JPH0795950B2 - カルボキシペプチダーゼの製造方法 - Google Patents
カルボキシペプチダーゼの製造方法Info
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- JPH0795950B2 JPH0795950B2 JP62081377A JP8137787A JPH0795950B2 JP H0795950 B2 JPH0795950 B2 JP H0795950B2 JP 62081377 A JP62081377 A JP 62081377A JP 8137787 A JP8137787 A JP 8137787A JP H0795950 B2 JPH0795950 B2 JP H0795950B2
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- paecilomyces
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- carboxypeptidase
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はカルボキシペプチダーゼ産性能を有するパエシ
ロマイセス属に属する糸状菌からカルボキシペプチダー
ゼを製造する方法に関する。カルボキシペプチダーゼ
は，ペプチドおよび蛋白質をカルボキシル基末端より順
次遊離させる性質をもつ酵素である。この酵素は，単独
又はプロティナーゼ等との併用により食品，消化剤等の
医薬品への利用，工業的にはアミノ酸混合物製造への利
用，生化学試薬として蛋白質のアミノ酸配列の決定への
利用，更に，苦味ペプチドの除去への利用など，ますま
す重要な酵素となっている。
ロマイセス属に属する糸状菌からカルボキシペプチダー
ゼを製造する方法に関する。カルボキシペプチダーゼ
は，ペプチドおよび蛋白質をカルボキシル基末端より順
次遊離させる性質をもつ酵素である。この酵素は，単独
又はプロティナーゼ等との併用により食品，消化剤等の
医薬品への利用，工業的にはアミノ酸混合物製造への利
用，生化学試薬として蛋白質のアミノ酸配列の決定への
利用，更に，苦味ペプチドの除去への利用など，ますま
す重要な酵素となっている。
（従来の技術） 従来，カルボキシペプチダーゼとしては，例えば，牛の
膵臓より抽出されたカルボキシペプチダーゼＡ（メソッ
ズ・イン・エンザイモロジーMethods in Enzymology 19
巻475頁），豚の膵臓より抽出されたカルボキシペプチ
ダーゼＢ（メソッズ・イン・エンザイモロジーMethods
in Enzymology 19巻504頁），また，植物においては柑
橘類の果皮のカルボキシペプチダーゼＣ（ネイチャーNa
ture（London）201巻613頁1964年），柑橘類の葉のカル
ボキシペプチダーゼ（ホッペーザイラーズ・ツアイトシ
ュリフト・フュール・フィジオロギッシュ・ケミストリ
ーHoppe−Seylers Z.Physiol.Chem.352巻,1524頁,1971
年），インゲンマメ葉の酵素（ジャーナル・オブ・バイ
オロジカル・ケミストリーJ.Biol.Chem.247巻,5573頁,1
972年），発芽大麦の酵素（ヨーロピアン・ジャーナル
・オブ・バイオケミストリーEur.J.Biochem.7巻,193頁,
1969年），発芽小麦の酵素（プラント・フィジオロジー
Plant Physiol.58巻,516頁,1976年），発芽綿実の酵素
（ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリーJ.
Biol.Chem.247巻,5034頁,5041頁,1972年），トマトの酵
素（アグリカルチュラル・バイオロジカル・ケミストリ
ーAgric・Biol.Chem.38巻,1901頁,1974年），スイカの
酵素（アグリカルチュラル・バイオロジカル・ケミスト
リーAgric.Biol.Chem.38巻,1891頁,1974年）及びブロメ
ライン粉末中の酵素（ジャーナル・オブ・バイオケミス
トリーJ.Biochemistry 75巻,881頁,1974年）が知られて
いる。
膵臓より抽出されたカルボキシペプチダーゼＡ（メソッ
ズ・イン・エンザイモロジーMethods in Enzymology 19
巻475頁），豚の膵臓より抽出されたカルボキシペプチ
ダーゼＢ（メソッズ・イン・エンザイモロジーMethods
in Enzymology 19巻504頁），また，植物においては柑
橘類の果皮のカルボキシペプチダーゼＣ（ネイチャーNa
ture（London）201巻613頁1964年），柑橘類の葉のカル
ボキシペプチダーゼ（ホッペーザイラーズ・ツアイトシ
ュリフト・フュール・フィジオロギッシュ・ケミストリ
ーHoppe−Seylers Z.Physiol.Chem.352巻,1524頁,1971
年），インゲンマメ葉の酵素（ジャーナル・オブ・バイ
オロジカル・ケミストリーJ.Biol.Chem.247巻,5573頁,1
972年），発芽大麦の酵素（ヨーロピアン・ジャーナル
・オブ・バイオケミストリーEur.J.Biochem.7巻,193頁,
1969年），発芽小麦の酵素（プラント・フィジオロジー
Plant Physiol.58巻,516頁,1976年），発芽綿実の酵素
（ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリーJ.
Biol.Chem.247巻,5034頁,5041頁,1972年），トマトの酵
素（アグリカルチュラル・バイオロジカル・ケミストリ
ーAgric・Biol.Chem.38巻,1901頁,1974年），スイカの
酵素（アグリカルチュラル・バイオロジカル・ケミスト
リーAgric.Biol.Chem.38巻,1891頁,1974年）及びブロメ
ライン粉末中の酵素（ジャーナル・オブ・バイオケミス
トリーJ.Biochemistry 75巻,881頁,1974年）が知られて
いる。
しかしながら，上述せるカルボキシペプチダーゼは，そ
の原料が資源的に工業的規模の生産には適していないた
め，資源的に問題のない糸状菌からカルボキシペプチダ
ーゼを得ることがなされている。例えば，一島等による
アスペルギルス・サイトイ（Aspergillus saitoi）の酵
素（ビオキミカ・ビオフィジカ・アクタBiochim.Biophy
s.Acta 258巻,274頁,1972年），中台等によるアスペル
ギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）の酵素（アグ
リカルチュラル・バイオロジカル・ケミストリーAgric.
Biol.Chem.36巻,1343頁,1474兵知,1481頁,1972年,37巻,
1237頁,1973年），森原等によるアスペルギルス属（Asp
ergillus）の酵素（特開昭47−25382号公報），横山等
によるペニシリウム属（Penicillium）の酵素（特開昭4
8−35084号公報），熊谷等によるアスペルギルス属（As
pergillus）の酵素（特開昭51−95182号公報），ホフマ
ン等によるペニシリウム・ジャンチネラム（Penicilliu
m janthinellum）のペニシロカルボキシペプチダーゼＳ
−１とペニシロカルボキシペプチダーゼＳ−２（メソッ
ズ・イン・エンザイモロジーMethods in Enzymology 45
巻,587頁）が知られている。
の原料が資源的に工業的規模の生産には適していないた
め，資源的に問題のない糸状菌からカルボキシペプチダ
ーゼを得ることがなされている。例えば，一島等による
アスペルギルス・サイトイ（Aspergillus saitoi）の酵
素（ビオキミカ・ビオフィジカ・アクタBiochim.Biophy
s.Acta 258巻,274頁,1972年），中台等によるアスペル
ギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）の酵素（アグ
リカルチュラル・バイオロジカル・ケミストリーAgric.
Biol.Chem.36巻,1343頁,1474兵知,1481頁,1972年,37巻,
1237頁,1973年），森原等によるアスペルギルス属（Asp
ergillus）の酵素（特開昭47−25382号公報），横山等
によるペニシリウム属（Penicillium）の酵素（特開昭4
8−35084号公報），熊谷等によるアスペルギルス属（As
pergillus）の酵素（特開昭51−95182号公報），ホフマ
ン等によるペニシリウム・ジャンチネラム（Penicilliu
m janthinellum）のペニシロカルボキシペプチダーゼＳ
−１とペニシロカルボキシペプチダーゼＳ−２（メソッ
ズ・イン・エンザイモロジーMethods in Enzymology 45
巻,587頁）が知られている。
（発明の目的） 本発明はカルボキシペプチダーゼ産性能を有するパエシ
ロマイセス総に属する糸状菌からカルボキシペプチダー
ゼを製造する方法を提供することを目的とする。
ロマイセス総に属する糸状菌からカルボキシペプチダー
ゼを製造する方法を提供することを目的とする。
（目的を達成するための手段） 本願出願人は，種々の糸状菌についてスクリーニングを
した結果，パエシロマイセス属（Paecilomyces）に属す
る糸状菌が新規なカルボキシペプチダーゼを生産するこ
とを見い出しついに本発明を完成したものである。
した結果，パエシロマイセス属（Paecilomyces）に属す
る糸状菌が新規なカルボキシペプチダーゼを生産するこ
とを見い出しついに本発明を完成したものである。
即ち、本発明は、カルボキシペプチダーゼ産性能を有す
るパエシロマイセス属に属する糸状菌からカルボキシペ
プチダーゼを製造する方法を要旨とするものである。
るパエシロマイセス属に属する糸状菌からカルボキシペ
プチダーゼを製造する方法を要旨とするものである。
以下，詳述する。
本発明に利用できるパエシロマイセス属に属する糸状菌
としては，例えば，パエシロマイセス・カルネウス（Pa
ecilomyces carneus），パエシロマイセス・エレガンス
（Paecilomyces elegans），パエシロマイセス・ファリ
ノサス（Paecilomyces farinosus），パエシロマイセス
・フモソーロゼウス（Paecilomyces fumosoroseus），
パエシロマイセス・イザリオイデス（Paecilomyces isa
rioides），パエシロマイセス・ジャパニクス（Paecilo
myces javanicus），パエシロマイセス・マルクアンデ
ィ（paecilomyces marquandii），パエシロマイセス・
パリオティ（Paecilomyces variotii），パエシロマイ
セス・バシリスポラス（Paecilomyces bacillisporu
s），パエシロマイセス・カナデンシス（Paecilomyces
canadensis），パエシロマイセス・クラビスポリス（Pa
ecilomyces clavisporis），パエシロマイセス・クレメ
オーロセイ（Paecilomyces cremeo−rosei），パエシロ
マイセス・ダクチルエチロモルフィス（Paecilomyces d
actylethromorphis），パエシロマイセス・フシスポラ
ス（paecilomyces fusisporus），パエシロマイセス・
グリスオビリディス（Paecilomyces griseoviridis），
パエシロマイセス・フミコラ（Paecilomyces humicol
a），パエシニロマイセス・インフラツス）（Paecilomy
ces inflatus），パエシロマイセス・バリオティ・バラ
イアティ・アンティビオティクス（Paecilomyces vario
ti var.antibioticus），パエシロマイセス・バリオテ
ィ・バライアティ・ブランネルオルム（Paecilomyces v
arioti var.brrunneolum），パエシロマイセス・ビリデ
ス（Paecilomyces viridis），パエシロマイセス・リラ
シネス（Paecilomyces lilacinus），パエシロマイセス
・オクラセウス（Paecilomyces ochraceus），パエシロ
マイセス・ペルシシヌス（Paecilomyces persicinu
s），パエシロマイセス・ロセオルス（Paecilomyces ro
seolus），パエシロマイセス・ストリアティスポラス
（Paecilomyces striatisporus），パエシロマイセス・
サブグロボサス（Paecilomyces subglobosus），パエシ
ロマイセス・テヌイペス（Paecilomyces tenuipes），
パエシロマイセス・テリコラ（Paecilomyces terricol
a），パエシロマイセス・バリアビリス（Paecilomyces
variabilis），パエシロマイセス・マンドシュリクム
（Pacilomyces mandshuricum）などが挙げられるが，糸
状菌パエシロマイセス属に属するものであればその変種
や変異種に限ることなく利用でき，カルボキシペプチダ
ーゼの生産能の点でパエシロマイセス・カルネウス（Pa
ecilomyces carneus）が好ましい。
としては，例えば，パエシロマイセス・カルネウス（Pa
ecilomyces carneus），パエシロマイセス・エレガンス
（Paecilomyces elegans），パエシロマイセス・ファリ
ノサス（Paecilomyces farinosus），パエシロマイセス
・フモソーロゼウス（Paecilomyces fumosoroseus），
パエシロマイセス・イザリオイデス（Paecilomyces isa
rioides），パエシロマイセス・ジャパニクス（Paecilo
myces javanicus），パエシロマイセス・マルクアンデ
ィ（paecilomyces marquandii），パエシロマイセス・
パリオティ（Paecilomyces variotii），パエシロマイ
セス・バシリスポラス（Paecilomyces bacillisporu
s），パエシロマイセス・カナデンシス（Paecilomyces
canadensis），パエシロマイセス・クラビスポリス（Pa
ecilomyces clavisporis），パエシロマイセス・クレメ
オーロセイ（Paecilomyces cremeo−rosei），パエシロ
マイセス・ダクチルエチロモルフィス（Paecilomyces d
actylethromorphis），パエシロマイセス・フシスポラ
ス（paecilomyces fusisporus），パエシロマイセス・
グリスオビリディス（Paecilomyces griseoviridis），
パエシロマイセス・フミコラ（Paecilomyces humicol
a），パエシニロマイセス・インフラツス）（Paecilomy
ces inflatus），パエシロマイセス・バリオティ・バラ
イアティ・アンティビオティクス（Paecilomyces vario
ti var.antibioticus），パエシロマイセス・バリオテ
ィ・バライアティ・ブランネルオルム（Paecilomyces v
arioti var.brrunneolum），パエシロマイセス・ビリデ
ス（Paecilomyces viridis），パエシロマイセス・リラ
シネス（Paecilomyces lilacinus），パエシロマイセス
・オクラセウス（Paecilomyces ochraceus），パエシロ
マイセス・ペルシシヌス（Paecilomyces persicinu
s），パエシロマイセス・ロセオルス（Paecilomyces ro
seolus），パエシロマイセス・ストリアティスポラス
（Paecilomyces striatisporus），パエシロマイセス・
サブグロボサス（Paecilomyces subglobosus），パエシ
ロマイセス・テヌイペス（Paecilomyces tenuipes），
パエシロマイセス・テリコラ（Paecilomyces terricol
a），パエシロマイセス・バリアビリス（Paecilomyces
variabilis），パエシロマイセス・マンドシュリクム
（Pacilomyces mandshuricum）などが挙げられるが，糸
状菌パエシロマイセス属に属するものであればその変種
や変異種に限ることなく利用でき，カルボキシペプチダ
ーゼの生産能の点でパエシロマイセス・カルネウス（Pa
ecilomyces carneus）が好ましい。
また，カルボキシペプチダーゼは，大量に得る上で，上
記糸状菌を培養して得るが，その培養方法としては，固
体培養であっても液体培養であってもよく，固体培養を
行なう場合には，適当な固体培値の原料，例えば，小麦
▲麸▼，脱脂大豆，米糠，菜種粕，小麦，米等から単独
もしくは複数併用して適宜選択すればよく，必要に応じ
て適当な栄養源を添加してもよいものである。この原料
に水を加えて蒸気加圧殺菌後放冷し，これに糸状菌を接
種して培養を行なう。培養条件としては，糸状菌の増殖
可能な温度で15〜35℃，好ましくは,20〜25℃付近がよ
く，培養日数は３〜10日間でカルボキシペプチダーゼ生
産能が最大に達した時に培養を終了する。また，液体培
養を行なう場合には，適当な炭素源，窒素源，冷えば，
小麦▲麸▼，脱脂大豆，米糠，菜種粕，澱粉，ブドウ糖
等を単独もしくは複数併用して適宜選択したものを含有
し，さらに糸状菌の生育に必要な諸成分，冷えば，リン
酸塩などの無機塩，医療金属塩を含有した培地に水を加
えて，蒸気加圧殺菌後放冷し，これに糸状菌を接種して
培養を行なう。培養条件としては，使用菌や培地によ
り，カルボキシペプチダーゼ生産能が最大になるように
調整され，一般に，倍地のpHは2.0〜6.0,培養温度は15
〜35℃で,3〜10日間培養を行なうのが好ましく，カルボ
キシペプチダーゼ生産能が最大に達した時に培養を終了
する。尚，液体培養は，静置，振盪，撹拌，通気培養な
どいずれの培養法を用いてもよい。
記糸状菌を培養して得るが，その培養方法としては，固
体培養であっても液体培養であってもよく，固体培養を
行なう場合には，適当な固体培値の原料，例えば，小麦
▲麸▼，脱脂大豆，米糠，菜種粕，小麦，米等から単独
もしくは複数併用して適宜選択すればよく，必要に応じ
て適当な栄養源を添加してもよいものである。この原料
に水を加えて蒸気加圧殺菌後放冷し，これに糸状菌を接
種して培養を行なう。培養条件としては，糸状菌の増殖
可能な温度で15〜35℃，好ましくは,20〜25℃付近がよ
く，培養日数は３〜10日間でカルボキシペプチダーゼ生
産能が最大に達した時に培養を終了する。また，液体培
養を行なう場合には，適当な炭素源，窒素源，冷えば，
小麦▲麸▼，脱脂大豆，米糠，菜種粕，澱粉，ブドウ糖
等を単独もしくは複数併用して適宜選択したものを含有
し，さらに糸状菌の生育に必要な諸成分，冷えば，リン
酸塩などの無機塩，医療金属塩を含有した培地に水を加
えて，蒸気加圧殺菌後放冷し，これに糸状菌を接種して
培養を行なう。培養条件としては，使用菌や培地によ
り，カルボキシペプチダーゼ生産能が最大になるように
調整され，一般に，倍地のpHは2.0〜6.0,培養温度は15
〜35℃で,3〜10日間培養を行なうのが好ましく，カルボ
キシペプチダーゼ生産能が最大に達した時に培養を終了
する。尚，液体培養は，静置，振盪，撹拌，通気培養な
どいずれの培養法を用いてもよい。
更に，固体培養をしたものでは，培養物に，冷えば，水
又は適当な塩溶液，緩衝液等を加えて抽出した後過等
によって処理した溶液を粗酵素液とする。液体培養をし
たものは，培養物を過等によって処理した溶液を粗酵
素液とすればよい。この粗酵素液は有機溶剤等を添加す
ることにより酵素が沈澱の形となり，さらに凍結乾燥等
により粗酵素標品の形とすることもできる。このように
して得た粗酵素液又は粗酵素標品は，限外過等による
濃縮，透析膜等を用いる透析，硫酸アンモニウム，塩化
ナトリウム等による塩析，各種のイオン交換物質による
吸着および溶出，分子量の差により分けるゲル過など
によって精製することができる。尚，精製法は単独もし
くは併用してもよい。
又は適当な塩溶液，緩衝液等を加えて抽出した後過等
によって処理した溶液を粗酵素液とする。液体培養をし
たものは，培養物を過等によって処理した溶液を粗酵
素液とすればよい。この粗酵素液は有機溶剤等を添加す
ることにより酵素が沈澱の形となり，さらに凍結乾燥等
により粗酵素標品の形とすることもできる。このように
して得た粗酵素液又は粗酵素標品は，限外過等による
濃縮，透析膜等を用いる透析，硫酸アンモニウム，塩化
ナトリウム等による塩析，各種のイオン交換物質による
吸着および溶出，分子量の差により分けるゲル過など
によって精製することができる。尚，精製法は単独もし
くは併用してもよい。
次に，このようにして得られたカルボキシペプチダーゼ
（以下本酵素と称す。）の性質について述べる。尚，本
酵素は，精製によってメイン部分である低分子型とマイ
ナー部分である高分子型の２種類の酵素が存在すること
が明らかになった。以下の性質は，低分子型の酵素につ
いて述べたものである。
（以下本酵素と称す。）の性質について述べる。尚，本
酵素は，精製によってメイン部分である低分子型とマイ
ナー部分である高分子型の２種類の酵素が存在すること
が明らかになった。以下の性質は，低分子型の酵素につ
いて述べたものである。
（１） 酵素活性の測定 測定条件により適当に希釈した酵素液0.5mlに基質とし
てカルボベンゾキシ−グルタミル−チロシンを1/20M酢
酸ソーダ−塩酸緩衝液（pH3.0）に10-3Mとなるように溶
解した基質溶液0.5mlを加え,30℃で20分間反応させる。
その後，ニンヒドリン試薬1.0mlを加え反応を停止させ
る。更に,1/2Mクエン酸ソーダ−クエン酸緩衝液（pH5.
0）を3.0mlを加え,100℃で15分間加熱し，発色させた後
氷水中で急冷した後，分光光度計を用いて,570nmの波長
で吸光度を測定した。対照は酵素液にニンヒドリン試薬
を加え，その後基質を加え，以後同様の操作をして吸光
度を測定した。ニンヒドリン試薬は，メチルセロソルブ
118mlに1/100M青酸カリ2mlを加え，更にニンヒドリン1g
を溶解させ調整したものを用いた。基質から遊離するア
ミノ酸量の算定標準として各測定毎に10-4Mチロシン溶
液1.0mlにニンヒドリン試薬1.0mlを加え，以後同様の操
作をして吸光度測定した。酵素活性単位は，上記条件で
１秒間に１モルの遊離チロシンを精製することのできる
酵素を１酵素活性単位１カタール（1kat）とした。尚,1
ナノカタール（1nkat）は10-9カタールである。
てカルボベンゾキシ−グルタミル−チロシンを1/20M酢
酸ソーダ−塩酸緩衝液（pH3.0）に10-3Mとなるように溶
解した基質溶液0.5mlを加え,30℃で20分間反応させる。
その後，ニンヒドリン試薬1.0mlを加え反応を停止させ
る。更に,1/2Mクエン酸ソーダ−クエン酸緩衝液（pH5.
0）を3.0mlを加え,100℃で15分間加熱し，発色させた後
氷水中で急冷した後，分光光度計を用いて,570nmの波長
で吸光度を測定した。対照は酵素液にニンヒドリン試薬
を加え，その後基質を加え，以後同様の操作をして吸光
度を測定した。ニンヒドリン試薬は，メチルセロソルブ
118mlに1/100M青酸カリ2mlを加え，更にニンヒドリン1g
を溶解させ調整したものを用いた。基質から遊離するア
ミノ酸量の算定標準として各測定毎に10-4Mチロシン溶
液1.0mlにニンヒドリン試薬1.0mlを加え，以後同様の操
作をして吸光度測定した。酵素活性単位は，上記条件で
１秒間に１モルの遊離チロシンを精製することのできる
酵素を１酵素活性単位１カタール（1kat）とした。尚,1
ナノカタール（1nkat）は10-9カタールである。
（２） 作用 酸性下で蛋白質及びペプチドのカルボキシル末端のペプ
チド結合を加水分解し，アミノ酸を逐次遊離する。
チド結合を加水分解し，アミノ酸を逐次遊離する。
（３） 基質特異性 第１表に，カルボベンゾキシジペプチド類及びベンゾイ
ル−グリシル−リシンのカルボベンゾキシ−グルタミル
−チロシンに対する相対酵素活性を示した。
ル−グリシル−リシンのカルボベンゾキシ−グルタミル
−チロシンに対する相対酵素活性を示した。
（４） 最適作用pH 第１図及び第２図に示すように，本酵素をカルボベンゾ
キシ−グルタミル−チロシン及びカルボベンゾキシ−フ
エニルアラニル−アラニンを基質とし,pH2〜７の範囲で
作用させたところ最適作用pHは両基質に対しても,pH4.0
であった。
キシ−グルタミル−チロシン及びカルボベンゾキシ−フ
エニルアラニル−アラニンを基質とし,pH2〜７の範囲で
作用させたところ最適作用pHは両基質に対しても,pH4.0
であった。
（５） pH安定性 第３図に示すように，本酵素は30℃,120分分間の処理後
pH2〜８の間で安定であった。
pH2〜８の間で安定であった。
（６） 各種阻害剤および金属塩の影響 第２表に各種阻害剤及び金属塩の影響を示した。フェニ
ルメチルフルオロスルホン酸（PMSF）で100％阻害さ
れ，ペプスタチンＡで阻害をうけないことからセリンカ
ルボキシペプチダーゼであることがわかった。尚，セリ
ンカルボキシペプチダーゼは，国際生化学連合の命名委
員会により命名されており，エンザイムノウメンクレイ
チャー（Enzyme Nomenclature,ed.by Nomenclature Com
mittee of the International Union of Biochemistry,
Academic Press,New York,1984,p300）に記載されてい
る。また，本酵素は，パラクロロマーキュリー安息香酸
により100％阻害されることから，酵素活性にチオール
基が関与しているものと思われる。
ルメチルフルオロスルホン酸（PMSF）で100％阻害さ
れ，ペプスタチンＡで阻害をうけないことからセリンカ
ルボキシペプチダーゼであることがわかった。尚，セリ
ンカルボキシペプチダーゼは，国際生化学連合の命名委
員会により命名されており，エンザイムノウメンクレイ
チャー（Enzyme Nomenclature,ed.by Nomenclature Com
mittee of the International Union of Biochemistry,
Academic Press,New York,1984,p300）に記載されてい
る。また，本酵素は，パラクロロマーキュリー安息香酸
により100％阻害されることから，酵素活性にチオール
基が関与しているものと思われる。
（７） 分子量 本酵素は分子量はアンドリウスの方法に準じセファデッ
クスＧ−100（ファルマシアファインケミカル社製）の
ゲル過法により求めると第４図に示すように約45,000
（低分子型）であった。また，高速液体クロマトグラム
によるTSK−GEL Ｇ−3000SW（東洋曹達工業（株）製）
カラムを用いたゲルろ過法により求めると，約47,000で
あった。ちなみに，マイナー部分である高分子型はセフ
ァデックスＧ−100のゲル過法により求めると約93,00
0であった。
クスＧ−100（ファルマシアファインケミカル社製）の
ゲル過法により求めると第４図に示すように約45,000
（低分子型）であった。また，高速液体クロマトグラム
によるTSK−GEL Ｇ−3000SW（東洋曹達工業（株）製）
カラムを用いたゲルろ過法により求めると，約47,000で
あった。ちなみに，マイナー部分である高分子型はセフ
ァデックスＧ−100のゲル過法により求めると約93,00
0であった。
（８） 等電点 ファルマライト2.5〜5.0（スウェーデン，ファルマシア
ファインケミカル社製）を用いた等電点電気泳動法によ
り，本酵素の等電点はpI3.9であった。
ファインケミカル社製）を用いた等電点電気泳動法によ
り，本酵素の等電点はpI3.9であった。
（９） 吸光係数 本酵素を凍結乾燥し，重量を測定後,280nmにおける吸光
度を測定し吸光係数を求めたところ▲Ａ1% 1cm▼は14.8
であった。
度を測定し吸光係数を求めたところ▲Ａ1% 1cm▼は14.8
であった。
（10） 反応速度論的解析 第３表にカルボベンゾキシジペプチド及びベンゾイル−
グリシル−リシンを基質として用いた時の本酵素の反応
速度定数を示した。
グリシル−リシンを基質として用いた時の本酵素の反応
速度定数を示した。
（11） ディスク電気泳動 本酵素をポリアクリルアミドゲルpH4.3,ゲル濃度7.5％
を用いて１本のゲル当り5mAで,4℃４時間電気泳動を行
ない，次いでク−マシーブリリアントブルーR250で染色
した。その結果，第５図に示すように原点（陽極端）よ
り，陰極側約0.7cmの所に単一のバンドとして認めら
れ，本酵素は電気泳動的均一標品であることが明らかに
なった。
を用いて１本のゲル当り5mAで,4℃４時間電気泳動を行
ない，次いでク−マシーブリリアントブルーR250で染色
した。その結果，第５図に示すように原点（陽極端）よ
り，陰極側約0.7cmの所に単一のバンドとして認めら
れ，本酵素は電気泳動的均一標品であることが明らかに
なった。
（実施例） 実施例１（固体培養による生産） 100ml三角フラスコ中で小麦▲麩▼3gに水2.1mlを加えて
よく練り,120℃20分間加圧殺菌し放冷後，予め純粋培養
しておいた各種のパエシロマイセス属のスラントカルチ
ャーから１白金耳接種した。これを24℃で１日に２回振
盪してフラスコ中の糸状菌をよくほぐし通気させ,7日間
静置培養した。培養後，固体培養物に1/20M酢酸ソーダ
−塩酸緩衝液（pH3.0）30mlを添加して激しく振盪し４
℃で２時間放置後，過を行ないこの液を粗酵素液と
した。得られた粗酵素液の酵素活性を測定した結果を第
４表に示す。
よく練り,120℃20分間加圧殺菌し放冷後，予め純粋培養
しておいた各種のパエシロマイセス属のスラントカルチ
ャーから１白金耳接種した。これを24℃で１日に２回振
盪してフラスコ中の糸状菌をよくほぐし通気させ,7日間
静置培養した。培養後，固体培養物に1/20M酢酸ソーダ
−塩酸緩衝液（pH3.0）30mlを添加して激しく振盪し４
℃で２時間放置後，過を行ないこの液を粗酵素液と
した。得られた粗酵素液の酵素活性を測定した結果を第
４表に示す。
実施例２（液体培養による生産） 500mlの坂口フラスコに，小麦▲麩▼3gと脱脂大豆1gに
リン酸１カリウム0.2gを含む水道水3mlを加えてよく練
り,93mlの水道水を追加して,1M酒石酸3.5mlでpHを3.0に
調整後,120℃20分間加圧殺菌し放冷後，予め純粋培養し
ておいた各種パエシロマイセス属のスラカントカルチャ
ーから１白金耳接種した。これを24℃,120（振幅10cm）
往復／分で７日間振盪培養した。酵素の抽出は，培養物
をNo.2の東洋紙（東洋瀘紙（株）製）で過を行な
い，この液を粗酵素液とした。得られた粗酵素液の酵
素活性を測定した結果を第５表に示す。
リン酸１カリウム0.2gを含む水道水3mlを加えてよく練
り,93mlの水道水を追加して,1M酒石酸3.5mlでpHを3.0に
調整後,120℃20分間加圧殺菌し放冷後，予め純粋培養し
ておいた各種パエシロマイセス属のスラカントカルチャ
ーから１白金耳接種した。これを24℃,120（振幅10cm）
往復／分で７日間振盪培養した。酵素の抽出は，培養物
をNo.2の東洋紙（東洋瀘紙（株）製）で過を行な
い，この液を粗酵素液とした。得られた粗酵素液の酵
素活性を測定した結果を第５表に示す。
実施例３（カルボキシペプチダーゼの精製） 小麦▲麩▼90gと水道水63mlをよく練った後１三角フ
ラスコ３本に分注し,120℃で20分間殺菌し培地とした。
パエシロマイセス・カルネウス（Paecilomyces carneu
s）IFO7012を約1cm2ずつ切り取った後無菌的に細かく砕
いて培地に接種し24℃で７日間静置培養を行なった。培
養中,1日に２回振盪してフラスコ中の糸状菌をよくぼく
し通気した。培養後，培養物に1/20M酢酸ソーダ−酢酸
緩衝液（pH4.0）900mlを加え激しく振盪後,2時間静置し
抽出を行なった。培養物と抽出液は,No.2東洋紙（東
洋濾紙（株）製）にて過を行ない分離した。この液
に硫酸アンモニウムを407gに加えて溶解（80％飽和）
後,1晩放置し塩析を行なった（80％硫安塩析）。次に遠
心分離（14,000×g/10min）より本酵素が沈殿として2,3
2g得られた。この沈殿を1/20M酢酸ソーダ−酢酸緩衝液
（pH4.0）に溶解後，透析チューブに入れ1/20M酢酸ソー
ダ−酢酸緩衝液（pH4.0）で１晩透析し，透析液を遠心
分離（25,000×g/10min）し上清液8.2mlを得た。ここで
の本酵素回収率は，培養抽出物液の72.7％となった。こ
の上清液をセファデックスＧ−100カラム（1.8φ×72c
m,1/20M酢酸ソーダ−酢酸緩衝液（pH4.0））でゲル過
を行なったところ第６図に示す如くマイナー部分である
分子量約93.000の高分子型，メイン部分である分子量4
5,000の低分子型のカルボキシペプチダーゼ画分に分か
れた。メイン部分である低分子型の酵素活性を測定した
ところ109nkat/ml,比活性74.7nkat/mlであった。この低
分子画分は51ml得られ，回収率は45.2％であった。次
に，得られた低分子画分を1/20M酢酸ソーダ−酢酸緩衝
液（pH4.5）で透析後，透析液をDEAE−セルロース（DE3
2）（イギリス，ワットマン社製）カラム（1.8φ×41c
m,1/20M酢酸ソーダ−酢酸緩衝液（pH4.5））に吸着させ
た後，上記緩衝液pH4.5で1/20Mより1/2Mまでの濃度勾配
させて，イオン交換クロマトグラムを行なった。（第７
図にDEAE−セルロース（DE32）によるイオン交換クロマ
トグラムの溶出パターンを示した。）得られたメイン画
分は55mlであり，酵素活性は53.7nkat/ml,比活性は245n
kat/A280,回収率は24.0％であった。更に,DEAE−セルロ
ース（DE32）カラムを用いた再クロマトグラムを行なっ
た。カラムは1.8φ×41cm,1/20M酢酸ソーダ−酢酸緩衝
液（pH4.5）であらかじめ平衡化しておき，上記緩衝液
（pH4.5）で1/5Mより1/2Mまでの濃度勾配溶出を行な
い，カルボキシペプチダーゼ活性のメイン画分を精製酵
素標品として取得した。この操作より，酵素活性46.7nk
at/ml,比活性313nkat/A280の酵素液50mlを得た。（第８
図にDEAE−セルロース（DE32）によるイオン交換再クロ
マトグラムの溶出パターンを示した。）尚，抽出工程以
後の作業はすべて４℃で行なった。
ラスコ３本に分注し,120℃で20分間殺菌し培地とした。
パエシロマイセス・カルネウス（Paecilomyces carneu
s）IFO7012を約1cm2ずつ切り取った後無菌的に細かく砕
いて培地に接種し24℃で７日間静置培養を行なった。培
養中,1日に２回振盪してフラスコ中の糸状菌をよくぼく
し通気した。培養後，培養物に1/20M酢酸ソーダ−酢酸
緩衝液（pH4.0）900mlを加え激しく振盪後,2時間静置し
抽出を行なった。培養物と抽出液は,No.2東洋紙（東
洋濾紙（株）製）にて過を行ない分離した。この液
に硫酸アンモニウムを407gに加えて溶解（80％飽和）
後,1晩放置し塩析を行なった（80％硫安塩析）。次に遠
心分離（14,000×g/10min）より本酵素が沈殿として2,3
2g得られた。この沈殿を1/20M酢酸ソーダ−酢酸緩衝液
（pH4.0）に溶解後，透析チューブに入れ1/20M酢酸ソー
ダ−酢酸緩衝液（pH4.0）で１晩透析し，透析液を遠心
分離（25,000×g/10min）し上清液8.2mlを得た。ここで
の本酵素回収率は，培養抽出物液の72.7％となった。こ
の上清液をセファデックスＧ−100カラム（1.8φ×72c
m,1/20M酢酸ソーダ−酢酸緩衝液（pH4.0））でゲル過
を行なったところ第６図に示す如くマイナー部分である
分子量約93.000の高分子型，メイン部分である分子量4
5,000の低分子型のカルボキシペプチダーゼ画分に分か
れた。メイン部分である低分子型の酵素活性を測定した
ところ109nkat/ml,比活性74.7nkat/mlであった。この低
分子画分は51ml得られ，回収率は45.2％であった。次
に，得られた低分子画分を1/20M酢酸ソーダ−酢酸緩衝
液（pH4.5）で透析後，透析液をDEAE−セルロース（DE3
2）（イギリス，ワットマン社製）カラム（1.8φ×41c
m,1/20M酢酸ソーダ−酢酸緩衝液（pH4.5））に吸着させ
た後，上記緩衝液pH4.5で1/20Mより1/2Mまでの濃度勾配
させて，イオン交換クロマトグラムを行なった。（第７
図にDEAE−セルロース（DE32）によるイオン交換クロマ
トグラムの溶出パターンを示した。）得られたメイン画
分は55mlであり，酵素活性は53.7nkat/ml,比活性は245n
kat/A280,回収率は24.0％であった。更に,DEAE−セルロ
ース（DE32）カラムを用いた再クロマトグラムを行なっ
た。カラムは1.8φ×41cm,1/20M酢酸ソーダ−酢酸緩衝
液（pH4.5）であらかじめ平衡化しておき，上記緩衝液
（pH4.5）で1/5Mより1/2Mまでの濃度勾配溶出を行な
い，カルボキシペプチダーゼ活性のメイン画分を精製酵
素標品として取得した。この操作より，酵素活性46.7nk
at/ml,比活性313nkat/A280の酵素液50mlを得た。（第８
図にDEAE−セルロース（DE32）によるイオン交換再クロ
マトグラムの溶出パターンを示した。）尚，抽出工程以
後の作業はすべて４℃で行なった。
（発明の効果） 以上述べたように、本発明によれば、原料として糸状菌
を用いていることから、大量生産するための培養が容易
であり工業的規模の生産に適している。
を用いていることから、大量生産するための培養が容易
であり工業的規模の生産に適している。
第１図は，カルボベンゾキシ−グルタミル−チロシンを
基質としたときの本酵素の作用pH範囲を示す図，第２図
は，カルボベンゾキシ−フェニルアラニル−アラニンを
基質としたときの本酵素の作用pH範囲を示す図，第３図
は本酵素の安定pH範囲を示す図，第４図は，本酵素の分
子量を示す図，第５図は，本酵素のディスク電気泳動の
図，第６図は，本酵素のセファデックスＧ−100による
ゲル過の溶出パターンを示す図，第７図は，本酵素の
DEAE−セルロースによるイオン交換クロマトの溶出パタ
ーンを示す図，第８図は，本酵素のDEAE−セルロースに
よるイオン交換再クロマトの溶出パターンを示す図であ
る。
基質としたときの本酵素の作用pH範囲を示す図，第２図
は，カルボベンゾキシ−フェニルアラニル−アラニンを
基質としたときの本酵素の作用pH範囲を示す図，第３図
は本酵素の安定pH範囲を示す図，第４図は，本酵素の分
子量を示す図，第５図は，本酵素のディスク電気泳動の
図，第６図は，本酵素のセファデックスＧ−100による
ゲル過の溶出パターンを示す図，第７図は，本酵素の
DEAE−セルロースによるイオン交換クロマトの溶出パタ
ーンを示す図，第８図は，本酵素のDEAE−セルロースに
よるイオン交換再クロマトの溶出パターンを示す図であ
る。
Claims (1)
- 【請求項１】カルボキシペプチダーゼ産性能を有するパ
エシロマイセス属に属する糸状菌からカルボキシペプチ
ダーゼを製造する方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62081377A JPH0795950B2 (ja) | 1987-03-09 | 1987-04-02 | カルボキシペプチダーゼの製造方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5367587 | 1987-03-09 | ||
| JP62-53675 | 1987-03-09 | ||
| JP62081377A JPH0795950B2 (ja) | 1987-03-09 | 1987-04-02 | カルボキシペプチダーゼの製造方法 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS642573A JPS642573A (en) | 1989-01-06 |
| JPH012573A JPH012573A (ja) | 1989-01-06 |
| JPH0795950B2 true JPH0795950B2 (ja) | 1995-10-18 |
Family
ID=26394385
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62081377A Expired - Lifetime JPH0795950B2 (ja) | 1987-03-09 | 1987-04-02 | カルボキシペプチダーゼの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0795950B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4792685B2 (ja) * | 2001-09-26 | 2011-10-12 | 住友化学株式会社 | 広宿主範囲を持つ昆虫病原性糸状菌 |
| CN104251510A (zh) * | 2014-09-11 | 2014-12-31 | 张弛 | 可移动电供暖模块 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5195182A (ja) * | 1975-02-17 | 1976-08-20 | Shinkinasanseikarubokishipepuchidaazeno seizohoho |
-
1987
- 1987-04-02 JP JP62081377A patent/JPH0795950B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS642573A (en) | 1989-01-06 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term | ||
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20071018 Year of fee payment: 12 |