JPH0795953B2 - 大腸菌中のバシルス・ツリンギエンシス細晶性蛋白質 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本書はアメリカンタイプカルチヤーコレクシヨン（メリ
ーランド州ロツクバイル20852）に寄託されたプラスミ
ド類を開示するものである。プラスミドpES1の寄託番号
はATCC No.31995である。プラスミドpJWK20の寄託番号
はATCC No.31997である。プラスミドpJWK18の寄託番号
はATCC No.31998である。これらのプラスミドは1981年1
0月20日に、ブダペスト条約の条件で、ATCCに寄託され
た。出願人はこの細胞類が本件の米国特許が発行された
後、公衆が自由に入手できるよう指示している。

本発明はおおむね、ある種の植物に有害な昆虫類を支配
する物質の生産に関するものである。より詳細には、本
発明はタバコホーンウオーム（マンズカ・セクスタ）及
び類縁種の幼虫に対する毒物の生産手段の改良法に関す
るものである。

周知のように、バシルス・ツリンギエンシスの生産する
結晶性蛋白質は多くの鱗翅類昆虫の幼虫に有毒である。
結晶類を含有する調製物は高選択性生物学的殺虫剤とし
て商品化されている。然しながら、この種の殺虫剤は比
較的高い生産コストを伴なうと共に、使用に際し付随す
る問題点のために、大てい他の市販品と競争することが
実際上、困難となつている。

バシルス・ツリンギエンシスによる結晶性蛋白質の産生
は胞子形成期に限られるということがその結晶類の製造
と利用に関わる重大な欠点である。そのように成長期に
限りがあるということが、殊に生産過程で、製造中の不
便さと時間超過の原因となり得る。実際、限界のある成
長期、若しくは他の印紙に起因するある種の圧迫によ
り、バシルス・ツリンギエンシスが結晶類生産能を欠く
菌株になつてしまうようである。そのようなアクリスタ
リフエラス株は殺虫作用を持たない。

本発明の目的はバシルス・ツリンギエンシスの結晶性蛋
白質製造の改良法を提供することである。

本発明の別の目的は、毒素産生が成長期に限定されない
ようにバシルス・ツリンギエンシスの結晶性蛋白質に対
応するコードをもつDNAを他の微生物に転移することに
よつてバシルスツリンギエンシスの結晶性蛋白質を製造
する改良法を提供することである。

本発明の他の目的は、添附の図面と関連した以下の記載
により当業者に理解されるであろう。

第１図は、プラスミドDNAとマーカーとしてのDNA断片の
アガロースゲルによる解析で、エチジウムブロミド染色
の0.7％（レーン１〜５）及び0.35％（レーン6,7）アガ
ローススラブゲルの写真であり； 第２図はニトロセルロースに移されたプラスミドDNA類
のハイブリツド形成による解析でエチジウムブロミド染
色0.7％アガロースゲル（レーン１〜３）と³²P標識プラ
スミドのオートラジオグラムの写真から成り； 第３図は、トリプシン分解前後の、結晶性蛋白質及び細
菌株ES12によつて産生された蛋白質のラジオイムノアツ
セイを示した写真であり； 第４図はエチジウムブロミド染色ゲルの写真で、異株バ
シルス・ツリンギエンシスからの抽出物中に検出された
プラスミド類を示している。

大筋において、本発明は細菌類宿主中で複製可能で、し
かもバシルス・ツリンギエンスの結晶性蛋白質に対し発
現可能な異種DNAコードを含有するプラスミド類を開示
するものである。本プラスミド類はさらに、宿主側の系
により認識される異種DNAの情報発現機構をも含有し、
この発現機構は、宿主細菌類中で該宿主の成長期による
制限を事実上受けることなく、異種DNAの転写およびト
ランスレーションを可能にし、バシルス・ツリンギエン
シスの結晶性蛋白質を生産する。言い換えれば、本発明
はそのようなプラスミド類により形質転換された、すな
わち遺伝子的に操作された細菌株に関するものである。

本発明の組み換え体プラスミド類を含むように遺伝子操
作された細菌株はバシルス・ツリンギエンシスの結晶性
蛋白質を発現するものとして形質転換され得る。これら
遺伝子操作された菌株により産生される蛋白質は多くの
鱗翅類昆虫の幼虫に対し有毒である。本結晶類を含有す
る製剤は高選択性生物学的殺虫剤として使用できる。

本発明の好ましい形式では、新規組み換えプラスミド類
はBolivaらがGene2巻：頁95−113（1977年）で述べた公
知のクローニングベクタープラスミドpBR322がバシルス
・ツリンギエンシス株のプラスミド類から得たプラスミ
ド断片と結合されると創製される。「大プラスミド分
画」が特に好ましい。この「大プラスミド分画」は約10
メガダルトン以上の大きさの断片類を含有している。バ
シルス・ツリンギエンシス中のプラスミド類は確かにバ
シルスツリンギエンシス中で結晶性蛋白質の産生を担当
しているものと考えられている。本発明の結晶性蛋白質
コードを持つ組み換え体プラスミド類の作製に使用され
るバシルス・ツリンギエンシスのプラスミド断片の由来
は種々のバシルス・ツリンギエンシス菌株であり、その
中には公共機関から入手できるものもある。例えば、バ
シルス・ツリンギエンシス クルスタキ変種HD−１は米
国イリノイ州ペオリア市のアグリカルチユラルリサーチ
カルチヤーコレクシヨン（NRRL）から入手でき、寄託番
号NRRL No.B−3792が与えられている。バシルス・ツリ
ンギエンシス クルスタキ変種HD−73も、アグリカルチ
ユラルリサーチカルチヤーコレクシヨンより入手でき、
寄託番号NRRL No.B−4488で登録されている。数種のバ
シルス・ツリンギエンシス菌株の利用法を説明するため
本明細書本分中に実施例をあげてある。それら実施例は
説明のためだけにあげており、本発明の範囲をその菌株
に由来する断片の利用法のみに限定するものではない。

実施例 Ｉ 本発明の組み換えプラスミド作製に於けるバシルス・ツ
リンギエンシス クルスタキ変種HD−１−デイペルのプ
ラスミドDNA断片の利用法。

バシルス・ツリンギエンシスの結晶産生株のプラスミド
類の数と大きさは種々異なる。バシルス・ツリンギエン
シス クルスタキ変種HD−１−デイペルから得たプラス
ミド類の分子量は、本菌株から通常得られる種々のプラ
スミドを示す第１図のレーン１にみられるように約47か
ら1.32メガダルトンの範囲を持つ。本菌株は大型プラス
ミド類を持つが、本研究での成育条件下では閉環状で見
出されることは少ない。しかしながらバシルス・ツリン
ギエンシスから単離したプラスミド分画には小量の直鎖
状大型プラスミド類が含まれていた。第１図、レーン２
及び３で示したようにバシルスツリンギエンシス クル
スタキ変種HD−１−デイペル菌株からは２つのプラスミ
ド分画が得られた。レーン２に示した分画には痕跡量の
直鎖状巨大プラスミド（分子量×10⁶,左側に示す）に加
え、47,32及び30メガダルトンのプラスミドが含まれて
いた。２番目の分画には、レーン３のように、4,9,5.2,
5.5及び9.6メガダルトンという、より小型のプラスミド
が含まれていた。

pES1（ATCC No.31995）と呼称した本発明の好ましい組
み換え体プラスミドは第１図のレーン４に示したが、そ
のゲル分析で本プラスミドはレーン５で示したpBR322と
比較されうる。本プラスミドを１箇所で切断する要素に
よる消化後の直鎖状プラスミドは、Hind IIIで消化した
ラムダDNA（第１図、レーン６及び７に示す）と比較す
る分子量約11×10⁶Mrに相当する移動度であつた。図の
右側に示した分子量（×10^-6）はHind IIIによるラダム
DNAの消化物を示している。第１図の右側の矢印はレー
ン６及び７の原点を示している。

本発明によるpES1（ATCC No.31995）のような組み換え
体プラスミド類の作製に際し、上下の詳細な方法が続け
られた。本作製過程はまたSchnepf Whiteleyにより、Pr
oc.Nat.Acad.Sci.USA,78巻：頁2893−2897（1981年）で
も概説されている。本作製過程は実施例としてのみ述べ
てあり、また、本明細書の特許請求の範囲を限定しよう
とするものではない。

バシルス・ツリンギエンシス クルスタキ変種HD−１−
デイペルから得られた分離された、「大」及び「小」と
呼称する２つのプラスミド分画を種々の希釈率のSau3A1
で消化した。大プラスミドフラクションは平均寸法が10
メガダルトンより大きいプラスミドを含有し、一方小プ
ラスミドフラクションは平均寸法が10メガダルトンより
小さいプラスミドを含有する。これをアガロースゲル電
気泳動にかけた。挿入源の生成のため、「大プラスミド
分画」を共有結合閉環分子をすべて直鎖状にするのに要
する最少量の酵素を用いて消化した。製造業者（ニユー
イングランド バイオラツド社）の推奨に従い、制限エ
ンドヌクレアーゼSal I,Hind III,BamH I及びSau 3A1を
用いた。これにより、10メガダルトン以上の平均分子量
を持つ断片となつた。「小プラスミド分画」に対しては
一定量のSau 3A1を用いることにより、いくらかの共有
結合閉環分子が残つたが、分子量２×10⁶Mr以下の直鎖
状断片はほとんど生じなかつた。

次に、各分画を、制限酵素Bam H1を用いた消化により既
に開環済みのpBR322に結合した。プラスミドpBR322はBl
airらがProc.Nat.Acad.Sci.,USA69巻：頁2518−2522（1
972年）で概説した方法で大腸菌HB101株（pBR322）から
単離された。DNA断片（容量10μ中、バシルス・ツリ
ンギエンシス プラスミドDNA3μｇ及びpBR322DNA0.15
μｇ）の結合はManiatisらがCell 15巻：頁667−701で
既述の、接着末端（cohesive ends）に対して用いた方
法により行なつた。

次に、組み換え体のふるい分けと選別を行なつた。ブド
ウ球菌蛋白質Ａ（フアルマシア）を、ErlichらがCell 1
3巻：頁681−689（1978年）で述べたクロラミンＴを用
いる方法により、¹²⁵I（アマーシヤム）で標識した。Sa
u 3A1消化物であるDNA断片の〔α−32p〕dCTP（アマー
シヤム）による標識はManiatisらがProc.Nat.Acad.Sc
i.,USA,72巻：頁1184−1188（1975年）で述べたDNAポリ
メラーゼＩ−触媒作用による埋め込み反応（fill−in−
reaction）により行なつた。

プラスミド類はLee A.Bulla,Jr.博士により寄贈された
バシルス・ツリンギエンシス クルスタキ変種HD−１−
デイペルから、WhiteとNesterがJ.Bacteriol 141巻：頁
1134−1141（1980年）で述べたプラスミドのスクリーニ
ング法に従つて得られた。すべてのプラスミド標品は、
さらに塩化セシウム−エチジウムブロミド密度勾配遠心
法によつて精製した。クローニング実験用サンプル（１
勾配当り、100μg DNA）はインターナシヨナルＢ−60遠
心機でSB−283型ロータを用い毎分35,000回転で2.5時間
の５−28％シヨ糖密度勾配遠心法により分画した。Meye
rsらがJ.Bacteriol.127巻：頁1529−1537（1976年）で
述べたアガローズゲル中での電気泳動によりプラスミド
DNAの解析を行なつた。プラスミド断片は公知の技術に
より制限酵素でDNAを消化して製造した。プラスミドDNA
への交雑はWahlらがProc.Nat.Acad.Sci.,USA76巻：頁36
83−3687（1979年）で述べたように部分的脱プリン後行
なつた。また、ゲルからニトロセルロースへのDNAの移
行はThomashowらがCell 19巻：頁729−739（1980年）で
述べた方法により行なつた。

こうして作製された組み換えプラスミドは、次に大腸菌
中に形質転換された。本転換は公知の過程で行ない、形
質転換物は100μg/mlのアンピシリンを含む培地上で選
択した。クローニングはメツセンジヤーDNAを、pBR322
のテトラサイクリン耐性をコードする遺伝子中に局在す
るBamH1の切断部位へ挿入して行なつたので、アンピシ
リン耐性の形質転換物はテトラサイクリン（25μg/ml）
に対する感受性をスクリーニングした。アンピシリン耐
性でテトラサイクリン感受性のコロニーが移入物を含む
ものであると考えられる。バシルス・ツリンギエンシス
のDNA挿入体を運搬すると考えられるそれら形質転換コ
ロニーは次に抗体と¹²⁵I−蛋白質Ａを用いた結晶性蛋白
質抗原産生性能のスクリーニングにかけられた。結晶体
に対する抗体調製のため、結晶体はまずAronsonらが、
J.Bacteriol.106巻：頁1016−1025（1971年）で述べた
変法Ｇ培地中で成育し、胞子形成したバシルス・ツリン
ギエンシスの培養から、レノグラフイン（Squibb）密度
勾配中での連続４回の遠心により精製された。胞子の夾
雑は、位相差顕微鏡により0.1％以下と見積つた。可溶
化した結晶はドデシル硫酸ナトリウムを含む分取用10％
ポリアクリルアミドスラブゲルによる電気泳動にかけら
れ、結晶性蛋白質のポリペプチドの主要部を含むゲルの
一部を切り分け、破砕し、同量のFreundの完全アジユバ
ンドと混合してウサギを免疫した。免疫グロブリンＧの
分画を免疫したウサギの血清から、硫安分画とDEAEセル
ロースによるクロマトグラフイーにより精製し、公知の
技術でOuchterlonyの免疫拡散法により分析した。

抗原検出によるスクリーニングのため、コロニーはまず
HenningらがAnal.Biochem.97巻：頁153−157（1979年）
で述べたように、寒天板から紙へ移し、フエノール−
クロロホルム−ヘプタンおよびクロロホルム−メタノー
ルで変性させた。RenartらがProc.Nat.Acad.Sci.,USA76
巻：頁3116−3120（1979年）で述べたように、その紙
を１％ウシ血清アルブミン（シグマ社、分画Ｖ）中に浸
し、抗体及び¹²⁵I−蛋白質Ａと共にインキユベーシヨン
した。結晶性蛋白質抗原と反応し得る物質を含むコロニ
ーはオートラジオグラフイーで検出した。抗体の濃度
（稀釈率10^-3から10^-4）と¹²⁵I−蛋白質Ａの濃度（0.2
から１×10⁶cpm）は大腸菌HB101（pBR322）のコロニー
が反応しないか或いは灰色の背景に対し明るく見える間
に、紙上に１μスポツトしたうちで5ngの結晶性蛋
白質を検出できるような条件を得るのにいろいろ変えら
れた。蛋白質の検体は公知の操作過程に従い、10％ドデ
シル硫酸ナトリウム／ポリアクリルアミドスラブゲルに
よる電気泳動にかけ、電気泳動的にニトロセルロースへ
移し、さらに抗体（５×10^-3稀釈）及び¹²⁵I−蛋白質Ａ
（６×10⁵cpm）と共にインキユベーシヨンした。移行し
たペプチドと抗原及び¹²⁵I−蛋白質Ａとの反応はオート
ラジオグラフイーで検出した。

100μg/mlのアンピリシンを含むＬ肉汁中で16時間成育
した細胞は遠心によつて集め、1mM EDTAと200μg/mlの
フエニルメチルスルフオニルフルオライドを含むpH7.0
の0.1Mトリス緩衝液に懸濁し、超音波処理により粉砕し
た。その超音波処理物を100,000×ｇで30分間遠心して
得られた不溶物は4M尿素、0.285M2−メルカプトエタノ
ール、0.05M炭酸水素ナトリウム、pH9.5に完全に懸濁
し、pH7.4の0.05Mトリス緩衝液に対し透析し、これを昆
虫の毒性試験用、或いは電気泳動による分析遥とした。
スブチリン或いはトリプシンによる蛋白質分解を行なう
ため、検体はpH9.5の尿素緩衝液のかわりに0.285Mの２
−メルカプトエタノールを含むpH10,0の0.05Mスルホン
酸シクロヘキシルアミノエタン（CHES）を用い、最終透
析をpH10.0の0.01M CHES緩衝液に対して行なうようにし
て上述の方法で調製した。トリプシン消化は、緩衝液と
して0.01M CHESを用い、同緩衝液に対して遠析しつつ室
温にて消化し；またサブチリシン消化は、Clevelandら
がJ.Biol.Chem.252巻：頁1102−1106（1977年）で述べ
た方法に従つて行なつた。反応は電気泳動の検体用緩衝
液中で検体を煮沸して停止させ、また結晶性蛋白質に対
する抗体と反応し得るポリペプチドの検出は上述のよう
に¹²⁵I−蛋白質Ａ及びオートラジオグラフイーを用いて
行なつた。蛋白質濃度はBrandfordがAnal.Biochem.72
巻：頁248−254（1976年）で述べた方法に従つて定量し
た。

本組み換え体プラスミドpES1（ATCC No.31995）は、プ
ラスミドベクターpBR322と30,32及び47メガダルトンの
プラスミドと相同のDNAとから構成され、さらにバシル
ス・ツリンギエンシスの直鎖状巨大プラスミドと相同の
DNAをも含んでいる。このような構成となった一つの説
明は、バシルス・ツリンギエンシスの各巨大プラスミド
由来の幾つかのSau3AI部分消化断片が互いに連結し、次
にこの異種多分子結合体（ヘテロマルチマー）が、pBR3
22ベクターに連結されたためであるか、もう一つの可能
性は、第２図に示されている47メガダルトンのプラスミ
ドへのみかけのハイブリダイゼーションは、実際は30も
しくは32メガダルトンプラスミド由来の人工的テーリン
グによるものかも知れない。

実施例 II 本発明による組み換え体プラスミドによつて形質転換さ
れた大腸菌がバシルス・ツリンギエンシスの結晶性蛋白
質を産生することの証拠。

本発明による組み換え体プラスミドを用いて大腸菌細胞
を形質転換できる。これら形質転換細胞はバシルス・ツ
リンギエンシスの結晶性蛋白質を産生する。そのような
形質転換が可能であるのは、本発明による組み換え体プ
ラスミドがベクターDNAと結晶性蛋白質コードをもつバ
シルス・ツリンギエンシスのプラスミド由来のDNAの両
者を含有するからである。プラスミドpES1（ATCC No.31
995）を用いてこのことを実証した。

第２図に示したように、プラスミドpES1（ATCC No.3199
5）はプラスミドpBR322由来のDNA,30,32及び47メガダル
トンのプラスミドと相同のDNA及びバシルス・ツリンギ
エンシスの直鎖状巨大プラスミドと相同のDNAの実質的
相同体を含んでいる。第２図のレーン１〜３は0.7％エ
チジウムブロミド染色アガロースゲルの写真である：レ
ーン１はBamH 1消化したpBR322DNAを示し；レーン２は
バシルス・ツリンギエンシスの全プラスミド（通常得ら
れる種々のプラスミド）を示しさらにレーン３はバシル
ス・ツリンギエンシス由来の「大プラスミド分画」を示
す。レーン４−ｂは、以下のものとバイブリツド形成し
た³²P−標識pBR322DNAのオートラジオグラムを示す：す
なわちレーン４ではBamH1消化したpBR322DNA;レーン５
では全プラスミド（通常得られる種々のプラスミド）；
レーン６ではバシルスツリンギエンシス由来の「大プラ
スミド分画」である。レーン７−９は以下のものとハイ
ブリツドを形成した³²P−標識pES1（ATCC No.31995）DN
Aのオートラジオグラムを示す：すなわちレーン７ではB
amH1消化したpBR322;レーン８では全プラスミド（通常
得られる種々のプラスミド）；さらにノーン９はバシル
ス・ツリンギエンシス由来の「大プラスミド分画」であ
る。レーン10−12は、以下のものとハイブリダイゼーシ
ヨンしたバシルス・ツリンギエンシスの³²P−標識全プ
ラスミドDNAのオートラジオグラムを示す：すなわちレ
ーン10ではBamH1消化したpBR322DNA;レーン11では全プ
ラスミド分体；レーン12ではバシルス・ツリンギエンシ
ス由来の「大プラスミド分画」である。図中、矢印は直
鎖状断片の位置と、その断片へのプローブの交雑を示
す。

第３図はトリプシン消化前後の形質転換大腸菌ES12株に
より産生された結晶性蛋白質のラジオイムノアツセイを
示す。第３図レーン１−３に示したのは、ポリペプチド
の固相法ラジオイムノアツセイのオートラジオグラムで
ある。これら断片は、ドデシル硫酸ナトリウム／ポリア
クリルアミドゲル電気泳動後の抗結晶抗体と反応する。
レーン１はバシルス・ツリンギエンシスの結晶性蛋白質
１μｇを示す。レーン２は大腸菌HB101（pBR322）から
抽出した蛋白質100μｇを示す。レーン３はES12から抽
出した蛋白質100μｇを示す。レーン４は５％（wt/wt）
トリプシンとpH10、室温で３時間反応させ溶解したバシ
ルス・ツリンギエンシスの結晶に由来する。レーン５−
７では、以下のように反応させたES12の抽出物を示し。
レーン５では、２％（wt/wt）トリプシン；レーン６で
は４％（wt/wt）トリプシン；レーン７では６％（wt/w
t）トリプシンとpH10で室温で３時間である。

第３図、レーン１〜３は結晶性蛋白質抗体と反応し、ES
12によつて作られた抗原がバシルス・ツリンギエンシス
の結晶性蛋白質と同じ電気泳動での移動度を持つことを
示す。溶解したバシルス・ツリンギエンシスの結晶類と
HB101（pBR322）及びES12の細胞抽出物は、ドデシル硫
酸ナトリウム／ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動を
行ない、ニトロセルロースへ移した後抗結晶性抗体及び
¹²⁵I−蛋白質Ａと反応させた。第３図レーン３に示した
このES12の抽出物は、第３図、レーン１に示したバシル
ス・ツリンギエンシスの溶解後の結晶と同じか（又は非
常に近い）電気泳動的移動度をもつていた。このポリペ
プチド抗原は、第３図、レーン２で示されるように、HB
101（pBR322）の同様な抽出物の場合には見られず、ま
た、データは示してないが、抗結晶抗体を免疫前の血清
と置換した場合にも、或いは抗体による前処理をせずに
¹²⁵I−蛋白質Ａを用いた場合にも検出されなかつた。

第３図レーン１で示した１μｇの結晶性蛋白質のバンド
とレーン３にのせた蛋白質の総量（100μｇ）との比較
により、結晶性蛋白質抗原はES12中の蛋白質の少量（１
％か、それ以下）に相当することがわかる。このラジオ
イムノアツセイによるポリペプチドの検出法をES12の抽
出物分画を監視するべく利用した場合、還元剤に加え、
変性剤或いはアリカリ領域のpHが結晶性蛋白抗原を可溶
化するのに必要なことが判明した。この条件はバシルス
・ツリンギエンシスの結晶類を可溶化するのにも必要で
ある。

LilleyらはJ.Gen.Microbiol.118巻：頁１−11（1980
年）で、本結晶性蛋白質はpH10で大量のプロテアーゼ類
により消化され主として単一ポリペプチドを生ずること
を報告した。第３図、レーン４−７は溶解後のバシルス
・ツリンギエンシスの結晶類及びES12の特定の分画から
の溶出物を示された量のトリプシンによりpH10で部分消
化した際の実験結果を示す。第３図レーン５、６及び７
に見られるように、ES12の抽出物の消化はトリプシン量
を増加させていくと第３図、レーン７に示されるよう
に、第３図、レーン４で示したようなバシルス・ツリン
ギエンシスの結晶性蛋白質のトリプシン消化により得ら
れた同様のパターンとなつた。この２つの標品から生じ
たバンドのパターンは定性的には類似している。定量的
な、また多少の定性的な差異は、大量の他のポリペプチ
ド類の存在により、ES12の抽出物中の結晶性蛋白質抗原
に対する消化効果がより弱くなることによるのであろ
う。

本実験中、結晶性蛋白質のトリプシン消化により生じた
大多数のポリペプチド類がLilleyらが前記論文で報告し
た数量よりも多いということは、トリプシン処理の条件
が異なることによるのであろう。スブチリシンを用いた
同様の実験でも、昆虫に対する毒性試験により得られた
バシルス・ツリンギエンシスの結晶性蛋白質から生じた
バンドの電気泳動的移動度と一致する結果が示された。
大腸菌HB101（pBR322）及びES12から得られた特定の分
画の抽出物を、タバコホーンウオーム（マンズカ・セク
スタ）の新生芋虫に供給される飼料粉と混合した。マン
ズカ・セクスタの新生幼虫は、ワシントン大学、動物学
教室のJ.Truman博士とL.Riddiford博士により提供され
た。抽出物は、特定の大腸菌株８から上述のように調
製した;6−8mlの抽出物を50mlの溶解した寒天基質の食
事と混合し、速やかに注ぎ、浅い層を形成した。固化し
た飼料を切断して（容量３−4mlの）ガラスバイアル中
に１匹の新生幼虫と共に室温で10日間入れておいた。

その結果、遺伝子操作された組み換え体金株からの抽出
物が芋虫類に対して毒性のあることが示された。ES12の
抽出物にさらされた15匹の幼虫は最初の齢虫期を完遂せ
ずに死んだ。対象株である大腸菌HB101（pBR322）から
の等量の抽出物は、如何なる抽出物も加えない飼料分で
生育した幼虫と比べた場合、少なくとも第３齢期を通じ
て、15匹の幼虫の成長、発育には、何ら顕著な影響を及
ぼさなかつた。本実験を別の大腸菌抽出物群を用いて繰
り返した場合でも同じ結果が得られた。幼虫の芋虫を殺
すのに要するES12抽出物の最少量の決定はまだ行なつて
いない。ES12抽出物の結晶性蛋白質抗原を総蛋白量の0.
5−１％と仮定すると、ES12からの抽出物で調製した飼
料粉はml当り12−25μｇの結晶性蛋白質を含んでいるこ
とになるが、それに対し、純結晶性蛋白質は２μg/mlの
濃度で幼虫を100％殺すのに充分である。

結果的に形質転換した大腸菌株、ES12は組み換え体プラ
スミドを運搬し、バシルス・ツリンギエンシスの結晶性
蛋白質に対して特異的な抗体と反応する蛋白質抗原を産
生する。このことは上述の試験で確証されており、この
場合、本菌種pES1（ATCC No.31995）より単離された組
み換え体プラスミドは同時に培養系の大腸菌HB101菌株
をアンピシリン耐性及び結晶性蛋白質抗原産生株に形質
転換するが、それに対し、プラスミドベクターpBR322は
HB101をアンピシリン及びテトラサイクリン耐性に形質
転換するが結晶抗原は検出できない。試験結果では、組
み換え体プラスミドpES1（ATSS No.31995）のDNA挿入体
は、バシルス・ツリンギエンシスの結晶性蛋白質のポリ
ペプチドと同様の性質を持つポリペプチドを作る能力を
コードすることが示されている。実際、この結果はpES1
（ATCC No.31995）のDNA挿入体がバシルス・ツリンギエ
ンシスの結晶性蛋白質に対する遺伝子をコードし、しか
もこの遺伝子は大腸菌中で生物学的活性状態で存在す
る。それ故、この新規な遺伝子操作された菌株、ES12か
ら作られた標品は、特定の場合に殺虫剤として用いられ
うる。

実施例 III 本発明による組み換え体プラスミドの作製に於けるバシ
ルス・ツリンギエンシス クルスタキ変種HD−73（NRRL
B−4488）のプラスミドDNA断片の利用バシルス・ツリ
ンギエンシス クルスタキ変種HD−73は、いくらかの他
のバシルス・ツリンギエンシス菌株に比べ、所謂、大プ
ラスミド類の含有量はより少ない。しかしながら、本実
施例の如く、本菌株は本発明による組み換え体プラスミ
ドの作製の際利用されるDNA断片を生成するのに使用で
きる。バシルス・ツリンギエンシス クルスタキ変種HD
−73由来の「大プラスミド分画」は、実施例I.に既にバ
シルス・ツリンギエンシス クルスタキ変種HD−１−デ
イペル由来の「大プラスミド分画」の場合と同様にシヨ
糖密度勾配遠心法で得た。この分画を制限酵素Bg1 IIで
消化し、約６個の断片を得、そのうち１つを、pES1（AT
CC No.31995）より得たPvu II−C DNA probeを用いて交
雑を行なつた。そのプローブについては実施例IVでより
充分に議論する。「大プラスミド分画」はBg1 IIで消化
し、BamH I消化したpBR322に結合し、大腸菌へ移入し
た。アンピリシン耐性でテトラサイクリン感受性のコロ
ニーをPvu II−C DNA probeとのハイブリツド形成、及
び結晶性蛋白質抗原の合成能につきスクリーニングし
た。本発明者の一人ホワイトリー教授の指導の下にJame
s W.Kronstadは、JWK1と呼称される菌株を単離したが、
このものは、直鎖状の場合、約13.5メガダルトンの分子
量をもつプラスミド、pJWK20（ATCC No.31997）を持
つ。pJWK20及びHD−73金株由来の「大プラスミド分画」
をBg1 II,Sal I及びHind IIIを用いて消化した予備解析
の結果によれば、pJWK20はバシルス・ツリンギエンシス
クルスタキ変種HD−73の45メガダルトンのプラスミド
に由来する約10.9メガダルトンの単一挿入体を持つらし
い。

遺伝子操作した金株JWK1の抽出物は、HD−１−デイペル
由来の結晶性蛋白質に対する抗体と反応する分子量約13
0,000Mrのポリペプチドを含有することが判明した。こ
のペプチドの移動度はHD−１−デイペル由来の結晶性蛋
白質の移動度と同等であつた。昆虫に対する毒性試験で
は、形質転換された大腸菌JWK1株の抽出物が加えられた
飼料粉はタバコホーンウオームの幼虫に対し致命的であ
ることが示された。初期の毒性症状は可溶化結晶性蛋白
質を含む粉末で飼料した幼虫で観察されたのと同様であ
つた。既述の毒性試験でみたように、大腸菌（pBR322）
からの抽出物を含む食事は幼虫の成育を阻止しなかつ
た。したがつて、遺伝子操作した大腸菌JWK1菌株は、大
きさ、抗原性及び生物活性という点でバシルス・ツリン
ギエンシスHD−１−デイペルの結晶性蛋白質に類似した
蛋白質を産生するものと見られる。

実施例 IV バシルス・ツリンギエンシス菌株のプラスミド含有量及
びこれらプラスミドとpES1（ATCC No.31995）由来のプ
ローブとハイブリツド形成能の測定。

pES1へのトランスポゾンTn5挿入体の制限酵素による解
析（データは示さず）では、結晶性蛋白質遺伝子と推定
されるものの大部分がバシルス・ツリンギエンシスのプ
ラスミドのPvu IIによる２個所の切断部位中に含まれて
いることが示されている。この切断部位は、どのプラス
ミドがその遺伝子を含んでいるのかを決定するためのバ
シルス・ツリンギエンシスの種々の菌株のプラスドにつ
いて解析するためのプローブとして利用できるPvu II−
C DNA断片を規定する。Pvu II−Ｃプローブ断片はシヨ
糖密度勾配遠心法により精製した。ManiatiasらがCell
15巻：頁66−701（1978年）で述べた、DNAポリメラーゼ
を用いる埋め込み反応、又はManiatiasらがProc.Nat.Ac
ad.Sci.,USA 72巻：頁1184−1188（1975年）で述べたニ
ツクトランスレーシヨンによつてα−³²P−dCTPで標識
した。次にそのprobeを、電気泳動及びニトロセルロー
スへの移行後、種々のバシルス・ツリンギエンシス菌株
由来のプラスミドとハイブリツドを形成させた。フアイ
ルする際に、約20の結晶性蛋白質産生性のバシルス・ツ
リンギエンシス菌株についてプラスミド含量とこれらプ
ラスミドのpES1（ATCC No.31995）由来のPvu II−C pro
be断片とのハイブリツド形成能を調べた。本測定の一部
として泳動したゲルの一例を第４図に示した。この写真
は、エチジウムブロミド染色したゲルのもので、種々の
バシルス・ツリンギエンシス菌株の抽出物中に検出され
たプラスミド類を示している。レーンａはホルボルチ
（folworthii）亜種であり；レーンｂはダルムスタジエ
ンシス（darmstadiensis）亜種であり；レーンｃはソオ
ト（sotto）亜種であり；レーンｄ−ｇはそれぞれツリ
ンギエンシス変種Ｆ−10,HD−290,HD−120及びHD−２で
あり；レーンｈ−ｊはそれぞれクルスタキ（Kurstaki）
変種HD−244,HD−73及びHD−１である。欄外に示した数
字はプラスミドの大きさをメガダルトンで示したもので
ある。データは示さないが、他のゲルでは、バシルス・
ツリンギエンシスアレスチ（alesti）亜種HD−4,ホマノ
ヒ（foumanoffi）亜種Ｆ−9,ガレリア（galleriae）亜
種HD−8,ウンナエシス（wuhnanesis）亜種Ｆ−ｂ及びモ
リソニ（morrisoni）亜種Ｆ−５についても泳動した。
第４図に示した電気泳動の結果は、各々に数個のプラス
ミドのバンドがあることを示している。開環状のものか
らなるバンドもあるだろうが、恐らくほとんどのバンド
が閉環状分子から成つてていると思われる。各菌株は含
有するプラスミドの数と大きさが大きく異なつてはいる
が、しかし、数種の菌株では全く同じか或いは同程度の
移動度を示すバンドも存在していた。本発明者は、第４
図に提示したデータが常法によつて塩化セシウムによる
精製を施したプラスミド標品の解析であり、また検出可
能なすべてのプラスミド類を検出するための成育条件、
プラスミド抽出条件、或いは電気泳動に関する条件につ
いての確認を行なわれなかつたこと、或いはまた、他の
研究者の用いた電気泳動条件についても行なつてみると
いうこともなされなかつたことを指摘している。さら
に、大きさは、StahleyらがBiochem.Biophys.Res Com
m.,84巻：頁581−588（1978年）で電顕により外形の長
さを決定したプラスミド類を用いて、その移動度との比
較から大ざつぱに概算したものである。

第４図で示した実験で用いた菌株は鞭毛に関する血清型
を異にし、また、HD−１−デイペル菌株の結晶性蛋白質
に対する抵抗との交差反応も異なる。血清型は、クルス
タキ株については3a,3bであり；ツリンギエンシス株に
ついてはタイプ１であり；ソオト（sotto）亜種ではタ
イプ4a,4bであり；ダルムスタジエンシス（darmstadien
sis）亜種ではタイプ10であり；ホルボルチ（folworthi
i）亜種ではタイプ９である。De Barjac及びBonnefoiに
よるC.R.Acad.Sci.,264巻：頁1811−1813（1967年）参
照のこと。試験した20菌株のうち14例がHD−１−デイペ
ル株の結晶性蛋白質に対する抗体と反応し、且つPvu II
−Caprobeとハイブリッドを形成した。ハイブリッド形
成の条件は、サザンらの方法（Sothern,E.M.「ゲル電気
泳動で分離したDNAフラグメント中の特異的配列の検出
（Detection of specific sequences among DNA fragme
nts separated by gel electrophoresis）」,J.Mol.Bio
l.,98:503−517（1975））に従った。

実施例 Ｖ 本発明による組み換え体プラスミド類の作製に於けるバ
シルス・ツリンギエンシス sotto亜種のプラスミドDNA
断片の利用。

バシルス・ツリンギエンシスsotto亜種から得た結晶性
蛋白質に対する遺伝子をクローニングするのに用いた手
順は、バシルス・ツリンギエンシス クルスタキ変種HD
−73から得た遺伝子のクローニングに用いたのと基本的
に同じ手順である。本手順は実施例IIIで概説してあ
る。

結晶性蛋白質に対する遺伝子をクローニングするのにソ
オト（sotto）亜種を選択したのは、含有するプラスミ
ドが２つだけであり、異なる血清型に属するからであ
る。本遺伝子をクローニングするために、塩化セシウム
−エチジウムブロミド密度勾配遠心により精製した全プ
ラスミドDNAを制限エンドヌクレアーゼMbo Iにより部分
消化した。生じた断片を、pBR322のBamH Iによる切断部
位に結合した。大腸菌へ移入後、アンピシリン耐性かつ
テトラサイクリン感受性のコロニーを選択した。これら
コロニーを、Pvu II−Ｃ断片とのハイブリツド形成能及
び結晶性蛋白質産生能につきスクリーニングした。（Ja
mes W.Kronstandにより単離された）組み換え体菌株の
一つ、JWK11はプラスミドpJWK18を含んでおり；バシル
ス・ツリンギエンシスのプラスミドDNA挿入体の大きさ
は今だ正確に決定されていない。JWK11菌株はバシルス
・ツリンギエンシス クルスタキ変種HD−１−デイペル
より単離した結晶性蛋白質に対して調製された抗血清と
交差反応する分子量130,000Mrの蛋白質を産生する。JWK
11からの抽出物はマンズカ・セクスタの幼虫に対し有毒
である。

それ故、本発明によれば、バシルス・ツリンギエンシス
の結晶性蛋白質は、組み換え体プラスミド類で形質転換
された宿主菌株により産生されうる。生体内では、バシ
ルス・ツリンギエンシスは胞子形成期のみ結晶性蛋白質
を産生する。本発明の利点は、宿主が結晶性蛋白質産生
を示すのに胞子形成をする必要がないということであ
る。本発明によるプラスミド類中での遺伝情報の発現は
宿主の特定の成長期には限定されないが、それは、結晶
性蛋白質がほとんどすべての成長期にわつて宿主菌株に
より認識される発現機構に従つて発現されるからであ
る。成長期限界を取り除くことにより、毒物の産生は今
や集中培養でなく連続的培養で可能である。これによ
り、必要な設備資金は減少して高速で高生産性の発酵が
可能となる。

本特許明細書に指示しかつ記述した方法に加え、さらに
本発明の種々の変法が前述の記載及び添附の図面により
当業者に明らかとなるであろう。そのような変更は添附
の特許請求の範囲内でなされるべきである。

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巻：頁1134−1141（1981年）

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ 9282−4Ｂ (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:07） 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ３１９９５ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ３１９９６ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ３１９９７ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ３１９９８ (56)参考文献 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｎｏ ｌｏｇｙ 96［３］（1968）Ｐ．721−726 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ 118, （1980）Ｐ．１−11

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】（１）プラスミドpES1（ATCC第31995号）
   に含まれるバシルス・ツリンギエンシス結晶性蛋白質を
   コードするPvu II−Pvu II DNA断片、および（２）バ
   シルス・ツリンギエンシスの分子量10×10⁶ダルトン以
   上のプラスミドに由来し、上記Pvu II−Pvu II DNA断
   片とハイブリダイズし、且つバシルス・ツリンギエンシ
   スの結晶性蛋白質をコードするDNA断片からなる群から
   選択される発現可能な異種DNAを有し、さらに、 宿主細菌種内の系によって認識される、該異種DNAに対
   する発現機構であって、該宿主細菌種内において該宿主
   の成長段階による制約を実質的に受けない発現機構を有
   してなる、宿主細菌種内で複製可能なプラスミド。
2. 【請求項２】バシルス・ツリンギエンシス結晶性蛋白質
   をコードするDNAと実質上相同な配列を有するDNA部分を
   含む、特許請求の範囲第１項記載のプラスミド。
3. 【請求項３】プラスミドpBR322とおおむね相同な配列を
   有するDNA部分を有する、特許請求の範囲第１項記載の
   プラスミド。
4. 【請求項４】プラスミドpES1（ATCC第31995号）、プラ
   スミドpJWK20（ATCC第31997号）およびプラスミドpJWK1
   8（ATCC第31998号）である、特許請求の範囲第１項記載
   のプラスミド。
5. 【請求項５】（１）プラスミドpES1（ATCC第31995号）
   に含まれるバシルス・ツリンギエンシス結晶性蛋白質を
   コードするPvu II−Pvu II DNA断片、および（２）バ
   シルス・ツリンギエンシスの分子量10×10⁶ダルトン以
   上のプラスミドに由来し、上記Pvu II−Pvu II DNA断
   片とハイブリダイズし、且つバシルス・ツリンギエンシ
   スの結晶性蛋白質をコードするDNA断片からなる群から
   選択される発現可能な異種DNAを有し、さらに、 宿主細菌種内の系によって認識される、該異種DNAに対
   する発現機構であって、該宿主細菌種内において該宿主
   の成長段階による制約を実質的に受けない発現機構を有
   してなる、宿主細菌種内で複製可能なプラスミドを含む
   細菌株。
6. 【請求項６】ES12、JWK1およびJWK11よりなる群から選
   択される特許請求の範囲第５項記載の細菌株。
7. 【請求項７】バシルス・ツリンギエンシスの結晶性蛋白
   質に対する抗体と特異的に反応する分子量130,000のポ
   リペプチドを発現するように形質転換された遺伝子操作
   細菌株である、特許請求の範囲第５項記載の細菌株。