JPH0787793B2

JPH0787793B2 - 高度不飽和脂肪酸の分離方法

Info

Publication number: JPH0787793B2
Application number: JP61251397A
Authority: JP
Inventors: 幸久田中; 二郎平野; 正船田; 弥村山; 康孝小菅; 義明布垣
Original assignee: 日本油脂株式会社
Priority date: 1986-10-22
Filing date: 1986-10-22
Publication date: 1995-09-27
Anticipated expiration: 2010-09-27
Also published as: JPS63105683A

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明はエイコサペンタエン酸（以下、EPAと略す）、
ドコサヘキサエン酸（以下DHAと略す）などの高度不飽
和脂肪酸（以下、PUFAと略す）を脂肪酸成分として含有
する天然油脂（例えば、魚油、鯨油、微生物由来の油
脂）からPUFAを選択的に分離する方法に関するものであ
る。

〔従来の技術〕 EPA,DHAには血小板の凝集抑制作用があり、脳血栓や心
筋梗塞等の循環器系疾患の予防薬としての可能性がDyer
berg博士らによる研究によって示唆されている。またEP
Aには血液中のコレステロールを低下させる働きがあ
り、その活性は現在脱コレステロール剤として用いられ
ているリノール酸の約４倍と言われている。以上のよう
にPUFAはその薬理作用が注目されている。

従来のPUFAの分離方法としては、グリセリドをメタノー
ルやエタノール等の低級アルコールのエステルに変換し
た後蒸留し、さらに尿素包接処理により濃縮分離を行う
方法（例えば特開昭58-8037号）、逆相クロマトグラフ
ィーを用いて濃縮分離を行う方法（例えば特開昭58-883
39号、特開昭58-109444号）などが提案されている。

一方、魚油をキャンディダ・シリンドラッセから得られ
たリパーゼにより加水分解してPUFAをグリセリド側に濃
縮し、これを遊離脂肪酸（以下、FFAと略す）から分離
する方法が提案されている（特開昭58-165796号）。

〔発明が解決しようとする問題点〕

ところでPUFAはその構造上、光、熱、酸素などに対し極
めて不安定で酸化されやすく、過酸化脂質を生成しやす
い。過酸化脂質は人体に悪影響を及ぼし、下痢、嘔吐、
発熱や、最悪の場合死に至ることもある。従ってPUFAを
処理する際には常温、常圧、中性条件下での反応が望ま
しい。

しかるに、従来のエステル交換法による分離方法では、
PUFAを低級なアルコールのエステルに変換した後に分離
濃縮が行われているため、エステル化の過程において
熱、触媒、アルカリ等によってPUFAが酸化、変性などを
起こす可能性が非常に高い。

また逆相クロマトグラフィーを用いて濃縮分離する方法
は、大量の充填剤および溶剤を使用する必要があるとと
もに処理効率が悪く、大量の処理に適しない。

さらに、従来のPUFAを含有する油脂への酵素的加水分解
の応用としてのリパーゼを用いる方法は、PUFAを含むグ
リセリドがリパーゼにより加水分解されにくい性質を利
用するもので、炭素数18以下の通常の脂肪酸部分をリパ
ーゼにより分解して脂肪酸とし、PUFAを未分解のままグ
リセリドとしてFFAから分離する方法であるが、PUFAの
分離効率が低く、高濃度に分離できないという問題点が
あった。

本発明は上記問題点を解決するためのもので、不安定な
PUFAを変性させることなく、効率よく高濃度に分離する
ことが可能なPUFAの分離方法を提案することを目的とし
ている。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明は、高度不飽和脂肪酸を脂肪酸成分として含有す
る天然油脂をリパーゼで分解して、モノグリセリドおよ
び遊離脂肪酸を含む混合物を生成させ、この混合物を遠
心液々分配クロマトグラフィーで分画し、高度不飽和脂
肪酸の遊離脂肪酸およびモノグリセリドを含む画分を分
取することを特徴とする高度不飽和脂肪酸の分離方法で
ある。

本発明ではPUFAを低級アルコールのエステルに変換する
ことなく、リパーゼを用いた部分加水分解により各種グ
リセリドおよびFFAの混合物として、遠心液々分配クロ
マトグラフィーによって分画し、PUFAのFFAおよびモノ
グリセリドを含む画分を分取することによりPUFAを分離
する。

本発明においてPUFAとしては、炭素数18〜24、二重結合
の数３〜６の長鎖PUFAがあり、その例としては前記EPA,
DHAのほかにγ−リノレン酸、アラキドン酸などがあげ
られる。本発明における原料油脂はこれらのPUFAを脂肪
酸成分として含有する天然油脂であり、魚油、鯨油、月
見草種子油、松実油、微生物由来の油脂などがあげられ
る。

本発明で用いられるリパーゼはムコール属、クロモバク
テリウム属、シュードモナス属およびアスペルギルス属
に属するリパーゼ生産菌から得られたものが好ましい。
上記のリパーゼ生産菌としては、例えばムコール・ミエ
ハイ、クロモバクテリウム・ビスコスム、シュードモナ
ス・フルオレッセンス、アスペルギルス・ニガーなどが
あげられる。このうち一部のリパーゼ、例えばムコール
・ミエハイから得られたリパーゼにより油脂を完全にFF
Aにまで分解するのは困難であるが、モノグリセリドま
での分解は可能である。

原料油脂をリパーゼで分解するには、その活性を発現さ
せるために水が必要であり、その量は天然油脂に対して
30〜70重量％、好ましくは50重量％程度が適当である。
またリパーゼの使用量は通常天然油脂1gあたり10〜1000
0ユニット、好ましくは100〜500ユニット程度が適当で
ある。

分解の方法は上記原料油脂、リパーゼおよび水を混合
し、酵素分解に適した温和な温度、圧力で中性条件下に
攪拌し、24〜72時間反応させることができる。

この反応において、原料油脂はリパーゼにより加水分解
され、PUFAはトリグリセリドからジグリセリド、モノグ
リセリドを経てFFAに分解するが、PUFAはグリセリンの
β位に結合しているため、モノグリセリドにもPUFAが多
量に存在している。一方、遠心液々分配クロマトグラフ
ィーによれば、PUFAのFFAおよびモノグリセリドをトリ
グリセリド、ジグリセリド、ならびに他の脂肪酸のFFA
およびモノグリセリドから選択的に分離することが可能
であるから、リパーゼによるPUFAの分解は完全にFFAに
まで進行する必要はなく、モノグリセリドまで分解され
ていれば、効率よくPUFAを分離することができる。

こうしてリパーゼにより原料油脂を分解して生成するPU
FAおよび他の脂肪酸のトリ、ジ、モノグリセリドおよび
FFAの混合物を遠心液々分配クロマトグラフィーにより
分画を行い、PUFAのモノグリセリドおよびFFAを含む画
分を分取してPUFAを分離する。

遠心液々分配クロマトグラフィーは特開昭59−62312号
に開示されているもので、２層分離液のうち一方を固定
相として遠心力により保持しつつ、他方を移動相として
連続的に固定相内を通過させて、移動相内に注入された
試料を連続的に分画する向流分配クロマトグラフィーで
ある。

本発明では比重および極性が異なり、２相に分離する２
種の溶媒の一方を固定相、他方を移動相とし、遠心加速
度の作用により固定相中を移動相を移動させ、試料中の
各成分を分配係数の差を利用して多段分配平衡によりク
ロマトグラフィー的に分画する。この方法では、試料中
の極性の高い成分が順次極性の高い溶媒に分配され、ま
た極性の低い成分が順次極性の低い溶媒に分配される。

図面は本発明で用いられる遠心液々分配クロマトグラフ
ィーの系統図であり、その原理は以下の通りである。

遠心機ローターＲ上に多数の分配管Ｃ（500〜4000管）
が遠心加速度ｇの方向と平行に配列され、相互に直列に
導管Ｔで接続されている。導管Ｔの両端は遠心機回転軸
の両端に設置された回転送液ジョイントJ₁、J₂に接続さ
れている。回転送液ジョイントJ₁、J₂は４方バルブV₃、
６方バルブ（試料インジェクター）V₂、定流量ポンプＰ
および４方ロータリーバルブV₁を介して固定相SP、移動
相MP、洗浄液WSの容器に接続され、また４方バルブV₃、
フローセルモニターＭおよび３方ロータリーバルブV₄を
介してフラクションコレクターＦおよび廃液WTの容器に
接続している。SLはサンプリングループ、RCはレコーダ
ーである。

この装置を用いた遠心液々分配クロマトグラフィーは次
のような手順で行われる。比重および極性が異なり、２
相に分離する任意の溶媒を混合、静置後、重液相、軽液
相にそれぞれ分離し容器に貯える。いずれか一方の液相
（図面では重液相）を固定相SPとして分配管Ｃに充填し
た後、ローターＲを回転させ、一定の遠心加速度ｇを与
えつつ、他方の液相（図面では軽液相）を移動相MPとし
て回転軸一端の回転送液ジョイントJ₁を通して連続的に
送液する。移動相MPは遠心加速度ｇの作用により固定相
中SP中を微細な液滴となって分配管Ｃを順次通過し、回
転軸他端の回転送液ジョイントJ₂より連続的に流出す
る。遠心機外部に設置されたサンプリングループSLよ
り、送液初期の一定量の移動相MP中に導入された試料成
分は上記過程中に遠心液々分配にクロマトグラフィーに
よりそれぞれ目的成分に分離され、その後必要に応じて
フラクションコレクターＦで分画される。

固定相SPとして極性の高い重液例えばアセトニトリルエ
タノール／水（90:10V/V）混合溶媒等を使用し、移動相
MPとして極性の低い軽液例えばｎ−ヘキサン等を使用す
る場合、試料中の極性が低いものまたは鎖長の長いもの
から順次移動相とともに流出する。一方固定相の流入側
から極性が高いものまたは鎖長の短いものが順次残留す
ることになるので、移動相の送液を反転して固定相を流
入側から押出すと、極性が高いものまたは鎖長の短いも
のが順次流出する。

こうして流出する移動相中には主としてトリグリセリ
ド、ジグリセリド、および不飽和度の低い脂肪酸のFFA
が含まれ、反転により最初に流出する固定相中には鎖長
の短いFFAおよびモノグリセリドが含まれ、続いて流出
する固定相中には鎖長が長く不飽和度の高いFFAおよび
モノグリセリドが含まれる。従って最後の固定相画分を
分取すると、PUFAを高回収率で分離することができる。

〔発明の効果〕

以上の通り本発明によれば、天然油脂をリパーゼで分解
して、モノグリセリドおよび遊離脂肪酸を含む混合物を
生成させ、この混合物を遠心液々分配クロマトグラフィ
ーでPUFAのFFAおよびモノグリセドを含む画分を分取す
るようにしたので、不安定なPUFAを変性させることなく
分離することができ、またPUFAを完全にFFAに分解させ
ることなく、FFAおよびモノグリセリドの形で高収率で
分離できるため、PUFAを効率よく分離することができ
る。

〔実施例〕

以下、本発明を実施例により説明する。各例中、％は重
量％を示す。

実施例１魚油10gおよび精製水4mlを50ml容量のスクリュー管に入
れ、ムコール・ミエハイから得た酵素100ユニットを精
製水に溶かして加え、50℃の恒温槽中で毎分500回転の
速度で回転攪拌して、約48時間反応を行った。分解物を
第１図の構成を有する遠心液々分配クロマトグラフCPC
モデルLLN（三鬼エンヂニアリング（株）製）を用いて
次の条件でクロマトグラフィーによる分画を行った。

分配液としてｎ−ヘキサンおよびアセトニトリルを混合
後静置して分離した重液を固定相として850ml充填し、
軽液を移動相とした。試料として上記魚油分解物10gを5
0mlとなるように移動相に溶解した溶液を注入し、その
後移動相1500mlを注入して分画を行った。このときの回
転数は1000rpm、送液速度は10ml/分、操作温度は20℃で
ある。上記により溶出した移動相（軽液）1500mlを濃縮
して画分１とし、送液方向を反転して最初に溶出した固
定相（重液）100mlを濃縮して画分２とし、その後溶出
した固定相800mlを濃縮して画分３とした。

画分１、画分２、画分３をそれぞれメタノール／クロロ
ホルム系溶剤で溶剤抽出した後、メタノールでエステル
を合成し、ガスクロマトグラフィーにより下記測定条件
で組成分析を行った。その結果を原料油脂中からのEPA,
DHAの回収率として表１に示した。

なお画分１にはトリグリセリド、ジグリセリド、不飽和
度の低い脂肪酸のFFAが主に含まれ、画分２には鎖長の
短いFFAおよびモノグリセリドが主に含まれ、画分３に
はPUFAのFFAおよびモノグリセリドが主に含まれてい
た。また日本油化学協会制定の基準油脂分析試験法によ
る過酸化物価はほとんど変化がみられなかった。

ガスクロマトグラフィーの測定条件カラム：キャピラリークロマトグラムサーモン3000A（島津製作所製）、（φ0.24mm×50m）注入口、検出器温度:250℃ カラム温度:He;25kPa,Air;30kPa,H₂;30kPa 検出器:FID 実施例２実施例１と同様の条件でクロモバクテリウム・ビスコス
ムより得られたリパーゼを用いて反応および分画を行っ
た。その結果を表１に示した。

実施例３実施例１の条件でシュードモナス・フルオレッセンスよ
り得られたリパーゼを用いて反応および分画を行った。
その結果を表１に示した。

以上の結果より、画分３を分取することにより、PUFAを
高収率で分離できることがわかる。

比較例１実施例１で得られたムコール・ミエハイの分解物をカラ
ムクロマトグラフィーで分画した。７％含水フロリシル
800gをヘキサンに懸濁し、ガラス管（10×20cm）内に充
填した。10gの分解物をヘキサンに溶解してカラムに充
填した。ヘキサン500ml、ヘキサン／エーテル（90:10）
500ml、ヘキサン／エーテル（70:80）500ml、ヘキサン
／エーテル（50:50）500ml、メタノール／エーテル（1
0:90）500mlで分画した。1000mlを溶離し、その後500ml
ずつを分画し、画分１、２、３とした。それぞれの脂肪
酸組成を分析して表２に示した。

以上の結果より、リパーゼによる分解後に遠心液々分配
クロマトグラフィー以外の分離手段を用いてもPUFAを高
収率で分離できないことがわかる。

【図面の簡単な説明】

図面は遠心液々分配クロマトグラフィーの系統図であ
り、SPは固定相、MPは移動相、WSは洗浄液、V₁は４方ロ
ータリーバルブ、V₂は６方バルブ、V₃は４方バルブ、V₄
は３方ロータリーバルブ、SLはサンプリングループ、Ｐ
は定流量ポンプ、J₁,J₂は回転送液ジョイント、Ｒはロ
ーター、Ｃは分配管、Ｔは導管、Ｍはフローセルモニタ
ー、RCはレコーダー、Ｆはフラクションコレクターであ
る。

フロントページの続き (72)発明者布垣義明京都府長岡京市うぐいす台43 (56)参考文献特開昭51−80305（ＪＰ，Ａ) 特開昭59−62312（ＪＰ，Ａ)

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】高度不飽和脂肪酸を脂肪酸成分として含有
する天然油脂をリパーゼで分解して、モノグリセリドお
よび遊離脂肪酸を含む混合物を生成させ、この混合物を
遠心液々分配クロマトグラフィーで分画し、高度不飽和
脂肪酸の遊離脂肪酸およびモノグリセリドを含む画分を
分取することを特徴とする高度不飽和脂肪酸の分離方
法。
【請求項２】高度不飽和脂肪酸が炭素数18〜24、二重結
合の数３〜６のものである特許請求の範囲第１項記載の
分離方法。
【請求項３】リパーゼがムコール属、クロモバクテリウ
ム属、シュードモナス属、またはアスペルギルス属に属
するリパーゼ生産菌により生産されたものである特許請
求の範囲第１項または第２項記載の分離方法。
【請求項４】遠心液々分配クロマトグラフィーが２相分
離液のうち一方を固定相として遠心力により保持しつ
つ、他方を移動相として連続的に固定相内を通過させ
て、移動相内に注入された試料を連続的に分画するもの
である特許請求の範囲第１項ないし第３項のいずれかに
記載の分離方法。