JPH0815435B2

JPH0815435B2 - 新規血小板凝集抑制物質ｏｍ−４８４２ａ、その製造法およびその用途

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Publication number: JPH0815435B2
Application number: JP62162245A
Authority: JP
Inventors: 智大村; 中川　　彰
Original assignee: 北里研究所（社団法人）
Priority date: 1987-07-01
Filing date: 1987-07-01
Publication date: 1996-02-21
Anticipated expiration: 2011-02-21
Also published as: JPS6410992A

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、新規血小板凝集抑制物質OM−4842Aの製造
法および血圧低下剤あるいは血栓症治療剤、さらには制
癌剤としての用途に関する。

〔従来の技術〕

従来、抗血小板活性物質は、殆ど化学合成物質に限ら
れており、ストレプトマイセス属の微生物が血小板凝集
抑制物質を産生することは極めて報告が少ない。

〔発明が解決しようとする問題点〕

近年、微生物の代謝産物から有効な物質のスクリーニ
ングが活発に行われている。本発明者らは、新規な血小
板凝集抑制物質の探索を目的として種々の土壌から菌株
を分離し、その生産する代謝産物について研究を続けた
結果、放線菌OM−4842株の培養物中に血小板凝集抑制活
性を有する物質が産生されることを見出した。そこで、
培養物から該有効物質を分離、精製し、その理化学的性
質を調べた結果、新規物質であることが判明したので、
該物質を血小板凝集抑制物質OM−4842Aと命名した。本
発明はかかる知見に基づいて完成されたものである。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明は、後記の理化学的性質を有する血小板凝集抑
制物質OM−4842Aおよびストレプトマイセス属に属し、
血小板凝集抑制物質OM−4842A生産菌を培地に培養して
培養物中に該血小板凝集抑制物質OM−4842A生産蓄積さ
せ、その培養物から該血小板凝集抑制物質OM−4842Aを
採取することを特徴とする新規血小板凝集抑制物質OM−
4842Aの製造法ならびに血小板凝集抑制物質OM−4842Aを
有効成分として含有してなる血小板凝集抑制剤である。

本発明の血小板凝集抑制物質OM−4842A（以下単に物
質OM−4842Aと称することがある）を生産する能力を有
する微生物は、ストレプトマイセス属に属するが、例え
ば本発明者らが千葉県館山市の土壌から新たに分離した
ストレプトマイセス属に属するOM−4842株は、本発明に
最も有効に使用される菌株の一例であって、本菌株の菌
学的性質を示すと次の通りである。

（ａ）．形態的性質栄養菌糸は、各種寒天培地上でよく発達し、分断は観
察されない。気菌糸は、イーストエキストラクト・マル
トエキストラクト寒天あるいはスターチ無機塩寒天等で
豊富に着生し、グレイあるいはピンク系を呈する。顕微
鏡下の観察では、気菌糸はら旋状を呈し、20ケ以上の胞
子の連鎖が認められる。胞子の大きさは1.1×0.7μで円
柱状である。胞子の表面は平滑である。菌核、胞子のう
および遊走子は見出されない。

（ｂ）．各種培地上での性状イー・ビー・シャーリング（E.B.Shirling）とデー・
ゴットリーブ（D.Gottlieb）の方法（インターナシヨナ
ル・オブ・システィマティツク・バクテリオロジー、16
巻、313頁、1966年）によって調べた本生産菌の培養性
状を第１表に示す。色調は標準色として、カラー・ハー
モニー・マニュアル第４版（コンテナ・コーポレーシヨ
ン・オブ・アメリカ・シカゴ、1958年）を用いて決定
し、色票名とともに括弧内にそのコードを併せて記し
た。以下は特記しない限り、27℃、２週間目の各培地に
おける観察の結果である。

（ｃ）生理学的諸性質（１）メラニン色素の生成（イ）チロシン寒天；陽性（ロ）ペプトン・イースト鉄寒天；陽性（ハ）グルコース・ペプトン・ゼラチン培地（21〜23
℃）；陽性（ニ）トリプトン・イースト液；陰性（２）チロシナーゼ反応；陽性（３）硫化水素の生産；陰性（４）硝酸塩の還元；陽性（５）ゼラチンの液化（21〜23℃）（グルコース・ペ
プトン・ゼラチン培地）；陰性（６）スターチの加水分解；陽性（７）脱脂乳の凝固（37℃）；陰性（８）脱脂乳のペプトン化（37℃）；陽性（９）生育温度範囲15〜41℃ （ｄ）炭素源の利用性（プリーダム・ゴトリーブ寒天培地）利用する；グルコース、ラフィノース、メリビオース、
Ｄ−マンニトール、Ｄ−フラクトース、Ｌ−ラムノー
ス、ｉ−イノシトール、シュークロースやや利用する;D−キシロース利用しない;L−アラビノースセルロースの分解；陰性（ｅ）細胞壁組成細胞壁のジアミノピメリン酸はLL型である。

以上、本菌の菌学的性状を要約すると次のとおりであ
る。細胞壁中のジアミノピメリン酸はLL型である。気菌
糸の形態は、ら旋状で、長い胞子鎖を形成する。胞子の
表面は平滑である。培養状の諸性質としては、栄養菌糸
はブラウンあるいはワイン系の色調を呈し、気菌糸はグ
レイあるいはピンク系の式調を呈する。可溶性色素とし
てはブラウン系の色素を生産する。

これらの結果から、本菌株はストレプトミセス属に属
する菌種であり、プリドハムとトレスナーの分類（バー
ジズ・マニュアル・オブ・デターミネーテイブ・バクテ
リオロジー、第８版、748〜829頁、1974年）によるグレ
イあるいはレッドシリーズに属する菌種であると考えら
れる。

なお、本菌株は、ストレプトミセス・エスピー・OM−
4842（Streptmyces sp.OM−4842）として、工業技術院
微生物工業技術研究所に寄託されている（微工研菌寄第
9427号）。

以上、本物質OM−4842A生産菌について説明したが、
放線菌の一般的性状として菌学上の性状は極めて変異し
易く、一定したものではなく、自然的にあるいは通常行
われる紫外線照射、Ｘ線照射または変異誘導剤例えばＮ
−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、エチ
ルメタンスルホネートなどを用いる人工変異手段により
変異することは周知の事実である。このような、人工的
変異手段は勿論、自然変異株も含め、ストレプトマイセ
ス属に属し、物質OM−4842Aを生産する能力を有する菌
株は、すべて本発明に使用することができる。

本発明においては、先ずストレプトマイセス属に属す
る物質OM−4842A生産菌が適当な培地に培養される。本
菌の培養においては、通常放線菌の培養が一般に用いら
れる。培地としては、微生物が同化し得る炭素源、消化
し得る窒素源、さらには必要に応じて無機塩などを含有
させた栄養培地が培養される。同化し得る炭素源として
は、ブドウ糖、糖蜜、澱粉、デキストリン、セルロー
ス、コーン・スティープ・リカー、グリセリン、有機酸
などが単独または組み合わせて用いられる。消化し得る
窒素源としては、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、乾
燥酵母、大豆粉、コーン・スティープ・リカー、綿実
粕、カゼイン、大豆タンパク分解物、アミノ酸、尿素な
どの有機窒素源、硝酸塩、アンモニウム塩などの無機窒
素化合物が単独または組み合わせて用いられる。その
他、必要に応じナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム
塩、マグネシウム塩、リン酸塩などの無機塩類が添加さ
れる。さらに、培地には、必要に応じて、本菌の生育や
物質OM−4842Aの生産を促進する微量栄養素、発育促進
物質、前駆物質を適当に添加してもよい。

培地は、通常振とうまたは通気撹拌培養などの好気的
条件下で行うのがよい。工業的には深部通気撹拌培養が
好ましい。培地のpHはやや酸性ないし中性付近で行うの
が好ましい。培養温度は20〜40℃の範囲であるが、通常
は24〜30℃、好ましくは27℃付近に保つのがよい。

培養時間は、液体培養の場合は、通常１〜８日でよい
が、好ましくは血小板凝集抑制物質の培養中の蓄積量が
最大に達した時に培養を終了させる。培地組成、培地の
液性、培地温度、撹拌速度、通気量等の培養条件は、使
用する菌株の種類や外部の条件などに応じて好ましい結
果が得られるよう適宜調節選択されることはいうまでも
ない。液体において発泡があるときは、シリコン油、植
物油、界面活性剤などの消泡剤が適宜使用される。この
ようにして得られた培養物中に蓄積された血小板凝集抑
制物質OM−4842Aは菌体内および培養濾液中に含有され
るので、遠心分離して培養濾液と菌体とに分離し、各々
から本血小板凝集抑制物質OM−4842Aを採取するのが有
利である。

培養濾液からOM−4842Aを採取するには、培養濾液を
酢酸エチル、ベンゼンなどの非親水性有機溶媒で抽出す
る。得られた抽出液または溶出液を減圧濃縮し、得られ
る粗物質はさらに脂溶性物質の精製に通常用いられる公
知の方法、例えばシリカゲル、アルミナなどの担体を用
いるカラムクロマトグラフイーにより本物質OM−4842A
を各々分離精製することができる。

菌体から本物質OM−4842Aを採取するには、菌体を含
水アセトンや含水メタノールなどの含水親水性有機溶媒
で抽出し、得られた抽出液を減圧濃縮し、その濃縮物を
酢酸エチルで抽出し、この酢酸エチル抽出液は、前期の
培養濾液から得た酢酸エチル抽出液と合わせて分離精製
するか、あるいは前記と同じ方法で分離精製することが
できる。

次に、本血小板凝集抑制物質OM−4842Aの理化学的性
質について述べる。

分子式;C₃₇H₄₆O₁₄（¹Hおよび¹³C−NMRスペクトルお
よび元素分析による）、分子量;714（¹³C−NMRスペクトルおよび元素分析に
よる）、比旋光度；〔α〕＋60゜（Ｃ＝0.2、メタノール）紫外線吸収スペクトル（メタノール中）；λmax n
m（Ｅ）220（416.75）、321.5（63.25）、427.5（83.2
5）、赤外線吸収スペクトル（臭化カリウム中）；第２図
の通り、溶剤に対する溶解性；アセトン、メタノール、エタ
ノール、酢酸エチル、クロロホルム、ベンゼン、ジメチ
ルスルホキシドに可溶、水、ｎ−ヘキサンに不溶、塩基性、酸性、中性の区別；弱酸性脂溶性キノン物
質物質の色；橙赤色プロトン核磁気共鳴スペクトル（重クロロホルム
中）；第３図の通り、カーボン核磁気共鳴スペクトル（重クロロホルム
中）；第４図の通り、〔発明の効果〕次に、本発明の血小板凝集抑制物質OM−4842Aの生物
学的性質について述べる。

（１）血小板凝集抑制作用家兎の血液から調整した多血小板血漿（400μ）を
キューベットに入れ、これにOM−4842A（50μg/ml〜５
μg/mlの各濃度）を添加し、37℃で10分間インキュベー
ションを行う。次いで、血小板凝集剤としてADP、アラ
キドン酸、PAF、コラーゲンの各濃度を加え、反応液を
５分間インキュベーションし、24穴ウエルで血小板凝集
抑制度を調べた。本物質OM−4842Aの各種凝集剤に対す
る血小板凝集最小抑制濃度は次の通りであった。

ADP（５μＭ）:12.5μg/ml アラキドン酸（100μＭ）:5.0μg/ml PAF（５×10^-8M）:25.0μg/ml コラーゲン（100μg/ml）：＞25.0μg/ml （２）毒性本抗血小板凝集抑制物質OM−4842Aは、200mg/kgマウ
ス腹腔内に投与したが、なんら毒性は認められなかっ
た。

上記の通り、本抗血小板凝集抑制物質OM−4842Aは、
毒性が低く、ADP、アラキドン酸、PAFなどの血小板凝集
剤に対し著しい凝集抑制効果を示すことから、ヒトの血
圧低下作用ならびに血栓症の予防薬として有用である。

〔実施例〕

次に、実施例により本発明を具体的に示すが、これに
より本発明は限定されるものではない。

500ml坂口フラスコにグルコース0.1％、澱粉2.4％、
ペプトン0.3％、肉エキス0.3％、酵母エキス0.5％、炭
酸カルシウム0.4を含む液体培地（pH7.0）100mlを分注
し、121℃で15分間蒸気滅菌し、これらにグリセロール
1.0％、リンゴ酸カルシウム1.0、塩化アンモン0.05％、
リン酸二カリウム0.05％、酵母エキス0.1％に寒天1.5％
を含む寒天斜面培地上で27℃で培養したストレプトマイ
セスOM−4842株の斜面培地から１白金耳ずつ接種し、回
転式振とう機を用い、27℃にて２日間振とう培養し、種
母を得た。50容ジャーファメンターにオートミール2.
0％を含む液体培地（pH7.0）30を仕込み、121℃で15
分間蒸気滅菌した。これに上記の種母９本分を移植し、
撹拌速度250rpm通気量15/minの条件下で、27℃で96時
間通気撹拌培養した。培養液をシャープレス型遠心分離
機で遠心（10000rpm）して、菌体と培養液上清とに分別
した。

得られた上清に酢酸エチル30を加え、撹拌し、抽出
した。酢酸エチル層を分取し、減圧下濃縮することによ
って暗赤色物質28gを得た。

抽出物質28gをキーゼルゲル（Kiselgel）60シリカゲ
ル（メルク社製）のカラム（50×7cm）を用いてカラム
クロマトグラフイーを行った。

展開溶媒クロロホルム−メタノール（100:1）にて先
ず油状物を溶出させ、次いで、クロロホルム−メタノー
ル（50:1−20:1）にて溶出させ、物質OM−4842Aを含む
画分を集め、減圧濃縮乾固し、赤褐色物質3gを得た。こ
れをできるだけ少量のクロロホルムに溶解度し、Kiselg
el60F254シリカゲル薄層プレート（メルク社製）上にチ
ャージし、クロロホルム−メタノール（10:1にて展開さ
せ、Rf値0.32の部分（黄橙色のバンド）をかきとった。
物質OM−4842Aを含むシリカゲル粉末をカラムに詰め、
溶出溶媒クロロホルム−メタノール（3:1）を用いて、
活性物質を溶出させ、減圧濃縮し、物質OM−4842A 13
4.6mgを橙赤色粉末として得た。

本粉末をさらに精製分離するため、セファデックスLH
−20（展開溶媒：メタノール）を用いるカラムクロマト
グラフイーを行い、橙赤色粉末として本物質OM−4842A
83.6mgを得た。

【図面の簡単な説明】

第１図は血小板凝集抑制物質OM−4842Aの紫外線吸収ス
ペクトル（メタノール中）；第２図は血小板凝集抑制物質OM−4842Aの赤外線吸収ス
ペクトル（臭化カリウム中）；第３図は血小板凝集抑制物質OM−4842Aのプロトン核磁
気共鳴スペクトル（重クロロホルム中）；第４図は血小板凝集抑制物質OM−4842Aのカーボン磁気
共鳴スペクトル（重クロロホルム中）である。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】次の理化学的性質を有する血小板凝集抑制
物質OM−4842A。分子式;C₃₇H₄₆O₁₄（¹Hおよび¹³C−NMRスペクトルお
よび元素分析による）、分子量;714（¹³C−NMRスペクトルおよび元素分析に
よる）、比旋光度；〔α〕＋60゜（Ｃ＝0.2、メタノール）紫外線吸収スペクトル（メタノール中）；λmax n
m（Ｅ）220（416.75）、321.5（63.25）、427.5（83.2
5）、赤外線吸収スペクトル（臭化カリウム中）；第２図
の通り、溶剤に対する溶解性；アセトン、メタノール、エタ
ノール、酢酸エチル、クロロホルム、ベンゼン、ジメチ
ルスルホキシドに可溶、水、ｎ−ヘキサンに不溶、塩基性、酸性、中性の区別；弱酸性脂溶性キノン物
質物質の色；橙赤色プロトン核磁気共鳴スペクトル（重クロロホルム
中）；第３図の通り、カーボン核磁気共鳴スペクトル（重クロロホルム
中）；第４図の通り、
【請求項２】ストレプトマイセス属に属する血小板凝集
抑制物質OM−4842A生産菌を培地に培養し、該培養物中
に血小板凝集抑制物質OM−4842Aを生産蓄積させ、その
培養物から該血小板凝集抑制物質OM−4842Aを採取する
ことを特徴とする新規血小板凝集抑制物質OM−4842Aの
製造法。
【請求項３】血小板凝集抑制物質OM−4842A生産菌がス
トレプトマイセス・スピーシーズOM−4842（FERM−Ｐ
No.9427）である特許請求の範囲第２項記載の製造法。
【請求項４】血小板凝集抑制物質OM−4842Aを有効成分
として含有してなる血小板凝集抑制剤。