JPH0789946B2 - 微生物によるｌ−アスコルビン酸の製造法 - Google Patents
微生物によるｌ−アスコルビン酸の製造法Info
- Publication number
- JPH0789946B2 JPH0789946B2 JP61151845A JP15184586A JPH0789946B2 JP H0789946 B2 JPH0789946 B2 JP H0789946B2 JP 61151845 A JP61151845 A JP 61151845A JP 15184586 A JP15184586 A JP 15184586A JP H0789946 B2 JPH0789946 B2 JP H0789946B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- ascorbic acid
- glucose
- strain
- glucose source
- source
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
- C12P17/04—Oxygen as only ring hetero atoms containing a five-membered hetero ring, e.g. griseofulvin, vitamin C
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/946—Microorganisms using algae
Landscapes
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 Ｌ−アスコルビン酸は重要な栄養補給物であり、そして
これはビタミンカプセルにおいて、並びにヒト及び他の
ビタミンＣ要求動物の両者のための食物中の栄養補給物
として広い用途を有する。Ｌ−アスコルビン酸は、基本
的に大量に製造される化学物質であり、そしてこれは、
ひじょうに価格不安定であり、そして市場性を有するた
めには経済的且つ能率的な生産を必要とする。従って、
Ｌ−アスコルビン酸の能率的な生産をもたらす、栄養物
の能率的転換を提供する微生物を用いる方法を開発する
ことができることに実質的な興味持たれる。
これはビタミンカプセルにおいて、並びにヒト及び他の
ビタミンＣ要求動物の両者のための食物中の栄養補給物
として広い用途を有する。Ｌ−アスコルビン酸は、基本
的に大量に製造される化学物質であり、そしてこれは、
ひじょうに価格不安定であり、そして市場性を有するた
めには経済的且つ能率的な生産を必要とする。従って、
Ｌ−アスコルビン酸の能率的な生産をもたらす、栄養物
の能率的転換を提供する微生物を用いる方法を開発する
ことができることに実質的な興味持たれる。
野生型の微生物は、少量のＬ−アスコルビン酸を産生す
るに過ぎない。Ｌ−アスコルビン酸の実質的に増強され
た製造を微生物により達成することができるかどうか
は、予測できない。消費される栄養物に対する、Ｌ−ア
スコルビン酸の増強された製造が、Ｌ−アスコルビン酸
経路に関与する酵素の増大された発現により可能である
かも知れない場合でも、微生物の生存及び代謝に対する
Ｌ−アスコルビン酸の上昇した濃度の効果は予測できな
い。従って、微生物がＬ−アスコルビン酸を産生するこ
とは知られているが、経済的に能率的な方法を達成する
ことができるという確実性はない。
るに過ぎない。Ｌ−アスコルビン酸の実質的に増強され
た製造を微生物により達成することができるかどうか
は、予測できない。消費される栄養物に対する、Ｌ−ア
スコルビン酸の増強された製造が、Ｌ−アスコルビン酸
経路に関与する酵素の増大された発現により可能である
かも知れない場合でも、微生物の生存及び代謝に対する
Ｌ−アスコルビン酸の上昇した濃度の効果は予測できな
い。従って、微生物がＬ−アスコルビン酸を産生するこ
とは知られているが、経済的に能率的な方法を達成する
ことができるという確実性はない。
Loewus,F.A.は,L−Ascorbic Acid:Metabolism、Biosynt
hesis,Function,The Biochemistry of Plants,第３巻,A
cademic Press,Inc.,77〜99ページ,1980において,L−ア
スコルビン酸の源及び生合成の総説を提供する。藻類に
おけるアスコルビン酸の製造の説明を、Vaidyaなど.,Sc
ince and Culture（1971）37:383〜384;Subbulakshmiな
ど.,Nutrition Reports International（1976）14:581
〜591;Aarunsonなど.,Arch Microbiol.（1977）112:57
〜59;Shigeokaなど.,J.Nutr.Sci.Vitaminol.（1979）2
5:299〜307;Shigeokaなど.,Agric.Biol.Chem.（1979）4
3:2053〜2058;Bayanora及びTrubachev,Prikladnaya Bio
khimiya;Mikrobiologyia（1981）17:400〜407（UDC582.
26:577.16）；及びCiferri,Microbiological Reviews
（1983）47:551〜578に見出すことができる。
hesis,Function,The Biochemistry of Plants,第３巻,A
cademic Press,Inc.,77〜99ページ,1980において,L−ア
スコルビン酸の源及び生合成の総説を提供する。藻類に
おけるアスコルビン酸の製造の説明を、Vaidyaなど.,Sc
ince and Culture（1971）37:383〜384;Subbulakshmiな
ど.,Nutrition Reports International（1976）14:581
〜591;Aarunsonなど.,Arch Microbiol.（1977）112:57
〜59;Shigeokaなど.,J.Nutr.Sci.Vitaminol.（1979）2
5:299〜307;Shigeokaなど.,Agric.Biol.Chem.（1979）4
3:2053〜2058;Bayanora及びTrubachev,Prikladnaya Bio
khimiya;Mikrobiologyia（1981）17:400〜407（UDC582.
26:577.16）；及びCiferri,Microbiological Reviews
（1983）47:551〜578に見出すことができる。
クロレラ藻類を用いるＬ−アスコルビン酸の製造のため
の改良方法を提供し、その方法においては、該クロレラ
を初期の間、中間的な細胞密度に増殖せしめ、そして制
限レベルで炭素源の逐次的又は連続的添加によって増殖
を続ける。炭素源の改良された利用性が、高められた収
率を伴って、Ｌ−アスコルビン酸の製造に関して観察さ
れる。
の改良方法を提供し、その方法においては、該クロレラ
を初期の間、中間的な細胞密度に増殖せしめ、そして制
限レベルで炭素源の逐次的又は連続的添加によって増殖
を続ける。炭素源の改良された利用性が、高められた収
率を伴って、Ｌ−アスコルビン酸の製造に関して観察さ
れる。
微生物細胞によるＬ−アスコルビン酸の能率的な製造の
ための新規な方法が提供される。その方法は、中間的な
密度に細胞を増殖するために十分である炭素源を含む発
酵器中における藻類の初期増殖を含む。炭素源は消耗し
た段階で、追加量の炭素源を逐次的に又は連続的に添加
し、その添加を停止するまで、予定したレベル以下に炭
素源の濃度を維持する。停止は、微生物によるＬ−アス
コルビン酸生産の実質的な消耗によって決定されるであ
ろう。
ための新規な方法が提供される。その方法は、中間的な
密度に細胞を増殖するために十分である炭素源を含む発
酵器中における藻類の初期増殖を含む。炭素源は消耗し
た段階で、追加量の炭素源を逐次的に又は連続的に添加
し、その添加を停止するまで、予定したレベル以下に炭
素源の濃度を維持する。停止は、微生物によるＬ−アス
コルビン酸生産の実質的な消耗によって決定されるであ
ろう。
対称の微生物を、過剰生産体（Overproducer）である株
についてランダムにスクリーンすることができる。有望
な微生物を選択し、そして物理的又は化学的突然変異誘
発物、たとえば紫外線、Ｘ線、ニトロソ尿素、硫酸ジメ
チル、等を用いて突然変異を誘発することができる。過
剰生産体及び排出体の検出をレドックス色素により有利
に決定することができる。アスコルビン酸への代謝中間
体に対する類似体又はアスコルビン酸合成の阻害剤を用
いることによって、化学的妨害の存在の中で、Ｌ−アス
コルビン酸生産を維持し又は増大することができる微生
物を選択することができる。
についてランダムにスクリーンすることができる。有望
な微生物を選択し、そして物理的又は化学的突然変異誘
発物、たとえば紫外線、Ｘ線、ニトロソ尿素、硫酸ジメ
チル、等を用いて突然変異を誘発することができる。過
剰生産体及び排出体の検出をレドックス色素により有利
に決定することができる。アスコルビン酸への代謝中間
体に対する類似体又はアスコルビン酸合成の阻害剤を用
いることによって、化学的妨害の存在の中で、Ｌ−アス
コルビン酸生産を維持し又は増大することができる微生
物を選択することができる。
上の生産体の子孫を、グラム細胞当りミリグラムにより
測定されるＬ−アルコルビン酸の改良された比生産性に
ついて選択する。次に、これらの子孫を個々のクローン
にさらに分離することができ、そして上の方法にさらに
ゆだねることができる。選択される藻類は、クロレラ、
特にクロレラピレノイドサの株である。C.ピレノイド
サ,UTEX1663株又は他の同等の株が特別な興味の対象で
ある。
測定されるＬ−アルコルビン酸の改良された比生産性に
ついて選択する。次に、これらの子孫を個々のクローン
にさらに分離することができ、そして上の方法にさらに
ゆだねることができる。選択される藻類は、クロレラ、
特にクロレラピレノイドサの株である。C.ピレノイド
サ,UTEX1663株又は他の同等の株が特別な興味の対象で
ある。
この方法を行なう場合、約0.15〜0.4g/の乾量の細胞
の初期細胞密度を提供するのに十分な量で、活発に増殖
している微生物株の培養物を栄養培地に接種する。その
培地は炭素源、種々の塩及び微量金属を含むであろう。
炭素源は通常、グルコースを含むグルコース源であろ
う。グルコース源は、グルコースに転換され得る任意の
サッカリド又はポリサッカリド、たとえばスクロース、
アミロースであることができる。使用されるグルコース
源の合計量は、代謝されるとすれば、約65〜90、より普
通には約75〜85そして好ましくは約80g/の濃度を提供
するであろう。普通、全グルコースの約15〜30％、普通
には全グルコースの約20％〜25％が初めに添加されるで
あろう。グルコースは、通常、他の添加物と共に最初に
及び発酵の過程で添加されるであろう。グルコース源
は、一般的に制限されない増殖の期間中15〜30g/の範
囲で維持されるであろう。この量は、増殖期間中グルコ
ース制限を避けるのに十分であることが見出される。
の初期細胞密度を提供するのに十分な量で、活発に増殖
している微生物株の培養物を栄養培地に接種する。その
培地は炭素源、種々の塩及び微量金属を含むであろう。
炭素源は通常、グルコースを含むグルコース源であろ
う。グルコース源は、グルコースに転換され得る任意の
サッカリド又はポリサッカリド、たとえばスクロース、
アミロースであることができる。使用されるグルコース
源の合計量は、代謝されるとすれば、約65〜90、より普
通には約75〜85そして好ましくは約80g/の濃度を提供
するであろう。普通、全グルコースの約15〜30％、普通
には全グルコースの約20％〜25％が初めに添加されるで
あろう。グルコースは、通常、他の添加物と共に最初に
及び発酵の過程で添加されるであろう。グルコース源
は、一般的に制限されない増殖の期間中15〜30g/の範
囲で維持されるであろう。この量は、増殖期間中グルコ
ース制限を避けるのに十分であることが見出される。
所望により、いくらかの添加物が最初に発酵器中に存在
し、そしてグルコース源の添加と一緒に同じ添加物の逐
次的添加によって連続的に添加されるであろう。
し、そしてグルコース源の添加と一緒に同じ添加物の逐
次的添加によって連続的に添加されるであろう。
発酵器に添加される全量と比較する場合、少しづつ添加
される量のグルコースに対して異なった割合を有するで
あろう添加物の中に、アルカリ金属のリン酸塩、すなわ
ちリン酸ナトリウム及びリン酸カリウムが、特に二塩基
性リン酸ナトリウム及び一塩基性リン酸カリウムとして
存在する。二塩基性リン酸ナトリウムの合計量は、１
当り合計約１〜2g、普通１当り合計約１〜1.5g、そし
て好ましくは１当り合計約1.3gであろう。発酵器中に
初めに存在する二塩基性リン酸ナトリウムの量は、添加
される二塩基性リン酸ナトリウムの全量の約35％〜50
％、より普通には約40％〜45％であろう。一塩基性リン
酸カリウムの全量、１当り約1.5〜3g、より普通には
１当り約２〜2.5gであろう。最初に存在する量は、一
般的に、全量の約40％〜50％、より普通には、全量の約
45％〜50％であろう。
される量のグルコースに対して異なった割合を有するで
あろう添加物の中に、アルカリ金属のリン酸塩、すなわ
ちリン酸ナトリウム及びリン酸カリウムが、特に二塩基
性リン酸ナトリウム及び一塩基性リン酸カリウムとして
存在する。二塩基性リン酸ナトリウムの合計量は、１
当り合計約１〜2g、普通１当り合計約１〜1.5g、そし
て好ましくは１当り合計約1.3gであろう。発酵器中に
初めに存在する二塩基性リン酸ナトリウムの量は、添加
される二塩基性リン酸ナトリウムの全量の約35％〜50
％、より普通には約40％〜45％であろう。一塩基性リン
酸カリウムの全量、１当り約1.5〜3g、より普通には
１当り約２〜2.5gであろう。最初に存在する量は、一
般的に、全量の約40％〜50％、より普通には、全量の約
45％〜50％であろう。
上の添加物の他に、生物学的に許容されるキレート剤を
添加する。便利には、クエン酸三ナトリウムが、１当
り約0.8〜1.2gの合計量、普通１当り約1.0gの合計量
で使用されるであろう。一塩基性リン酸ナトリウムは、
約0.8〜1g/、好ましくは約0.95〜1g/で存在するで
あろ。生物学的に許容される鉱酸は、溶液中に微量金属
を保持し、そしてまた、窒素源として普通使用されるア
ンモニアを中和するために添加される。便利には、濃硫
酸が、１当り約１〜2ml、より普通には１当り約1.2
〜1.5mlの量で使用される。金属の中で、特に生理的に
許容される塩、たとえば硫酸塩として、マグネシウムが
約0.1〜0.2g/、好ましくは約0.1〜0.15g/で存在す
るであろう。使用される鉄及び銅の量は限定される。な
ぜなばら、これらの金属は、アスコルビン酸形成を抑制
するからである。鉄（第一鉄）は、初めに約５〜7mg/
、好ましくは約5.5〜6mg/で存在し、そしてその後
のいずれの添加中にも含まれないであろう。銅は、比較
的少量、一般的にグルコース1g当り約１〜50μｇで存在
するであろう。
添加する。便利には、クエン酸三ナトリウムが、１当
り約0.8〜1.2gの合計量、普通１当り約1.0gの合計量
で使用されるであろう。一塩基性リン酸ナトリウムは、
約0.8〜1g/、好ましくは約0.95〜1g/で存在するで
あろ。生物学的に許容される鉱酸は、溶液中に微量金属
を保持し、そしてまた、窒素源として普通使用されるア
ンモニアを中和するために添加される。便利には、濃硫
酸が、１当り約１〜2ml、より普通には１当り約1.2
〜1.5mlの量で使用される。金属の中で、特に生理的に
許容される塩、たとえば硫酸塩として、マグネシウムが
約0.1〜0.2g/、好ましくは約0.1〜0.15g/で存在す
るであろう。使用される鉄及び銅の量は限定される。な
ぜなばら、これらの金属は、アスコルビン酸形成を抑制
するからである。鉄（第一鉄）は、初めに約５〜7mg/
、好ましくは約5.5〜6mg/で存在し、そしてその後
のいずれの添加中にも含まれないであろう。銅は、比較
的少量、一般的にグルコース1g当り約１〜50μｇで存在
するであろう。
次の実験の部分に記載されるであろう微量金属の溶液
は、１当り約10〜15ml、より普通には１当り約12〜
14mlで存在するであろう。グルコースに基づいて、微量
金属の溶液は0.1〜0.2ml/gグルコースで使用されるであ
ろう。
は、１当り約10〜15ml、より普通には１当り約12〜
14mlで存在するであろう。グルコースに基づいて、微量
金属の溶液は0.1〜0.2ml/gグルコースで使用されるであ
ろう。
便利には、発酵の過程の間に添加される溶液を調製す
る。この溶液は、多くの場合、次の組成物を有するであ
ろう。
る。この溶液は、多くの場合、次の組成物を有するであ
ろう。
供給される窒素は無水アンモニアによってである。これ
はまた、pH調節として使用される。培地中の実際の窒素
レベルは、培地の酸性度及び培地の緩衝能によって決定
される。
はまた、pH調節として使用される。培地中の実際の窒素
レベルは、培地の酸性度及び培地の緩衝能によって決定
される。
微量金属組成物は次の金属を有するであろう。
微量のHClを含む蒸留水中に溶解されている上の表に示
された種々の化合物の適切な量を蒸留水に添加すること
によって微量金属の原液を調製し、そしてここで最終体
積は１であり、そして濃塩酸20mlを含む。蒸留水を用
いて、成分の微量金属の適切な割合を確保する。
された種々の化合物の適切な量を蒸留水に添加すること
によって微量金属の原液を調製し、そしてここで最終体
積は１であり、そして濃塩酸20mlを含む。蒸留水を用
いて、成分の微量金属の適切な割合を確保する。
多くの塩が一又は二塩基性塩として言及されているけれ
ども、これは便宜上であり、そして必要ではないことを
理解するべきである。これらの化合物は緩衝剤として作
用し、そして従って陽子化の状態の割合は、培地のpHに
より異なるであろう。
ども、これは便宜上であり、そして必要ではないことを
理解するべきである。これらの化合物は緩衝剤として作
用し、そして従って陽子化の状態の割合は、培地のpHに
より異なるであろう。
発酵を行なう場合、二塩基性リン酸ナトリウム及び一塩
基性リン酸ナトリウムは、発酵器中に添加されるべき全
培地の約75％〜90％、普通約80％〜90％中に溶解される
であろう。
基性リン酸ナトリウムは、発酵器中に添加されるべき全
培地の約75％〜90％、普通約80％〜90％中に溶解される
であろう。
次に発酵の過程の間に少しづつ添加されるべき溶液を、
適切な割合で、個々の成分を混合することによって調製
する。グルコースは、使用されるべき水の約75％〜85
％、好ましくは約80％中に溶解されるであろう。シトレ
ート、マグネシウム及び硫酸は、使用されるべき水の約
５％〜15％、普通約10％を含む水溶性培地中に混合さ
れ、他方、リン酸塩は、使用されるべき水の約５％〜15
％、より普通には約10％中に混合され、次に使用される
べき全量水の約５％〜15％、より普通には約８％〜10％
中の微量金属の溶液が混合される。リン酸塩の一部を含
む発酵器に、第一鉄塩及び上で調製されたグルコース−
塩濃縮物の約20％を添加する。その添加は、いかなる外
来性微生物の導入をも避けるために、無菌状態で行な
う。次に、栄養培地を目的とする温度、一般的に約30゜
〜40℃の範囲、好ましくは約35℃にして、そして発酵器
に接種物を接種し、約0.15〜0.4g/の開始細胞密度を
提供する。少量の消泡剤を発酵の進行の間に添加するこ
とができる。
適切な割合で、個々の成分を混合することによって調製
する。グルコースは、使用されるべき水の約75％〜85
％、好ましくは約80％中に溶解されるであろう。シトレ
ート、マグネシウム及び硫酸は、使用されるべき水の約
５％〜15％、普通約10％を含む水溶性培地中に混合さ
れ、他方、リン酸塩は、使用されるべき水の約５％〜15
％、より普通には約10％中に混合され、次に使用される
べき全量水の約５％〜15％、より普通には約８％〜10％
中の微量金属の溶液が混合される。リン酸塩の一部を含
む発酵器に、第一鉄塩及び上で調製されたグルコース−
塩濃縮物の約20％を添加する。その添加は、いかなる外
来性微生物の導入をも避けるために、無菌状態で行な
う。次に、栄養培地を目的とする温度、一般的に約30゜
〜40℃の範囲、好ましくは約35℃にして、そして発酵器
に接種物を接種し、約0.15〜0.4g/の開始細胞密度を
提供する。少量の消泡剤を発酵の進行の間に添加するこ
とができる。
発酵の第１段階において、細胞は中間的な密度に増殖せ
しめられる。これは、普通、約0.1〜0.15/時の増殖速度
により、約35〜50時間、より普通には約40〜45時間を必
要とするであろう。約6.5〜8.0の範囲のpHを維持するた
めに、そのpHを無水アンモニアを用いることによって調
節することができる。普通、pH調節は活発な増殖の後解
除される。撹拌は普通、約200〜1000rpmで行なわれ、そ
して通気は約0.2〜0.6／分で空気により行なわれるで
あろう。初期のための最終密度は、約35〜45g/、好ま
しくは約40g/の細胞密度であるべきである。
しめられる。これは、普通、約0.1〜0.15/時の増殖速度
により、約35〜50時間、より普通には約40〜45時間を必
要とするであろう。約6.5〜8.0の範囲のpHを維持するた
めに、そのpHを無水アンモニアを用いることによって調
節することができる。普通、pH調節は活発な増殖の後解
除される。撹拌は普通、約200〜1000rpmで行なわれ、そ
して通気は約0.2〜0.6／分で空気により行なわれるで
あろう。初期のための最終密度は、約35〜45g/、好ま
しくは約40g/の細胞密度であるべきである。
グルコースの利用性を、便利な方法、たとえばグルコー
スオキシダーゼ酵素試験、HPLC、等によって上清液中に
おいてモニターする。グスコース濃度が下がる場合、全
グルコースの濃度が約30g/以下に維持されることを確
認しながら、グルコース一塩濃縮物の溶液の約20％のア
クコートを添加することによって、グルコースを補充す
ることができる。初期相において、高い細胞密度に達
し、そしてグルコースが実質的に完全に使い尽くされた
場合、その後約２〜４時間、より普通には約３時間、そ
のグルコースの消耗状態が維持される。次に、その後比
較的等い時間間隔で約0.005〜0.015gグルコース／時/g
細胞の添加速度をもたらすようにグルコースを添加する
ことができる。Ｌ−アスコルビン酸の濃度が実質的に一
定に維持され又は減少し始める時、反応を停止し、細胞
及び上清液を単離し、そしてアスコルビン酸を細胞から
分離し、そして常法に従って集める。
スオキシダーゼ酵素試験、HPLC、等によって上清液中に
おいてモニターする。グスコース濃度が下がる場合、全
グルコースの濃度が約30g/以下に維持されることを確
認しながら、グルコース一塩濃縮物の溶液の約20％のア
クコートを添加することによって、グルコースを補充す
ることができる。初期相において、高い細胞密度に達
し、そしてグルコースが実質的に完全に使い尽くされた
場合、その後約２〜４時間、より普通には約３時間、そ
のグルコースの消耗状態が維持される。次に、その後比
較的等い時間間隔で約0.005〜0.015gグルコース／時/g
細胞の添加速度をもたらすようにグルコースを添加する
ことができる。Ｌ−アスコルビン酸の濃度が実質的に一
定に維持され又は減少し始める時、反応を停止し、細胞
及び上清液を単離し、そしてアスコルビン酸を細胞から
分離し、そして常法に従って集める。
本発明によれば、Ｌ−アスコルビン酸の高い収率が、他
の天然源、たとえばローズヒップス（rose hips）から
の収量よりもはるかに高い収量が得られる。3.5％を越
えるバイオマス物質のレベルを達成することができ、そ
して4.0％及びそれよりも高いレベルも達成し得る。Ｌ
−アスコルビン酸の濃度は1.45g/を越え、そして3.3g
/又はそれよりも高くなることができる。消費される
基質に基づくモル収率は少なくとも約0.010、普通少な
くとも約0.013である。
の天然源、たとえばローズヒップス（rose hips）から
の収量よりもはるかに高い収量が得られる。3.5％を越
えるバイオマス物質のレベルを達成することができ、そ
して4.0％及びそれよりも高いレベルも達成し得る。Ｌ
−アスコルビン酸の濃度は1.45g/を越え、そして3.3g
/又はそれよりも高くなることができる。消費される
基質に基づくモル収率は少なくとも約0.010、普通少な
くとも約0.013である。
次の例は制限的でなく例示的に示されている。
実験 １の発酵器中で水0.6、二塩基性リン酸ナトリウム
0.23g及び一塩基性リン酸カリウム0.27gを殺菌した。次
に、そのリン酸塩溶液に、蒸留水5ml中硫酸第一鉄（七
水和物）11.2mg及び次のようにして調製された殺菌され
たグルコース−塩濃縮物20mlを添加した。栄養物のグル
ープをそれぞれ殺菌し、そして冷却後混合した。
0.23g及び一塩基性リン酸カリウム0.27gを殺菌した。次
に、そのリン酸塩溶液に、蒸留水5ml中硫酸第一鉄（七
水和物）11.2mg及び次のようにして調製された殺菌され
たグルコース−塩濃縮物20mlを添加した。栄養物のグル
ープをそれぞれ殺菌し、そして冷却後混合した。
グループ１ 水80ml中食品銘柄の一水和物（無水基準）グルコース56
g（80g/） グループ２ 水10ml中クエン酸三ナトリウム二水和物0.7g（1.0g/
）、無水硫酸マグネシウム（0.66g/）及び硫酸1ml
（1.4ml/） グループ３ 水10ml中一塩基性リン酸ナトリウム0.65g（0.97g/
）、一塩基性リン酸カリウム1.3g（1.9g/）及び二
塩基性リン酸ナトリウム0.68g（0.97g/） グループ４ 微量金属の溶液9.4ml温度を35℃に上昇し、撹拌を約200
rpmで始め、そして約0.3gの細胞／の濃度で、50mlの
クロレラピレノイドサUV/101−158を添加した。これら
の細胞を1985年６月27日にA.T.C.C.に寄託し、そして寄
託番号53170を得た。次の図表は発酵のための条件及び
分析結果を記載している。
g（80g/） グループ２ 水10ml中クエン酸三ナトリウム二水和物0.7g（1.0g/
）、無水硫酸マグネシウム（0.66g/）及び硫酸1ml
（1.4ml/） グループ３ 水10ml中一塩基性リン酸ナトリウム0.65g（0.97g/
）、一塩基性リン酸カリウム1.3g（1.9g/）及び二
塩基性リン酸ナトリウム0.68g（0.97g/） グループ４ 微量金属の溶液9.4ml温度を35℃に上昇し、撹拌を約200
rpmで始め、そして約0.3gの細胞／の濃度で、50mlの
クロレラピレノイドサUV/101−158を添加した。これら
の細胞を1985年６月27日にA.T.C.C.に寄託し、そして寄
託番号53170を得た。次の図表は発酵のための条件及び
分析結果を記載している。
Ｌ−アスコルビン酸を測定するために使用される方法
は、Grun及びLoewus,Analytical Biochemistry（1983）
130:191〜198によって記載されている。その方法は、7.
8×300mmの有機酸分析カラム、HPX−87（Bio−Rad Labo
ratories,リッチモンド，カリフォルニア）を用いるイ
オン交換方法である。その条件は、移動相,0.013Mの硝
酸,0.8ml/分の流速、1500psigの圧力,UV245〜254nmでの
検出である。
は、Grun及びLoewus,Analytical Biochemistry（1983）
130:191〜198によって記載されている。その方法は、7.
8×300mmの有機酸分析カラム、HPX−87（Bio−Rad Labo
ratories,リッチモンド，カリフォルニア）を用いるイ
オン交換方法である。その条件は、移動相,0.013Mの硝
酸,0.8ml/分の流速、1500psigの圧力,UV245〜254nmでの
検出である。
上の条件により、Ｌ−アスコルビン酸及びイソアスコル
ビン酸の分離が可能である。
ビン酸の分離が可能である。
１当りの細胞のグラム数を決定するために、次の方法
を使用する。バイオマスサンプル（5ml）を１つの秤量
パンに移し、そして上清液5mlを第２の秤量パンに移
す。その上清液を遠心分離する。そのパンを対流オーブ
ン（105℃で３時間）中で乾燥せしめる。デシケーター
中で冷却した後、パン内容物の重さを計る。１当りの
細胞のグラム数を（サンプル重量−上清液重量）×200
として決定する。
を使用する。バイオマスサンプル（5ml）を１つの秤量
パンに移し、そして上清液5mlを第２の秤量パンに移
す。その上清液を遠心分離する。そのパンを対流オーブ
ン（105℃で３時間）中で乾燥せしめる。デシケーター
中で冷却した後、パン内容物の重さを計る。１当りの
細胞のグラム数を（サンプル重量−上清液重量）×200
として決定する。
上の結果に基づく場合、グラム細胞当りのアスコルビン
酸のグラムに基づく比生産性を、0.04又はそれよりも高
いレベルで達成し、そして消化されるグルコースのモル
当り形成されるＬ−アスコルビン酸のモルとして定義さ
れるモル収率は少なくとも0.01又はそれよりも高い。さ
らに、そのアスコルビン酸の濃度を約1.5g/又はそれ
よりも高く上昇せしめることができる。
酸のグラムに基づく比生産性を、0.04又はそれよりも高
いレベルで達成し、そして消化されるグルコースのモル
当り形成されるＬ−アスコルビン酸のモルとして定義さ
れるモル収率は少なくとも0.01又はそれよりも高い。さ
らに、そのアスコルビン酸の濃度を約1.5g/又はそれ
よりも高く上昇せしめることができる。
アスコルビン酸の高められた収率を、グルコースの能率
的な使用及び発酵時間により達成することができること
が、上の結果から明らかである。微生物、特にクロレラ
株を発酵器中において増殖せしめることができ、そして
そこで、高レベルのＬ−アスコルビン酸を安い炭素源の
能率的な使用により得て、Ｌ−アスコルビン酸を提供す
ることができる。
的な使用及び発酵時間により達成することができること
が、上の結果から明らかである。微生物、特にクロレラ
株を発酵器中において増殖せしめることができ、そして
そこで、高レベルのＬ−アスコルビン酸を安い炭素源の
能率的な使用により得て、Ｌ−アスコルビン酸を提供す
ることができる。
前述の発明は、明確に理解するために例示的及び例的に
いくらか詳細に記載されているけれども、特許請求の範
囲内で変法及び変更を行なうことができる。
いくらか詳細に記載されているけれども、特許請求の範
囲内で変法及び変更を行なうことができる。
Claims (9)
- 【請求項１】Ｌ−アスコルビン酸の改良された製造方法
であって、 高Ｌ−アスコルビン酸生産性クロレラ（Chlorella）株
をグルコース源並びに低レベルの鉄及び銅を含む栄養培
地中で、該細胞が35〜45g/の密度に増殖し、そしてグ
ルコース源を実質的に使い尽くすのに十分な時間増殖せ
しめ； 該グルコース源の消耗した状態を短時間維持し； そして 0.005〜0.015gグルコース／時/g細胞の速度でグルコー
ス源を添加し、目的とするレベルのＬ−アスコルビン酸
が得られるまで0.1g/よりも低い濃度を維持する； ことを含んで成る方法。 - 【請求項２】前記株が、親株を突然変異誘発し、そして
消費されたグルコースに対する形成されたアスコルビン
酸の改良された割合について選択することによって得ら
れたものである特許請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項３】前記突然変異誘発がUV照射によって行なわ
れたものである特許請求の範囲第２項記載の方法。 - 【請求項４】前記グルコース源の消耗した状態を約２〜
４時間の期間維持する特許請求の範囲第１項記載の方
法。 - 【請求項５】前記株がA.T.C.C.寄託番号53170を有する
株である特許請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項６】グルコース源に基づくモル収率が少なくと
も約0.01である特許請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項７】Ｌ−アスコルビン酸の改良された製造方法
であって、 増殖制限しないために十分な量のグルコース源を含み、
そしてＬ−アスコルビン酸の生産のために非抑制的レベ
ルの鉄及び銅を有する栄養培地中において高Ｌ−アスコ
ルビン酸生産性突然変異誘発されたクロレラピレノイド
サ（Chlorella pyrenoidosa）株を35〜45g/の密度に
増殖せしめ； グルコース源の実質的な消耗の後、該グルコース源の消
耗状態を約４時間維持し； 0.005〜0.015gグルコース／時/g細胞の速度でグルコー
ス源を添加し、目的とするレベルのＬ−アスコルビン酸
が得られるまで0.1g/よりも低いグルコース源の濃度
を維持し； 該細胞を収得し、そして他の細胞性物質を実質的に含ま
ないＬ−アスコルビン酸を単離することを含んで成る方
法。 - 【請求項８】前記株がA.T.C.C.寄託番号53170を有する
株である特許請求の範囲第７項記載の方法。 - 【請求項９】前記株がA.T.C.C.寄託番号53170を有する
クロレラピレノイドサ（Chlorella pyrenoidosa）株で
ある特許請求の範囲第８項記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US750828 | 1985-07-01 | ||
| US06/750,828 US5001059A (en) | 1985-07-01 | 1985-07-01 | L-ascorbic acid production in microorganisms |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7077857A Division JP2690469B2 (ja) | 1985-07-01 | 1995-04-03 | Ｌ−アスコルビン酸含有バイオマス |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6229994A JPS6229994A (ja) | 1987-02-07 |
| JPH0789946B2 true JPH0789946B2 (ja) | 1995-10-04 |
Family
ID=25019329
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61151845A Expired - Fee Related JPH0789946B2 (ja) | 1985-07-01 | 1986-06-30 | 微生物によるｌ−アスコルビン酸の製造法 |
| JP7077857A Expired - Fee Related JP2690469B2 (ja) | 1985-07-01 | 1995-04-03 | Ｌ−アスコルビン酸含有バイオマス |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7077857A Expired - Fee Related JP2690469B2 (ja) | 1985-07-01 | 1995-04-03 | Ｌ−アスコルビン酸含有バイオマス |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5001059A (ja) |
| EP (1) | EP0207763A3 (ja) |
| JP (2) | JPH0789946B2 (ja) |
| CN (1) | CN1029990C (ja) |
| CA (1) | CA1318870C (ja) |
Families Citing this family (29)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5521090A (en) * | 1985-07-01 | 1996-05-28 | Bio-Technical Resources | L-ascorbic acid containing biomass of chlorella pyrenoidosa |
| US5900370A (en) * | 1985-07-01 | 1999-05-04 | Bio-Technical Resources | Process for the production of ascorbic acid with prototheca |
| US5792631A (en) * | 1985-07-01 | 1998-08-11 | Dcv, Inc. | Microbial process for the production of ascorbic acid using Chlorella protothecoides |
| ATE312193T1 (de) * | 1990-09-17 | 2005-12-15 | Dsm Ip Assets Bv | Microbiologische herstellung von l-ascorbinsäure |
| JPH0646834A (ja) * | 1992-03-18 | 1994-02-22 | Bio Technical Resources Lp | Ｌ−アスコルビン酸を高めたバイオマス及びその製造 |
| CN1083110A (zh) * | 1992-03-18 | 1994-03-02 | 生物技术资源L.P. | L-抗坏血酸的微生物生产法 |
| ATE200913T1 (de) * | 1994-02-10 | 2001-05-15 | Dcv Inc | Herstellung von l - ascorbinsäure in mikroorganismen |
| US5817490A (en) * | 1996-05-17 | 1998-10-06 | Eastman Chemical Company | Enzymatic process for the manufacture of ascorbic acid 2-keto-L-gulonic acid and esters of 2-keto-L-gulonic acid |
| ATE349547T1 (de) * | 2002-09-27 | 2007-01-15 | Dsm Ip Assets Bv | Mikrobielle herstellung von vitamin c |
| JP2010110216A (ja) * | 2007-02-20 | 2010-05-20 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸または核酸の製造方法 |
| US20090004715A1 (en) | 2007-06-01 | 2009-01-01 | Solazyme, Inc. | Glycerol Feedstock Utilization for Oil-Based Fuel Manufacturing |
| CA2720828C (en) | 2008-04-09 | 2017-03-21 | Solazyme, Inc. | Direct chemical modification of microbial biomass and microbial oils |
| US20100297323A1 (en) * | 2008-10-14 | 2010-11-25 | Solazyme, Inc. | Gluten-free Foods Containing Microalgae |
| US20160324167A1 (en) | 2008-10-14 | 2016-11-10 | Terravia Holdings, Inc. | Novel microalgal food compositions |
| US20100297296A1 (en) * | 2008-10-14 | 2010-11-25 | Solazyme, Inc. | Healthier Baked Goods Containing Microalgae |
| US20100303989A1 (en) * | 2008-10-14 | 2010-12-02 | Solazyme, Inc. | Microalgal Flour |
| AU2009319722B2 (en) | 2008-11-28 | 2016-08-04 | Corbion Biotech, Inc. | Production of tailored oils in heterotrophic microorganisms |
| US8592188B2 (en) | 2010-05-28 | 2013-11-26 | Solazyme, Inc. | Tailored oils produced from recombinant heterotrophic microorganisms |
| EP2635663B1 (en) | 2010-11-03 | 2019-05-08 | Corbion Biotech, Inc. | Microbial oils with lowered pour points, dielectric fluids produced therefrom, and related methods |
| KR101964965B1 (ko) | 2011-02-02 | 2019-04-03 | 테라비아 홀딩스 인코포레이티드 | 재조합 유지성 미생물로부터 생산된 맞춤 오일 |
| MX339607B (es) | 2011-05-06 | 2016-05-31 | Solazyme Inc | Microorganismos geneticamente modificados que metabolizan xilosa. |
| US8945908B2 (en) | 2012-04-18 | 2015-02-03 | Solazyme, Inc. | Tailored oils |
| US9719114B2 (en) | 2012-04-18 | 2017-08-01 | Terravia Holdings, Inc. | Tailored oils |
| US10098371B2 (en) | 2013-01-28 | 2018-10-16 | Solazyme Roquette Nutritionals, LLC | Microalgal flour |
| EP2993993A2 (en) | 2013-04-26 | 2016-03-16 | Solazyme, Inc. | Low polyunsaturated fatty acid oils and uses thereof |
| FR3009619B1 (fr) | 2013-08-07 | 2017-12-29 | Roquette Freres | Compositions de biomasse de microalgues riches en proteines de qualite sensorielle optimisee |
| MX369685B (es) | 2013-10-04 | 2019-11-19 | Terravia Holdings Inc | Aceites adaptables. |
| WO2015149026A1 (en) | 2014-03-28 | 2015-10-01 | Solazyme, Inc. | Lauric ester compositions |
| US9969990B2 (en) | 2014-07-10 | 2018-05-15 | Corbion Biotech, Inc. | Ketoacyl ACP synthase genes and uses thereof |
-
1985
- 1985-07-01 US US06/750,828 patent/US5001059A/en not_active Expired - Fee Related
-
1986
- 1986-06-27 EP EP86305019A patent/EP0207763A3/en not_active Withdrawn
- 1986-06-27 CA CA000512672A patent/CA1318870C/en not_active Expired - Fee Related
- 1986-06-30 JP JP61151845A patent/JPH0789946B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1986-06-30 CN CN86104477.0A patent/CN1029990C/zh not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-04-03 JP JP7077857A patent/JP2690469B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN86104477A (zh) | 1987-04-29 |
| US5001059A (en) | 1991-03-19 |
| JPS6229994A (ja) | 1987-02-07 |
| JP2690469B2 (ja) | 1997-12-10 |
| CA1318870C (en) | 1993-06-08 |
| EP0207763A3 (en) | 1988-10-05 |
| JPH08116964A (ja) | 1996-05-14 |
| EP0207763A2 (en) | 1987-01-07 |
| CN1029990C (zh) | 1995-10-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPH0789946B2 (ja) | 微生物によるｌ−アスコルビン酸の製造法 | |
| US5900370A (en) | Process for the production of ascorbic acid with prototheca | |
| US5792631A (en) | Microbial process for the production of ascorbic acid using Chlorella protothecoides | |
| EP0205215B1 (en) | Process for the preparation of 2-arylpropionic acids | |
| US5521090A (en) | L-ascorbic acid containing biomass of chlorella pyrenoidosa | |
| CS277658B6 (en) | Process for preparing 6-hydroxynicotinic acid | |
| Klein et al. | Cellular localization of acetyl-coenzyme A synthetase in yeast | |
| EP0759088B1 (en) | L-ascorbic acid production in microorganisms | |
| JPS61500201A (ja) | アスコルビン酸の生物転化による製造 | |
| CA2091918C (en) | L-ascorbic acid production in microorganisms | |
| US6342377B1 (en) | Microorganisms producing 5-aminolevulinic acid and processes for producing 5-aminolevulinic acid by using the same | |
| HU191129B (en) | Process for production of riboflavin | |
| JP2005518780A (ja) | シュードモン酸生産のための代謝的制御発酵方法 | |
| CS220315B2 (en) | Method of producing bacterial cells | |
| WO1993019193A1 (en) | L-ascorbic acid enhanced biomass and its production | |
| EP0405691B1 (en) | A process for the preparation of a S-2,2-R1,R2-1,3-dioxolane-4-methanol | |
| Shankar et al. | EFFECT OF METALLIC IONS ON THE GROWTH, MORPHOLOGY, AND METABOLISM OF CLOSTRIDIUM PERFRINGENS: II. Cobalt | |
| US4677068A (en) | Process for obtaining cholesterol esterase | |
| KR890000537B1 (ko) | 미생물에 의한 5'-구아닐산의 제조방법 | |
| KR960004035B1 (ko) | 세팔로스포린 c를 생산하는 미생물 및 이를 이용한 세팔로스포린 c의 제조방법 | |
| JPH01148193A (ja) | ５−アミノレブリン酸の製造法 | |
| JPH066523B2 (ja) | 新規微生物 | |
| US5045465A (en) | Fermentation process for creatinine iminohydrolase | |
| JPS5817589B2 (ja) | コウボノセイゾウホウ | |
| JPS6174591A (ja) | アデノシン三リン酸の製造方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |