器内で３週間インキュベートして、上記２）の毒性
試験を行なった。
恒温器内で３週間インキュベートして、上記２）の毒性
試験を行なった。
４） 力価試験：百日咳トキソイドの力価試験は、生物
学的製剤基準の百日咳ワクチンの力価試験法に従って行
なった。緑膿菌エクソトキシンＡトキソイドの力価試験
は、トキソイドを免疫したマウスに100＞D50の緑膿菌エ
クソトキシンＡを攻撃し、生残率を調べた。コレラトキ
ソイドの力価試験は、コレラトキソイドをウサギに免疫
して抗血清を作成し、コレラ毒素によるPF活性の中和試
験を行なった。
学的製剤基準の百日咳ワクチンの力価試験法に従って行
なった。緑膿菌エクソトキシンＡトキソイドの力価試験
は、トキソイドを免疫したマウスに100＞D50の緑膿菌エ
クソトキシンＡを攻撃し、生残率を調べた。コレラトキ
ソイドの力価試験は、コレラトキソイドをウサギに免疫
して抗血清を作成し、コレラ毒素によるPF活性の中和試
験を行なった。
Claims (1)
- 【請求項１】微生物が産生する毒素に、尿素、マグネシ
ウムイオン、またはホフマイスター系列が塩素イオンよ
り小さいカオトロピックイオン、およびホルマリンを作
用させることを特徴とするトキソイド化法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP31187486A JPH0774161B2 (ja) | 1986-12-29 | 1986-12-29 | 毒素のトキソイド化法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP31187486A JPH0774161B2 (ja) | 1986-12-29 | 1986-12-29 | 毒素のトキソイド化法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63166835A JPS63166835A (ja) | 1988-07-11 |
| JPH0774161B2 true JPH0774161B2 (ja) | 1995-08-09 |
Family
ID=18022450
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP31187486A Expired - Fee Related JPH0774161B2 (ja) | 1986-12-29 | 1986-12-29 | 毒素のトキソイド化法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0774161B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AT408191B (de) * | 1991-08-19 | 2001-09-25 | Haemosan Erzeugung Pharmazeuti | Verfahren zur inaktivierung von prionen |
| WO2007111326A1 (ja) * | 2006-03-27 | 2007-10-04 | The Kitasato Institute | 長期保存においても毒性復帰がおこらない特徴を持つ全菌体細菌ワクチンならびにその用途 |
-
1986
- 1986-12-29 JP JP31187486A patent/JPH0774161B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS63166835A (ja) | 1988-07-11 |
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