JPH0789913B2

JPH0789913B2 - リパ−ゼａｍｌの製造法

Info

Publication number: JPH0789913B2
Application number: JP18473286A
Authority: JP
Inventors: 正明横江; 民生間瀬
Original assignee: 天野製薬株式会社
Priority date: 1986-08-06
Filing date: 1986-08-06
Publication date: 1995-10-04
Anticipated expiration: 2010-10-04
Also published as: JPS6339579A

Description

【発明の詳細な説明】〔発明の目的〕産業上の利用分野本発明はシュードモナス属に属しリパーゼAML生産能を
有する菌株を栄養培地に好気的に培養して培養液中にア
ルカリ領域においても界面活性剤、洗剤中で安定で活性
を示すリパーゼAMLを生産せしめることを特徴とするリ
パーゼAMLの製造法に関する。

細菌類を用いたリパーゼの製造法として、シュードモナ
ス属〔Y.Kosugi,ジャーナル・オブ・フアーメンテーシ
ヨン・テクノロジー（J.Ferment.Technol.）,49巻,968
〜980頁（1971）〕、コリネバクテリウム属〔K.Weaber,
アプライド・マイクロバイオロジー（Appl.Microb.）,2
1巻,639〜642頁（1971）〕、スタフイロコツカス属〔J.
A.Troller,アプライド・マイクロバイオロジー（Appl.M
icrob.）,20巻,480〜484頁（1970）〕、プロピオニオバ
クテリウム属〔A.Oterholm,アプライド・マイクロバイ
オロジー（Appl.Microb.）,20巻,16〜22頁（1970）〕、
アルカリゲネス属〔Y.Kokusho,アグリカルチヤル・バイ
オロジカル・ケミストリー（Agric.Biol.Chem.）,46巻
５号,1159〜1164頁（1982）〕等に属する菌を利用する
方法が知られており、特にシユードモナス属を利用する
方法に関しては多くの方法が知られている（特公昭41−
7836号，同56−28516号，同56−28517号，同57−42312
号，同57−42313号，同57−52835号，同57−59753
号）。

一方、洗剤業界では洗剤の洗浄力増強の目的から、洗剤
組成物として酵素剤（プロテアーゼ、アミラーゼ等）を
配合しているが、一般に酵素は陰イオン界面活性剤等の
洗剤組成物に対し安定性が低く、特にリパーゼにおいて
は顕著である〔E.D.WIlls,バイオケミカル・ジヤーナル
（Biochem.J.）,60巻,529頁（1955）〕。

更に、今日においても、汚こう中の油汚れの除去は困難
とされ、繊維の黄ばみの原因であるトリグリセライドの
除去は重要な課題である。

この様に洗剤組成物の阻害を受けず、洗浄条件下でも十
分にその活性を示すことの出来るリパーゼは、汚こう中
の油脂汚れの除去により、洗浄力を向上される有用な洗
剤組成物となりうる。

従来の技術リパーゼを洗剤組成物として応用し、洗浄力を増強しよ
うとする試みは古くから行われている。

リゾープス層、キヤンデイダ層、アスペルギルス層、ム
コール層及びパンクレアスの各リパーゼを検討した例
〔H.Andree,ジヤーナル・オブ・アプライド・バイオケ
ミストリー（J.Appl.Biochem.）,2巻,218〜229頁（198
0）〕ではそれ等のリパーゼが中性及び微アルカリ性で
のみ活性を示すことと、衣料用重質洗剤の主体である陰
イオン界面活性剤中で十分な活性を示すことが出来ない
ことから、洗浄力の増強はほとんど望めない。

又、アクロモバクター属、キヤンデイダ属、ムコール属
及びパンクレアスの各リパーゼへの陰イオン界面活性剤
の影響を試験した結果においても、全てのリパーゼが強
くその活性を阻害された〔国生純孝，油化学，第23巻,9
8〜104頁（1974）〕。

リパーゼを配合した洗剤による洗浄力試験〔T.Hashimot
o,油化学，第35巻，第４号,61〜67頁（1986）〕におい
ても報告があり、キヤンデイダ属、リゾープス属、シユ
ードモナス属、ムコール属及びパンクレアスの各リパー
ゼについて報告されているが、pH7での効果に比べpH10
での効果が非常に少なく、洗剤存在下アルカリ側で十分
その活性を発揮出来るリパーゼが望まれる。

発明が解決しようとする問題点本発明は、洗剤組成物によりその活性がほとんど阻害さ
れず、洗浄条件下でも十分活性を発現し、油脂汚れ等を
分解除去することで洗浄力を増強出来るリパーゼを提供
するものである。

〔発明の構成〕

問題点を解決するための手段本発明者等は、界面活性剤、洗剤に対し、アルカリ領域
においても安定性が高く、活性を十分発揮するリパーゼ
生産菌を見出すべく広く自然界からリパーゼを産生する
微生物を分離し、そのリパーゼの界面活性剤、洗剤に対
する性質を検討したところ、シユードモナス属に属する
No.924菌がその目的に合う新規なリパーゼを産生するこ
とを見い出し、本発明者等はこれをリパーゼAMLと命名
した。

このリパーゼAML生産菌No.924は以下の如き菌学的性質
を有する。

（１）形態（ａ）細胞の形及び大きさ：桿菌、約0.5μ×1.0〜2.5
μ （ｂ）多形性の有無：なし（ｃ）運動性：あり、極ベン毛（ｄ）胞子：なし（ｅ）グラム染色性：陰性（ｆ）抗酸性：陰性（２）各培地における生育状態（ａ）肉汁寒天平板培養：円形、平滑、全縁、扁平状〜やや凸円状、半透明、湿
光、無色〜淡黄茶色（ｂ）肉汁寒天斜面培養：中程度生育、糸状、扁平、半透明、無色〜淡黄茶色（ｃ）肉汁液体培養：中程度生育、一様な混濁、沈渣なし（ｄ）肉汁ゼラチン穿刺培養：ゼラチンを液化する。

（ｅ）リトマスミルク：わずかにアルカリ性、ペプトン化する。

（３）生理学的性質（ａ）硝酸塩還元性：陽性（ｂ）脱窒反応：陰性（ｃ）MRテスト：陰性（ｄ）VPテスト：陰性（ｅ）インドールの生成：陰性（ｆ）硫化水素の生成：陰性（ｇ）デンプンの加水分解：陰性（ｈ）クエン酸塩の利用:Koserの培地とChristensenの
培地で陽性。

（ｉ）無機窒素源の利用：硫酸アンモニウムと硝酸ナト
リウムを利用する。

（ｊ）色素の生成:King A培地で色素生成なし。King B
培地で淡赤茶色の水溶性色素を生成する。

（ｋ）ウレアーゼ：陰性（ｌ）オキシダーゼ：陽性（ｍ）カタラーゼ：陽性（ｎ）生育の範囲:pH5〜９で生育する。37℃で生育する
が42℃では生育しない。

（ｏ）酸素に対する態度：好気性（ｐ）Ｏ−Ｆテスト：好気条件下でグルコースから酸を
生成する。

（ｑ）糖類からの酸及びガスの生成：アラビノース、キシロース、グルコース、マンノース、
フラクトース、ガラクトース、麦芽糖、乳糖、トレハロ
ース、ソルビツト、マンニツト、イノシツト、グリセリ
ンから酸を生成するが、ガスは生成しない。デンプンか
らは酸もガスも生成しない。

以上の性質を〔Buchanan,R.E.and Gibbons,N.E.:Berge
y′s Manual of Determinative Bacteriology,8th.ed.,
Williams＆Wilkins Co.,（1974）〕、〔坂崎利一訳：医
学細菌同定の手びき（２版）、近代出版、（1974）〕等
を参考にして検索するとグラム陰性、桿菌、好気
性、極ベン毛による運動性、カタラーゼ陽性、オ
キシダーゼ陽性、好気性条件下で酸を生成することか
らシユードモナス属に分類される。従って本生産菌株を
シユードモナスsp.No.924（Pseudomonas sp.No.924）と
命名した。

本菌株は微生物工業技術研究所に微工研菌寄第8879号
（FERM−P No.8879）の受託番号で寄託されている。

本菌株を培養し、リパーゼAMLを生産するに際し使用す
る培地として、まず炭素源としては可溶性澱粉等の多糖
類、デキストリン，マルトース等の二糖類、グルコース
等の単糖類が上げられ、窒素源としてはコーンステイー
プリカー，ペプトン，肉エキス，カゼイン，アミノ酸，
酵母エキス等が上げられる。無機塩及び微量栄養源とし
てはリン酸，マグネシウム，カリウム，鉄，カルシウ
ム，亜鉛等の塩類の他ビタミン，非イオン界面活性剤，
消泡剤等の菌の生育やリパーゼAMLの生産を促進するも
のであれば必要に応じて使用出来る。培養は好気的条件
で、培養温度は菌が発育しリパーゼAMLが産生する範囲
であれば良く、好ましくは25〜40℃である。培養時間は
条件により異なるがリパーゼAMLが最も産生される時間
まで培養すれば良いが通常１〜３日程度である。リパー
ゼAMLは、主として培養液中に蓄積されるので、培養終
了後培養液より菌体及び固形分を分離し、培養ろ液を採
取する。

培養ろ液よりリパーゼAMLを得るには通常酵素精製に用
いられるあらゆる方法が使用出来る。

例えばエタノール，アセトン，イソプロピルアルコール
等の有機溶媒による処理、硫安，食塩等による塩析、透
析、限外ろ過法、イオン交換クロマトグラフイー等によ
る各種精製法を行うことが出来る。

次に、こうして得られたリパーゼAML部分精製品につい
て酵素化学的性質について述べる。

（１）各種油脂に対する作用：表２に示す如く各種油脂に良く作用する。なお各種油脂
に対するリパーゼAMLの作用条件は50℃、30分（pH 7.
0）である。

（２）脂肪酸メチルエステルに対する作用：表３に示す如く短鎖ないし長鎖に至る各種の脂肪酸に作
用出来る。なお各種脂肪酸メチルエステルに対するリパ
ーゼAMLの作用条件は40℃、30分（pH 7.0）である。

（３）作用pH: pH4〜12に至る広いpH領域で（図１に示す）作用出来
る。

（４）安定pHの範囲： pH3〜12に至る広いpH領域で（図２に示す）安定であ
る。

（５）至適温度： 50℃付近に至適温度を有し（図３に示す）70℃でも60％
以上の比活性を持つ。

（６）金属塩の影響： Feによりわずかに阻害される（表１に示す）のみであ
る。なお各種金属塩の濃度は1mMである。

（７）活性測定法：精製水1ml及び酵素液1mlを基質のオリーブ油エマルジヨ
ン3mlに加え、温度37℃で20分インキユベート後、2N硫
酸1mlを加えて反応を止め、ヘプタン−イソプロパノー
ル混液（11:4）15mlを加え遊離した脂肪酸を30秒間振盪
抽出したのち、上層5mlを分取し、指示薬としてチモー
ルブルーを用いてN/100アルコール性KOHにより滴定す
る。活性表示法は、上記条件下１分間当り１μmoleに相
当する脂肪酸を遊離する酵素量を１単位とした。

（８）界面活性剤に対する性質：図4,5に示す如くムコール層、シユードモナス属リパー
ゼが陰イオン界面活性剤（0.05％濃度）に強く阻害され
るのに比べリパーゼAMLはほとんど影響を受けない。

かつ、非イオン界面活性剤により活性が増大する傾向に
あった。

（９）洗剤に対する性質：図６に示す如く、標準使用濃度での各国の洗剤中におい
てリパーゼAMLは十分な活性を示す。

次に本発明を実施例により説明する。

実施例１可溶性澱粉２％、脱脂大豆粉２％、尿素0.3％、リン酸
二カリウム0.5％及び大豆油１％を含む液体培地50mlを5
00ml容坂口フラスコに取り、121℃、20分間滅菌した
後、シユードモナスsp.No.924を１白金耳接種し、30℃
に48時間、振巾5cm毎分130回の往復振盪培養機で培養す
る。

培養終了後、遠心分離機で培養物中の菌体及び固形分を
除き、40mlの上澄液を得た。この液のリパーゼ活性は38
0u/mlであった。

この粗リパーゼ液を５℃に冷却し、−10℃に冷却したエ
チルアルコール200mlを徐々に添加し、生じた澱粉をろ
別し、減圧下に乾燥して、26800u/gのリパーゼAML粉末3
40mgを得た。

実施例２酵母エキス0.5％、ポリペプトン1.5％、グルコース1.0
％、尿素0.5％、硫酸マグネシウム0.05％、塩化カリウ
ム0.05％及び大豆油1.0％を含む液体培地20を30容
ジヤーフアーメンターに入れ0.3％のアデカノールLG126
を添加し、121℃、20分間滅菌した後、同培地で培養し
たシユードモナスsp.No.924の培養液200mlを接種し、30
℃で通気量10／分、撹拌250rpmの条件下、48時間通気
培養した。

培養後、遠心分離機にて菌体を除去し、更にろ過により
清澄なリパーゼ液17.5を得た。このリパーゼ活性は35
8u/mlであった。

このリパーゼ液は限外ろ過膜により３に濃縮後、５℃
に冷却した。−10℃に冷却したエチルアルコール９を
徐々に添加し、生じた沈澱をろ別後、減圧下に乾燥し
て、98450u/gのリパーゼ粉末35gを得た。

実施例３コーンステイープリカー３％、酵母エキス0.3％、グル
コース1.0％、尿素0.5％、硫酸マグネシウム0.05％、塩
化カリウム0.05％及び大豆油2.0％を含む液体培地500
を800容培養槽にとり、0.3％のアデカノールLG126を
消泡剤として加え、121℃、30分間滅菌した後、同培地
で30℃、24時間培養したシユードモナスsp.No.924の培
養２を接種し、30℃で通気量200／分、撹拌240rpm
の条件下48時間通気培養した。

培養後、連続遠心機にて菌体を除去し、更にろ過により
清澄なリパーゼ液450を得た。この液のリパーゼ活性
は412u/mlであった。

更に限外ろ過膜により50に濃縮後５℃に冷却した。こ
のリパーゼ濃縮液の活性は3265u/mlであった。

−15℃に冷却したエチルアルコール150を徐々に添加
し生じた沈澱をろ別し、冷アセトンで脱水後、減圧下に
乾燥してリパーゼAML粉末857gを得た。このリパーゼAML
粉末のリパーゼ活性は112000u/gであった。

発明の効果以上の如く本発明で得られるリパーゼAMLは従来のリパ
ーゼに比べ界面活性剤、洗剤中でも安定に十分活性を発
揮し、又界面活性剤の種類によってはその活性が増大す
る。

これ等の性質を利用すれば洗剤組成物として洗浄力を増
強することが可能である。

【図面の簡単な説明】

第１図、第２図及び第３図は本発明のリパーゼAMLの至
適pH曲線、pH安定曲線及び至適温度曲線をそれぞれ示す
ものであり、第４図は本発明リパーゼAMLに及ぼす各種
界面活性剤の影響を示す図であり、第５図及び第６図
は、各種リパーゼに及ぼす陰イオン界面活性剤及び洗剤
の影響を示す図である。なお第１図において−■−は0.
1N塩酸−酢酸ナトリウム緩衝液、−□−は0.1N酢酸−酢
酸ナトリウム緩衝液、−○−は0.1Nトリス−塩酸緩衝
液、−●−は0.1Nグリシン−NaOH緩衝液をそれぞれ用い
た場合の曲線であり、又第２図において−□−は酢酸−
酢酸ナトリウム緩衝液、−○−はトリス−塩酸緩衝液、
−●−はグリシン−NaOH緩衝液をそれぞれ用いた場合の
曲線である。更に第４図においてＡはAOS（α−オレフ
インスルホン酸ナトリウムの略である。）、ＢはLAS
（直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウムの略であ
る。）、ＣはDBS（ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリ
ウム、ハード型の略である。）ＤはSDS（ドデシル硫酸
ナトリウムの略である。）Ｅはポリオキシエチレンアル
キルフエニルエーテル硫酸ナトリウム、Ｆはタウロコー
ル酸ナトリウム、Ｇはラウリルトリメチルアンモニウム
クロライド、Ｈはラウリルベタイン、ＩはトリトンＸ−
100、Ｊはスパン60、Ｋはポリオキシエチレン高級アル
コールエーテル、Ｌはポリオキシエチレンノニルフエニ
ルエーテルである。更に又第５図においてＡはAOS、Ｂ
はLAS、ＣはDBS、ＤはSDSをそれぞれ示す。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】シュードモナス属に属し、界面活性剤、洗
剤に対し、アルカリ領域において安定性が高いリパーゼ
AML生産能を有する菌株を栄養培地に培養し、リパーゼA
MLを培養液中に蓄積せしめ、これを採取することを特徴
とするアルカリ領域において安定性が高いリパーゼAML
の製造法。
【請求項２】シュードモナス属に属する菌株がシュード
モナスsp.No.924菌株である特許請求の範囲第１項記載
のリパーゼAMLの製造法。