JPH0779710B2 - 酵母による組換ポリペプチドの製造方法 - Google Patents
酵母による組換ポリペプチドの製造方法Info
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- JPH0779710B2 JPH0779710B2 JP2061304A JP6130490A JPH0779710B2 JP H0779710 B2 JPH0779710 B2 JP H0779710B2 JP 2061304 A JP2061304 A JP 2061304A JP 6130490 A JP6130490 A JP 6130490A JP H0779710 B2 JPH0779710 B2 JP H0779710B2
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の背景 （発明の分野） ハイブリドDNA技法は無数の種類の組成のポリペプチド
を製造する可能性に革命をもたらした。生物は蛋白質に
よって構成されており、そして制御のために蛋白質を用
いるから、これらの蛋白質を意のままに製造することが
可能であれば、これらの蛋白質の機能様式を研究し、そ
して治療及び診断においてこれらの蛋白質、これらの蛋
白質の断片又は類似体を使用する独特の機会が得られ
る。細胞による蛋白質の生産速度及び量の改良において
多くの進歩が存在する。これらの進歩のほとんどがより
大きなコピー数、より効果的なプロモーター、及び所望
の生成物の分解量を減少せしめる手段と関連している。
目的生成物たる目的ポリペプチドの分泌が可能であるこ
とが非常に望ましいことが明らかである。
を製造する可能性に革命をもたらした。生物は蛋白質に
よって構成されており、そして制御のために蛋白質を用
いるから、これらの蛋白質を意のままに製造することが
可能であれば、これらの蛋白質の機能様式を研究し、そ
して治療及び診断においてこれらの蛋白質、これらの蛋
白質の断片又は類似体を使用する独特の機会が得られ
る。細胞による蛋白質の生産速度及び量の改良において
多くの進歩が存在する。これらの進歩のほとんどがより
大きなコピー数、より効果的なプロモーター、及び所望
の生成物の分解量を減少せしめる手段と関連している。
目的生成物たる目的ポリペプチドの分泌が可能であるこ
とが非常に望ましいことが明らかである。
さらに、多くの状況において、目的ポリペプチドは最初
のメチオニンアミノ酸を有しない。これは、目的ポリペ
プチドをコードする遺伝子中にプロセシングシグナルが
存在し、遺伝子源がそれを認識し、そして適当なペプチ
ダーゼによりポリペプチドが開裂する結果である。ほと
んどの状況において、問題の遺伝子は、その遺伝子が中
で発現する宿主にとって外来性であるから、このような
プロセシングは発現宿主中で不正確であり、そして発生
率が低い。この場合、得られる蛋白質はほとんどすべて
の配列において目的ペプチドと同じであるが、Ｎ末端に
おいて異なり、このために生理的活性が有害な影響を受
ける場合がある。
のメチオニンアミノ酸を有しない。これは、目的ポリペ
プチドをコードする遺伝子中にプロセシングシグナルが
存在し、遺伝子源がそれを認識し、そして適当なペプチ
ダーゼによりポリペプチドが開裂する結果である。ほと
んどの状況において、問題の遺伝子は、その遺伝子が中
で発現する宿主にとって外来性であるから、このような
プロセシングは発現宿主中で不正確であり、そして発生
率が低い。この場合、得られる蛋白質はほとんどすべて
の配列において目的ペプチドと同じであるが、Ｎ末端に
おいて異なり、このために生理的活性が有害な影響を受
ける場合がある。
従って、分泌をコードし、そしてポリペプチドが生成物
を成熟せしめるDNA配列を調製することが非常に有利で
あるとする多くの理由が存在する。さらに、目的のポリ
ペプチドにとって不必要なアミノ酸を除去するプロセシ
ングのための配列が見出される場合、単一転写上にタン
デムにコードされているであろう同一の又は異なる多数
のDNA配列が得られる可能性が存在する。
を成熟せしめるDNA配列を調製することが非常に有利で
あるとする多くの理由が存在する。さらに、目的のポリ
ペプチドにとって不必要なアミノ酸を除去するプロセシ
ングのための配列が見出される場合、単一転写上にタン
デムにコードされているであろう同一の又は異なる多数
のDNA配列が得られる可能性が存在する。
（従来技術の記載） 米国特許第4,336,336号は、通常細胞表面に又はそれを
超えて輸送される非細胞質性蛋白質をコードする原核生
物のためのリーダー配列の使用について記載しており、
この場合融合蛋白質はペレプラズム空間に輸送される。
米国特許第4,338,397号は、目的のポリペプチドからリ
ーダー配列を開裂して分泌を生じさせるリーダー配列を
用いる原核細胞について記載している。米国特許第4,33
8,397第３欄及び第４欄は有用な定義を提供しており、
この定義を引用によりこの明細書に組み入れる。
超えて輸送される非細胞質性蛋白質をコードする原核生
物のためのリーダー配列の使用について記載しており、
この場合融合蛋白質はペレプラズム空間に輸送される。
米国特許第4,338,397号は、目的のポリペプチドからリ
ーダー配列を開裂して分泌を生じさせるリーダー配列を
用いる原核細胞について記載している。米国特許第4,33
8,397第３欄及び第４欄は有用な定義を提供しており、
この定義を引用によりこの明細書に組み入れる。
具体的には米国特許第4,338,397号には、蛋白質又はポ
リペプチドの前駆体が宿主の細胞膜を通して輸送され、
そして分泌の間に前駆体のシグナル配列の適切な切断に
より成熟蛋白質又はポリペプチドが形成されるには蛋白
質又はポリペプチドの前駆体のシグナル配列の一部分の
みが必須である旨記載されている。
リペプチドの前駆体が宿主の細胞膜を通して輸送され、
そして分泌の間に前駆体のシグナル配列の適切な切断に
より成熟蛋白質又はポリペプチドが形成されるには蛋白
質又はポリペプチドの前駆体のシグナル配列の一部分の
みが必須である旨記載されている。
クージャン（Kurjan）及びヘルスコビッチ（Herskowit
z）Cell（1982）30:933〜943は成熟α−ファクターの４
個のテンダムコピーを含む推定上のα−ファクター前駆
体について記載し、その配列を記載しそしてプロセシン
グの機構を予想している。この文献はさらに、酵母α−
ファクターの前駆体配列のＮ−末端の22個のアミノ酸が
分泌のためのシグナル配列であることを予想している。
Cg「A Putative α−Factor Ptecursor Containing Fou
r Tandem Repeats of Mature α−Factor」と題するThe
Molecular Biology of Yeastsの1981年スプリングハー
バーミーティングの要約242頁において、クージャン及
びヘルスコビッチはα−ファクターをコードする配列及
びこの２個の配列の間のスペーサーについて記載してい
る。ブライア（Blair）等は「Synthesis and Processin
g of Yeast Pheremones:Identification and Character
ization of Mutants That Produce Altered α−Factor
s」と題する上記要約において、成熟α−ファクターの
生産に対する種々の変異株の効果を記載している。
z）Cell（1982）30:933〜943は成熟α−ファクターの４
個のテンダムコピーを含む推定上のα−ファクター前駆
体について記載し、その配列を記載しそしてプロセシン
グの機構を予想している。この文献はさらに、酵母α−
ファクターの前駆体配列のＮ−末端の22個のアミノ酸が
分泌のためのシグナル配列であることを予想している。
Cg「A Putative α−Factor Ptecursor Containing Fou
r Tandem Repeats of Mature α−Factor」と題するThe
Molecular Biology of Yeastsの1981年スプリングハー
バーミーティングの要約242頁において、クージャン及
びヘルスコビッチはα−ファクターをコードする配列及
びこの２個の配列の間のスペーサーについて記載してい
る。ブライア（Blair）等は「Synthesis and Processin
g of Yeast Pheremones:Identification and Character
ization of Mutants That Produce Altered α−Factor
s」と題する上記要約において、成熟α−ファクターの
生産に対する種々の変異株の効果を記載している。
発明の要約 成熟ポリペプチドの製造するための方法及び組成が提供
される。酵母リーダー配列、及びポリペプチド生成物の
分泌と成熟のための外来性遺伝子に対するプロセシング
シグナルとをコードするDNA配列を連結するDNA構成が提
供される。Ｎ−末端開裂性オリゴペプチドをコードする
DNA構成及び成熟ポリペプチド生成物をコードするDNA配
列を、酵母又は所望のポリペプチドを製造するためのプ
ロセシングシグナルを認識する他の細胞に導入するため
の適当なベクターに連結することができる。
される。酵母リーダー配列、及びポリペプチド生成物の
分泌と成熟のための外来性遺伝子に対するプロセシング
シグナルとをコードするDNA配列を連結するDNA構成が提
供される。Ｎ−末端開裂性オリゴペプチドをコードする
DNA構成及び成熟ポリペプチド生成物をコードするDNA配
列を、酵母又は所望のポリペプチドを製造するためのプ
ロセシングシグナルを認識する他の細胞に導入するため
の適当なベクターに連結することができる。
特定の態様の記載 この発明に従えば成熟ポリペプチドを製造するために真
核細胞、特に酵母が使用され、該ポリペプチドが培地か
ら採取される。酵母リーダー及び目的ポリペプチドに結
合したプロセシングシグナル（このポリペプチドは単一
ポリペプチドでもよくプロセシングシグナルにより分離
された多数のポリペプチドでもよい）をコードするDNA
構成を用いることによりポリペプチドが製造される。得
られたDNA構成はプレープロ−ポリペプチドをコード
し、プレープロ−ポリペプチドを分泌するためのシグナ
ル及びポリペプチドを細胞内又は細胞外で成熟ポリペプ
チドにプロセシングするためのシグナルを含有するであ
ろう。
核細胞、特に酵母が使用され、該ポリペプチドが培地か
ら採取される。酵母リーダー及び目的ポリペプチドに結
合したプロセシングシグナル（このポリペプチドは単一
ポリペプチドでもよくプロセシングシグナルにより分離
された多数のポリペプチドでもよい）をコードするDNA
構成を用いることによりポリペプチドが製造される。得
られたDNA構成はプレープロ−ポリペプチドをコード
し、プレープロ−ポリペプチドを分泌するためのシグナ
ル及びポリペプチドを細胞内又は細胞外で成熟ポリペプ
チドにプロセシングするためのシグナルを含有するであ
ろう。
この発明のDNA構成は、プロ−ポリペプチドを規定する
少なくとも次の構造、 ((R)r-(GAXYCX)n-Gene*)y （式中、ＲはCGX又はAZZ、すなわちリジン及びアミギニ
ンをコードするコドンであってＲの各各は同一であり又
は異り;rは２〜４、通常２〜３、好ましくは２又は４の
整数であり;Xは４種のヌクレオチドすなわちT,G,C又は
Ａの内の任意のものであり;YはＧ又はＣであり、ｙは１
以上の整数であり、通常は10以下であり、さらに通常は
４以下であって、モノマー又はマルチマーを供し;ZはＡ
又はＧであり；そしてGene*はα−ファクター以外の遺
伝子、通常は酵母宿主にとって外来性（foreign）の遺
伝子、通常は異種性（heterologous）遺伝子、好ましく
は植物遺伝子又は哺乳動物遺伝子であり;nは０、又は一
般に１〜４、通常は２〜３の間で変化する整数である）
を有する。
少なくとも次の構造、 ((R)r-(GAXYCX)n-Gene*)y （式中、ＲはCGX又はAZZ、すなわちリジン及びアミギニ
ンをコードするコドンであってＲの各各は同一であり又
は異り;rは２〜４、通常２〜３、好ましくは２又は４の
整数であり;Xは４種のヌクレオチドすなわちT,G,C又は
Ａの内の任意のものであり;YはＧ又はＣであり、ｙは１
以上の整数であり、通常は10以下であり、さらに通常は
４以下であって、モノマー又はマルチマーを供し;ZはＡ
又はＧであり；そしてGene*はα−ファクター以外の遺
伝子、通常は酵母宿主にとって外来性（foreign）の遺
伝子、通常は異種性（heterologous）遺伝子、好ましく
は植物遺伝子又は哺乳動物遺伝子であり;nは０、又は一
般に１〜４、通常は２〜３の間で変化する整数である）
を有する。
プロ−ポリペプチドは、Gene*によりコードされるアミ
ノ酸に先行するアミノ酸を除去するペプチダーゼのため
のＮ−末端プロセシングシグナルを有する。
ノ酸に先行するアミノ酸を除去するペプチダーゼのため
のＮ−末端プロセシングシグナルを有する。
多くの場合、この発明のDNA構成はプレ−プロ−ポリペ
プチドを規定する少なくとも次の構造、 L-(R-S-(GAXYCX)n-Gene*)y （式中、Ｌ及びＳ以外のすべての記号は上に定義した通
りであり;SはＲと同じ意味を有し、１個のＲ及び１個の
Ｓが存在し；そしてＬはプレープロ−ポリペプチドの分
泌をもたらすリーダー配列である）を有する。さらに多
くのＲ及びＳを有することも可能であるが、アミノ酸を
追加することには通常利益がない。分泌をもたらす任意
のリーダー配列を用いることができ、リーダー配列は一
般に約30〜120個、通常約30〜100個のアミノ酸から成
り、疎水性領域を有しそしてＮ末端にメチオニンを有す
る。
プチドを規定する少なくとも次の構造、 L-(R-S-(GAXYCX)n-Gene*)y （式中、Ｌ及びＳ以外のすべての記号は上に定義した通
りであり;SはＲと同じ意味を有し、１個のＲ及び１個の
Ｓが存在し；そしてＬはプレープロ−ポリペプチドの分
泌をもたらすリーダー配列である）を有する。さらに多
くのＲ及びＳを有することも可能であるが、アミノ酸を
追加することには通常利益がない。分泌をもたらす任意
のリーダー配列を用いることができ、リーダー配列は一
般に約30〜120個、通常約30〜100個のアミノ酸から成
り、疎水性領域を有しそしてＮ末端にメチオニンを有す
る。
ｎが０である場合、DNA構成はプレープロ−ポリペプチ
ドを規定する次の構造、 L-((R)r′-Gene*)y （式中、ｒ′以外のすべての記号は前に定義した通りで
あり；そしてｒ′は２〜４、好ましくは２又は４であ
る）を有する。
ドを規定する次の構造、 L-((R)r′-Gene*)y （式中、ｒ′以外のすべての記号は前に定義した通りで
あり；そしてｒ′は２〜４、好ましくは２又は４であ
る）を有する。
特に有利なのはクージャン及びヘルスコビッチ、（前
記）第937頁に記載されているα−ファクターのリーダ
ー配列又はその断片もしくは類似体であり、このものは
所望のポリペプチドの効果的な分泌をもたらす。さら
に、上記論文に示されているDNA配列（この配列を引用
によりこの明細書に組み入れる）は必須ではなく、所望
のオリゴペプチドをコードする任意の配列で十分であ
る。種種の配列が幾分翻訳されよう。
記）第937頁に記載されているα−ファクターのリーダ
ー配列又はその断片もしくは類似体であり、このものは
所望のポリペプチドの効果的な分泌をもたらす。さら
に、上記論文に示されているDNA配列（この配列を引用
によりこの明細書に組み入れる）は必須ではなく、所望
のオリゴペプチドをコードする任意の配列で十分であ
る。種種の配列が幾分翻訳されよう。
前記の構造が好ましいが、サプレッサー変異体において
は、所望の機能を発揮する他の配列が使用され得ること
を理解すべきである。通常、サプレッサー変異体は発現
のためには効果的でなく、従って前記配列、又は同じア
ミノ酸配列をコードする同等の配列が好ましい。変異体
が、異なるコドンから前記の配列によって発現されるア
ミノ酸と同じアミノ酸を発現する限り、そのような代替
配列も許容される。
は、所望の機能を発揮する他の配列が使用され得ること
を理解すべきである。通常、サプレッサー変異体は発現
のためには効果的でなく、従って前記配列、又は同じア
ミノ酸配列をコードする同等の配列が好ましい。変異体
が、異なるコドンから前記の配列によって発現されるア
ミノ酸と同じアミノ酸を発現する限り、そのような代替
配列も許容される。
カッコ内の配列によってコードされるジペプチドは１個
の酸性アミノ酸、すなわちアスパラギン酸又はグルタミ
ン酸、好ましくはグルタミン酸、及びそれに続く１個の
中性アミノ酸、アラニン又はプローリン、特にアラニン
である。
の酸性アミノ酸、すなわちアスパラギン酸又はグルタミ
ン酸、好ましくはグルタミン酸、及びそれに続く１個の
中性アミノ酸、アラニン又はプローリン、特にアラニン
である。
発現のためのカセットとして使用し得る有用なDNA配列
として、次の配列、 Tr-L-((R-S)r″-(GAXYCX)n′-W-(Gene*)d)y （式中、Trは転写制御シグナル、特にプロモーター及び
オペレーターのごとき他の制御シグナル、アクティベー
ター、キャップシグナル、リボゾーム結合を強化するシ
グナルをコードするDNA配列、又は転写制御もしくは翻
訳制御に関与するその他の配列であり;Tr配列は一般に
約100bp以上であり、そして約2000bp以下であり；宿主
に固有のリーダー配列に連結された転写及び翻訳シグナ
ル配列を含むDNA断片を用いることができるように、Tr
配列とリーダー配列Ｌとが関連しているのが特に好まし
く；これに代えて発現生成物の強化された生産をもたら
すその他の転写及び翻訳シグナルを用いることもでき;d
は０又は１であり、ｙが１より大であるときは１であ
り;n′は一般に０〜３、さらに通常は０又は２〜３の整
数であり;r″は１又は２であり;Wは末端デオキシリボシ
ル−３′基、又はそれ自体によりもしくは隣接ヌクレオ
チドと一緒になって接着末端又は平滑末端を供する制限
部位を規定し、そして０〜最長20個のヌクレオチドを有
し；そして他の記号は前に定義した通りである）を便利
に使用することができる。
として、次の配列、 Tr-L-((R-S)r″-(GAXYCX)n′-W-(Gene*)d)y （式中、Trは転写制御シグナル、特にプロモーター及び
オペレーターのごとき他の制御シグナル、アクティベー
ター、キャップシグナル、リボゾーム結合を強化するシ
グナルをコードするDNA配列、又は転写制御もしくは翻
訳制御に関与するその他の配列であり;Tr配列は一般に
約100bp以上であり、そして約2000bp以下であり；宿主
に固有のリーダー配列に連結された転写及び翻訳シグナ
ル配列を含むDNA断片を用いることができるように、Tr
配列とリーダー配列Ｌとが関連しているのが特に好まし
く；これに代えて発現生成物の強化された生産をもたら
すその他の転写及び翻訳シグナルを用いることもでき;d
は０又は１であり、ｙが１より大であるときは１であ
り;n′は一般に０〜３、さらに通常は０又は２〜３の整
数であり;r″は１又は２であり;Wは末端デオキシリボシ
ル−３′基、又はそれ自体によりもしくは隣接ヌクレオ
チドと一緒になって接着末端又は平滑末端を供する制限
部位を規定し、そして０〜最長20個のヌクレオチドを有
し；そして他の記号は前に定義した通りである）を便利
に使用することができる。
次の構成、 （式中、すでに定義したすべての記号は前記と同じ意味
を有し;aは０又は１であって、この構成が転写及び翻訳
シグナルを有するか又は有しないことを意味し；破線枠
中に示したヌクレオチドは存在しないがしかしジペプチ
ドをコードする配列を再構成（recreation）するために
HindIII開裂末端を加えることによって付加することが
できることを意味し；そしてｎ″は０〜２であり、Ｘ及
びＹの少なくとも１つが、カッコ内の配列が配列GAAGCT
とならないように１つのヌクレオチドを規定する）が特
に有利である。
を有し;aは０又は１であって、この構成が転写及び翻訳
シグナルを有するか又は有しないことを意味し；破線枠
中に示したヌクレオチドは存在しないがしかしジペプチ
ドをコードする配列を再構成（recreation）するために
HindIII開裂末端を加えることによって付加することが
できることを意味し；そしてｎ″は０〜２であり、Ｘ及
びＹの少なくとも１つが、カッコ内の配列が配列GAAGCT
とならないように１つのヌクレオチドを規定する）が特
に有利である。
コード配列の読み枠が開始コドンに整合しており、そし
てプロセシングに際して第１のアミノ酸が成熟ポリペプ
チドの正しいアミノ酸であれば、Gene*のコード配列は
末端Ｔに連結することができる。
てプロセシングに際して第１のアミノ酸が成熟ポリペプ
チドの正しいアミノ酸であれば、Gene*のコード配列は
末端Ｔに連結することができる。
Gene*の３′−末端はさらに容易に操作することがで
き、従って構成内の唯一の制限部位にGene*を挿入する
ことを可能にする構成を用いるのが好ましい。このよう
な構成は、読み枠が開始コドンに整合するようにGene*
が挿入される１個の制限部位を有するであろう。このよ
うな構成は次のように表示することができる。
き、従って構成内の唯一の制限部位にGene*を挿入する
ことを可能にする構成を用いるのが好ましい。このよう
な構成は、読み枠が開始コドンに整合するようにGene*
が挿入される１個の制限部位を有するであろう。このよ
うな構成は次のように表示することができる。
−(Tr)a-L-(R-S)r″-(GAXYCX)n″-W-(SC)b-Te 式中、前に定義した記号は前記の意味を有し;SCは停止
コドン（stop codon）であり;TeはプロモーターTrに対
応する終結配列（termination sequence）であり、そし
て他のシグナル、例えばポリアデニル化シグナルを含有
することができ；そしてｂは一般に約０〜４、さらに通
常は０〜３の間で変化する整数である。Gene*はそれ自
体の停止コドンを含有していてもよい。
コドン（stop codon）であり;TeはプロモーターTrに対
応する終結配列（termination sequence）であり、そし
て他のシグナル、例えばポリアデニル化シグナルを含有
することができ；そしてｂは一般に約０〜４、さらに通
常は０〜３の間で変化する整数である。Gene*はそれ自
体の停止コドンを含有していてもよい。
上記の構造を有する配列の例においてはＷが配列GAであ
り、そしてｎ″が２である。
り、そしてｎ″が２である。
末端ジペプチドをコードする配列がＷと一緒になってリ
ンカー又はコネクターを規定し、これがプロセシングシ
グナルのジペプチドを規定する末端配列の再構成を可能
にしそしてGene*の最初のアミノ酸をコードし、その結
果コドンの解読枠がリーダーの開始コドンと整合する場
合が特に好ましい。リンカーがずれ末端（staggered en
d）又はバットエンド（butt end）を供し、そしてGene*
の連続する配列と共に制限部位を構成するのが好まし
い。リンカーとGene*との連結に際してGene*のコドンの
解読枠がリーダーの開始コドンと整合するであろう。こ
のようにして、プロセシングシグナル配列中の制限部位
に連結される合成配列を用いてプロセシングシグナルを
再構成し、他方においてＮ末端アミノ酸をコードするGe
ne*の最初の塩基を得ることができる。合成配列を用い
ることにより、この合成リンカーを３′−末端に便利な
制限部位を有する適合コネクター（tailored connecto
r）であることができ、そしてこの合成コネクターは遺
伝子の５′−末端のために必要なコドンを供するであろ
う。
ンカー又はコネクターを規定し、これがプロセシングシ
グナルのジペプチドを規定する末端配列の再構成を可能
にしそしてGene*の最初のアミノ酸をコードし、その結
果コドンの解読枠がリーダーの開始コドンと整合する場
合が特に好ましい。リンカーがずれ末端（staggered en
d）又はバットエンド（butt end）を供し、そしてGene*
の連続する配列と共に制限部位を構成するのが好まし
い。リンカーとGene*との連結に際してGene*のコドンの
解読枠がリーダーの開始コドンと整合するであろう。こ
のようにして、プロセシングシグナル配列中の制限部位
に連結される合成配列を用いてプロセシングシグナルを
再構成し、他方においてＮ末端アミノ酸をコードするGe
ne*の最初の塩基を得ることができる。合成配列を用い
ることにより、この合成リンカーを３′−末端に便利な
制限部位を有する適合コネクター（tailored connecto
r）であることができ、そしてこの合成コネクターは遺
伝子の５′−末端のために必要なコドンを供するであろ
う。
上記の方法に代えて、プロセシングシグナルから下流に
制限エンドヌクレアーゼ認識部位を導入し、余分な塩基
を開裂及び除去を可能にし、Gene*を、開始コドンと解
読枠が整合するようにプロセシングシグナルに連結する
ことができる。すなわち、第１のコドンがポリペプチド
のＮ−末端アミノ酸をコードする。ＴがGene*の第１の
塩基である場合には、認識部位が開裂部位より下流にあ
る制限部位を導入することができる。例えば、Sau3A認
識配列をプロセシングシグナルのすぐ後に導入し、これ
によって開裂及びGene*の連結を可能にし、Geneの最初
のコドンの解読枠をリーダー開始コドンと整合せしめる
ことができる。開裂部位から下流の離れたところに認識
部位を有する制限エンドヌクレアーゼ例えばHga Iを用
いる場合、Ｗが、プロセシングシグナル配列の１部分を
含有するような配列を構成することができる。他の構成
を用いることも可能であり、プライマー修復及び試験管
内変異を用いて適当な制限部位を導入することにより構
成中にGene*を便利に挿入することができる。
制限エンドヌクレアーゼ認識部位を導入し、余分な塩基
を開裂及び除去を可能にし、Gene*を、開始コドンと解
読枠が整合するようにプロセシングシグナルに連結する
ことができる。すなわち、第１のコドンがポリペプチド
のＮ−末端アミノ酸をコードする。ＴがGene*の第１の
塩基である場合には、認識部位が開裂部位より下流にあ
る制限部位を導入することができる。例えば、Sau3A認
識配列をプロセシングシグナルのすぐ後に導入し、これ
によって開裂及びGene*の連結を可能にし、Geneの最初
のコドンの解読枠をリーダー開始コドンと整合せしめる
ことができる。開裂部位から下流の離れたところに認識
部位を有する制限エンドヌクレアーゼ例えばHga Iを用
いる場合、Ｗが、プロセシングシグナル配列の１部分を
含有するような配列を構成することができる。他の構成
を用いることも可能であり、プライマー修復及び試験管
内変異を用いて適当な制限部位を導入することにより構
成中にGene*を便利に挿入することができる。
DNA構成によりベクターに挿入するためのポータブル配
列が得られ、このベクターが所望の複製系を供する。す
でに記載したごとく、ある場合にはリーダー配列に関連
する野性タイプのプロモーターを他のプロモーターに代
えることが好ましい。酵母においては、解糖経路中の酵
素に関与するプロモーターが高い転写速度を供する。こ
れらのプロモーターはホスホグルコイソメラーゼ、ホス
ホフラクトキナーゼ、ホスホトリオースイソメラーゼ、
ホスホグルコムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、グリセロ
アルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、及び
アルコールデヒドロゲナーゼのごとき酵素と関連してい
る。これらのプロモーターをリーダー配列の上流に挿入
することができる。リーダー配列への５′−フランク領
域を維持することができ又は代りのプロモーターの３′
−配列で置き換えることができる。プロモーターを含有
し、そしてそのプロモーターの下流に前記のごときDNA
構成を挿入するのに便利な制限部位を有するベクターを
調製することができ、そして報告されている。
列が得られ、このベクターが所望の複製系を供する。す
でに記載したごとく、ある場合にはリーダー配列に関連
する野性タイプのプロモーターを他のプロモーターに代
えることが好ましい。酵母においては、解糖経路中の酵
素に関与するプロモーターが高い転写速度を供する。こ
れらのプロモーターはホスホグルコイソメラーゼ、ホス
ホフラクトキナーゼ、ホスホトリオースイソメラーゼ、
ホスホグルコムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、グリセロ
アルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、及び
アルコールデヒドロゲナーゼのごとき酵素と関連してい
る。これらのプロモーターをリーダー配列の上流に挿入
することができる。リーダー配列への５′−フランク領
域を維持することができ又は代りのプロモーターの３′
−配列で置き換えることができる。プロモーターを含有
し、そしてそのプロモーターの下流に前記のごときDNA
構成を挿入するのに便利な制限部位を有するベクターを
調製することができ、そして報告されている。
最終構成は、宿主、特に酵母のごとき菌類中に安定に保
持され得るエピゾーム性要素である。この構成は１個又
は複数個、好ましくは２個の複製系を有し、発現宿主中
での保持及び原核生物中でのクローニングが可能であ
る。さらに、１個又は複数個の選択マーカーが含有さ
れ、これにより宿主中でエピゾーム要素を保持するため
の選択圧が得られる。さらに、エピゾーム要素は高い又
は低いコピー数を有し、コピー数は一般に約１〜200の
範囲である。高コピー数エピゾーム要素の場合、コピー
数は10以上、好ましくは20以上であり、そして通常約15
0以下、さらに通常は約100以下である。Gene、及びエピ
ゾーム要素が宿主に与える影響に応じて高コピー数又は
低コピー数が好ましい。エピゾーム要素の発現生成物が
宿主に不利な影響を与える場合、低コピー数が好まし
い。
持され得るエピゾーム性要素である。この構成は１個又
は複数個、好ましくは２個の複製系を有し、発現宿主中
での保持及び原核生物中でのクローニングが可能であ
る。さらに、１個又は複数個の選択マーカーが含有さ
れ、これにより宿主中でエピゾーム要素を保持するため
の選択圧が得られる。さらに、エピゾーム要素は高い又
は低いコピー数を有し、コピー数は一般に約１〜200の
範囲である。高コピー数エピゾーム要素の場合、コピー
数は10以上、好ましくは20以上であり、そして通常約15
0以下、さらに通常は約100以下である。Gene、及びエピ
ゾーム要素が宿主に与える影響に応じて高コピー数又は
低コピー数が好ましい。エピゾーム要素の発現生成物が
宿主に不利な影響を与える場合、低コピー数が好まし
い。
種々の宿主、特に所望の性質を有する変異株を用いるこ
とができる。構成の発現生成物の生産速度に依存して、
プロセシング酵素はその生産レベルにおいてプロセシン
グのために適切であり又は適切でないことを認識すべき
である。従って、プロセシング酵素の生産が強化された
変異株が好ましく、又はエピゾーム要素によりこの酵素
の生産を増強することができよう。一般に、酵素の生産
は所望の発現生成物の生産より低オーダーであるべきで
ある。
とができる。構成の発現生成物の生産速度に依存して、
プロセシング酵素はその生産レベルにおいてプロセシン
グのために適切であり又は適切でないことを認識すべき
である。従って、プロセシング酵素の生産が強化された
変異株が好ましく、又はエピゾーム要素によりこの酵素
の生産を増強することができよう。一般に、酵素の生産
は所望の発現生成物の生産より低オーダーであるべきで
ある。
分泌及びプロセシングのためにα−ファクターを使用す
る場合、プロセシング酵素ジペプチジルアミノペプチダ
ーゼＡの生産を高めるのが好ましい。この酵素はSTE13
の発現生成物と考えられる。この酵素はＸ−Ala−及び
Ｘ−Pro−配列に特異的であり、この場合のＸはアミノ
酸、特にジカルボキシアミノ酸である。
る場合、プロセシング酵素ジペプチジルアミノペプチダ
ーゼＡの生産を高めるのが好ましい。この酵素はSTE13
の発現生成物と考えられる。この酵素はＸ−Ala−及び
Ｘ−Pro−配列に特異的であり、この場合のＸはアミノ
酸、特にジカルボキシアミノ酸である。
前記と異り、細胞内プロセシングが好ましくない場合が
ある。この場合は、分泌は生ずるが生成物はプロセシン
グされないste13変異株を取得するのが好ましい。この
方法においては、生成物はその後で生体外でプロセシン
グすることができる。
ある。この場合は、分泌は生ずるが生成物はプロセシン
グされないste13変異株を取得するのが好ましい。この
方法においては、生成物はその後で生体外でプロセシン
グすることができる。
発現が調節される宿主変異株が有利に使用される場合が
ある。例えば、融合蛋白質を発現するこの発明の構成を
用いることにより、融合蛋白質の毒性の結果として形質
転換体の増殖が低下する。従って、増殖中には発現を抑
制して宿主を高濃度に増殖せしめ、その後条件を発現の
ために条件に変える。
ある。例えば、融合蛋白質を発現するこの発明の構成を
用いることにより、融合蛋白質の毒性の結果として形質
転換体の増殖が低下する。従って、増殖中には発現を抑
制して宿主を高濃度に増殖せしめ、その後条件を発現の
ために条件に変える。
制御された発現を達成するために、温度感受性sir変異
株を使用することができる。SIR遺伝子のいずれかにお
ける変異によりHML及びHMR座に存在する通常は静止して
いるMATa及びMATα配列がその場で発現するため、非交
配表現型（non−mating phenotype）が生ずる。
株を使用することができる。SIR遺伝子のいずれかにお
ける変異によりHML及びHMR座に存在する通常は静止して
いるMATa及びMATα配列がその場で発現するため、非交
配表現型（non−mating phenotype）が生ずる。
さらに、すでに記載したように、Gene*は多数の配列、
すなわち同一の配列又は異る配列を、プロセシングシグ
ナルの介在を伴って縦列的（タンデム）に有することが
できる。この場合、生成物は完全に又は部分的にプロセ
シングされて、種々の配列それ自体が、又は縦列的（タ
ンデム）な形で得られ、これがさらに処理される。多く
の場合、個々の配列が蛋白質生成物のサブユニットであ
る種々の配列を得ることが好ましい。
すなわち同一の配列又は異る配列を、プロセシングシグ
ナルの介在を伴って縦列的（タンデム）に有することが
できる。この場合、生成物は完全に又は部分的にプロセ
シングされて、種々の配列それ自体が、又は縦列的（タ
ンデム）な形で得られ、これがさらに処理される。多く
の場合、個々の配列が蛋白質生成物のサブユニットであ
る種々の配列を得ることが好ましい。
Gene*は興味ある任意のタイプのポリペプチドをコード
することができる。ポリペプチドは小さい８アミノ酸の
オリゴペプチドでもよく、あるいは100,000ダルトン以
上であってもよい。通常、単鎖は約300,000ダルトンよ
り小であり、さらに一般的には約150,000より小であ
る。特に好ましいのは約5,000〜150,000ダルトンのポリ
ペプチド、さらに特定すれば約5,000〜10,000ダルトン
の蛋白質である。好ましいポリペプチドの例には、ホル
モン及び因子、例えば生長ホルモン、ソマトメジン上皮
増殖因子、内分泌物、例えば黄体形成ホルモン、プロラ
クチン等；造血因子、例えばエリスロポイエチン、コロ
ニー刺激因子等；リンポカイン；グロビン；グロブリ
ン、例えば免疫グロブリン；アルブミン；インターフェ
ロン；例えばα，β及びγインターフェロン；レプレッ
サー；酵素；エンドルフィン、例えばβ−エンドルフィ
ン、エンケファリン、ダイノルフィン等である。
することができる。ポリペプチドは小さい８アミノ酸の
オリゴペプチドでもよく、あるいは100,000ダルトン以
上であってもよい。通常、単鎖は約300,000ダルトンよ
り小であり、さらに一般的には約150,000より小であ
る。特に好ましいのは約5,000〜150,000ダルトンのポリ
ペプチド、さらに特定すれば約5,000〜10,000ダルトン
の蛋白質である。好ましいポリペプチドの例には、ホル
モン及び因子、例えば生長ホルモン、ソマトメジン上皮
増殖因子、内分泌物、例えば黄体形成ホルモン、プロラ
クチン等；造血因子、例えばエリスロポイエチン、コロ
ニー刺激因子等；リンポカイン；グロビン；グロブリ
ン、例えば免疫グロブリン；アルブミン；インターフェ
ロン；例えばα，β及びγインターフェロン；レプレッ
サー；酵素；エンドルフィン、例えばβ−エンドルフィ
ン、エンケファリン、ダイノルフィン等である。
この発明の構成を含有するエピゾーム要素を調製した
後、この要素を適当な宿主に導入する。この導入は常法
に従って行う。DNAを宿主に導入する方法は種々ある。
便利には、例えばHinnen等、PNAS USA（1978）75:1919
−1933:又はStinchcomb等、EP0045573A2の方法を用いて
スフェロプラストを調製する。次に、この形質転換体
を、この形質転換体のために適当な選択圧を維持した適
当な栄養培地中で増殖せしめる。発現が誘導的である場
合には、酵母を高密度に増殖せしめ、そして次に発現を
誘導する。生成物の実質的部分がペリプラズム空間に保
有される場合には、酵母細胞を酵素、例えばチモラーゼ
（zymolase）又はリティカーゼ（lyticase）で処理する
ことにより生成物を遊離せしめることができる。
後、この要素を適当な宿主に導入する。この導入は常法
に従って行う。DNAを宿主に導入する方法は種々ある。
便利には、例えばHinnen等、PNAS USA（1978）75:1919
−1933:又はStinchcomb等、EP0045573A2の方法を用いて
スフェロプラストを調製する。次に、この形質転換体
を、この形質転換体のために適当な選択圧を維持した適
当な栄養培地中で増殖せしめる。発現が誘導的である場
合には、酵母を高密度に増殖せしめ、そして次に発現を
誘導する。生成物の実質的部分がペリプラズム空間に保
有される場合には、酵母細胞を酵素、例えばチモラーゼ
（zymolase）又はリティカーゼ（lyticase）で処理する
ことにより生成物を遊離せしめることができる。
生成物を常用手段により回収し、蛋白質をクロマトグラ
フィー、電気泳動、透析、溶剤／溶剤抽出等により精製
する。
フィー、電気泳動、透析、溶剤／溶剤抽出等により精製
する。
この発明に従えば、広範囲の蛋白質の分泌がもたらさ
れ、これにより生成物の収量が増加し、精製が簡単にな
り、目的生成物の分解が最少となり、そして処理装置及
び工学的要求が単純化される。さらに、生産に基く栄養
の資化が強化され、この結果ポリペプチドのより経済的
且つより効率的製造が達成される。さらに、酵母を使用
することにより、原核生物の場合に存在するエンテロト
キシンが生産されず、又長期間にわたって酵母について
開発されてきた公知の技法を用いることができるという
利点が得られる。この技法には酵母生成物の分離技法が
含まれる。
れ、これにより生成物の収量が増加し、精製が簡単にな
り、目的生成物の分解が最少となり、そして処理装置及
び工学的要求が単純化される。さらに、生産に基く栄養
の資化が強化され、この結果ポリペプチドのより経済的
且つより効率的製造が達成される。さらに、酵母を使用
することにより、原核生物の場合に存在するエンテロト
キシンが生産されず、又長期間にわたって酵母について
開発されてきた公知の技法を用いることができるという
利点が得られる。この技法には酵母生成物の分離技法が
含まれる。
次に例によりこの発明をさらに具体的に説明する。但
し、これによりこの発明の範囲を限定するものではな
い。
し、これによりこの発明の範囲を限定するものではな
い。
実験 H.Gregory及びB.M Preston,Int.J.Pepti de Protein Re
s.９,107〜118（1977）により報告されたヒト−上皮増
殖因子（human epidermal growth factor）（EGF）のア
ミノ酸配列に基ずく、次の配列を有するEGFのための合
成配列を調製した。
s.９,107〜118（1977）により報告されたヒト−上皮増
殖因子（human epidermal growth factor）（EGF）のア
ミノ酸配列に基ずく、次の配列を有するEGFのための合
成配列を調製した。
（式中、５′は配列のプロモーターに近い末端を示
す。） この配列をpBR 328のEco RI部位に挿入してプラスミドp
328 EGF−１を調製し、そしてクローニングした。
す。） この配列をpBR 328のEco RI部位に挿入してプラスミドp
328 EGF−１を調製し、そしてクローニングした。
およそ30μｇのp328EGF−１をEco RIで消化し、そして
約1 μｇの期待される190bpEcoRI断片を分離した。これ
を制限酵素Hga Iで消化した。次に、２種類の合成オリ
ゴヌクレオチドコネクターHin d III−Hga I及びHga I
−Sal Iを159bpHga I断片に連結した。Hga I−Hind III
リンカーは次の配列を有する。
約1 μｇの期待される190bpEcoRI断片を分離した。これ
を制限酵素Hga Iで消化した。次に、２種類の合成オリ
ゴヌクレオチドコネクターHin d III−Hga I及びHga I
−Sal Iを159bpHga I断片に連結した。Hga I−Hind III
リンカーは次の配列を有する。
AGCTGAAGCT CTTCGATTGAG このリンカーは、Hind III消化により中断されたα−フ
ァクタープロセシングシグナルを復元し、そしてEGF遺
伝子の５′末端のHga I末端をpAB112のHind III末端に
連結する。
ァクタープロセシングシグナルを復元し、そしてEGF遺
伝子の５′末端のHga I末端をpAB112のHind III末端に
連結する。
Hga I−Sal Iリンカーは次の構造を有する。
TGAGATGATAAG ACTATTCAGCT このリンカーは２つの終結コドンを有し、そしてEGF遺
伝子の３′末端のHga I末端をpAB112のSal I末端に連結
する。
伝子の３′末端のHga I末端をpAB112のSal I末端に連結
する。
得られた181bp断片を調製用ゲル電気泳動により精製
し、そしてあらかじめ酵素Hind III及びSal Iにより完
全消化した100ngのpAB112に連結した。驚くべきこと
に、EGFの３番目及び４番目のアミノ酸であるasp及びse
rのためのコドンが欠落し、そしてEGFの他の部分は維持
された。pAB112は、Hind III及びSal I部位が除去され
たpBR322（pAB11）のEcoR I部位でクローニングされた
酵母α−ファクター遺伝子を伴う1.75kb Eco RI断片を
含有するプラスミドである。pAB112は、プラスミドYEp2
4のBam HI部位においてクローニングされた部分的Sau3
A断片として酵母α−ファクター遺伝子を含有するプラ
スミドpAB101から誘導した。pAB101は、公表されている
α−因子コード領域（Kurjan及びHerskowitz,Abstracts
1981 Cold Spring Harbor meeting on the Molecular
Biology of Yeasts,242頁）と相同の合成20連オリゴヌ
クレオチドプローブ、（３′−GGCCGGTTGGTTACATGATT−
５′）を用いて、YEp24について酵母ゲノムライブラリ
ーをスクリーニングすることにより得られた。
し、そしてあらかじめ酵素Hind III及びSal Iにより完
全消化した100ngのpAB112に連結した。驚くべきこと
に、EGFの３番目及び４番目のアミノ酸であるasp及びse
rのためのコドンが欠落し、そしてEGFの他の部分は維持
された。pAB112は、Hind III及びSal I部位が除去され
たpBR322（pAB11）のEcoR I部位でクローニングされた
酵母α−ファクター遺伝子を伴う1.75kb Eco RI断片を
含有するプラスミドである。pAB112は、プラスミドYEp2
4のBam HI部位においてクローニングされた部分的Sau3
A断片として酵母α−ファクター遺伝子を含有するプラ
スミドpAB101から誘導した。pAB101は、公表されている
α−因子コード領域（Kurjan及びHerskowitz,Abstracts
1981 Cold Spring Harbor meeting on the Molecular
Biology of Yeasts,242頁）と相同の合成20連オリゴヌ
クレオチドプローブ、（３′−GGCCGGTTGGTTACATGATT−
５′）を用いて、YEp24について酵母ゲノムライブラリ
ーをスクリーニングすることにより得られた。
得られた混合物を用いてE.coli HB101細胞を形質転換
し、そしてプラスミドpAB201を得た。プラスミドpAB201
（５μｇ）を酵素Eco RIにより完全消化し、そして得ら
れた断片を、 （ａ）DNAポリメラーゼＩクレノウ（Klenow）フラグメ
ントを用いて充たし； （ｂ）過剰のBamH Iリンカーに連結し；そして、 （ｃ）BamH Iで消化する。
し、そしてプラスミドpAB201を得た。プラスミドpAB201
（５μｇ）を酵素Eco RIにより完全消化し、そして得ら
れた断片を、 （ａ）DNAポリメラーゼＩクレノウ（Klenow）フラグメ
ントを用いて充たし； （ｂ）過剰のBamH Iリンカーに連結し；そして、 （ｃ）BamH Iで消化する。
1.75kbpの断片を調製用ゲル電気泳動により分離し、そ
して約100ngの断片を100ngのpC1/1に連結した。このpC1
/1はあらかじめ酵素BamH Iにより完全消化し、そしてア
ルカリホスファターゼにより処理したものである。
して約100ngの断片を100ngのpC1/1に連結した。このpC1
/1はあらかじめ酵素BamH Iにより完全消化し、そしてア
ルカリホスファターゼにより処理したものである。
プラスミドpC1/1はpJDB219,Beggs,Nature（1978）275:1
04の誘導体であり、pC1/1においては、pJDB219における
細菌プラスミドpMB9に対応する領域がpBR322により置き
換えられている。この混合物を用いてE.コリHB101細胞
を形質転換した。形質転換体をアンピシリン耐性により
選択し、そしてそのプラスミドを制限エンドヌクレアー
ゼを用いて分析した。選択された１つのクローン（pYEG
F−８）のDNAを調製し、そしてこれを用いて酵母AB103
細胞を形質転換した。形質転換体は1eu+表現型により選
択した。
04の誘導体であり、pC1/1においては、pJDB219における
細菌プラスミドpMB9に対応する領域がpBR322により置き
換えられている。この混合物を用いてE.コリHB101細胞
を形質転換した。形質転換体をアンピシリン耐性により
選択し、そしてそのプラスミドを制限エンドヌクレアー
ゼを用いて分析した。選択された１つのクローン（pYEG
F−８）のDNAを調製し、そしてこれを用いて酵母AB103
細胞を形質転換した。形質転換体は1eu+表現型により選
択した。
プラスミドｐ−YEGF−８により形質転換された酵母AB10
3株（α，pep ４−３，leu ２−３，leu ２−112，ura ３
−52，his ４−580）をロイシンを含有しない培地50ml中
に飽和まで（600nmの光学濃度５）増殖せしめ、そして
さらに12時間振とうした。遠心分離により細胞上清を集
めそして線維芽細胞リセプター競争結合測定法により、
ヒトEGFの存在について分析した。このEGF測定は、ヒト
−包皮線維芽細胞上の結合部位について、125I−標識マ
ウスEGFと競争するマウス及びヒトEGFの能力に基礎を置
いている。このような条件のもとで、２〜2.0ngのEGFが
容易に測定できる。ヒト−線維芽細胞への125I−標識上
皮細胞増殖因子の結合についての詳細はCarpenter等、
J.Biol. Chem. 250,4297（1975）に記載されている。この
測定により、培地が１当り７±1mgのヒト−EGFを含有
することが見出される。
3株（α，pep ４−３，leu ２−３，leu ２−112，ura ３
−52，his ４−580）をロイシンを含有しない培地50ml中
に飽和まで（600nmの光学濃度５）増殖せしめ、そして
さらに12時間振とうした。遠心分離により細胞上清を集
めそして線維芽細胞リセプター競争結合測定法により、
ヒトEGFの存在について分析した。このEGF測定は、ヒト
−包皮線維芽細胞上の結合部位について、125I−標識マ
ウスEGFと競争するマウス及びヒトEGFの能力に基礎を置
いている。このような条件のもとで、２〜2.0ngのEGFが
容易に測定できる。ヒト−線維芽細胞への125I−標識上
皮細胞増殖因子の結合についての詳細はCarpenter等、
J.Biol. Chem. 250,4297（1975）に記載されている。この
測定により、培地が１当り７±1mgのヒト−EGFを含有
することが見出される。
さらに特徴付けるため、上清液中のヒト−EGFを、イオ
ン交換樹脂Biorex−70に吸着せしめ、そして80％エタノ
ール中10mM HClで溶出することにより精製した。HCl及
びエタノールを蒸発せしめた後、EGFを水に溶解した。
この物質は、分子量約6,000の１種類の主たる蛋白質と
して移動し、真正のマウスEGF（分子量約6,000）とおよ
そ同じであった。このことは、α−ファクターリーダー
配列が、分泌過程において適切に除去されたことを示
す。高分離液体クロマトグラフィー（ミクロボンダパッ
クC18,ウォーターズカラム）による分析によって、この
生成物は、真正のマウスEGF標準と同様の保持時間をも
って移動することが示された。しかしながら、エドマン
（Edman）分解による蛋白質配列決定により、Ｎ末端がg
lu−ala末端を保持していることが示された。
ン交換樹脂Biorex−70に吸着せしめ、そして80％エタノ
ール中10mM HClで溶出することにより精製した。HCl及
びエタノールを蒸発せしめた後、EGFを水に溶解した。
この物質は、分子量約6,000の１種類の主たる蛋白質と
して移動し、真正のマウスEGF（分子量約6,000）とおよ
そ同じであった。このことは、α−ファクターリーダー
配列が、分泌過程において適切に除去されたことを示
す。高分離液体クロマトグラフィー（ミクロボンダパッ
クC18,ウォーターズカラム）による分析によって、この
生成物は、真正のマウスEGF標準と同様の保持時間をも
って移動することが示された。しかしながら、エドマン
（Edman）分解による蛋白質配列決定により、Ｎ末端がg
lu−ala末端を保持していることが示された。
h EGFをα−ファクター分泌リーダー配列と連結するた
めの異る構成を用いて他の多くの構成を調製した。これ
らは異なるプロセシングシグナル及び部位変異を有す
る。第２図ａ〜ｅにおいて、h EGFのＮ−末端部位にお
ける融合配列を示す。この配列は幾つかの構成の間で異
る。ｆはh EGFのＣ末端における配列を示す。これはす
べての構成において同じである。これらの構成中に使用
した合成オリゴヌクレオチドリンカ−は枠で囲んであ
る。
めの異る構成を用いて他の多くの構成を調製した。これ
らは異なるプロセシングシグナル及び部位変異を有す
る。第２図ａ〜ｅにおいて、h EGFのＮ−末端部位にお
ける融合配列を示す。この配列は幾つかの構成の間で異
る。ｆはh EGFのＣ末端における配列を示す。これはす
べての構成において同じである。これらの構成中に使用
した合成オリゴヌクレオチドリンカ−は枠で囲んであ
る。
これらの融合は次のようにして行った。構成（ａ）は前
記のようにして調製した。構成（ｂ）は構成（ａ）と同
様にして調製したがリンカー１の代りにリンカー２を用
いた。リンカー２は、h EGF遺伝子のすぐ前に追加のプ
ロセシング部位（ser−leu−asp−lys−arg）を挿入す
ることによりα−ファクタ−プロセシングシグナルを変
更している。得られた酵母プラスミドをpYαEGF−22と
称する。構成（ｃ）はジペプチジルアミノペプチターゼ
成熟部位（glu−ala）が除去されおり、構成（ａ）の試
験管内変異により得られそ。α−ファクターリーダーh
EGF配合を含有するPst I−Sal I断片をファージM13中で
クローニングし、そして単鎖形を分離した。合成31連ヌ
クレオチド、 ５′−TCTTTGGATAAAAGAAACTCCGACTCCCG−３′を合成
し、そしてこの70ピコモルを、DNAポリメラーゼのクレ
ノウ（Klenow）フラグメントを用いて前記のテンプレー
ト１ピコモルから第２鎖を合成するためのプライマーと
して使用した。補充（fill−in）し、そして14℃にて18
時間連結した後、混合物をS1ヌクレアーゼで処理（５ユ
ニット、15分間）し、そしてE. コリTM101細胞をトラン
スフェクトするのに用いた。glu−alaをコードする領域
が除去されたDNA配列を含有するバクテリオファージの
位置を、プローブとして32p−標識プライマーを用いる
フィルタープラクハイブリッド形成により決定した。陽
性プラクからのRFDNAを分離し、Pst I及びSal I消化
し、そして得られた断片を、あらかじめSal Iで完全消
化しそしてPst Iで部分消化しそしてアルカリホスファ
ターゼで処理したpAB114中に挿入した。
記のようにして調製した。構成（ｂ）は構成（ａ）と同
様にして調製したがリンカー１の代りにリンカー２を用
いた。リンカー２は、h EGF遺伝子のすぐ前に追加のプ
ロセシング部位（ser−leu−asp−lys−arg）を挿入す
ることによりα−ファクタ−プロセシングシグナルを変
更している。得られた酵母プラスミドをpYαEGF−22と
称する。構成（ｃ）はジペプチジルアミノペプチターゼ
成熟部位（glu−ala）が除去されおり、構成（ａ）の試
験管内変異により得られそ。α−ファクターリーダーh
EGF配合を含有するPst I−Sal I断片をファージM13中で
クローニングし、そして単鎖形を分離した。合成31連ヌ
クレオチド、 ５′−TCTTTGGATAAAAGAAACTCCGACTCCCG−３′を合成
し、そしてこの70ピコモルを、DNAポリメラーゼのクレ
ノウ（Klenow）フラグメントを用いて前記のテンプレー
ト１ピコモルから第２鎖を合成するためのプライマーと
して使用した。補充（fill−in）し、そして14℃にて18
時間連結した後、混合物をS1ヌクレアーゼで処理（５ユ
ニット、15分間）し、そしてE. コリTM101細胞をトラン
スフェクトするのに用いた。glu−alaをコードする領域
が除去されたDNA配列を含有するバクテリオファージの
位置を、プローブとして32p−標識プライマーを用いる
フィルタープラクハイブリッド形成により決定した。陽
性プラクからのRFDNAを分離し、Pst I及びSal I消化
し、そして得られた断片を、あらかじめSal Iで完全消
化しそしてPst Iで部分消化しそしてアルカリホスファ
ターゼで処理したpAB114中に挿入した。
プラスミドpAB114は次のようにして誘導した。プラスミ
ドpAB112をHindIIIにより完全消化し、そして高いDNA濃
度（４μg/ml）において再結合せしめ、そしてα−因子
構造遺伝子から３個の63 bp Hin d III断片が除去され
そして１個の成熟α−ファクターコード領域のみが残っ
ているプラスミドpAB113を得た。EcoR Iで切断し、突出
している末端をDNAポリメラーゼのクレノウフラグメン
トを用いて補充し、Bam H Iリンカーを結合し、Bam H I
により切断することによってプラスミドpAB11にBam H I
を加え、そして再連結することによってpAB12を得た。
プラスミドpAB113をEcoRIにより消化し、突出している
末端を補充し、そしてBam HI リンカーに結合した。Bam
H Iで消化した後1500bp断片をゲル過し、そしてBam
H Iで消化しそしてアルカリホスファターゼで処理したp
AB12と連結した。α−ファクター遺伝子を担持する1500
bp BamHI断片を含有するプラスミドpAB114を得た。得ら
れたプラスミド（前記の構成を含有するpAB114）をBam
HIで消化し、そしてプラスミドpC1/1中に連結した。
ドpAB112をHindIIIにより完全消化し、そして高いDNA濃
度（４μg/ml）において再結合せしめ、そしてα−因子
構造遺伝子から３個の63 bp Hin d III断片が除去され
そして１個の成熟α−ファクターコード領域のみが残っ
ているプラスミドpAB113を得た。EcoR Iで切断し、突出
している末端をDNAポリメラーゼのクレノウフラグメン
トを用いて補充し、Bam H Iリンカーを結合し、Bam H I
により切断することによってプラスミドpAB11にBam H I
を加え、そして再連結することによってpAB12を得た。
プラスミドpAB113をEcoRIにより消化し、突出している
末端を補充し、そしてBam HI リンカーに結合した。Bam
H Iで消化した後1500bp断片をゲル過し、そしてBam
H Iで消化しそしてアルカリホスファターゼで処理したp
AB12と連結した。α−ファクター遺伝子を担持する1500
bp BamHI断片を含有するプラスミドpAB114を得た。得ら
れたプラスミド（前記の構成を含有するpAB114）をBam
HIで消化し、そしてプラスミドpC1/1中に連結した。
得られた酵母プラスミドをpYαEGF−23と称する。構成
（ｄ）は新しいKpm I部位を有し、構成（ｃ）について
記載したのと同様にして調製した。但し配列５′−GGGT
ACCTTTGGATAAAAGAAACTCCGACTCCGAAT−３′を有する36連
オリゴヌクレオチドプライマ−を使用した。こうして得
られた酵母プラスミドをpYαEGF−24と称する。構成
（ｅ）は、構成（ｄ）をを含有するプラスミドをリンカ
ー１及び２を用いないでKpn I及びSal Iで消化すること
により誘導した。得られた酵母プラスミドをpYαEGF−2
5と称する。
（ｄ）は新しいKpm I部位を有し、構成（ｃ）について
記載したのと同様にして調製した。但し配列５′−GGGT
ACCTTTGGATAAAAGAAACTCCGACTCCGAAT−３′を有する36連
オリゴヌクレオチドプライマ−を使用した。こうして得
られた酵母プラスミドをpYαEGF−24と称する。構成
（ｅ）は、構成（ｄ）をを含有するプラスミドをリンカ
ー１及び２を用いないでKpn I及びSal Iで消化すること
により誘導した。得られた酵母プラスミドをpYαEGF−2
5と称する。
pYαEGF−22で形質転換した酵母細胞を15mlの培地に増
殖せしめた。示された濃度及び時間において培養物を遠
心分離し、そして上清液を得、氷上に保持した。細胞ペ
レットを溶解緩衝液（0.1トリトンＸ−10.0,10mM NaHPO
4,pH7.5）中で洗浄し、そして１容量の溶解緩衝液及び
１容量のガラスビーズ中で渦動せしめる（氷上で冷却し
ながら１分間間隔で５分間）ことにより破砕した。遠心
分離の後上清液を集め、そして氷上に保持した。培地中
及び細胞抽出液中のh EGFの量を、線維芽細胞リセプタ
ー結合競争測定により測定した。標準量の125I−標準マ
ウスEGFの結合に対する増加する量のマウスEGFの効果を
測定することにより標準曲線を得た。
殖せしめた。示された濃度及び時間において培養物を遠
心分離し、そして上清液を得、氷上に保持した。細胞ペ
レットを溶解緩衝液（0.1トリトンＸ−10.0,10mM NaHPO
4,pH7.5）中で洗浄し、そして１容量の溶解緩衝液及び
１容量のガラスビーズ中で渦動せしめる（氷上で冷却し
ながら１分間間隔で５分間）ことにより破砕した。遠心
分離の後上清液を集め、そして氷上に保持した。培地中
及び細胞抽出液中のh EGFの量を、線維芽細胞リセプタ
ー結合競争測定により測定した。標準量の125I−標準マ
ウスEGFの結合に対する増加する量のマウスEGFの効果を
測定することにより標準曲線を得た。
蛋白質を、Bio−Rex70樹脂への吸着及び80％エタノール
中0.01NHClによる溶出によって培地から濃縮し、そして
逆相C18カラムを用いる高速液体クロマトグラフィーに
より精製した。カラムを、0.2％のトリフルオロ酢酸を
含有する５％〜80％のアセトニトリルの直線グラディエ
ントにより4ml/分の流速で60分間溶出した。蛋白質（20
0〜800ピコモル）のアミノ末端のアミノ酸配列を、エド
マン分解法により、気相蛋白質シーケンサーApplied Bi
osystems model 470Aを用いて決定した。すべての分析
に通常のPROTFAプログラムを使用した。S2（酢酸エチ
ル:20mg/l）及びS3（塩化ブチル:10mg/1）に、使用直前
にジチオスレイトールを加えた。すべての試料をメタノ
ール中1N HClにより40℃にて15分間処理することによ
り、PTH−アスパラギン酸及びPTH−グルタミン酸をこれ
らのメチルエステルに転換した。すべてのPTH−アミノ
酸の同定は、標準としてPTH−アミノ酸の既知混合物を
用いて、IBM CN HPLC カラム上での保持時間を比較する
ことにより行った。
中0.01NHClによる溶出によって培地から濃縮し、そして
逆相C18カラムを用いる高速液体クロマトグラフィーに
より精製した。カラムを、0.2％のトリフルオロ酢酸を
含有する５％〜80％のアセトニトリルの直線グラディエ
ントにより4ml/分の流速で60分間溶出した。蛋白質（20
0〜800ピコモル）のアミノ末端のアミノ酸配列を、エド
マン分解法により、気相蛋白質シーケンサーApplied Bi
osystems model 470Aを用いて決定した。すべての分析
に通常のPROTFAプログラムを使用した。S2（酢酸エチ
ル:20mg/l）及びS3（塩化ブチル:10mg/1）に、使用直前
にジチオスレイトールを加えた。すべての試料をメタノ
ール中1N HClにより40℃にて15分間処理することによ
り、PTH−アスパラギン酸及びPTH−グルタミン酸をこれ
らのメチルエステルに転換した。すべてのPTH−アミノ
酸の同定は、標準としてPTH−アミノ酸の既知混合物を
用いて、IBM CN HPLC カラム上での保持時間を比較する
ことにより行った。
pYαEGF−22は、天然Ｎ末端h EGFとglu−ala末端hEGFを
4:1のモル比で分泌し、他方pYαEGF−23〜25は天然Ｎ末
端h EGFのみを分泌した。h EGFの収量は、蛋白質として
又はリセプター結合測定において測定した場合５〜８μ
g/mlの範囲であった。
4:1のモル比で分泌し、他方pYαEGF−23〜25は天然Ｎ末
端h EGFのみを分泌した。h EGFの収量は、蛋白質として
又はリセプター結合測定において測定した場合５〜８μ
g/mlの範囲であった。
JRY188株（MAT sir ２−８ Leu ２−３ Leu ２−112 tr
p 1 ura ３ his 4 rme）をpYαEGF−21で形質転換し、
そしてロイシン原栄養株を37℃において選択した。飽和
した培養物を新鮮培地中に1/100に稀釈し、そして許容
温度（24℃）及び非許容温度（36℃）においてロイシン
選択培地中で増殖せしめ、そして培養上清液中のh EGF
の存在を前記のようにして測定した。結果を次の表に示
す。
p 1 ura ３ his 4 rme）をpYαEGF−21で形質転換し、
そしてロイシン原栄養株を37℃において選択した。飽和
した培養物を新鮮培地中に1/100に稀釈し、そして許容
温度（24℃）及び非許容温度（36℃）においてロイシン
選択培地中で増殖せしめ、そして培養上清液中のh EGF
の存在を前記のようにして測定した。結果を次の表に示
す。
形質転換された酵母sir３温度感受性変異株におけるh E
GFの制御された合成及び分泌 これらの結果はハイブリッドα−因子/EGF遺伝子が、高
コピー数プラスミド上に存在する場合でも、交配型（ma
ting type）制御のもとで発現されることを示す。
GFの制御された合成及び分泌 これらの結果はハイブリッドα−因子/EGF遺伝子が、高
コピー数プラスミド上に存在する場合でも、交配型（ma
ting type）制御のもとで発現されることを示す。
この発明に従えば、ベクターに挿入される新規な構成が
提供され、これによりＮ末端リーダー配列と１個又は複
数個のプロセシングシグナルを有するポリペプチドが発
現され、そしてポリペプチドの分泌及び余分のアミノ酸
を含まない成熟ポリペプチド生成物を生じさせるプロセ
シングがもたらされる。すなわち、天然ポリペプチドと
同じ配列を有するポリペプチドが得られる。さらに、ポ
リペプチドが酵母中で生産され得るためグリコキル化が
生ずることができ、その結果天然生成物と同じ生成物が
得られる。さらに、生成物が分泌されるため、細胞数に
基いて非常に高い収量が得られ、そしてプロセシング及
び精製が非常に単純化される。さらに、変異宿主を用い
ることにより、発現の停止及び開始を意のままに制御す
ることができる。
提供され、これによりＮ末端リーダー配列と１個又は複
数個のプロセシングシグナルを有するポリペプチドが発
現され、そしてポリペプチドの分泌及び余分のアミノ酸
を含まない成熟ポリペプチド生成物を生じさせるプロセ
シングがもたらされる。すなわち、天然ポリペプチドと
同じ配列を有するポリペプチドが得られる。さらに、ポ
リペプチドが酵母中で生産され得るためグリコキル化が
生ずることができ、その結果天然生成物と同じ生成物が
得られる。さらに、生成物が分泌されるため、細胞数に
基いて非常に高い収量が得られ、そしてプロセシング及
び精製が非常に単純化される。さらに、変異宿主を用い
ることにより、発現の停止及び開始を意のままに制御す
ることができる。
以下、例示によってこの発明をいく分詳細に記載した
が、これは明確な理解に資するためのものであって、こ
れによりこの発明の範囲を限定するものではない。
が、これは明確な理解に資するためのものであって、こ
れによりこの発明の範囲を限定するものではない。
なお、酵母サッカロミセス・セレビシエー（S.cerevisi
ae）AB103（pYEGF8）は、1983年１月５日A.T.C.C.に寄
託され、受け入れ番号No.20658が与えられている。
ae）AB103（pYEGF8）は、1983年１月５日A.T.C.C.に寄
託され、受け入れ番号No.20658が与えられている。
プラスミドpYαEGF23（pAB114−pC1/1）は、1983年８月
12日にA.T.C.C.寄託され、受け入れ番号No.40079が与え
られている。
12日にA.T.C.C.寄託され、受け入れ番号No.40079が与え
られている。
第１図はプラスミドpYαEGF−21を構成するための系統
図であり、第２図はhEGFのＮ末端とリーダー配列連結部
の配列、及びhEGFのＣ末端の配列を示す図である。
図であり、第２図はhEGFのＮ末端とリーダー配列連結部
の配列、及びhEGFのＣ末端の配列を示す図である。
Claims (12)
- 【請求項１】酵母において異種性ポリペプチドを生産せ
しめそして該ポリペプチドを培地中に分泌せしめる方法
であって、 酵母にとって外来性の前駆体ポリペプチドをコードする
DNAにより形質転換された酵母宿主を用意し、該前駆体
ポリペプチドは、 （ａ）酵母α−ファクターリーダー配列の少なくとも一
部分を含んで成る第一アミノ酸配列、ここで、該酵母α
−ファクターリーダー配列の少なくとも一部分は、22個
のアミノ酸から成るシグナル配列の少なくとも一部分で
あって分泌を提供するものを含有している、 （ｂ）酵母プロセシングシグナルを含んで成る第二アミ
ノ酸配列、ここで、該酵母プロセシングシグナルは該第
二アミノ酸配列のＣ−末端に位置し、且つ配列（Ｎ−末
端）−R1−R2−（Ｃ−末端）（ここで、R1はリジン又は
アルギニンであり、そしてR2はリジン又はアルギニンで
ある）を有する、及び （ｃ）異種性ポリペプチド配列、 を含んで成り、ここで、前記第二アミノ酸配列は−その
Ｎ−末端において前記第一アミノ酸配列に連結されてお
り、そしてそのＣ−末端において前記異種性ポリペプチ
ド配列に連結されており、該第一アミノ酸配列は該異種
性ポリペプチド配列の細胞外分泌を行うことができ、そ
して該第二アミノ酸配列は前記（ｂ）及び（ｃ）を含ん
で成る前駆体ポリペプチドからアミノ酸を除去して該異
種性ポリペプチドを生成させることを可能にするもので
あり、 前記培地中で前記形質転換された酵母を、前記前駆体ポ
リペプチドが発現され、少なくとも部分的に異種性ポリ
ペプチドにプロセシングされそして該培地中に分泌され
る条件下で増殖せしめ；そして 前記培地から前記分泌された異種性ポリペプチドを回収
する； ことを特徴とする方法。 - 【請求項２】前記DNAが次の式： ５′−Tr−Ｌ−Ｓ−Gene*−Te−３′ （式中、 Trは、酵母プロモーター配列であり； Ｌは、細胞外分泌を提供する前記酵母α−ファクターリ
ーダー配列の少なくとも部分をコードしており； Ｓは、前記プロセシングシグナルをコードしているスペ
ーサーであり； Gene*は、異種性ポリペプチドをコードしており；そし
て Teは、Trに対応する転写終止シグナルである） で表わされることを特徴とする特許請求の範囲第１項に
記載の方法。 - 【請求項３】Trが酵母α−ファクタープロモーター配列
を含んで成る特許請求の範囲第２項記載の方法。 - 【請求項４】ＳがジペプチジルアミノペプチダーゼＡの
ためのプロセシングシグナルを含有しない特許請求の範
囲第２項に記載の方法。 - 【請求項５】Ｓが、（５′−末端）−リジンのコドン−
アルギニンのコドン−（３′−末端）を含んで成る特許
請求の範囲第２項〜第４項のいずれか１項に記載の方
法。 - 【請求項６】前記異種性ポリペプチドが哺乳類蛋白質で
ある特許請求の範囲第１項〜第５項のいずれか１項に記
載の方法。 - 【請求項７】前記哺乳類蛋白質がヒト上皮成長因子であ
る特許請求の範囲第６項に記載の方法。 - 【請求項８】前記酵母がサッカロミセス属の酵母である
特許請求の範囲第１項〜第７項のいずれか１項に記載の
方法。 - 【請求項９】前記ポリペプチドが上皮成長因子であり、
そして、前記DNAが次の方法、すなわち、 前記第一アミノ酸配列をコードするDNA、及び前記第二
アミノ酸配列の少なくとも部分をコードするDNAを含ん
で成る第一DNA断片を得、そして 上皮成長因子をコードする第二DNA断片を前記第一DNA断
片に連結し、ここで、該第一DNA断片が前記第二アミノ
酸配列の部分のみをコードするDNAを含む場合には欠落
部分を補完するリンカーを介して連結を行う、 段階を含んで成る方法、により製造されたものである、
特許請求の範囲第１項〜第８項のいずれか１項に記載の
方法。 - 【請求項１０】前記異種性ポリペプチドが細胞内又は細
胞外でプロセシングされて成熟ポリペプチドをもたら
す、特許請求の範囲第１項〜第９項のいずれか１項に記
載の方法。 - 【請求項１１】前記成熟ポリペプチドが、成長ホルモ
ン、ソマトメジン、上皮成長因子、インシュリン、レニ
ン、カルシトニン、アルブミン又はインターフェロンで
ある、特許請求の範囲第10項に記載の方法。 - 【請求項１２】前記酵母がプラスミドpYαEGF23（ATCC
No.40079）により形質転換されたものである、特許請求
の範囲第１項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US45732583A | 1983-01-12 | 1983-01-12 | |
| US457325 | 1983-01-12 | ||
| US52290983A | 1983-08-12 | 1983-08-12 | |
| US522909 | 1983-08-12 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59000939A Division JPH0779699B2 (ja) | 1983-01-12 | 1984-01-09 | 真核生物における分泌発現遺伝子 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0372893A JPH0372893A (ja) | 1991-03-28 |
| JPH0779710B2 true JPH0779710B2 (ja) | 1995-08-30 |
Family
ID=27038554
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59000939A Expired - Lifetime JPH0779699B2 (ja) | 1983-01-12 | 1984-01-09 | 真核生物における分泌発現遺伝子 |
| JP2061304A Expired - Lifetime JPH0779710B2 (ja) | 1983-01-12 | 1990-03-14 | 酵母による組換ポリペプチドの製造方法 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59000939A Expired - Lifetime JPH0779699B2 (ja) | 1983-01-12 | 1984-01-09 | 真核生物における分泌発現遺伝子 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0116201B1 (ja) |
| JP (2) | JPH0779699B2 (ja) |
| CA (1) | CA1341297C (ja) |
| DE (1) | DE3382547D1 (ja) |
| DK (1) | DK169952B1 (ja) |
Families Citing this family (62)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4943529A (en) | 1982-05-19 | 1990-07-24 | Gist-Brocades Nv | Kluyveromyces as a host strain |
| JPS60501140A (ja) * | 1983-04-22 | 1985-07-25 | アムジエン | 酵母による外因性ポリペプチドの分泌 |
| US7198919B1 (en) | 1983-04-25 | 2007-04-03 | Genentech, Inc. | Use of alpha factor sequences in yeast expression systems |
| NZ207842A (en) | 1983-04-25 | 1988-02-12 | Chiron Corp | Production of human insulin-like growth factor (igf) using cdna |
| NZ207926A (en) * | 1983-04-25 | 1988-04-29 | Genentech Inc | Use of yeast #a#-factor to assist in expression of proteins heterologus to yeast |
| IL71991A (en) | 1983-06-06 | 1994-05-30 | Genentech Inc | Preparation of human FGI and FGE in their processed form through recombinant AND tranology in prokaryotes |
| US5639639A (en) * | 1983-11-02 | 1997-06-17 | Genzyme Corporation | Recombinant heterodimeric human fertility hormones, and methods, cells, vectors and DNA for the production thereof |
| JPS61502795A (ja) * | 1984-07-09 | 1986-12-04 | レモント，ジェフリ−・エフ | 酵母クロ−ニング ビ−クル |
| EP0188555A4 (en) * | 1984-07-09 | 1988-04-18 | Integrated Genetics Inc | YEAST CLONING VEHICLE. |
| DE3587205T2 (de) * | 1984-07-30 | 1993-08-26 | Wakunaga Seiyaku Kk | Verfahren zur herstellung eines proteins und dafuer zu verwendender vektor, rekombinante dns und transformierte zelle. |
| JPS61503002A (ja) * | 1984-07-31 | 1986-12-25 | アプライド・リサーチ・システムズ・エイアールエス・ホールディング・ナムローゼ・フェンノートシャップ | 酵母クロ−ニングベクタ− |
| WO1986001515A1 (en) * | 1984-08-29 | 1986-03-13 | Chiron Corporation | Expression of human connective tissue activator and related peptides |
| EP0487116B1 (en) * | 1984-10-12 | 1999-12-29 | ZymoGenetics, Inc. | Biologically active PDGF analogs in eucaryotic cells |
| US5187263A (en) * | 1984-10-12 | 1993-02-16 | Zymogenetics, Inc. | Expression of biologically active PDGE analogs in eucaryotic cells |
| US5498600A (en) * | 1984-10-12 | 1996-03-12 | Zymogenetics, Inc. | Biologically active mosaic proteins |
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