JPH0797982B2 - 細胞培養装置 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は細胞培養装置に関し、詳細には細胞に効率よく
栄養分を与えると共に、産生有用物質を濃縮しつつ副生
する不要物質を巧みに除去して系内の環境の均一化を達
成し、高密度に連続的細胞培養を行なうのに最適な中空
繊維型細胞培養装置に関するものである。

［従来の技術］ 高密度な細胞大量培養は、モノクロナール抗体，リンホ
カインその他の有用な生理活性物質の工業的規模の生産
を実現する上で欠かせない技術である。

古典的な細胞培養は培養びん等を用いて実験室レベルで
行なわれてきたのであるが、より高密度に且つ大量に細
胞培養できれば工業的に有利であり、この様な観点から
細胞大量培養の為の方法や装置が各種開発されるに至っ
ている。

これらの方法や装置における培養方式は、培養される細
胞の特性によって浮遊性（非付着性）細胞培養と付着性
（壁付着性）細胞培養に大別され、前者の浮遊性細胞培
養に当たっては細胞の懸濁状態の維持と効率の良い物質
交換を、一方付着性細胞培養に当たっては単位容積当た
りの付着細胞数の増大及び栄養物，老廃物，気体等の物
質交換を効率よく達成することが重要なポイントとな
る。

上記いずれの培養方式を採用するにせよ、物質交換が重
要なポイントであるところから、選択分離性を有する中
空繊維や毛細管を用いた細胞培養が注目され、例えば中
空繊維を用いて行なう物質交換は、in vivoで細胞が血
管を通じて血液から栄養物を得ると共に代謝産物を排出
するのに類似しており、in vitroの細胞培養法として極
めて有望視されており、各種の培養装置が開発されるに
至っている。中でも中空繊維中に液体培地（培養液）を
流して中空繊維外表面に細胞を付着させて増殖させる方
法や、中空繊維内に酸素を含む気体を流して中空繊維外
表面における液体培地中に存在する細胞のガス交換を積
極的に行なう等の各種の改良が進められている。この様
な中空繊維を用いた細胞培養技術としては、これまでに
特開昭49−41579号，同50−36684号，同52−125688号，
同59−175877号，同61−25477号，公表特許昭62−50035
6号，同62−500357号等の技術が開示されている。

［発明が解決しようとする問題点］ 細胞の高密度培養に対する制限因子としては、系内での
成育阻害物質（例えば乳酸，アンモニウムイオン等の代
謝産物）の蓄積、必須栄養源（例えばグルコース，必須
アミノ酸，ビタミン等）の枯渇、溶存酸素量の枯渇、更
にはpHの急激な低下等が挙げられる。

従来の中空繊維型細胞培養装置では、この様な制限因子
を完全に排除することを目的として開発されていたもの
であるが、高密度な細胞培養を確立した技術とは言い難
い状況であった。特に培養装置内における環境が完全均
一状態とはならず、部分的に細胞の生育が不十分とな
り、その結果培養装置全体としての細胞密度が期待され
るほど高くならないというのが実情であった。

本発明はこうした技術的課題を解決する為になされたも
のであって、その目的とするところは、細胞培養装置内
における環境を可及的均一とし、これによって高密度に
細胞培養を行なうことのできる中空繊維型細胞培養装置
を提供することにある。

［問題点を解決する為の手段］ 上記目的を達成し得た本発明とは、選択透過性を有する
複数の中空繊維内に培養液を加圧下に供給してその一部
を該中空繊維の外周側へ透過させ、当該外周域に形成さ
れる細胞培養空間において細胞培養を行なう様に構成さ
れた細胞培養装置において、 前記中空繊維内に供給された培養液を加圧下に循環させ
る培養液循環系と、 前記細胞培養空間内で生成した低分子物質及び高分子有
用物質を含んだ培養液を、前記低分子物質を分離する為
の膜分離装置を介して循環させる生成液循環系を備え、 更に、前記培養液循環系と生成液循環系の流量バランス
を保持する圧力調整手段を設けたものである点に要旨を
有する細胞培養装置である。

［作用］ 本発明においては、中空繊維内に培養液を加圧下に供給
することによって、細胞培養空間における栄養源や溶存
酸素等の枯渇を防止することを基本的な構成とするもの
である。この場合に中空繊維内に供給される栄養源の組
成や溶存酸素量等を予め調整することによって最適な培
養条件での培養液の供給が可能となる。

そして中空繊維内に供給された培養液を加圧下に循環さ
せる培養液循環系の構成を採用することによって、前記
細胞培養空間内全体に亘って均一に培養液を供給でき
る。又この目的をより有効に達成するには、前記培養液
循環系にガス交換器好ましくは中空繊維型人工肺を設け
て溶存酸素量又は溶存炭酸ガス量を制御すると共に、新
鮮培養液や塩基を供給するラインを設けて上記中空繊維
を透過した培養液を補い且つpHを調節するのが推奨され
る。

尚前記細胞培養空間内における細胞の種類は何ら限定す
るものではなく、付着性細胞の場合には中空繊維の外表
面上に付着させる方法或はコラーゲン等の高分子ゲル状
マトリックス中に閉じ込める方法（特願昭62−65363
号）等が例示され、一方浮遊性細胞の倍には上記高分子
マトリックス中に閉じ込める方法や液中浮遊状態で培養
する方法等を挙げることができる。

細胞培養空間内の培養液は、生成した低分子不要物質及
び高分子有用物質を含んだ状態で膜分離装置へ導かれ
る。膜分離装置へ導かれた培養液は、細胞の代謝物質で
ある乳酸，アンモニウムイオン等の成育阻害因子となる
低分子不要物質が取り除かれた後再び細胞培養空間内に
循環される（生成液循環系）。尚この循環される培養液
は生成液循環系内でpHや溶存酸素量が調整される。

この様に細胞培養空間内の培養液を、膜分離装置を介し
て循環させることによって、細胞代謝物を細胞の近傍か
ら速やかに取り除くことができ、細胞培養空間内の環境
を均一にすることができる。又このことによって、代謝
物の蓄積による細胞培養空間内の部分的又は全体的なpH
の急激な低下を防ぐことができる。更に、低分子不要物
質を膜分離装置で選択的に分離して取り除くことによっ
て、培養液中の成育阻害物質濃度を低下させ、且つ細胞
が産生する高分子有用物質を濃縮することができる。そ
して高分子有用物質が濃縮された培養液を一定速度で系
外へ取り出すと共に、中空繊維を介した培養液透過流量
を制御して細胞培養装置内の培養液の移動が安定化され
ることによって、当該細胞培養装置における連続培養が
可能となり、高濃度の有用物質を長期間に亘って安定し
て回収することができる様になる。

尚前記膜分離装置においては低分子物質のみが選択的に
取り除かれることが望ましく、その分画分子量は少なく
とも高分子有用物質が透過しない範囲としなければなら
ず、例えば1000〜200000程度好ましくは3000〜30000程
度とするのが適当である。一方中空繊維における分画分
子量は有用物質が透過しない範囲内に設定すればよく、
膜分離装置の分画分子量より大きいか又は等しくても良
い。

本発明装置における中空繊維の材質は何ら限定するもの
ではないが、例えば有機高分子、無機多孔質体又は金属
多孔質体等が挙げられる。又その内径は10〜1000μｍ、
膜厚は２〜500μｍで良く、特に内径は50〜500μｍ程度
が好ましい。上記有機高分子材料としては、例えばセル
ロースアセテート，セルローストリアセテート，セルロ
ースエステル，ポリスルホン，ポリオレフィン，ポリフ
ルオロカーボン，ポリシロキサン等がある。

培養液循環系での循環流量は、線速度にして1000cm/分
以下、特に300cm/分以下とするのが好ましく、1000cm/
分を超えると中空繊維内の圧力が大きくなり過ぎ、細胞
培養空間への透過量が多くなって好ましくない。

一方生成液循環系での循環流量は、線速度にして0.1〜1
000cm/分、特に１〜300cm/分程度が好ましい。しかして
0.1cm/分未満であると液の置換が達成されず、細胞の近
傍における代謝物濃度が高くなり過ぎ細胞成育が阻害さ
れ、1000cm/分を超えると剪断力の影響で細胞の破壊や
死滅という好ましくない現象が発生する。

前記中空繊維を透過する培養液の移動量は、例えば第１
図（実施例図面）に示す様に、培養液循環系内にチャン
バー７を設け、このチャンバー７内の培養液５にガス圧
をかけ、この圧力を調整することによって中空繊維１内
の圧力を制御し、これによって上記移動量を変化させ
る。そして上記チャンバー７内の培養液５の液面及び生
成液循環系内に設けたチャンバー19内の培養液（生成
液）の液面を夫々一定に保つ様に制御することによっ
て、細胞培養装置内の培養液の流れが安定し、長期的な
連続培養が可能となる。

以下本発明を実施例によって更に詳細に説明するが、下
記実施例は本発明を限定する性質のものではなく、前・
後記の趣旨に徴して各種の設計変更を加えることはいず
れも本発明の技術的範囲に含まれるものである。

［実施例］ 第１図は本発明の一実施例を示す概略説明図である。

本発明に係る細胞培養装置は、基本的には細胞培養器２
と膜分離装置15を含んでいる。そして前記細胞培養器２
は、選択透過性を有する複数の中空繊維１が容器３内に
収納されて成り、中空繊維１の外周域と前記容器３との
間には細胞培養空間４が形成され、該空間４内には培養
されるべき細胞が充填される。

前記中空繊維１内には、送液ポンプ６によって培養液５
が供給される。該培養液５はチャンバー７内に貯留され
ており、空気圧供給装置８により圧力が加えられること
によって推進力が与えられ、培養液５の一部が細胞培養
空間４内に透過してゆく。細胞培養空間４内に透過しな
かった残余の培養液５は、ライン20を通ってガス交換器
９に導かれ、このガス交換器９によって酸素や炭酸ガス
の濃度が調整された後、新鮮培養液10と最適pH調整用塩
基11（例えば0.5N−NaOH）が添加されて再びチャンバー
７に戻される（培養液循環系）。又ライン20にはpHセン
サー12aと溶存酸素量検知センサー13aが設けられてお
り、ライン20内を通る培養液５のpHや溶存酸素量が測定
される。

一方細胞培養空間４内の培養液５は生成した低分子物質
及び高分子有用物質を含んだ状態で（以下生成液5aとい
う）、一旦チャンバー19に貯留された後送液ポンプ14に
よって膜分離装置15に供給される。そして当該膜分離装
置15では、前記送液ポンプ14の動圧によって分離用膜16
（この実施例では中空繊維膜）を介して、生成液5a中の
乳酸やアンモニウムイオン等の低分子代謝産物が分離さ
れ系外17に取り出される。尚分離用膜16の構成は図示し
た中空繊維膜に限らず、通常用いられている平膜状や管
状の限外瀘過膜や逆浸透膜であってもよい。

分離用膜16を透過しなかった生成液5aは、その後ライン
21を通って再び細胞培養空間４に戻され（生成液循環
系）、細胞培養空間４内が適度に撹拌され、細胞近傍の
培養液５（又は生成液5a）や代謝産物等を均一に分散さ
せるのに役立つ。そして生成液5a中のの高分子有用物質
は分離膜16を透過できないので、上述した生成液循環系
を経ることで濃縮されてゆく。この高分子有用物質はラ
イン21に設けられた送液ポンプ18によって生成液5aを一
定流量回収することにより、連続的に高濃度に取り出す
ことができ、細胞近傍の代謝産物が適当に取り除かれる
ことと相俟って細胞培養空間４内の環境を均一に維持で
き細胞を長時間に亘って高密度に培養することができ
る。又前記ライン21にはpHセンサー12b,溶存酸素量検知
センサー13bが設けられ、ライン21内を通過する生成液
のpHや溶存酸素量が測定される。

尚第１図に示した実施例は、pHセンサー12a,12b、溶存
酸素量検知センサー13a,13bは培養液循環系と生成液循
環系の双方に設けたけれども、どちらか一方の循環系に
設ける構成であってもよい。

又この実施例においては、中空繊維１はセルロースアセ
テート製で分画分子量が22,000のものを、分離用膜16は
セルロースアセテート製で分画分子量が5000のものを夫
々用いた。

一方細胞培養装置内の培養液５や生成液5aの流れを安定
させる為には、培養液循環系のチャンバー７と生成液循
環系のチャンバー19の夫々に液面計22a,22bを設け、夫
々のチャンバー7,19内の液面が一定となる様にチャンバ
ー７内の圧力を空気圧供給装置８によって制御すればよ
く、こうして例えば培養液の透過量を調整することによ
って、前記培養液循環系と生成液循環系の流量のバラン
スを保持することができる。尚空気圧供給装置８をチャ
ンバー19にも設け、チャンバー７の圧力を調整すると共
にチャンバー19内の圧力を調整することによっても同様
の効果が達成される。但し、この様な場合にはチャンバ
ー７内の圧力をチャンバー19内の圧力よりも高くなる様
に調整する必要がある。更に、本発明の目的を達成する
為には、前記送液ポンプ6,14は、同期的に作動する脈動
とすることが好ましく、又長期間無菌的状態を維持する
必要性をも考慮すれば、前記送液ポンプ6,14としては密
閉性に優れたベローズポンプを用いるのが最適である。

第２図は本発明の他の実施例の概略説明図であり、基本
的な構成は第１図に示した構成と類似しており対応する
部分には同一の参照符号を付すことにより重複説明を避
ける。そしてこの実施例は、膜分離装置15から系外17に
取出す生成液5aの一部をライン21に戻す様なライン23を
設けたものである。即ち膜分離装置15によって分離され
る低分子物質の中には乳酸やアンモニウムイオン等の生
育阻害物質以外にも無機塩類やアミノ酸等の様に細胞の
生育に有用な栄養源も含まれており、これらの栄養源を
できるだけ利用する為に第２図に示した構成が採用され
る。但し、この場合の返戻量は、含まれる上記生育阻害
物質が細胞の生育を阻害しない程度とする必要があるの
は言う迄でもない。

第２図に示した構成と同様の観点から、例えば第３図に
示す様な構成も採用することができる。即ち第３図に示
す構成では、膜分離装置15から系外17に取出す生成液5a
の一部を培養液循環系のライン20に戻すライン24を設
け、前記第２図に示した構成と同様の効果が達成され
る。

第４図は本発明の更に他の実施例の概略説明図である。
この実施例では、系外17に生育阻害物質と共に取り出さ
れた無機塩類やアミノ酸等の栄養源を補う為に、無機塩
類やアミノ酸を含んだ水溶液25を別に調製し、この水溶
液25をライン26を介して前記ライン21に補給するもので
ある。

［発明の効果］ 以上述べた如く本発明によれば、既述の構成を採用する
ことによって細胞培養装置内の環境を可及的均一に維持
でき、細胞の高密度な連続培養が可能となり、高濃度の
有用物質を長期間に亘って得ることができる様になっ
た。

【図面の簡単な説明】

第１〜第４図は本発明の各種の実施例を示す概略説明図
である。 １……中空繊維、２……細胞培養器 ３……容器、４……細胞培養空間 ５……培養液、5a……生成液 6,14,18……送液ポンプ 7.19……チャンバー、８……空気圧供給装置 ９……ガス交換器、15……膜分離装置

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】選択透過性を有する複数の中空繊維内に培
   養液を加圧下に供給してその一部を該中空繊維の外周側
   へ透過させ、当該外周域に形成される細胞培養空間にお
   いて細胞培養を行なう様に構成された細胞培養装置にお
   いて、 前記中空繊維内に供給された培養液を加圧下に循環させ
   る培養液循環系と、 前記細胞培養空間内で生成した低分子物質及び高分子有
   用物質を含んだ培養液を、前記低分子物質を分離する為
   の膜分離装置を介して循環させる生成液循環系を備え、 更に、前記培養液循環系と生成液循環系の流量バランス
   を保持する圧力調整手段を設けたものであることを特徴
   とする細胞培養装置。