JPH0785086B2 - 螢光偏光免疫検定法および該検定法に使用する試薬 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は一般には液体、殊に例えば血清、血漿、脊髄
液、羊水、および尿のような生物学液体中のリガンドを
測定するための方法およびこの方法に有用な試薬に関す
る。更に詳しくは、本発明は、検定の効能を改善するべ
く界面活性剤としてスルホコハク酸ジオクチルナトリウ
ムを用いる新規な螢光偏光免疫検定法に関する。

リガンドを測定するための拮抗結合免疫検定は周知であ
り、リガンドおよびトレーサーに特異的な抗体上の限ら
れた数のレセプター結合部位について、供試試料中のリ
ガンドと標識された試薬（トレーサーと称する）との間
の拮抗を基としている。試料中のリガンドの濃度は抗体
に特異的に結合するトレーサーの量を定めている。生成
されるトレーサー−抗体複合体の量は定量的に測定する
ことができ、そして供試試料中のリガンドの量に反比例
している。

螢光偏光免疫検定技術は、螢光標識化合物は平面偏光で
励起されるとその回転速度と逆の関連を有する偏光度を
有する螢光を発するという原理に基いている。特に、螢
光ラベルを有するトレーサー−抗体複合体のような分子
を平面偏光で励起すると、発光される光は極度に偏光し
たままである。その理由は螢光団は光が吸収される時の
時間と光が発光される時の時間との間の回転から拘束さ
れるからである。「遊離の」トレーサー化合物（すなわ
ち、抗体に結合されていない）を平面偏光で励起する
と、その回転は相当するトレーサー−抗体複合体の回転
よりも速くなる。従つて、発光される光がより大巾に消
極される。すなわち、分子回転弛緩時間、それ故螢光偏
光反応の大きさは化合物の分子サイズに直接関係する。
従つて、平面偏光を比較的高分子量の螢光化合物を含有
する溶液中を通過されると、発光の偏光の度合は一般に
平面偏光を低分子量の螢光化合物を含有する溶液中を通
過させるときよりも大きい。それで、螢光偏光により拮
抗結合免疫検定において生成されるトレーサー−抗体複
合体の量を測定する定量的手段が提供される。

螢光偏光原理は、関心のある分析物もしくはリガンド
（あるいは分析物を含有すると予想される）を含む試料
を「トレーサー」すなわち分析物と類似しているが平面
偏光に対して螢光偏光反応を生成し得る標識化合物と混
合することによつて、検定に通常利用されている。通
例、分析物もしくはリガンドは比較的低分子量の化合
物、すなわち約2,000ダルトン未満の化合物であるが、
分析物（ana−lyte）は螢光偏光免疫検定技術を用いて
測定可能である限り実質的により大きい、例えば100,00
0ダルトン以上の程度の分子量を有するものであつてよ
い〔例えば、1985年７月22日出願の本出願人の出願に係
る米国特許出願第757,822号を参照、この記載を参考と
して本文に挿入する。そこでは、約120,000ダルトンの
分子量を有するＣ−反応性蛋白質についての螢光偏光免
疫検定が開示されている。〕。分析物およびトレーサー
に特異的な抗体もまた混合物に包含されている。トレー
サーおよびリガンド抗体上の限られた数のレセプター結
合部位と拮抗する。結合するトレーサーの量は試料中の
分析物の濃度と逆の関係を有する。その理由は分析物お
よびトレーサーはそれぞれの濃度に比例してそれぞれ抗
体に結合するからである。

TDxフルオレセンス・ポーラリゼーシヨン・アナライザ
ー、すなわちアポツト・ラボラトリーズ、アポツト・パ
ーク、イリノイから商業上入手し得る装置は就中螢光偏
光検定の達成のための自動化システムである。TDxアナ
ライザーは、多くのリガンドの患者試料中の測定のため
に臨床検査所に螢光偏光免疫検定を提供するに当り著し
い商業的成功をおさめている。これらのリガンドには、
抗喘息剤例えばテオフイリン、抗不整脈剤例えばリドカ
イン、Ｎ−アセチルプロカインアミド、プロカインアミ
ドおよびキニジン、抗生物質例えばアミカシン、ゲンタ
マイシン、カナマイシン、ネチルマイシン、ストレプト
マイシン、トプラマイシン、およびバンコマイシン、抗
けいれん剤例えばカルバムアセピン、フエニトイン、フ
エノバルビタール、ピリミドンおよびバルプロイツク・
アシド（valproic acid）、抗ガン剤例えばメトトレキ
セート、強心グリコシド例えばジゴキシン、甲状腺機能
検定例えばＴ−貯留、チロキシンおよびその他が包含さ
れる。免疫検定の実施でのTDxアナライザーおよびその
使用は、ジヨレイ（Jolley）等、「フルオレセンス・ポ
ーラリゼーシヨン・イムノアツセイＩ（Flurorescence
Polarization Immunoassay I、モニタリング・アミノグ
リコキシド・アンチバイオテイクス・イン・シーラム・
アンド・プラズマ（Monitoring Aminoglycoside Anibio
tics in Serum and Plasma」、クリニカル・ケミストリ
ー（Clenical Chemistry）、27/7、第1190−1197頁（19
81年）；ポペルカ（Popelka）等、「フルオレセンス・
ポーラリゼーシヨン・イムノアツセイII、アナライザー
・フオア・ラピツド・プレサイス・メジユアメント・オ
プ・フルオレセンス・ポーラリゼーシヨン・ウイズ・ユ
ース・オブ・デイスポザブル・キユベツツ（Analyzer f
or Rapid,Precise Measwement of Fluorescence Polari
zation with Use of Disposable Cuvettes」、クリニカ
ル・ケミストリー、27/7、第1198−1201頁（1981年）；
ジヨレイ等、「フルオレセンス・ポーラリゼーシヨン・
イムノアツセイIII、アン・オートメーテツド・システ
ム・フオア・セラピユーテイツク・ドラツグ・デターミ
ネーシヨン（An Automated System for Therapeutic Pr
ug Determination）」、クリニカル・ケミストリー、27
/9、第1575−1579頁（1981年）；およびルーステフエス
（Lu−Steff−es）等、「フルオレセンス・ポーラリゼ
ーシヨン・イムノアツセイIV、デターミネーシヨン・オ
ブ・フエニトイン・アンド・フエノバルビタール・イン
・ヒユーマン・シーラム・アンド・プラズマ（Determin
ation of Phenytion and Phenobarbital in Human Seru
m and Plasma）」、クリニカル・ケミストリー、28/1
1、第2278−2282（1982年）に記載されている。

血清または血漿試料中の関心のある分析物を測定するた
めの螢光偏光免疫検定法の使用で遭遇する一つの問題
は、試料中に様々の程度で存在する基底値螢光（backgr
ound Pluorescence）である。黄疽血清または血漿は所
望の偏光測定値に著しい誤差を与える。黄疽血清または
血漿の主要螢光成分はアルブミン−結合ビリルビンであ
る。ビリルビンはヘム異化作用の最終生成物であり、正
常な個体では血清中に1mg/dl未満で存在する。肝臓に影
響する種々の疾病状態では、ビリルビンは著しく上昇
し、場合によつては10−20mg/dlに適する。新生児では
往々にして出生直後の弱い肝機能のために10−20mg/dl
の高レベルとなる。ビリルビンは水溶液中にあるときは
比較的非螢光性であるが、アルブミンと結合すると極め
て螢光性となる〔チエン（Chen）、アーク・ビオヘム・
ビオフイズ（Arck.Biochem.Biophys）、160、106−112
頁〕。そして、ビリルビン−アルブミン結合は非常に強
固である〔グレイ（Gray）等、J.ビオル・ケム（J.Biol
・Chem.）、253、第4370−4377頁〕。従つて、上昇した
ビリルビンレベルを有する血清または血漿試料はビリル
ビン−アルブミン複合体の存在により上昇した螢光を示
す。

基底値螢光による誤つた結果を避けるために、検定を行
う前にTDxアナライザーで血清または血漿試料について
通常ブランクの読み取りをし、これを次に最終検定読み
から差引いて補正値に適する。しかしながら、基底値差
引はいくつかの上昇ビリルビン試料で基底値螢光を適切
に補償するのに無効である場合もあり、そして検定過程
でのビリルビン−アルブミン複合体の分解によりかかる
試料中で不正確な基底値螢光の補償を生じ得る。従つ
て、米国特許第4,492,762号には、試料中のビリルビン
−血清アルブミン複合体を分裂させるのに有効な量の院
イオン界面活性剤を含有し、かくして試料の基底値螢光
を減少させる溶液で螢光偏光免疫検定を実施することが
開示されている。この米国特許には、この目的のために
広いカテゴリーの陰イオン界面活性剤が有用であるこ
と、および0.001−0.2（重量／容量）％の濃度範囲が好
ましいことが開示されている。この米国特許の方法の実
施に用いるのに好ましい界面活性剤はドデシル硫酸ナト
リウムおよびコール酸ナトリウムであつた。この米国特
許の方法は血清試料中の高ビリルヒンレベルの故にTDx
アナライザーでの測定誤差を限定するのに非常に有効で
あることが立証されているが、このような界面活性剤の
使用はある種のリガンドについての螢光検定の発を妨げ
ていた。例えば、供試試料中のリガンドの低濃度の故
に、感度要件および大量の試料が必要とされる場合のリ
ガンドである。これらの場合、この米国特許に開示され
ているドデシル硫酸ナトリウムあるいはその他の界面活
性剤の使用は十分に高い濃度の界面活性剤を必要とし、
それにより検定の実施において抗体または分析物の分解
を生じる。比較的低い分子量のリガンド例えばジゴキシ
ンのような治療薬の濃度のためにこの問題を克服するた
めには、例えば血清中の蛋白質の変性による螢光偏光免
疫検定でのビリルビン干渉を除去するのに、過酷な前処
理工程が必要であつた。比較的大きい分子例えば蛋白質
の低濃度に対して、このような前処理は使用することが
できない。その理由はこれらの前処理によつて試料中の
分析物の変性を生じ、そして螢光偏光技術を用いるこの
ような比較的大きい分子についての螢光偏光免疫検定は
不可能であつたからである。先行技術のシステムによる
これらの問題およびその他の問題は本発明の実施により
克服され、そして本発明では血清または血漿試料中の分
析物についての螢光偏光免疫検定をスルホコハク酸ジオ
クチルナトリウムの存在下で実施するものである。

本発明の実施に当り、スルホコハク酸ジオクチルナトリ
ウム（DSS）を螢光偏光免疫検定において陰イオン性界
面活性剤として使用して血清試料中のビリルビン−血清
アルブミン複合体から生じる基底値を低減させる。意外
にも、スルホコハク酸ジオクチルナトリウムが比較的低
い濃度でこの目的に非常に有効であつて、検定に使用さ
れる抗体に対して分解効果をほとんどあるいは全く示さ
ず、かくして螢光偏光技術に使用して先行技術の方法で
はこれまで除外されていた分析物の濃度を測定すること
が可能ととなるが見い出された。

本発明は更に上述の方法に有用なある種の新規な試薬を
も包含している。

定 義 本分で使用されるDSS、すなわちスルホコハク酸ジオク
チルナトリウムは構造式 を有する化合物、スルホブタンジオイツク・アシド1,4
−ビス（２−エチルヘキシル）エステルナトリウム塩で
ある。ナトリウム塩に加えて、他の塩例えばカリウム
塩、カルシウム塩、リチウム塩、マグネシウム塩および
その他の均等な塩も本文に記載の如く本発明の範囲内に
包含される。

本文で使用される「リガンド」なる語は、結合蛋白質例
えばレセプターあるいは抗体が得られるかまたは形成さ
れ得る分子例えばナプテンを称する。このようなハプテ
ンは、動物に注入されたとき抗体形成を誘起しないが、
抗体に対して反応性である一般に低分子量の蛋白質を含
まない化合物である。更に、「リガンド」なる語は、中
程度のまたは高い分子量の化合物例えばＣ−反応性蛋白
質のような蛋白質を称することもある。ハプテンに対す
る抗体は、まずハプテンを蛋白質に共役させ、そして共
役生成物を動物に注入することによつて一般に生産され
る。得られた抗体は通常の周知の抗体単離技術により単
離される。

本文で使用される「リガンド類似体」なる語は、一価あ
るいは多価ラジカルを称し、このラジカルの実質的な部
分は、レセプターの結合部位に対するリガンドと拮抗し
得る１種またはそれ以上の決定因子またはエピトープ部
位を定めるリガンドと同じ空間および極性機構を有して
いる。このようなリガンド類似体の特徴は、関心のある
リガンドに対して十分な構造類似性を有してリガンドに
対する抗体によつて認識されるようになつていることで
ある。たいていの場合、リガンド類似体は分子表面の重
要な部分に対して関心のあるリガンド（本発明の目的に
違う、CRP）と同一もしくは実質的に同一の構造および
帯電分布（空間および極性機構）を有している。往々に
して、ハプテンのための結合部位はリガンドに結合させ
るためのトレーサーに使用されるのと同じであるので
（抗体生産のための抗原の調製において）、抗体に対す
る鋳型を提供するリガンド類似体の同一部分はトレーサ
ーにおいてリガンド類似体により露出される。

本発明はフルオレセインおよびフルオレセイン誘導体の
使用を包含している。特に、トレーサー化合物の有用性
のために必要とされるフルオレセインおよびその誘導体
の特性はフルオレセインの螢光である。これらの化合物
は適当な波長の偏光で励起されると螢光反応を示し、こ
れにより螢光偏光測定を行うことが可能となる。一般
に、本発明によつて提供される検定で使用されるトレー
サー化合物は測定すべきリガンドあるいはリガンド類似
体とフルオレセインあるいはフルオレセイン誘導体との
共役体から形成され、そして溶液中で生物学的に許容し
得る塩例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム等と
して存在し、これにより本発明の分析法で使用した場合
化合物が開環、螢光形態で存在することが可能となる。
存在する特定の塩はpHレベルを調節するのに使用される
緩衝剤によつて左右される。例えば、りん酸ナトリウム
緩衝剤の存在下で、本発明に使用される化合物は一般に
ナトリウム塩として開環形態で存在する。本発明に使用
するのに適したフルオレセイントレーサー化合物は例え
ばカルボキシフルオレセンフルオレセインイソチオシア
ート（FITC）、トリアジニルアミノフルオレセイン（DT
AF）および先にあげた先行技術に開示されたものを包含
する多くの他の周知の化合物を包含する。使用のために
特別な螢光トレーサーの選択は本文の教示により通例の
選択の問題であり、そして本発明の実施に決定的なもの
ではない。

螢光偏光免疫検定法 本発明の方法によれば、測定すべきリガンドを含む試料
のDSSの存在下トレーサーおよびリガンドとトレーサー
とに特異的な抗体と混合させる。本発明の実施に有効な
反応混合物中のDSSの濃度範囲は特定のリガンド、抗体
および検定に用いられる他の試薬によつて左右される
が、一般には約0.001乃至約1.0％（重量／容量）、更に
好ましくは約0.002乃至約0.5％（重量／容量）、最も好
ましくは約0.005乃至約0.1％（重量／容量）の範囲にあ
る。試料中に存在するリガンドおよびトレーサーは限ら
れた数の抗体部位と拮抗し、結果としてリガンド−抗体
およびトレーサー−抗体複合体が形成される。トレーサ
ーおよび抗体の濃度を一定に保持することにより、形成
されるリガンド−抗体複合体対トレーサー−抗体複合体
の比は試料中に存在するリガンドの量に正比例する。従
つて、混合物を偏光で励起し、そしてトレーサーおよび
トレーサー−抗体複合体により発する螢光の偏光を測定
すると、試料中のリガンドの量を定量的に測定すること
が可能となる。

抗体と複合されていない溶液中のトレーサーは、吸収に
必要な時間よりも短い時間で自由回転し、そして再発光
される光は比較的無作為に配向され、その結果抗体に複
合されていないトレーサーの螢光偏光は低く、零に近
い。特定の抗体と複合すると、このようにして形成され
たトレーサー−抗体複合体は、比較的小さいトレーサー
分子の回転よりも遅い抗体分子の回転をするものと予想
され、これによつて観察される偏光が増大される。従つ
て、リガンドが抗体部位についてトレーサーと拮抗する
場合、得られた遊離トレーサーとトレーサー−抗体複合
体との混合物の螢光の観察される偏光はトレーサーの偏
光とトレーサー−抗体複合体の偏光との中間にある値を
示すものと予想される。試料が高濃度のリガンドを含有
しているときは、観察される偏光値は遊離リガンドの値
により近くなる、すなわち低くなる。供試試料が低濃度
のリガンドを含有しているときは、偏光値は結合リガン
ドの値により近くなる、すなわち高くなる。免疫検定の
反応混合物を順次垂直偏光次いで水平偏光で励起し、そ
して発光された光の垂直偏光された成分のみを分析する
ことにより、反応混合物での螢光偏光を正確に測定する
ことができる。偏光と測定すべきリガンドの濃度との間
の正確な関係は、既知濃度を有する検量体の偏光値を測
定することにより確立することができる。リガンドの濃
度はこのようにして作成した標準曲線から内挿すること
ができる。

本発明の方法を実施するpHは、トレーサーはそのイオン
化された状態で存在させるのに十分でなければならな
い。pHは約３−12、更に普通には約５−10の範囲、最も
好ましくは約６−９の範囲にあり得る。検定操作中pHを
得て、維持するのに、種々の緩衝剤を使用することがで
きる。代表的な緩衝剤には、ほう酸塩、酢酸塩、りん酸
塩、炭酸塩、トリス、バルビタール等が包含される。使
用される特別な緩衝剤は本発明にとつて限定的ではない
が、個々の検定においては使用される抗体および測定す
べきリガンドに鑑み、特定の緩衝剤が好ましいこともあ
る。緩衝剤の陽イオン部分は一般に溶液中のトレーサー
の陽イオン部分を決定する。

本発明の方法は適度の温度、好ましくは一定の温度で実
施される。温度は普通約０℃−約50℃、更に好ましくは
約15℃−約40℃の範囲にある。

本発明に従つて検定されるリガンドの濃度は一般に約10
^-2乃至約10^-13M、更に通常では約10^-4乃至約10^-10Mに変
化する。高濃度のリガンドは当初の試料を希釈すると検
定することができる。

リガンドの濃度範囲に加えて、例えば、検定が定量的、
半定量的あるいは定量的であるか否か、使用する装置お
よびトレーサーおよび抗体の特徴を考慮すると普通使用
されるトレーサーおよび抗体の濃度を決定する。試料中
のリガンドの濃度範囲は通常検定の感度を最適とするの
に他の試薬、すなわちトレーサーおよび抗体の濃度範囲
を定めるが、個々の試薬濃度は経験則で定めることがで
きる。トレーサーおよび抗体の適切な濃度は当業者によ
つて容易に確定される。

本発明の一部を形成するものではないが、本発明で提供
されるリガンドのための螢光偏光免疫検定法は、TDx
（登録商標）フルオレセンス・ポーラリゼーシヨン・ア
ナライザー（Fluorescence Polarization Analyzer）
〔アボツト・ラボラトリーズ（Abbott Laboratorie
s）、アボツト・パーク（Abbott Park）、イリノイで商
業上入手可能であり、ここからこのアナライザーの操作
および特徴に関する細部が入手し得る〕で本発明に従つ
て試薬および検定操作を用いて特に有利に達成すること
ができる。

本発明はまた本発明の検定に用いるために試薬を包含
し、この試薬は検定の実施に当り希釈するとこれまでに
記載した濃度範囲内に反応混合物でDSS濃度を生じる。
試薬中のDSSの濃度は使用することが企図されている検
定プロトコールによつて変るが、有利には約0.01乃至約
20.0％（重量／容量）DSS、更に好ましくは約0.02乃至
約15.0％（重量／容量）DSSおよび最も好ましくは約0.0
5乃至約10.0％（重量／容量）DSSを包含している。本発
明の試薬の溶媒系は水性溶媒あるいは水に混和し得る結
城溶媒例えばエチレングリコール、プロピレングリコー
ル、DMSO、DMF、低級アルカノール等の１種またはそれ
以上であり得る。一つの現在特に好ましい溶媒系は２−
プロパノール、DMSOおよびプロピレングリコールの混合
物である。DSSを含む試薬は好ましくは検定で使用する
ための前処理緩衝液である。

実 施 例 次に実施例をあげて本発明の着想に従つて行われる実験
を記載し、そしてこれらの実施例は螢光分極技術を用い
るCRPおよびT3の検定に係るものである。実施例は先行
技術による陰イオン界面活性剤を使用する顕著な技術上
の難点を提供するリガンドについて例示しているもので
あるが、本発明の着想は本文に記載の如く他のリガンド
の検定についても同等に適用し得ることが明白である。
このような検定は次の一般的操作に従つて行うことがで
きる。

１）標準または供試血清の則定量を試験管に送り、DSS
からなる前処理緩衝剤で希釈する； ２）既知濃度の抗血清を試験官に加える； ３）任意に界面活性剤を含有する既知濃度のトレーサー
を次に各試験官に加える； ４）反応混合物を室温で培養する； ５）抗体に結合されたトレーサーの量を試料中のリガン
ドの量の標準として螢光分極技術により測定する。

本発明の原理は非自動化検定に十分に適用し得るが、TD
s検定の自動化性状により検定の実施あるいはデータの
解釈のための技術者の時間が最小となるようにされる。

実施例 1. 螢光偏光免疫検定法による自動化Ｃ−反応性蛋白質検定
ヒトＣ−反応性蛋白質の単離 CRPは、臭化シアン活性化セフアロースにより共有結合
された肺炎球菌Ｃ−多糖類でのカルシウム依存アフイニ
テイ−クロマトグラフイーにより、悪性腫瘍腹水および
胸膜液から得られる。次に、このものをカルシウムイオ
ンの存在下分子ふるいクロマトグラフイーとアガロース
に対する親和力による混在SAPの除去と組合せてアルト
ロゲル（Ultrogel）AcA44（アクリルアミド−アガロー
ス・ビーズ）でゲル過する。残留痕跡量の不純分はセ
フアロースで不溶化した抗正常人血清および抗SAP抗体
による免疫吸着によつて、そして糖蛋白質を除去するた
めのセフアロース−ConAおよびアルブミンを除去するた
めのブルー−セフロースでの吸着により除去する。セフ
アクリル（Sephacryl）Ｓ−300での最終ゲル過工程の
後、最初のCRPの35−40％が実質的に純粋な形態で採取
される。

CRP抗血清生産 完全フロイントアジユバンドに懸濁した単離CRPの深部
皮下もしくは筋肉内注射次いで不完全アジユバント中の
エマルジヨンの隔週または毎月の促進注射により、羊お
よび山羊を免疫する。各注射は少くとも500μｇのCRPを
含有している。この規則を全動物について５ケ月間続行
し、この間動物を隔週または毎月の飼育間隔で抗体力価
をモニターする。次に、促進注射を３ケ月中間中断し、
一方力価モニターを続ける。３ケ月の休止期についで、
力価が低下し始めるにつれて促進注射を再開する。

トレーサー合成DTAF/CRP ５−（4,6−ジクロロ−トリアジン−２−イル）−アミ
ノフルオレセイン（DTAF）のストツク溶液を超音波処理
の助けで無水エタノール中2kg/mlで調製する。ストツス
CRPは0.005モルほう酸塩緩衝剤、pH9.0、0.002モルCaCl
₂および0.9％NaClを3mg/mlで含有し、そして0.04モルほ
う酸塩緩衝剤pH90、0.002M CaCl₂、0.9％NaCl500μｇの
濃度とする。（500μg/ml）CRP溶液1mlに、ストツクDTA
Fの25μを加える。次に、暗所で混合しながら周囲の
温度で１時間カツプリング反応を行う。１時間の終り
に、DTAF反応物を10％グリシン50μ（0.04モルほう酸
塩緩衝剤、pH9.0、上述したものと同じ緩衝剤）で急冷
し、そして上記条件で15分間混合しながら培養する。複
合体をセフアデツクスＧ−25でクロマトグラフイー処理
し、そしてほう酸塩緩衝剤pH9.0（上述したものと同じ
緩衝剤）で溶離し、そしてボイドボリユームで採集す
る。次に、TDxアナライガーでの自動検定で使用するた
めに、このものを所望の濃度に希釈する。

自動Ｃ−反応性蛋白質検定試薬、検量体、および比較対
照トレーサー：ストツクDTAF/CRP複合体を蛋白質および
塩安定剤および防腐剤として0.1％NaN₃を含む緩衝剤で
希釈してTDxアナライザーで20のゲインで3000の正味強
度読みを与える。

抗血清：原CRP抗血清の希釈を1:10乃至1:100で行う。各
希釈液25μをキユベツトに入れ、そして0.1Mりん酸塩
緩衝剤、pH7.5、0.01％牛−γ−エチレングリコ−グロ
ブリン（BGG）、0.1％NaN₃および２％（容量）の最終2m
l容量中のトレーサー試薬25μと共に培養する。抗血
清およびトレーサーを上記緩衝条件下35℃で3.4分間反
応させる。希釈係数は、螢光偏光測定値に基いて抗血清
について決定する。次に、抗血清試薬を、決定した希釈
形成に従つて原抗血清を希釈することによつて上記りん
酸塩緩衝剤中で調製する。

前処理：前処理緩衝剤試薬は、0.05モルトリス、pH8.
0、0.1％NaN₃（防腐剤）およびその他の有機安定化溶媒
中の3.5％（重量／容量）DSSの溶液からなる。

緩衝剤:TDx検定緩衝剤は、0.1モルりん酸塩、pH7.5、0.
01％牛−γ−グロブリン（BGG）および防腐剤としての
0.1％NaN₃からなる。

検量体:C−反応性蛋白質は、蛋白質および塩安定剤およ
び防腐剤としての0.1％NaN₃を含む緩衝化合成血清マト
リツクス中に入れる。

比較対照：（検量体と同じマトリツクスに含有される） 上記処方の許容し得る変更： pH領域 ６−８ Na₂SO₄濃度４％およびpH7.0で2.0％卵アルブミン ２％プロピレングリコールを２％エチレングリコールで
置換 Na₂SO₄を（NH₄）₂SO₄で、卵アルブミン加水分解物を卵
アルブミンで置換 上記処方物は45℃で10日間CRP−DTAF複合体を安定化す
ることがわかる。

上記処方物はＣ−反応性蛋白質を45℃で30日間安定化す
ることがわかつた。

6N HClでpHを8.0に調節する。この前処理組成物は、8.0
μの試料容量CRP検定を用いて、ビリルビン濃度20mg/
dlでビリルビン干渉を除去するのに有効であることがわ
かつた。

検定操作 CRPのための螢光偏光免疫検定（FPIA）は次の如くTDx・
フルオレセンス・ポーラリゼーシヨン・アナライザー
（TDx Fluorescense Polarization Analyzer）で実施す
る。反応順序、培養、時期、試薬容量および試料容量
は、プログラム検定パラメーターに従つてマイクロプロ
セツサ制御されている。CRP検定を行うには、試料およ
び試薬をそれぞれの受け器でTDxアナライザーに装填す
る。試料、抗血清、前処理試薬、および緩衝剤を反応溜
めに分配する。希釈試料の最終容量の1/2を、最終反応
容量の1/2とするのに十分な緩衝剤と共にキユベツト中
に分配する。試料、抗血清および前処理試薬の混合物に
ついて基底強度値の読みをとる。希釈試料の第二の半量
をトレーサーおよび緩衝剤と共にキユベツトに分配して
最終反応容量2mlとする。最終強度測定を行う。TDx/CRP
操作を達成するための特定の検定順序は次の工程からな
る： 1.試料8.6μを反応溜めに分配し、そして緩衝剤25μ
を加える。

2.前処理試薬10μおよび抗血清試薬25μを反応溜め
中の試料に加え、そして緩衝剤431.4μを加えて最終
反応溜め容量を500μとする。

3.前処理試薬の追加25μをキユベツトに分配する。

4.反応溜めに入つている試料、抗血清および前処理混合
物の174μをキユベツトに移し、緩衝剤776μで希釈
して中間キユベツト容量1000μとする。

〔註〕工程１〜４を各試料についてくりかえし、そして
試料当り18.4秒で達成する。

5.キユベツト内容物を34℃で6.4分間培養し、一方、3.4
分で基底値を読みとり、そして各試料について保存す
る。

6.基底値記録に従つて、試料、抗血清および前処理試薬
混合物の追加174μを反応溜めからキユベツトに移
し、そして緩衝剤20μを加える。

7.トレーサー試薬25μをキユベツトを加え、そして十
分な緩衝剤（601μ）を加えて最終キユベツト容量2ml
とする。

8.最終キユベツト反応混合物を3.4分間培養し、そして
各試料について最終読み取りをする。

9.ブランクの読み取り値を最終読み取り値から差引き
し、そして各試料について正味の偏光読み取り値を記録
する。

10.正味の偏光読み取り値を、既知のCRP濃度の検量体か
ら予め得られた検量曲線から得られた４種の保存数学定
数を用いて、CRP濃度に変換する。４種の定数は、TDxア
ナライザーと組合されたデータ処理システムの一部であ
る最小−２乗曲線−フイツト４種パラメータープログラ
ムにより求める。

前述の如く、本発明に従つて達成される検定を用いて、
正常濃度のCRPを含む試料に加えてそれぞれ概略濃度
２、10および20mg/dl CRPとするCRPの回収率は、それぞ
れ100％、100％および99.6％である。僅かに上昇した濃
度のCRPを含有する２種の他の試料に10mg/dlの概略濃度
を加える。これらの試料からの回収率は98.9％および9
7.4％であつた。結果を以下に要約する。

ビリルビン−アルブミン複合体基底値に対するDSSの効
果 ビリルビン〔ジグマ・ケミカル・カンパニー（Sigma Ch
emical Co.）、カタログNo.B40126〕のストツク溶液を
0.1M NaOH中1000mg/dlで調製する。ストツク溶液を用い
て低（Ｌ）、中（Ｍ）および高（Ｈ）CRP含有標準血清
試料をスパイク（spike）として以下に述べる如く試料
中のビリルビン濃度を得る。次に、試料を、ａ）先に記
載したDSSを包含する前処理試薬組成物、あるいはｂ）D
SSの代りにドデシル硫酸ナトリウム（SDS）0.7％、およ
びドデシル硫酸ナトリウム（LDS）0.5％からなる以外は
前述のとおりの前処理試薬組成物を用いて、前述の操作
に従つて、検定する。各検定に対するビリルビン干渉％
は次の方程式に従つて求める。

この式で、〔CPR_B〕はビリルビン含有試料中のCRPの測
定濃度であり、そして〔CRP_C〕はビリルビンを伴わない
対応する比較対照中のCRPの測定濃度である。結果は次
のとおりである。

他の方法との相関関係 ヒト血清試料をCRP試験を必要とする患者集団から1.5ケ
間の期間にわたつて得る。各試料についてのCRP値は商
業的比濁分析法を用いて病院で得られる。試料を凍結輸
送し、次に前述の如くCRP検定により試験する。両方の
方法から得られる患者の結果を直線回帰分析により比較
する。供試345試料について次の結果が示される。

相関係数＝0.992 スロープ＝0.976 ｙ−インターセプト＝3.0μg/ml フイールド研究を地方病院で約２週間実施した。この期
間中、次の３種の方法を用いて70の臨床検体を試験し
た。すなわち、比濁分析法（NPM）、放射線免疫拡散法
（RID）および前述の本発明による検定法（TDx CRP）で
ある。３種の方法からの相関データを次のとおり要約す
る。

検定感度 0.3mg/dlの検知限界は、20「零」検量体複製のミリ偏光
（mP）平均値からとり去つた２つ標準誘導体に基づいて
いた。次に、得られたmPを、CPR濃度0.3mg/dlに相当す
ることがわかつている検量曲線で読みとつた。

X₂₀＝270.55mP 標準誘導体＝0.529mP 標準誘導体＝1.06mP＝0.3mg/dl 本文に含まれる本発明の特別な開示から、本発明の精神
および範囲を逸脱することなく、当業者が種々の変化お
よび変形をなし得ることが明らかである。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】螢光偏光免疫検定法により試料中のリガン
   ドの存在または量を測定する方法において、スルホコハ
   ク酸ジオクチルナトリウムの0.001乃至1.0％（重量／容
   量）の存在下に螢光偏光免疫検定法を実施することを特
   徴とする螢光偏光免疫検定法。
2. 【請求項２】螢光偏光免疫検定法をスルホコハク酸ジオ
   クチルナトリウムの0.002乃至0.5％（重量／容量）の存
   在下で実施する特許請求の範囲第１項記載の方法。
3. 【請求項３】螢光偏光免疫検定法をスルホコハク酸ジオ
   クチルナトリウムの0.005乃至0.1％の存在下で実施する
   特許請求の範囲第１項記載の方法。
4. 【請求項４】スルホコハク酸ジオクチルナトリウム0.01
   乃至20.0％（重量／容量）を包含する螢光偏光免疫検定
   法に使用する試薬。
5. 【請求項５】スルホコハク酸ジオクチルナトリウム0.02
   乃至15.0％（重量／容量）を包含する特許請求の範囲第
   ４項記載の試薬。
6. 【請求項６】スルホコハク酸ジオクチルナトリウム0.05
   乃至10.0％（重量／容量）を包含する特許請求の範囲第
   ４項記載の試薬。